CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.3 Bố trí thí nghiệm
2.3.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của cytokinin lên sự phát sinh chồ
cây thủy sinh tiêu thảo lá nhăn Cryptocoryne wendtii in vitro
Mục đích thí nghiệm:
Xác định loại và nồng độ chất điều hịa sinh trưởng thực vật thích hợp cho sự phát sinh chồi cây thủy sinh tiêu thảo lá nhăn Cryptocoryne wendtii in vitro.
Mơ tả thí nghiệm:
Các mẫu cây in vitro được cắt ngọn và rễ có chiều cao 1 – 1,5 cm được cấy vào bình thủy tinh 500 ml với các mơi trường MS bổ sung BA và Kinetin riêng lẻ ở các nồng độ từ 0,5 – 2,0 mg/l để khảo sát nhân nhanh chồi in vitro. Thí nghiệm được bố trí như bảng 3.2.
Bảng 2.2. Khảo sát ảnh hưởng của cytokinin lên sự nhân nhanh chồi của mẫu cấy.
Nghiệm thức Chất bổ sung Nồng độ (mg/l) 0 BA 0,0 B0,5 0,5 B1,0 1,0 B1,5 1,5 B2,0 2,0 K0,5 Kinetin 0,5 K1,0 1,0 K1,5 1,5 K2,0 2,0
Bố trí thí nghiệm: theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, một yếu tố với 9 nghiệm thức, 3 lần lặp lại.
23
Quy mơ: 5 mẫu/ bình x 5 bình/ nghiệm thức x 9 nghiệm thức x 3 lần lặp lại
Chỉ tiêu theo dõi: Sau 8 tuần nuôi cấy, tiến hành thu nhận các số liệu với các chỉ tiêu: số chồi/ mẫu (chồi), số lá/ chồi (lá) và chiều cao mẫu (cm).
2.3.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của mơi trường khống lên sự tăng
trưởng của chồi cây thủy sinh tiêu thảo lá nhăn Cryptocoryne wendtii in vitro
Mục đích thí nghiệm:
Xác định được mơi trường khống nào ảnh hưởng đến sự tăng trưởng của cây thủy sinh tiêu thảo lá nhăn Cryptocoryne wendtii.
Mơ tả thí nghiệm:
Chồi cây thủy sinh tiêu thảo lá nhăn Cryptocoryne wendtii in vitro có cùng kích thước (1 – 1,5 cm) được cấy lên mơi trường khống bố trí như bảng 3.4.
Bảng 2.3. Khảo sát ảnh hưởng của mơi trường khống lên sự tăng chồi của mẫu cấy.
Nghiệm thức Mơi trường
E1 MS
E2 ½ MS
E3 MS ½
E4 B5
Bố trí thí nghiệm: theo kiểu hồn tồn ngẫu nhiên, một yếu tố với 3 nghiệm thức, 3 lần lặp lại.
Quy mơ: 5 mẫu/ bình x 10 bình/ nghiệm thức x 4 nghiệm thức x 3 lần lặp lại
Chỉ tiêu: Sau thời gian nuôi cấy, tiến hành thu nhận các số liệu với các chỉ tiêu: số chồi, chiều cao chồi trung bình (cm), số lá/ chồi (lá).
2.3.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát sự ảnh hưởng của auxin lên sự hình thành rễ từ
chồi của cây thủy sinh tiêu thảo lá nhăn Cryptocoryne wendtii in vitro.
24
Xác định được loại và nồng độ chất điều hòa sinh trưởng thực vật lên sự hình thành rễ từ chồi của cây thủy sinh tiêu thảo lá nhăn Cryptocoryne wendtii in vitro. Mơ tả thí nghiệm:
Chồi cây thủy sinh tiêu thảo lá nhăn Cryptocoryne wendtii in vitro có cùng chiều cao và kích thước được ni cấy trong mơi trường khống thích hợp ở nội dung 3.3.3 bổ sung NAA hoặc IBA với nồng độ bố trí như bảng 3.4
Bảng 2.4. Khảo sát ảnh hưởng của auxin lên sự hình thành rễ của mẫu cấy cây.
