xây dựng quy trình phát hiện và định lượng sự biểu hiện mrna e6 của human papilloma virus type 16 gây bệnh ung thư cổ tử cung bằng kỹ thuật real time rt pcr

Với kết quả đạt được ban đầu, chúng tôi nghĩ quy trình nên được thử nghiệm với một lượng bệnh phẩm lớn hơn để có thể ứng dụng quy trình trong phát hiện sớm và theo dõi tiến triển của xâm

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC



CHUYÊN ĐỀ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

ĐỀ TÀI:

XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÁT HIỆN VÀ

ĐỊNH LƯỢNG SỰ BIỂU HIỆN

mRNA E6 CỦA HUMAN PAPILLOMA

CỔ TỬ CUNG

BẰNG

KỸ THUẬT REAL-TIME RT PCR

NGƯỜI HƯỚNG DẪN: TS LÊ HUYỀN ÁI THÚY

Th.S TRƯƠNG KIM PHƯỢNG

SINH VIÊN THỰC HIỆN: ĐINH VŨ HỒNG VÂN

LỜI CẢM ƠN

Những lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất xin được dành đến:

Cha mẹ đã cho con tình thương, luôn tạo điều kiện tốt nhất về vật chất và tinh thần để con có thể hoàn thành tốt đề tài báo cáo này

TS Lê Huyền Ái Thuý đã tận tình hướng dẫn cho em hoàn thành tốt nhất đề tài báo cáo này

Cô Lê Thị Trúc Linh, Cô Trương Kim Phượng – những người đã hỗ trợ, giúp đỡ em trong suốt thời gian qua

Anh Phan Quốc Việt, chị Hồ Thị Thanh Thuỷ, anh Nguyễn Văn Hưng và tập thể các anh chị trong Công ty Cổ phần Thương mại và Dịch vụ Việt Á đã tạo mọi điều kiện và giúp đỡ em nhiệt tình trong thời gian em thực hiện đề tài tại công ty

Cuối cùng, xin gởi đến các bạn – những người đã đồng hành cùng tôi gắn bó, chia sẻ mọi khó khăn cũng như thành công lời cảm ơn chân thành nhất

TÓM TẮT

Ung thư cổ tử cung được xem là căn bệnh nguy hiểm với tỷ lệ tử vong đứng hàng thứ hai trong các bệnh ung thư ở phụ nữ, chỉ sau ung thư vú Đây là dạng ung thư có thể chữa khỏi nếu được phát hiện kịp thời Nguyên nhân chính gây ra bệnh này là virus human papilloma (HPV), đặc biệt là HPV type 16 và 18 Bình thường, sự xâm nhiễm của HPV chưa đủ để gây

ra ung thư mà chỉ khi nào HPV có sự gắn chèn lên bộ gene người, chúng mới biểu hiện khả năng đó Một trong những hệ quả của sự gắn chèn này là

sự phiên mã và dịch mã của hai oncogene E6 và E7 Nghiên cứu của chúng tôi nhằm vào hiện tượng phiên mã, nói cách khác là sự biểu hiện của một trong hai oncogene dưới hình thức mRNA E6

Bước đầu chúng tôi đã thành công trong việc xây dựng quy trình phát hiện và định lượng sự biểu hiện của mRNA E6 có trong mẫu bệnh phẩm (đã có kết quả dương tính với Pap’smear) bằng kỹ thuật Real - time

RT PCR Hệ primer - probe đặc hiệu cho gene E6 của chủng HPV type 16

đã được sử dụng và cho sản phẩm khuếch đại là 81bp Quy trình cũng đã được thử nghiệm trên hai mươi mẫu bệnh phẩm (đã có kết quả xác định nhiễm HPV type 16) Kết quả ghi nhận được có hai trong hai mươi trường hợp xuất hiện sự gắn chèn

Với kết quả đạt được ban đầu, chúng tôi nghĩ quy trình nên được thử nghiệm với một lượng bệnh phẩm lớn hơn để có thể ứng dụng quy trình trong phát hiện sớm và theo dõi tiến triển của xâm nhiễm HPV sang ung thư

cổ tử cung

MỤC LỤC

Trang MỞ ĐẦU 1

PHẦN I TỔNG QUAN TÀI LIỆU I ĐỊNH NGHĨA UNG THƯ CỔ TỬ CUNG 4

II TÁC NHÂN GÂY UNG THƯ CỔ TỬ CUNG 4

1 Tác nhân 4

2 Các type HPV 5

3 Sự xâm nhiễm về mặt phân tử 6

III TÌNH HÌNH BỆNH UNG THƯ CỔ TỬ CUNG TRÊN THẾ GIỚI VÀ Ở VIỆT NAM 9

1 Tình hình trên thế giới 9

2 Tình hình ở Việt Nam 11

IV PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN BỆNH UNG THƯ CỔ TỬ CUNG 12

