xây dựng quy trình phát hiện và định lượng mrna e7 human papilloma virus type 16 gây bệnh ung thư cổ tử cung bằng kỹ thuật real time rt pcr

Ung thư xuất hiện khi các tế bào cổ tử cung biến đổi và phát triển bất thường một cách không kiểm soát.. Phương pháp sinh học phân tử phát hiện khoảng 10% số phụ nữ cổ tử cung CTC bình t

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN CỬ NHÂN KHOA HOC

ĐỀ TÀI:

XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÁT HIỆN VÀ ĐỊNH

LƯỢNG mRNA E7 HUMAN PAPILLOMAVIRUS TYPE 16 GÂY BỆNH UNG THƯ CỔ TỬ CUNG BẰNG KỸ THUẬT

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin chân thành cảm ơn:

Ba – mẹ là người đã sinh ra, nuôi tôi nên người, tạo mọi điều kiện để

chúng tôi có thể đến trường, thực hiện được hoài bảo của mình

Cô Lê Huyền Ái Thúy, cô Trương Kim Phượng đã tận tình hướng dẫn, truyền đạt những kiến thức giúp tôi hoàn thành tốt luận văn này

Chị Hồ Thị Thanh Thủy, anh Nguyễn Văn Hưng và các anh chị trong công ty cổ phần thương mại sản xuất và dịch vụ Việt Á đã giúp đỡ tôi

rất nhiệt tình trong suốt thời gian qua

Cuối cùng là những người bạn đã hổ trợ tôi trong suốt quá trình làm khóa luận

Xin chân thành cảm ơn tất cả mọi người.!

MỤC LỤC

Trang MỞ ĐẦU 1

PHẦN 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

I BỆNH UNG THƯ CỔ TỬ CUNG 4

I.1 Định nghĩa 4

I.2 Sinh bệnh học 4

I.3 Tác nhân gây bệnh ung thư cổ tử cung 5

I.3.1 Tác nhân gây bệnh 5

I.3.2 Đặc điểm của HPV 6

I.4 Tình hình ung thư cổ tử cung trên thề giới và Việt Nam 8

I.4.1 Tình hình trên thế giới 8

I.4.2 Tình hình ở Việt Nam 9

II CÁC PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN UNG THƯ CỔ TỬ CUNG 9

II.1 Biểu hiện lâm sàn nhiễm HPV 9

II.2 Các phương pháp sàng lọc HPV 10

II.2.1 Phương pháp Pap ’s smears 10

II.2.2 Phương pháp VIA 10

II.2.3 Phương pháp VILI 11

II.2.4 Xét nghiệm HPV 11

III PHƯƠNG PHÁP REALTIME RT – PCR VÀ ỨNG DỤNG TRONG CHẨN ĐOÁN UNG THƯ CỔ TỬ CUNG 12

III.1 Phương pháp PCR 12

III.1.1 Nguyên tắc 12

III.1.2 Các thành phần trong phản ứng PCR 13

III.2 Phương pháp Realtime RT – PCR 15

III.2.1 Các khái niệm và thuật ngữ 15

III.2.2 Các kiểu phản ứng Realtime PCR 15

I.V GEN E7 mRNA 20

IV.1 Cấu trúc – chức năng 21

IV.2 Ứng dụng phương pháp Realtime RT – PCR trên gene E7 trong chẩn đoán bệnh UTCTC 22

PHẦN II: VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP 23

I VẬT LIỆU – HÓA CHẤT 23

I.1 Vật liệu sinh học 25

I.2 Hóa chất 25

I.2.1 Hoá chất dùng cho tách chiết RNA 25

I.2.2 Hoá chất dùng cho một phản ứng RT-PCR 25

I.2.3 Hoá chất dùng cho điện di trên thạch và thang DNA 25

I.2.4 Primer 26

I.2.5 Dụng cụ - thiết bị 26

II PHƯƠNG PHÁP 27

II.1 Phương pháp thiết kế primer 27

II.1.1 Các phần mềm máy tính sử dụng 27

II.1.2 Phương pháp tiến hành 27

II.2 Phương pháp tách chiết RNA 27

II.2.1 Phương pháp pha hóa chất 28

II.2.2 Phương pháp tiến hành 28

II.3 Phương pháp RT 28

II.3.1 Nguyên tắc 28

II.3.2 Cách tiến hành phản ứng RT 28

II.4 Phương pháp điện di trên gel agarose 29

II.4.1 Nguyên tắc 29

II.4.2 Pha hóa chất điện di 30

II.4.3 Phương pháp đổ gel agarose 2% 30

II.4.4 Phương pháp điện 30

II.5 Phương pháp Realtime RT – PCR 30

II.6 Phương pháp khảo sát độ nhạy của quy trình 31

PHẦN III: KẾT QUẢ - THẢO LUẬN 32

I KẾT QUẢ KHẢO SÁT PRIMER, PROBE 33

I.1 Khảo sát những đặc tính của Primer 33

I.2 Chiều dài của primer và prode 33

I.3 Thành phần Nu của các primer 34

I.4 Nhiệt độ nóng chảy của primer, probe (Tm) 34

I.5 Cấu trúc thứ cấp của primer, probe 35

II KẾT QUẢ THIẾT KẾ CHƯƠNG TRÌNH Realtime RT – PCR 35

III XÂY DỰNG QUY TRÌNH 36

III.1 Kiểm tra độ hoạt động của primer, probe bằng Realtime PCR 36

III.2 Kết quả tách chiết 37

III.3 Khảo sát nhiệt độ lai của primer 39

III.4 Khảo sát độ nhạy của primer và probe 40

IV ỨNG DỤNG QUY TRÌNH TRÊN MẪU BỆNH PHẨM 41

PHẦN IV KẾT LUẬN – ĐỀ NGHỊ 44

I KẾT LUẬN 45

II ĐỀ NGHỊ 45

TÀI LIỆU THAM KHẢO 46

PHỤ LỤC 52

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình1: Ba giai đoạn tăng truởng bất thường của tế bào 4