Nghiệm thức Chất bổ sung Nồng độ (mg/l) 0 NAA 0,0 NAA0,5 0,5 NAA1,0 1,0 NAA1,5 1,5 NAA2,0 2,0 IBA0,5 IBA 0,5 IBA1,0 1,0 IBA1,5 1,5 IBA2,0 2,0
Bố trí thí nghiệm: theo kiểu hồn tồn ngẫu nhiên, một yếu tố với 9 nghiệm thức, 3 lần lặp lại.
Quy mơ: 5 mẫu/ bình x 5 bình/ nghiệm thức x 9 nghiệm thức x 3 lần lặp lại
Chỉ tiêu: Sau thời gian nuôi cấy, tiến hành thu nhận các số liệu với các chỉ tiêu: số chồi, số lá/ chồi (lá), số rễ/ mẫu (rễ) và chiều cao cây (cm).
2.3.5 Thí nghiệm 5: Khảo sát sự ảnh hưởng của cường độ ánh sáng lên sự tăng
trưởng của chồi cây thủy sinh Cryptocoryne wendtii in vitro
25
Xác định được cường độ ánh sáng thích hợp cho sự tăng trưởng cây
Cryptocoryne wendtii in vitro.
Mơ tả thí nghiệm:
Mẫu cấy cây thủy sinh Cryptocoryne wendtii in vitro có cùng kích thước được cấy trong mơi trường với thành phần khống thích hợp dựa trên kết quả của nội dung 3.3.3. Các mẫu cấy được khảo sát sự sinh trưởng trong các điều kiện có cường độ chiếu sáng khác nhau theo bảng 3.5
Bảng 2.5. Khảo sát ảnh hưởng của cường độ sáng lên sự tăng chồi của mẫu cấy.
Nghiệm thức Cường độ chiếu sáng (lux)
AS1 2000
AS2 2500
AS3 3000
Bố trí thí nghiệm: theo kiểu hồn tồn ngẫu nhiên, một yếu tố với 3 nghiệm thức, 3 lần lặp lại.
Quy mơ: 5 mẫu/bình x 5 bình/nghiệm thức x 3 nghiệm thức x 3 lần lặp lại
Chỉ tiêu: Sau thời gian nuôi cấy, tiến hành thu nhận các số liệu với các chỉ tiêu như: chiều cao cây (cm), số lá/ chồi (lá), số chồi.
26
2.4 Các chỉ tiêu theo dõi
1. Tỷ lệ nhiễm (%) = Σ Số mẫu nhiễm
Σ Số mẫu theo dõi× 100
2. Tỷ lệ mẫu sống (%) = Σ Số mẫu sống
Σ Số mẫu theo dõi × 100
3. Tỷ lệ mẫu tạo chồi (%) = Σ Số mẫu tạo chồi
Σ Số mẫu cấy ban đầu × 100
4. Hệ số nhân (lần) = Σ Số mẫu thu được
Σ Số mẫu cấy ban đầu
5. Chiều cao TB chồi (cm) =Σ Chiều cao các chồi
Σ Chồi theo dõi
6. Số chồi (chồi/mẫu) = Σ Số chồi thu được
Σ Số mẫu ban đầu
7. Số lá (lá/chồi) = Σ Số lá
Σ Số chồi
8. Tỷ lệ mẫu tạo rễ (%) = Σ Số mẫu tạo rễ
Σ Số mẫu theo dõi × 100
9. Số rễ (rễ/chồi) = Σ Số rễ
27
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ & THẢO LUẬN
3.1 Kết quả khảo sát điều kiện khử trùng của cây thủy sinh tiêu thảo lá nhăn
Cryptocoryne wendtii tạo nguồn mẫu in vitro
Giai đoạn khử trùng mẫu là một bước khởi đầu quan trọng để tạo nguồn mẫu in
vitro cho q trình ni cấy. Đặc biệt đối với cây thủy sinh, là những loài thực vật
sống dưới nước hoặc khu vực đầm lầy ven ao hồ, sơng suối thì việc khử trùng rất khó khăn. Để khử trùng một mẫu vật thành công, không chỉ phụ thuộc vào vào kỹ thuật khử trùng mà còn phụ thuộc vào chất khử trùng và thời gian khử trùng. Kết quả khảo sát các chế độ khử trùng đối với mẫu thân rễ cuả cây tiêu thảo lá nhăn sử dụng chất khử trùng là HgCl2 0,1% hoặc Javel ở những nồng độ và thời gian khử trùng khác nhau được trình bày trong bảng 4.1.