1 Chẩn đoán lâm sàng 12

2 Các phương pháp chẩn đoán phòng thì nghiệm bệnh ung thư cổ tử cung 12

2.1 Xét nghiệm tế bào học 12

2.2 Xét nghiệm tìm HPV DNA 14

2.2.1 HPV DNA PCR 14

2.2.2 HPV DNA Hybrid Capture (HC2 test) 14

2.2.3 Phương pháp Southern blot 15

V PHƯƠNG PHÁP PCR VÀ ỨNG DỤNG TRONG CHẨN

ĐOÁN BỆNH UNG THƯ CỔ TỬ CUNG 15

1 Định nghĩa 15

2 Các thành phần trong phản ứng PCR 16

3 Phương pháp PCR không truyền thống 17

3.1 RT – PCR 17

3.2 Real - time PCR 17

PHẦN II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP I VẬT LIỆU THIẾT BỊ 24

1 Vật liệu – hoá chất 24

1.1 Vật liệu sinh học 24

1.2 Hoá chất 24

1.2.1 Hoá chất dùng cho tách chiết DNA 24

1.2.2 Hoá chất dùng cho một phản ứng PCR 24

1.2.3 Hoá chất dùng cho điện di trên thạch và thang agarose 25

2 Dụng cụ thiết bị 26

II PHƯƠNG PHÁP 27

1 Phương pháp thiết kế primer 27

1.1 Các phần mềm sử dụng 27

1.2 Phương pháp tiến hành 27

2 Phương pháp tách chiết DNA/RNA 28

2.1 Nguyên tắc 28

2.2 Cách tiến hành 29

3 Phương pháp PCR 30

3.1 Nguyên tắc 30

3.2 Cách tiến hành phản ứng Real time RT - PCR 30

PHẦN III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN I THIẾT KẾ MỒI VÀ MẪU DÒ TRÊN GENE E6 HPV TYPE 16 33

1 Kết quả chạy clustal hệ primer-probe vừa thiết kế 33

2 Kết quả chạy annhyb cho hệ primer-probe 35

II ĐÁNH GIÁ HỆ MỒI & MẪU DÒ CHO GENE E6, HPV TYPE 16 VỪA THIẾT KẾ 35

1 Tính đặc hiệu 35

2 Chiều dài 36

3 Thành phần nucleotide 36

4 Nhiệt độ nóng chảy 36

5 Cấu trúc thứ cấp 36

III KẾT QUẢ THIẾT KẾ CHƯƠNG TRÌNH REAL-TIME RT PCR 37

1 Đối với RT 37

2 Đối với Real - time PCR 38

3 Xây dựng quy trình 38

3.1 Kiểm tra khả năng hoạt động của hệ primer, probe trên gene E6 HPV type 16 bằng Real - time PCR 38

3.2 Kết quả tách chiết RNA 39

3.3 Khảo sát nhiệt độ lai của hệ primer, probe 44

3.4 Khảo sát độ nhạy của toàn bộ quy trình 45

IV ỨNG DỤNG QUY TRÌNH TRÊN CÁC MẪU BỆNH PHẨM 46

1 Quy trình tách chiết và Real time RT – PCR 46

2 Quy trình Real - time PCR 48

3 Kết quả 48

PHẦN IV: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ I KẾT LUẬN 52

II ĐỀ NGHỊ 52

TÀI LIỆU THAM KHẢO 53

PHỤ LỤC 61

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Trang Hình 1: Cận cảnh cổ tử cung cho thấy sự phát triển của các tế bào bất