Hình 2: Human papillomavirus 5

Hình 3: Bộ gen HPV 7

Hình 4: Tỷ lệ tử vong ung thư cổ tử cung chia theo lứa tuổi trên 100000 phụ nữ 8

Hình 5: Số ca ước tính và tỷ lệ mắc ung thư cổ tử cung 9

Hình 6: Nguyên lý hoạt động của molecular becon 17

Hình 7: Nguyên lý hoạt đông của SYRB Green1 18

Hình 8: Nguyên lý hoạt động của Prode đôi 19

Hình 9: Nguyên lý hoạt động của prode thủy giải 20

Hình 10: Lược đồ tiêu biểu của protein E7 21

Hình 11: Thang 100bp, mở đầu là 100bp, kết thúc là 1000bp 22

Hình 12: Lược đồ kết quả khảo sát DNA trong mẫu 26

Hình 13: Lược đồ kết quả khảo sát DNA trong mẫu sau khi đã xử lý DNase 1 37

Hình 14: Lược đồ kết quả sau khi đặt phản ứng Realtime PCR 38

Hình 15: Lược đồ kết quả khảo sát độ nhạy 39

Hình 16: Kết quả điện di sau khi thực hiện phản ứng PCR 40

Hình 17: Lược đồ kết quả sau khi ứng dụng quy trình ở 20 mẫu 41

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1: Trình tự primer trên gen E7 33

Bảng 2: Chiều dài của các Primer 33

Bảng 3: % GC của primer 34

Bảng 4: Nhiệt độ nóng chảy của primer 34

Bảng 5: Năng lượng của cấu trúc kẹp tóc 35

Bảng 6: Năng lượng của cấu trúc dimer 35

Bảng 7: Kết quả tiến hành trên 5 mẫu 38

Bảng 8: Kết quả khảo sát DNA trong mẫu sau khi đã xử lý DNase 1 39

Bảng 9: Kết quả ứng dụng quy trình trên 20 mẫu bệnh phẩm 43

Taq Thermus aquaticus

DNA deoxyribonucleic acid

cDNA complementary DNA

RNA ribonucleic acid

EDTA ethylenediaminetetraacetic acid

TAE tris acid – EDTA

RT – PCR Reverse transcription – polymerase chain reasion

Ta annealing Temperature (nhiệt độ lai)

Tm melting Temperature (nhiệt độ nóng chảy)

WHO World Health Organization (tổ chức y tế thế giới)

UTCTC ung thư cổ tử cung

BLAST basic local alignment search tool

NCBI National Central for Biotechnology Information

(Trung tâm thông tin công nghệ sinh học quốc gia)

IDT Intergrated DNA Technology (công ty IDT)

bp base pair (cặp base)

UV ultraviolet (tia cực tím)

Pp phương pháp

Fp Foward primer

Rp Reverse primer

MỞ ĐẦU

UTCTC cho đến nay vẫn là một vấn đề sức khỏe đối với phụ nữ trên toàn cầu, đặc biệt là các phụ nữ đang sống ở các nước đang phát triển Theo con số thống kê trên toàn cầu mỗi năm có đến 452.000 ca mới mắc UTCTC Gần 80% các trường hợp ung thư mới này tập trung ở các nước đang phát triển, nơi mà chương trình tầm soát UTCTC chưa hoạt động có hiệu quả Ở các quốc gia đang phát triển, UTCTC có tỉ lệ mắc bệnh đứng thứ nhì sau ung thư vú và là nguyên nhân gây tử vong hàng đầu ở phụ nữ Trên thế giới mỗi năm, UTCTC đã lấy đi mạng sống của 231.000 phụ nữ và hơn 80% số này diễn ra ở các nước đang phát triển Theo số liệu của WHO, có đến 50% các trường hợp UTCTC xảy ra ở châu Á [49]

Ở Việt Nam nếu chỉ tính riêng UTCTC thì số người chết vì HPV đã cao hơn nhiều so với HIV Trong 10 năm qua có khoảng 6.000 phụ nữ chết vì UTCTC cao gấp đôi so với phụ nữ chết vì HIV/AIDS; mặc dù khác với HIV, các tổn thương do HPV, thậm chí ung thư do HPV có thể chữa khỏi hoàn toàn nếu được phát hiện sớm Tuy nhiên thực tế ở Việt nam, phần lớn bệnh nhân ung thư cổ tử cung chỉ được phát hiện ở giai đoạn cuối, vài năm trước khi qua đời.[45]

Hầu hết tất cả các ca UTCTC đều có liên quan Human papillomavirus (HPV), một loại virus có DNA đặc thù theo mô dễ lây lan rộng rãi Hiện vẫn không

có thuốc điều trị đặc hiệu cho nhiễm HPV [34,15,6] HPV là một tổ hợp các chủng

vi rút khác nhau [13] Người ta biết tới hơn 100 loại HPV, trong đó hai type HPV nguy cơ cao có liên quan tới khoảng 70% tất cả các ca ung thư cổ tử cung: HPV-16

và -18.[ 4,37]

Ung thư cổ tử cung có thể phòng tránh được nếu phát hiện sớm được các tổn thương tiền ung thư và điều trị [51]

Với những điều nêu trên chúng tôi tiến hành: “xây dựng quy trình phát

hiện và định lượng E7 mRNA Human papillomavirus type 16 gây bệnh ung thư cổ tử cung bằng kỹ thuật Realtime RT – PCR ”

Nội dung chính của đề tài bao gồm:

- Thiết kế và đánh giá các primer, probe chuyên biệt cho E7 mRNA của HPV type 16

- Xây dựng quy trình Real time RT – PCR nhằm phát hiện và định lượng E7 mRNA của bệnh nhân nhiễm HPV type 16

- Thử nghiệm quy trình Realtime RT-PCR trên bệnh phẩm

PHẦN I:

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

I BỆNH UNG THƯ CỔ TỬ CUNG

I.1Định nghĩa : [60]

UTCTC là những tổn thương ác tính phát triển tại cổ tử cung Ung thư xuất hiện khi các tế bào cổ tử cung biến đổi và phát triển bất thường một cách không kiểm soát Ung thư cổ tử cung tiến triển bằng cách có thể xâm lấn tại chỗ hay lan rộng đến những cơ quan khác của cơ thể và gây tử vong Nhiễm lâu dài virus papilloma (HPV) là điều kiện cần để dẫn đến ung thư cổ tử cung Theo nghiên cứu của Cơ quan Quốc tế nghiên cứu về ung thư thì 99,7% các trường hợp ung thư cổ

tử cung có sự hiện diện của Human Pappiloma Virus (HPV) type nguy cơ cao

Hình 1: Ba giai đoạn tăng trưởng bất thường của tế bào

I.2 S inh bệnh học:[57]