Bảng 3.1. Ảnh hưởng của loại và thời gian khử trùng đến hiệu quả khử trùng sau 2
tuần theo dõi
Chất khử trùng Số lượng mẫu Thời gian khử trùng (phút) Tỷ lệ mẫu nhiễm (%) Tỷ lệ mẫu chết (%) Tỷ lệ mẫu sống vô trùng (%) HgCl2 0,1% 150 05 20,7 1,3 78,0 HgCl2 0,1% 150 10 3,3 2,0 94,7 HgCl2 0,1% 150 15 2,7 4,7 92,7 Javel 25% 150 05 86,0 0,0 14,0 Javel 25% 150 10 61,3 8,7 30,0 Javel 25% 150 15 40,7 34,0 25,3 Javel 50% 150 05 75,3 15,3 9,3 Javel 50% 150 10 43,3 52,0 4,7 Javel 50% 150 15 8,0 92,0 0,0
28
Từ kết quả bảng 4.1 cho thấy, loại chất khử trùng và thời gian chất khử trùng ảnh hưởng khác nhau qua từng nghiệm thức. Chất khử trùng HgCl2 0,1% cho thấy hiệu quả khử trùng tốt hơn Javel ở tất cả các nghiệm thức được khảo sát. Với các nghiệm thức sử dụng Javel có tỷ lệ nhiễm trên 40% ở 5 nghiệm thức được khảo sát. Việc gia tăng nồng độ hoặc thời gian khử trùng bằng Javel làm giảm tỷ lệ nhiễm này xong lại gây tình trạng chết mẫu, mẫu bị trắng trong sau thời gian theo dõi, đặc biệt là ở nghiệm thức Javel 50% khử trùng trong 15 phút có mẫu chết chiếm 92%. Các nghiệm thức sử dụng HgCl2 0,1% làm chất khử trùng có tỷ lệ mẫu nhiễm tỷ lệ nghịch với thời gian khử trùng. Trong đó, nghiệm thức với thời gian khử trùng là 10 và 15 phút có tỷ lệ mẫu nhiễm lần lượt là 3,3% và 2,7%. Hai nghiệm thức này cũng có tỷ lệ mẫu sống vô trùng đạt cao nhất lần lượt là 94,7% và 92,7%. Căn cứ trên các số liệu ghi nhận cho thấy chất khử trùng là HgCl2 0,1% thích hợp để sử dụng khử trùng mẫu cấy thân rễ cây tiêu thảo lá nhăn với thời gian khử trùng là 10 phút.
3.2 Ảnh hưởng của cytokinin lên sự phát sinh chồi của cây thủy sinh tiêu thảo lá
nhăn Cryptocoryne wendtii in vitro
Cytokinin kích thích phân chia tế bào mạnh mẽ, ảnh hưởng rõ rệt lên sự phân hóa cơ quan của thực vật, đặc biệt là phân hóa chồi. Từ lâu người ta đã chứng minh rằng sự cân bằng tỉ lệ giữa auxin và cytokinin có ý nghĩa rất quyết định trong q trình phát sinh hình thái của mơ ni cấy in vitro. Cytokinin đã được chứng minh tác động lên quá trình ngủ đơng của các chồi, kích thích nảy mầm và hình thành mơ mạch, mở rộng lá mầm ở nhiều các thực vật (Mok và Mok, 1994). [13]
Vật liệu ni cấy trong phịng thí nghiệm là các cây con tiêu thảo lá nhăn
Cryptocoryne wendti in vitro có độ dài khoảng 1 – 1,5 cm và cấy vào mơi trường MS
29
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của BA và kinetin lên sự phát sinh chồi của cây thủy sinh tiêu
thảo lá nhăn Cryptocoryne wendtii in vitro
Ghi chú: Các giá trị trong bảng là giá trị trung bình, các số liệu trong cùng một cột có các chữ cái theo sau có sự khác biệt ý nghĩa thống kê “**”: khác biệt rất có ý nghĩa ở mức 0,01. “*”: khác biệt
rất có ý nghĩa ở mức 0,05.