Tân sinh trong biểu mô cổ tử cung hay nghịch sản cổ tử cung (thường được

viết tắt là CIN, theo tiếng Anh Cervical Intraepithelial Neoplasia) chỉ những thay

đổi của niêm mạc cổ tử cung có tiềm năng ác tính nhưng chưa có sự xâm nhập vào

mô đệm Đa số hiện tượng này xuất hiện ở vùng chuyển tiếp giữa biểu mô lát và biểu mô tuyến (hay biểu mô trụ) của cổ tử cung Đây là vùng thường xuyên biến đổi và rất nhạy cảm với những thay đổi của môi trường xung quanh nó Từ tân sinh trong biểu mô cổ tử cung có thể sẽ diễn tiến thành ung thư tại chỗ, rồi ung thư xâm lấn cổ tử cung

I.3 Tác nhân gây bệnh ung thư cổ tử cung:

I.3.1 Tác nhân gây bệnh: [2,38]

Human papillomavirus là tác nhân chủ yếu gây ra các ca UTCTC Human papillomaviruses là những virus có DNA mạch đôi, vòng nhỏ, thuộc họ Papovaviridae Có hơn 100 type HPV khác nhau đã được xác định, trong đó 40

type được biết là gây nhiễm qua đường tình dục

Hình 2: Human papillomavirus

Papillomaviruses được Giuseppeffo Ciu mô tả lần đầu tiên vào năm 1907, nhưng HPV vẫn chưa đươc nghiên cứu rộng rãi cho đến khi Khoa Virut học có mặt vào năm 1970

HPV được phân loại bao gồm : nguy cơ cao và nguy cơ thấp Những type HPV nguy cơ thấp, như là 6 và 11, gây ra những tổn thương nhẹ với nguy cơ phát triển thành ác tính là thấp Trái lại, HPVs nguy cơ cao có gene gây ung thư tiềm ẩn

Khoảng 90% ung thư trong thượng mô cổ tử cung (CIN) mức độ cao có chứa DNA HPV nguy cơ cao, với type HPV 16 phổ biến nhất, theo sau là type 18,

31, 33 và 45 [30] Trong đó, type 16 chiếm khoảng 50 – 70 %, còn type 18 là 7 –

mã hóa gọi là “vùng điều hòa ngược” hay “vùng kiểm soát dài” Sản phẩm gene được chia ra bao gồm protein “sớm” và “trễ” phụ thuộc vào thời điểm biểu hiện

trong suốt chu kỳ sống của virus

Những phân tử quyết định cho sự sao chép của virus là E6 và E7, với chức năng làm bất hoạt sản phẩm của hai gene đàn áp khối u là p53 và pRb Cả hai gen gây ung thư này đều gây ra sự tăng nhanh, sự bất tử và những thay đổi ác tính của những tế bào bị nhiễm Hoạt động của E6 là chất đàn áp apoptosis và làm trung gian cho sự sống sót của những tế bào bị hư hại nghiêm trọng, trong khi chức năng của E7 như là một chất hoạt hóa cho sự sao chép và sự tăng trưởng của tế bào Cả hai có thể làm bất tử tế bào người một cách độc lập, nhưng chức năng chung là tạo

ra hiệu quả bổ trợ và bổ sung nhau, gây ra sự tăng lên rõ ràng trong hoạt động biến đổi

Hình 3: Cấu trúc bộ gene HPV type 16

Sự tiến triển từ nhiễm HPV thành ung thư cổ tử cung: [4,32,33]

Ung thư cổ tử cung bắt nguồn từ nhiễm HPV Hầu hết các viêm nhiễm đều

tự biến mất mà không hề có triệu chứng, nhưng viêm nhiễm kéo dài với các loại có nguy cơ cao có thể dẫn đến bị các bất thường tiền UTCTC và gây nên các tổn thương trong biểu mô cổ tử cung độ thấp Trong số các phụ nữ nhiễm các loại HPV nguy cơ cao, khoảng từ 5% đến 10% sẽ chuyển thành viêm nhiễm HPV kéo dài và

vì vậy làm tăng nguy cơ xuất hiện các tổn thương tiền ung thư ở cổ tử cung Nếu không được điều trị, các tổn thương tiền ung thư này sẽ tiến triển thành ung thư cổ

tử cung xâm lấn

Cả ung thư và tiền ung thư thường xuất hiện ở “khu vực ranh giới” ở cổ tử cung, và tiến triển mạnh hơn trong thời kỳ dậy thì và mang thai Thông thường, các lớp trên cùng của biểu mô cổ tử cung chết đi và bong ra, và các tế bào mới lại tiếp tục được sản sinh Tuy nhiên, đối với viêm nhiễm HPV kéo dài, thì tiến trình này bị ngắt quãng; các tế bào có xu hướng tiếp tục sản sinh, trước tiên sẽ trở thành bất thường (tiền ung thư), và sau đó sẽ xâm lấn tới các biểu mô phía dưới (ung thư xâm lấn) Vì sự tiến triển từ nhiễm HPV đến ung thư xâm lấn là rất chậm, thường kéo dài hàng chục năm, cho nên chúng ta thường gặp ở phụ nữ ở độ tuổi 40 và 50 Tham khảo hình 4 về tỷ lệ tử vong do ung thư cổ tử cung theo độ tuổi.[15 – 19 ]

Hình 4: Tỷ lệ tử vong ung thư cổ tử cung chia theo lứa tuổi trên 100000 phụ nữ

I.4 Tình hình bệnh ung thư cổ tử cung trên thế giới và ở Việt Nam:

I.4.1 Tình hình bệnh trên thế giới: [1,20,21,24,25]

Trên toàn thế giới, hằng năm có trên 250 ngàn phụ nữ tử vong vì căn bệnh

nhiễm và tỷ lệ tử vong là cao nhất (hình 5)

Nhìn tổng thể, tỷ lệ tử vong tại các nước đang phát triển cao gấp 4 lần tại các nước công nghiệp; 80% đến 85% ca tử vong do ung thư cổ tử cung xảy ra tại các nước đang phát triển Ở các vùng này, ung thư cổ tử cung thường xảy ra ở những phụ nữ có nhiều con, và họ chết đi đã kéo theo sự ảnh hưởng rất lớn đến xã hội của cộng đồng nơi họ sinh sống

Theo điều tra của cơ quan nghiên cứu ung thư quốc tế, tỷ lệ nhiễm HPV của phụ nữ toàn cầu dao động trong khoảng 9 –13 %, nghĩa là cứ 10 phụ nữ thì có 1 người

bệnh đã được thực hiện khá lâu, căn bệnh này vẫn rất phổ biến ở các nước thuộc thế giới thứ ba

Hình 5: Số ca ước tính và tỷ lệ mắc ung thư cổ tử cung

I.4.2 Tình hình bệnh ở Việt Nam:[49]

Ở Việt Nam, KCTC chiếm tỉ lệ 53,5% các loại ung thư ở nữ giới WHO ước tính tỉ

lệ KCTC ở phụ nữ Việt Nam từ 16 đến 24/100.000 Theo các con số thống kê ở Hà Nội

và TP HCM 1996 – 1999 tỉ lệ mắc chuẩn theo tuổi tính trên 100000 dân lần lượt là 5.5 và 26.0 [53] Như vậy tỉ lệ ung thư cổ tử cung ở TP HCM tương đối cao nếu đem so sánh với thống kê ở Mỹ (SEER) là 7.5

Tỉ lệ mắc dao động từ năm 2000 đến 2006 tại Việt Nam là 6,9 -10,1/100.000 dân Theo nghiên cứu của Viện Ung Thư, tại Hà Nội, tỉ lệ mắc từ 7 – 10/100.000 dân,TP Hồ Chí Minh là 25,2/100.000 dân Như vậy, UTCTC ở miền Nam cao gấp

Xuất hiện u sùi mào gà quanh vùng hậu môn, sinh dục cả nam và nữ, thường

do HPV-6, 11 gây nên, không dẫn đến ung thư Bệnh có thể tự khỏi hoặc tồn tại và tăng số lượng và kích thước u sùi Khi những u sùi này chuyển sang màu nâu đậm hoặc đỏ gạch, lúc này tế bào đã bắt đầu chuyển dạng (đặc biệt đối với HPV-16, 18) HPV có thể xâm nhập một cách “lặng lẽ”, người bị nhiễm không có triệu chứng lâm sàng, phần lớn tế bào ở vùng bị nhiễm bình thường Phương pháp sinh học phân tử phát hiện khoảng 10% số phụ nữ cổ tử cung (CTC) bình thường có sự hiện diện của DNA HPV HPV gây nhiễm dạng này chủ yếu thuộc nhóm nguy cơ thấp như HPV-6/11 và một số type khác

HPV xâm nhiễm vào cơ thể và có biểu hiện lâm sàng, chủ yếu do các type thuộc nhóm “nguy cơ cao”, gây biến đổi tế bào về mặt hình thái và cấu trúc Những

tế bào mẫn cảm với virus chủ yếu ở vùng sinh dục, đặc biệt là CTC Tuy nhiên không phải nhiễm HPV là có UTCTC, nhiễm HPV thuộc bất cứ type nào cũng có khả năng tự khỏi và không để lại di chứng Tổn thương dị sản hay UTCTC cần có một thời gian khá dài phát triển tại biểu mô, dị sản hay ung thư tại chỗ… Thời gian trung bình được tính là 10-20 năm, đây chính là điểm thuận lợi để tầm soát UTCTC

II.2 Các phương pháp sàn lọc HPV :

II.2.1Phương pháp Pap’s smears: [45]

Năm 1949 George Papanicolaou đã đưa ra một phương pháp tế bào học phát hiện những bất thường của tế bào biểu mô CTC để phát hiện sớm UTCTC, được gọi là Pap’s smear Nguyên lý dựa trên tính chất bong ra một cách tự nhiên, liên tục của tế bào âm đạo, CTC, đặc biệt là các tế bào bất thường thì tính bong sớm và rất dễ bong

Phân tích hình thái học chi tiết người ta cho rằng dấu hiệu của tế bào bị nhiễm HPV là sẽ bị biến đổi thành các dạng tế bào đa nhân, tế bào đa nhân khổng

lồ, hoặc nhân teo lại, hay có thể tìm thấy tế bào bóng, tế bào có vòng sáng quanh nhân….Phương pháp PAP’s smear có độ nhạy 44-78% và độ đặc hiệu cao 91-96%

Tuy nhiên phương pháp này cũng có tỉ lệ âm tính giả, theo các báo cáo thì tỉ lệ này dao động từ 1,1 -29,7%

II.2.2Phương pháp VIA: [3,5,9,28]

Dung dịch axít axêtic 3% đến 5% (dấm) được bôi lên cổ tử cung bằng cách xịt lên bề mặt hoặc thấm vào cục g ̣òn để bôi và quan sát cổ tử cung bằng mắt thường sau 1 phút Nếu quan sát thấy các vùng bị trắng gần với khu vực chuyển tiếp th́ xét nghiệm này được coi là dương tính đối với các thay đổi tế bào tiền ung thư hoặc ung thư xâm lấn sớm

Ưu điểm: Phương pháp VIA không đòi hỏi phải có phòng xét nghiệm hay nhân viên được đào tạo chuyên sâu Kết quả cho thấy ngay lập tức, cho phép điều trị ngay trong lần tới khám và vì vậy giảm tỷ lệ không được điều trị do khách hàng không đến khám lại Độ nhạy của VIA tốt bằng hoặc tốt hơn độ nhạy của Pap’s smear

Nhược điểm: Kiểm tra bằng mắt thường là rất chủ quan, và cần phải giám sát để kiểm soát chất lượng của các phương pháp kiểm tra bằng mắt thường

II.2.3Phương pháp VILI(dung dịch Iot Lugol: [5]

VILI cũng tương tự như VIA nhưng có bôi dung dịch iốt Lugol lên cổ tử cung và sau đó kiểm tra xem có vùng nào không bám màu

Ưu điểm: Cho kết quả nhanh

Nhược điểm: Số liệu về độ nhạy và độ đặc hiệu của phương pháp VILI vẫn còn hạn chế và cần có các nghiên cứu thêm về tính chính xác của phương pháp VILI

II.2.4 Xét nghiệm DNA HPV: [7]

Lấy mẫu tế bào từ cổ tử cung hoặc âm đạo bằng một bàn chải nhỏ hoặc tăm bông Sau đó, bệnh phẩm được đưa tới phòng xét nghiệm để xử lý tiếp

Ưu điểm: Phương pháp này không mang tính chủ quan

Xét nghiệm Hybrid Capture® 2 (hc2): [13,23,29]