Từ kết quả bảng 4.2 cho thấy, cytokinin gây phân hóa chồi rõ rệt qua nghiệm thức giữa BA và Kinetin. Nghiệm thức bổ sung BA cho thấy số lượng chồi mới hình thành đều cao hơn nghiệm thức đối chứng. Tăng nồng độ BA gây tác động tích cực đến số lượng chồi mới được hình thành, trong đó nghiệm thức bổ sung BA với nồng độ 2,0 mg/l hình thành chồi mới cao nhất (3,8 chồi/ mẫu).
Các nghiệm thức khác bổ sung Kinetin nồng độ từ 0,5 – 2,0 mg/l đều hình thành chồi mới, tuy nhiên tăng nồng độ Kinetin khơng tác động đến tăng số lượng chồi mới hình thành bên cạnh đó số chồi thay đổi khơng nhiều so với nghiệm thức đối chứng. Số chồi hình thành cao nhất ở nồng độ Kinetin 1,5 mg/l với 1,3 chồi.
Nghiệm thức Số chồi mới hình thành Số lá mới hình thành Chiều cao(cm) 0 1,0d 4,5c 14,0bc B0,5 1,5bcd 7,1a 11,5d B1 1,9b 7,1a 11,8d B1,5 1,7bc 7,0a 11,8d B2 3,8a 6,9a 12,4cd K0,5 1,0d 5,3ab 14,7bc K1 1,1d 5,3b 18,5a K1,5 1,3cd 5,9b 17,8aa K2 1,2cd 5,6b 15,3b F 31,7** 31,6** 18,6** CV% 84,1 27,0 34,4
30
Từ kết quả trên cho thấy BA tác động tích cực đến sự hình thành chồi trên cây thủy sinh tiêu thảo lá nhăn Cryptocoryne wendtii.
Biểu đồ 3.1. Ảnh hưởng của BA và Kinetin lên sự phát sinh chồi của cây thủy sinh
tiêu thảo lá nhăn Cryptocoryne wendtii in vitro
Biểu đồ 3.2. Ảnh hưởng của BA và Kinetin lên số lá mới của cây thủy sinh tiêu thảo
lá nhăn Cryptocoryne wendtii in vitro - 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 0 B0,5 B1,0 B1,5 B2,0 K0,5 K1,0 K1,5 K2,0 Số chồi mới hình thành 0 1 2 3 4 5 6 7 8 0 B0,5 B1,0 B1,5 B2,0 K0,5 K1,0 K1,5 K2,0 Số lá mới hình thành
31
Từ biểu đồ 4.2 cho thấy, sự có mặt của cytokinin gây kích thích sự hình thành lá. Trong mơi trường MS bổ sung BA nồng độ từ 0,5 – 2,0 mg/l đều cho số lượng lá mới hình thành cao gấp 1,6 lần so với môi trường đối chứng (7,1 lá/ mẫu). Việc tăng nồng độ BA từ 0,5 – 2,0 mg/l không ảnh hưởng nhiều đến sự ức chế hình thành lá mới, ở nghiệm thức BA 2,0 mg/l có số lá mới hình thành 6,9 lá.
Mơi trường MS bổ sung Kinetin có nồng độ từ 0,5 – 1,5 mg/l tác động đến số lượng lá mới hình thành và nghiệm thức Kinetin 1,5 mg/l có số lá mới hình thành cao nhất 5,9 lá/ mẫu. Tuy nhiên nồng độ Kinetin cao 2,0 mg/l không gây ảnh hưởng đến sự hình thành lá mới ở cây thủy sinh tiêu thảo lá nhăn Cryptocoryne wendtii (5,5 lá/ mẫu).
Kết quả trên cho thấy BA và Kinetin đều tác động tích cực lên việc hình thành số lượng lá mới ở cây tiêu thảo lá nhăn Cryptocoryne wendtii nhưng BA cho số lá mới cao hơn so với Kinetin.
Biểu đồ 3.3. Ảnh hưởng của BA và Kinetin lên chiều cao của cây thủy sinh tiêu thảo
lá nhăn Cryptocoryne wendtii in vitro 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 0 B0,5 B1,0 B1,5 B2,0 K0,5 K1,0 K1,5 K2,0 Chiều cao (cm)
32
Không chỉ loại cytokinin mà nồng độ còn gây tác động đến sự sinh trưởng của cây. Dựa vào bảng 4.2 và biểu đồ 4.3 cho thấy việc bổ sung BA từ nồng độ 0,5 – 2,0 mg/l ảnh hưởng đến chiều cao của cây. Trong tất cả nghiệm thức khảo sát môi trường MS bổ sung BA, cây phát triển đồng đều. Tuy nhiên, nghiệm thức đối chứng có chiều cao cây phát triển cao nhất trong 4 nghiệm thức BA được khảo sát (14,0 cm). Trong đó nồng độ BA thấp nhất 0,5 mg/l đạt chiều cao 11,5 cm và nồng độ BA cao nhất 2,0 mg/l đạt chiều cao 12,4 cm. Căn cứ vào số liệu đã ghi nhận, môi trường MS bổ sung BA gây ức chế đến sự phát triển chiều cao của cây.