Xét nghiệm phát hiện DNA HPV bằng phương pháp Hybrid Capture® 2, do Hăng Digene phát triển, hiện là xét nghiệm HPV duy nhất được Cơ quan Lương

thực và Dược phẩm Liên bang (FDA) của Mỹ cho phép dùng trong lâm sàng Xét nghiệm hc2 có thể phát hiện 13 loại HPV

Nhược điểm: Xét nghiệm này đòi hỏi phải có cơ sở vật chất về xét nghiệm, trang thiết bị đặc biệt, và nhân viên được đào tạo; mất khoảng từ 6-8 tiếng để có kết quả; và đòi hỏi phải đến lại cơ sở y tế để lấy kết quả và điều trị

Nhược điểm: Nhân viên phải được đào tạo thực hiện và máy soi cổ tử cung

có thể rất đắt, và phức tạp

Ngày nay nhờ sự phát triển của sinh học phân tử, đặc biệt là kỹ thuật PCR cho phép nhận biết chính xác có nhiễm HPV hay không và nhiễm type nào để tìm thấy nguy cơ cao hay thấp có khả năng dẫn đến UTCTC.:

III PHƯƠNG PHÁP PCR VÀ ỨNG DỤNG TRONG CHẨN ĐOÁN BỆNH UNG THƯ CỔ TỬ CUNG :

III.1 Phương pháp PCR:

III.1.1 Nguyên tắc:[44]

Tất cả các DNA polymerase khi hoạt động tổng hợp mới từ một mạch DNA mới từ mạch khuôn đều cần có sự hiện diện của những mồi chuyên biệt Mồi là những đoạn oligonucleotide có khả năng bắt cặp bổ sung với đầu 3’ của mạch

khuôn DNA polymerase sẽ nối dài mồi để hình thành mạch mới Phương pháp PCR được hình thành dựa trên đặc tính đó của DNA polymerase Phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm ba bước:

- Bước 1 : giai đoạn biến tính (denaturation), phân tử DNA được biến tính ở

nhiệt độ cao hơn Tm của phân tử, thường là 94 – 950C trong vòng 30 giây – 1 phút

- Bước 2 : giai đoạn lai (hybridization), nhiệt độ được hạ thấp (thấp hơn Tm

của các mồi) cho phép các mồi bắt cặp với khuôn, nhiệt độ từ 40 – 700C, tùy thuộc

Tm của các mồi sử dụng và kéo dài từ 30 giây – 1 phút

- Bước 3 : giai đoạn kéo dài (elongation), nhiệt độ tăng lên đến 720C, giúp cho DNA polymerase tổng hợp mạch khuôn, tùy thuộc độ dài DNA cần khuếch đại thời gian từ 30 giây đến nhiều phút

III.1.2 Các thành phần trong phản ứng PCR:[50]

❖ DNA bản mẫu:

Phản ứng khuếch đại tối ưu xảy ra trên DNA thật tinh sạch nhưng nhiều kỹ thuật chẩn đoán bằng PCR vẫn đạt kết quả tốt với DNA thu nhận trực tiếp từ dịch chiết tế bào

❖ Mồi và nhiệt độ lai:

Mồi là những đoạn oligonucleotide ngắn (17 – 30Nu) có khả năng bắt cặp

bổ sung đặc hiệu với DNA bản mẫu Mồi là chỉ tiêu quan trọng nhất để đạt được môt sự khuếch đại đặc trưng và có hiệu quả cao Việc chọn mồi là giai đoạn quyết định của phương pháp PCR, và phải tuân thủ một số nguyên tắc:

- Không có sự bắt cặp bổ sung giữa mồi “xuôi” và mồi “ngược”, và cũng không có cấu trúc “kẹp tóc” do sự bắt cặp bổ sung giữa các phần khác nhau của một mồi

- Tm của mồi xuôi và mồi ngược không cách biệt quá xa Thành phần nucleotide của các mồi cân bằng tránh các cặp GC lặp đi lặp lại nhiều lần

- Các mồi chọn phải đặc trưng cho trình tự DNA cần khuếch đại, không trùng với trình tự lặp lại trên gene

- Trình tự nằm giữa hai mồi xuôi và mồi ngược không quá lớn, phản ứng PCR

sẽ ưu tiên trên những trình tự nhỏ hơn 1 kb

❖ dNTP:

Bốn loại nucleotide (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) thường được sử dụng ở nồng độ 20 – 200 μM/mỗi loại nuceotide

❖ Dung dịch đệm cho phản ứng PCR (PCR buffer):

Dung dịch đệm có tác dụng cung cấp lực ion (ionic strength) cần thiết cho phản ứng PCR xảy ra Nồng độ pH của dung dịch đệm cũng như dồng độ KCl tối

ưu thường tuỳ thuộc vào nguồn DNA polymerase sử dụng Một dung dịch đệm điển hình cho phản ứng PCR chứa 50 mM KCl, 10 mM Tris – HCl, pH 8,3 ở nhiệt

❖ Taq polymerase:

Enzyme được sử dụng là DNA polymerase chịu nhiệt được tách chiết từ một

vi khuẩn suối nước nóng, Thermus aquaticus Enzyme Taq polymerase không bị

phá hủy ở nhiệt độ biến tính và xúc tác sự tổng hợp từ đầu đến cuối quá trình phản

ứng Với một phản ứng PCR 25 μl – 50 μl thông thường Taq polymerase được sử

dụng với một liều lượng nằm trong giới hạn 0,5 – 2,5 đơn vị

❖ Các chất tăng cường:

Giúp phản ứng PCR xảy ra hiệu quả hơn Nhưng nếu dùng với liều lượng không thích hợp, các chất này sẽ có tác dụng ngược lại, ảnh hưởng không tốt đến

phản ứng PCR Các chất tăng cường thường là: betain, DMSO (dimethinsulfoxide),

glycerol…

❖ Phương pháp RT – PCR:

Là phản ứng PCR, trước đó có thêm bước RT để chuyển RNA thành cDNA

III.2 Phương pháp Realtime RT – PCR :

III.2.1Các khái niệm và các thuật ngữ:

- Chu kỳ ngưỡng (threshold cycle): Khái niệm chu kì ngưỡng (Ct) là khái niệm trung tâm của kỹ thuật real-time PCR Chu kì ngưỡng của một mẫu được định nghĩa là chu kì mà tại đó tín hiệu phát huỳnh quang của mẫu vượt trên tín hiệu huỳnh quang nền của phản ứng PCR và được các thiết bị cảm biến ghi nhận

- Reoporter dye: là một phân tử flourescent được dùng để xác định lượng sản phẩm PCR tạo ra

- Quencher: là một phân tử dùng để hấp thụ năng lượng từ reporter dye ở trạng thái bị kích thích

- Amplification curve: cho biết tín hiệu huỳnh quang phát ra tại từng chu kỳ phản ứng PCR

III.2.2 Các kiểu phản ứng của kỹ thuật real-time:[52]

Hiện nay có bốn kiểu phản ứng được sử dụng trong kỹ thuật real-time với độ nhạy tương đương Cả bố phương pháp đều sử dụng các chất nhuộm phát huỳnh quang (fluorescent dye), có sự kết hợp bước nhân bản và phát hiện sản phẩm PCR mục tiêu nhằm theo dõi hàm lượng sản phẩm PCR mục tiêu theo thời gian thật (real time) của phản ứng Phương pháp đơn giản nhất là sử dụng một chất hóa học phát huỳnh quang có khả năng gắn vào mọi phân tử DNA mạch đôi Ba phương pháp còn lại sử dụng các probe có đánh dấu bằng chất phát huỳnh quang để lai đặc hiệu với sản phẩm PCR mục tiêu

❖ Molecular beacon:

Đây là loại probe có cấu trúc dạng vòng và cuống (stem and loop structure), trong đó cấu trúc dạng vòng bắt cặp bổ sung đặc hiệu với trình tự nucleic acid mục

tiêu Phần cấu trúc dạng cuống (stem) của phân tử probe được hình thành từ các liên kết hydro giữa các base bắt cặp bổ sung nằm ở hai đầu mút của probe Một chất hóa học phát huỳnh quang được gắn vào một đầu của probe và một chất hóa học khác (quencher) có nhiệm vụ “dập tắt” được gắn ở đầu bên kia Quencher là một chất màu không phát huỳnh quang có nhiệm vụ làm tiêu giảm năng lượng mà

nó nhận được từ chất phát huỳnh quang dưới dạng nhiệt và vì thế không cho ánh sáng huỳnh quang nào được phát ra Trong dung dịch phản ứng, một beacon ở trạng thái tự do sẽ có cấu trúc dạng vòng và cuống Lúc đó, phần cấu trúc dạng cuống làm cho hai đầu của probe ở gần với nhau trong không gian, lúc đó quencher sẽ phát huy tác dụng và ngăn cản sự phát huỳnh quang của chất phát huỳnh quang

Khi probe bắt cặp bổ sung với một mạch của trình tự DNA mục tiêu ở nhiệt

độ lai của phản ứng thì probe mất cấu trúc dạng vòng và cuống trở thành dạng thẳng Điểu này làm gia tăng khoảng cách không gian giữa chất phát huỳnh quang

và quencher Chất phát huỳnh quang lúc đó sẽ phát ánh sáng mà các thiết bị có thể tiếp nhận và phân tích Nếu beacon không bắt cặp bổ sung hoàn toàn với trình tự DNA thì sự lai giữa beacon và trình tự DNA sẽ không xảy ra và vì thế không có sự phát ánh sáng huỳnh quang Sở dĩ như vậy là vì, về mặt nhiệt động học, sự hình thành cấu trúc kẹp tóc ở beacon thuận lợi hơn là sự hình thành phân tử lai không hoàn chỉnh Điều đó giải thích cho tính đặc hiệu cao của beacon

Khó khăn lớn nhất khi dử dụng probe dạng beacon chính là việc thiết kế probe Trình tự nucleotide của cấu trúc dạng cuống phải được thiết kế sao cho quencher và chất phát huỳnh quang tiếp xúc nhau Nếu không thì một phần ánh sang huỳnh quang sẽ được phóng thích một cách không đặc hiệu, làm gia tăng mức

độ tín hiệu nền (background signal) của phản ứng dẫn đến việc sai lệch trong đánh giá kết quả định lượng Ngược lại, nếu các liên kết trong cấu trúc dạng cuống của phân tử quá mạnh thì beacon sẽ khó bắt cặp với trình tự DNA mục tiêu và tín hiệu huỳnh quang phát ra cũng không phản ánh đúng hàm lượng sàn phẩm PCR có trong phản ứng, Vì vậy, tìm thế cân bằng giữa một cấu trúc ổn định và khả năng bắt cặp với trình tự DNA mục tiêu là điều quan trọng khi thiết kế một beacon

Hình 6: Nguyên lý hoạt động của molecular beocon

❖ Chất nhuộm gắn với DNA mạch đôi:

Chất nhuộm này gắn vào mọi phân tử DNA mạch đôi Khi ở trạng thái tự do, chất nhuộm không phát huỳnh quang nhưng sau khi đã gắn vào DNA mạch đôi thì phát huỳnh quang và cường độ huỳnh quang phát ra tỉ lệ thuận với hàm lượng DNA

có trong phản ứng PCR Các chất nhuộm phát huỳnh quang thường được sử dụng là SYBR Green I, ethidium bromide Trong phản ứng PCR, các chất nhuộm sẽ gắn vào các DNA mới được tổng hợp trong bước kéo dài mạch và rời ra khi các phân

tử DNA bị biến tính trong bước biến tính Mọi DNA mạch đôi hiện diện trong phản ứng đều có khả năng bắt chất nhuộm và phát huỳnh quang nên nếu có các sản phẩm

ký sinh trong phản ứng thì sự định lượng trở nên không chính xác

Để phát hiện các sản phẩm ký sinh trong phản ứng, người ta xây dựng một đường cong “nóng chảy” (melting curve) bằng cách nâng dần nhiệt độ phản ứng và

đo giá trị cường độ ánh sáng huỳnh quang phát ra tại các thời điểm nhiệt độ khác nhau Nhiệt độ nóng chảy của phân tử DNA phụ thuộc vào số lượng và thành phần nucleotide Do đó, dựa vào đường cong “nóng chảy”, người ta có thể phát hiện sự hiện diện của các sản phẩm ký sinh và tiến hành các biện pháp khắc phục Các biện

pháp khắc phục rất đa dạng: thiết kế primer sao cho hiệu quả bắt cặp với trình tự DNA mục tiêu là tối ưu, khảo sát nồng độ các thành phần tham gia phản ứng như Taq polymerase, MgCl2, dNTP… sao cho việc nhân bản là hoàn toàn đặc hiệu