Bên cạnh đó, mơi trường MS bổ sung Kinetin nồng độ 0,5 – 2,0 mg/l cho thấy sự phát triển chiều cao rõ rệt. Việc bổ sung và tăng nồng độ Kinetin cho kết quả ở nồng độ 1,0 mg/l Kinetin có chiều cao phát triển cao nhất (18,5 cm) và có xu hướng ức chế phát triển chiều cao khi nồng độ Kinetin tăng cao. Nồng độ cao nhất Kinetin 2,0 mg/l đạt chiều cao 15,3 cm
Hình 3.1. Hình thái chồi của cây tiêu thảo lá nhăn trong môi trường bố sung BA và
33
Dựa vào các số liệu từ bảng 4.2, biểu đồ 4.1, 4.2, 4.3 và nhận xét cho thấy việc bổ sung BA vào môi trường MS tạo chồi tốt nhất ở nồng độ 2,0 mg/l, tuy nhiên nồng độ BA tăng cao khiến cây phải đối mặt với chiều cao bị ảnh hưởng. Bên cạnh đó Kinetin cũng là một loại cytokinin có khả năng phát sinh chồi nhưng khơng tốt bằng BA, mặt khác Kinetin có số lá mới và chiều cao phát triển tốt hơn. Kết quả này cũng phù hợp với nghiên cứu của Sundus Unal cùng cộng sự (2018) khi tiến hành nghiên cứu nhân giống in vitro cây thủy sinh tiêu thảo lá nhăn Cryptocoryne wendtii khi cho môi trường MS bổ sung 4mg/l BA. [26]
3.3 Ảnh hưởng của mơi trường khống lên sự tăng trưởng của chồi cây thủy sinh
tiêu thảo lá nhăn Cryptocoryne wendtii in vitro
Thành phần khống trong mơi trường ln đóng vai trị quan trọng đến sự tăng trưởng của thực vật. Trong đó ni cấy in vitro, các loại khoáng rất cần thiết cho sinh trưởng của mô và tế bào thực vật. Các chất khống bổ sung vào mơi trường ni cấy được chia thành hai loại: khoáng đa lượng và khoáng vi lượng. Tuy nhiên từng loại thực vật có nhu cầu dinh dưỡng khơng giống nhau, do đó hàm lượng và thành phần khống bổ sung vào mơi trường ni cấy được thay đổi nhằm khảo sát mơi trường khống thích hợp lên sự tăng trưởng của cây thủy sinh Cryptocoryne wendtii in vitro. Mơi trường được chọn để khảo sát thí nghiệm này là mơi trường MS, mơi ½ MS MS ½ và B5, trong đó mơi trường MS gọi là môi trường Murashige and Skoog medium một loại môi trường rất giàu chất dinh dưỡng, được ứng dụng phổ biến trong nuôi cấy mô thực vật, môi trường ni cấy mơ tế bào thực vật. MS ½, là mơi trường với thành phần khoáng đa lượng được giảm đi một nửa so với mơi trường MS và ½ MS là môi trường chứa một nửa thành phần khoáng đa lượng và vi lượng so với môi trường MS, B5 cịn gọi là mơi trường Gamborg B5 thích hợp cho việc tạo mơ sẹo và biệt hóa của các bộ phận thực vật. Vật liệu nuôi cấy là chồi cây tiêu thảo lá nhăn
Cryptocoryne wendtii in vitro có kích thước 1 – 1,5 cm được cấy vào nghiệm thức với các loại môi trường khác nhau đã được bố trí trong bảng 3.3.
34
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của mơi trường khống lên sự tăng trưởng của chồi cây thủy
sinh tiêu thảo lá nhăn Cryptocoryne wendtii in vitro.