Hình 7 :Nguyên lý hoạt động của SYBR Green1

❖ Probe đôi (hybridization probe):

Phương pháp này có độ đặc hiệu rất cao do việc sử dụng cùng lúc hai probe bắt cặp với trình tự DNA mục tiêu Một probe mang ở đầu 3’ chất cho

“fluorescein” (fluorescein donor) phát ánh sang màu xanh và probe thứ hai mang ở đầu 5’ chất vận “fluorescein” (fluorescein acceptor) Probe thứ hai này được chặn

ở đầu 3’ sao cho Taq polymerase không thể kéo dài mạch từ đầu này Ánh sang huỳnh quang từ chất cho chuyển đến chất nhận thông qua hiệu ứng FRET (Fluorescent Resonance Energy Transfer - sự chuyển năng lượng huỳnh quang kiểu cộng hưởng) và chất nhận sẽ phát ra ánh sang huỳnh quang có màu đỏ (red fluorescent) Trong dung dịch phản ứng, khi hai chất cho và chất nhận cách xa nhau thì tín hiệu nền là tín hiệu huỳnh quang do chất cho phát ra Đến bước bắt cặp giữa probe với bản mẫu thì có sự sắp xếp giữa hai probe sao cho phần đầu của probe này tiếp xúc với phần cuối của probe kia Khi đó , hiệu ứng FRET xảy ra, chất nhận huỳnh quang phát ra một ánh sang huỳnh quang mới có bước sóng lớn hơn ánh

sang mà nó nhận được và sẻ phát ra tỉ lệ thuận với hàm lượng sản phẩm PCR có trong phản ứng.

Ưu điểm đáng chú ý của phương pháp này là sự thiết kế probe tương đối linh động, dễ dàng hơn so với việc thiết kế beacon

❖ Probe thuỷ giải (hydrolysis pribe):

Probe sử dụng trong phương pháp này còn có tên là Taqman (Taqman probe) Người ta dựa vào đặc tính exonuclease 5’ – 3’ của Taqpolymerase để hình thành phương pháp Probe Taqman được gắn một chất phát huỳnh quang ở đầu 5’

và một chất “dập tắt” (quencher) ở đầu 3’ sao cho ánh sang huỳnh quang của chất phát huỳnh quang bị hấp thụ bởi quencher

Trong bước bắt cặp và kéo dài mạch của một chu kỳ PCR, probe này sẽ bắt cặp với mạch bổ sung trên trình tự DNA mục tiêu Khi Taqman kéo dài mạch bổ sung từ đầu 3’ của primer đến tiếp xúc với probe, nó sẽ thể hiện hoạt tính 5’ – 3’ exconuclease và loại bỏ một số nucleotide ở đầu của probe, thay bằng những nucleotide mới Khi đó, chất phát huỳnh quang sẽ tách rời khỏi probe và quencher mất tác dụng

Tương tự như beacon, ánh sáng huỳnh quang phát ra sẽ tương ứng với hàm lượng sản phẩm PCR có trong phản ứng Taqman probe chỉ bắt cặp với mạch khuôn nếu trình tự nucleotide của hai phân tử DNA là bổ sung hoàn toàn với nhau Nếu không có sự bổ sung hoàn toàn thì Taqman probe sẽ không bắt cặp và sẽ không có tín hiệu huỳnh quang nào được phát ra

Như vậy, các sản phẩm ký sinh nếu có trong phản ứng PCR cũng không thể hiện, điều này khiến cho phản ứng PCR sử dụng Taqman probe có tính đặc hiệu cao Thông thường Taqman probe có nhiệt độ nóng chảy cao hơn cặp primer từ 8 –

100C nhằm tạo thuận lợi cho việc bắt cặp và thủy giải probe bởi Taq

polymerase

Hình9 : nguyên lý hoạt động của prode thủy giải

IV GENE E7 CỦA HPV type 16:

90% UTCTC có hiện tượng gắn chèn của DNA HPV Sự gắn chèn thường dẫn đến kết quả là mất sự biểu hiện của một số gene của HPV Khi có sự gắn chèn của HPV thì gene E6,E7 được phiên mã, và protein E7 được biểu hiện một cách phong phú

IV.1 Cấu trúc - Chức năng : [ 16,40,41 ]

⮚ Cấu trúc:

Gene E7 mã hoá cho protein phân tử lượng thấp khoảng 100 axit amin Protein E7 gồm 3 vùng bảo tồn Vùng bảo tồn 1 – đầu amin cuối cần thiết cho sự biến đổi của tế bào và làm giảm chức năng của pRb, nhưng không góp phẩn trực tiếp vào sự liên kết với pRb Vùng bảo tồn 2 chứa trình tự trung tâm LxCxE liên kết pRb đã bảo tồn và là vị trí phosphoryle hoá casein kinase I Vùng bảo tồn 3 – đầu cacboxyl cuối chứa hai bản sao C-x-x-C với khoảng 29 – 30 acid amin Vùng này có mối tương quan với pRb và những protein thuộc tế bào vật chủ khác

Hình 10 : Lược đồ tiêu biểu của protein E7.FVDGD

⮚ Chức năng:

- Gây ra bất tử cho tế bào

- Làm bất hoạt gene đàn áp khối u pRb

- Gây ra sự không ổn định của bộ gene vật chủ

❖ Sự gắn chèn của HPV vào bộ gene người:

- Cơ chế gắn chèn của HPV vẫn chưa được hiểu rõ

- Cần phải có sự đứt gãy của DNA mạch đôi ở cả HPV và vật chủ

- Bình thường trong bộ gene của HPV, gene E2 có nhiệm vụ là ức chế sự biểu hiện của E6 và E7 Khi có sự gắn chèn của bộ gene HPV thì lúc này E2 bị phá vỡ, dẫn đến E6, E7 không được kiểm soát và biểu hiện

- Khi nhiễm HPV type 16 thì HPV type 16 tồn tại như những episome Khi HPV type 16 gắn chèn vào bộ gen thuộc tế bào thì sự gắn chèn xảy ra tại vùng E1/E2 dẫn đến mRNA mã hóa gen E6 và E7 được biểu hiện (Minh họa hình 11)

Hình 11: Sự gắn chèn của HPV type 16

IV.2 Ứng dụng phương pháp Realtime RT-PCR trên gene E7 trong chẩn đoán bệnh UTCTC

Ưu điểm của phương pháp realtime RT – PCR:

- Độ đặc hiệu cao do sử dụng các mẫu dò đặc hiệu để phát hiện các sản phẩm khuếch đại

- Cho phép định lượng sản phẩm khuếch đại nhờ sử dụng các chất phát quang đặc hiệu, lượng sản phẩm khuếch đại có thể định lượng ở từng chu kỳ phản ứng

- Không cần tiến hành các thí nghiệm sau khi kết thúc các phản ứng PCR, như

chạy điện di trên gel…

Ứng dụng:

Dùng cặp mồi và probe đặc hiệu để tạo ra thật nhiều bản sao nhằm phát hiện

và định lượng sự có mặt của mRNA E7, từ đó kết luận bệnh nhân đó có bị nguy cơ

bị ung thư hay không, góp phần giúp phát hiện sớm tình trạng nhiễm bệnh của bệnh nhân và kịp thời theo dõi bệnh

PHẦN II:

VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP

I VẬT LIỆU – HÓA CHẤT:

I.1 Vật liệu sinh học:

- Vật liệu là những mẫu phết do phòng xét nghiệm 273 Nguyễn Bỉnh Khiêm, Rạch Giá - Kiên Giang cung cấp

- Các mẫu bệnh phẩm này được xác định là type 16 bằng phương pháp Reverse Dot Blot tại Công ty cổ phần thương mại, dịch vụ và sản xuất Việt Á

I.2 Hóa chất:

I.2.1 Hóa chất dùng cho tách chiết RNA:

⮚ Dung dịch 1 (trizol) : Phenol 38% guanidium thyocianate 0.8M, glycerol chỉnh về pH 4.0

⮚ Dung dich 2 : Cloroform

⮚ Dung dich 3: Isopropanol tuyệt đối có chứa chất trợ tủa

⮚ Dung dich 4: Ethanol 70%

⮚ Dung dich 5: dung dịch DEPC

I.2.2 Hóa chất dùng cho phản ứng PCR:

⮚ Taq DNA polymerase

⮚ Dung dịch đệm cho phản ứng PCR (50mM KCl, Tris Ph8 10mM)

⮚ MgCl2

⮚ dNTP

⮚ Nước cất hai lần vô trùng tuyệt đối

I.2.3 Hóa chất dùng cho điện di trên gel agarose và thang DNA

⮚ Dung dịch điện di TAE 50X (242g Tris – base, 57.1 ml glacial acetic acid, 100ml 0.5 EDTA pH8.0)

⮚ Dung dịch nạp mẫu 6X (40% glyxerol, 0.25% bromophenol blue)

⮚ Ethidium bromide (10mg/ml)

⮚ Chúng tôi dùng thang 100bp àm chuẩn, trong kỹ thuật điện di Các vạch (band) DNA có kích thước như sau:

100bp Hình 12: Thang 100bp, mở đầu là 100bp, kết thúc là 1000bp

I.2.4 Primer:

Các primer và probe sử dụng trong luận văn được tổng hợp từ công ty IDT (Integrated DNA Technology), Hoa Kỳ, trình tự cụ thể được trình bày trong phẩn kết quả và thảo luận

I.2.5 Dung cụ - thiết bị:

⮚ Pipetman 1000μl, 200μl, và các đầu tip tương ứng, eppendorf 1.5ml (đầu tip biopure có phin lọc biopure), eppendorf 0.2ml

⮚ Máy ly tâm

⮚ Máy voxtex

⮚ Máy ủ nhiệt khô

⮚ Pipetman 10μl và các đầu tip tương ứng đầu tip biopure có phin lọc biopure)

II PHƯƠNG PHÁP:

II.1 Phương pháp thiết kế primer, probe

II.1.1 Các phần mềm máy tính sử dụng:

Clustal X 1.81 (EMBL, Châu Âu)

Annhyb – 4.922, năm 2004 (Olivier Friard, Hoa kỳ)

Phần mềm trực tuyến BLAST (NCBI, Hoa Kỳ)

Phần mềm Oligo Analyzer 3.0 (IDT, Hoa kỳ)

http://scitools.idtdna.com/scitools/Applications/OligoAnalyzer/

II.1.2 Phương pháp tiến hành:

- Download các trình tự của gene E7 HPV từ ngân hàng gene NCBI

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)

- Tiến hành so sánh các trình tự trên (alignment) tìm ra các vùng bảo tồn, từ

đó chọn ra những đoạn oligonucleotide có thể làm primer, probe

- Phân tích những đoạn oligonucleotide này về các thông số Tm, chiều dài,

độ tương đồng, kích thước sản phẩm PCR bằng các chương trình BLAST, Oligo Analyzer, Annhyb Từ đó chọn ra đoạn oligo tốt nhất làm primer, probe

II.2 Phương pháp tách chiết RNA:[52]

II.2.2 Phương pháp pha hóa chất:

⮚ Phenol pH 4:

Cân 100g phenol tinh thể, để tan ở 680C Thêm vào 1 thể tích dung dịch Tris NaOH 0,5 M pH 4 Khuấy từ trong 15 phút, để yên cho hỗn hợp trên tách thành hai pha rõ rệt, huỷ bỏ pha trên Tiếp tục cho thể tích Tris HCl 0,1 M pH 4 tiếp tục khuấy từ và lập lại các thao tác trên khi pH của dung dịch phenol bằng 4

⮚ Dung dịch Trizol pH4:

Cân guanidinium thiocyanate hoà tan nước cất hai lần Tiếp theo thêm 33

ml sodium acetate 3M pH 5,4 (đã hấp khử trùng trước đó); 50 ml glycerol; 380 ml phenol pH 4 Cuối cùng bổ sung thêm nước cất hai lần cho đủ 1l

⮚ Ethanol 70%:

⮚ Pha 7 phần thể tích ethanol tuyệt đối trong 3 phần thể tích nước cất hai lần

vô trùng tuyệt đối

II.2.3 Phương pháp tiến hành:

⮚ 100μL dịch virus + 900 μL dung dịch 1, vortex đều, để yên 10 phút

⮚ Thêm 200μl dung dịch 2, trộn đều Ly tâm 13.000 v/phút trong 10

phút.600μl dịch nổi có chứa RNA vào một eppendorf sạch khác có sẵn 600 μl dung dịch 3, trộn đều, để yên 10 phút Ly tâm 13.000 phút trong v/ 10 phút

⮚ Loại dịch nổi, thu cặn màu xanh Cho từ từ 900μl dung dịch 4 vào Ly