Hình 2: Virus HPV 5

Hình 3: Bộ gene HPV 5

Hình 4: Quá trình xâm nhiễm và gây bệnh của HPV trong tế bào chủ 7

Hình 5: Diễn tiến của hiện tượng chèn gene E6 và E7 vào trong bộ gene

Hình 6: Sơ đồ biểu diễn phân bố tỉ lệ bị ung thư CTC trên thế giới 10

Hình 7: Đồ thị biểu diễn độ tuổi và so sánh tình trạng tử vong do ung thư

Hình 8: Biểu đồ phân bố tỉ lệ KCTC ở các nước vùng Châu Á – Thái Bình

Hình 12: Cơ chế phát huỳnh quang của chất nhuộm SYBR Green I 20

Hình 13: Cơ chế phát tín hiệu huỳnh quang của probe đôi 20

Hình 14: Phương pháp Taqman probe 21

Hình 15: Thang 100bp 26

Hình 16: Chương trình luân nhiệt của phản ứng Real - time PCR 34

Hình 17: Kết quả của việc tìm độ tương đồng trên gene E6 và primer xuôi

Hình 18: Kết quả của việc tìm độ tương đồng trên gene E6 và primer

Hình 19: Kết quả của việc tìm độ tương đồng trên gene E6 và probe bằng

Hình 20: Kết quả của việc đánh giá primer, probe bằng annhyb (3 chỗ có

Hình 21: Chu trình luân nhiệt của phản ứng RT 43

Hình 22: Chu trình luân nhiệt của phản ứng Real - time PCR 43

Hình 23: Đường cong biểu diễn sự hoạt động của hệ primer – probe của

Hình 24: Kết quả kiểm tra quy trình tách chiết RNA trên 5 mẫu dương tính

Hình 27: Đường cong biểu diễn độ nhạy của hệ primer – probe trên gene

Hình 28: Chu trình luân nhiệt của phản ứng Real - time PCR trong thực

Hình 29: Đường cong biểu diễn sự hoạt động của hệ primer – probe trên

DANH MỤC BẢNG

Trang

Bảng 1: Tỷ lệ tiến triển của các giai đoạn CIN sang ung thư CTC 9

Bảng 2: Trình tự hệ mồi – mẫu dò trên gene E6 của HPV type 16 33

Bảng 3: Kết quả chạy Real - time PCR trên 5 mẫu và chu kỳ dương tính

Bảng 4: Kết quả xử lý mẫu C với enzyme DNase I 43

Bảng 5: Kết quả khảo sát độ nhạy của hệ primer – probe theo gradient từ

Bảng 6: Kết quả định tính và định lượng mRNA E6 trên 20 mẫu bệnh

▪ dNTPs: deoxynucleotide triphosphates

▪ TE: Tris EDTA

▪ nu: nucleotide

▪ Ct: Cycle Threshold

MỞ ĐẦU

Human Papilomavirus (HPV: virus gây u nhú vùng sinh dục) là virus gây bệnh cho con người, đặc biệt là phụ nữ Chúng là nguyên nhân gây ra mụn cơm, mụn cóc và các sùi mào gà ở da, dương vật, âm hộ, hậu môn,… dẫn đến viêm da lành tính, hoặc viêm cơ quan sinh dục dẫn đến vô sinh

Ở phụ nữ, HPV là nguyên nhân chính gây ra bệnh ung thư cổ tử cung (chiếm khoảng 97% trường hợp [44 – 47] Đây là loại ung thư phụ nữ thường mắc phải, chỉ sau ung thư vú Hàng năm trên thế giới có hơn nửa triệu phụ nữ bị ung thư

cổ tử cung và trên 50% người bệnh tử vong do phát hiện bệnh ở giai đoạn muộn Còn ở Việt Nam trong 10 năm qua, có khoảng 6000 phụ nữ chết vì bệnh này, cao gấp đôi số phụ nữ chết vì AIDS, mặc dù ung thư cổ tử cung có thể được chữa khỏi hoàn toàn nếu được phát hiện sớm

Hiện nay, người ta đã tìm thấy được hơn 100 type HPV, trong đó có khoảng

40 type tác động lên đường sinh dục nhưng chỉ có 13 type là có nguy cơ cao, đặc biệt type 16 được xác định là có nguy cơ gây bệnh cao nhất [48], chúng hiện diện trong hơn 50% số ca mắc bệnh ung thư cổ tử cung [49]

Khả năng gây bệnh ung thư của các type HPV nguy cơ cao nằm trên protein sớm E6 và E7 Hai protein này rất cần thiết cho quá trình chuyển biến của khối u ác tính, đồng thời ức chế hệ thống tiêu diệt và đàn áp khối u [50 – 53] mRNA E6 và E7 mã hoá cho hai protein trên là gene biểu hiện sớm trong quá trình phát triển của virus Do đó, dựa vào sự hiện diện và số bản sao của mRNA E6 mà người ta có thể xác định được diễn biến của bệnh ung thư cổ tử cung và nếu được phát hiện sớm, khả năng chữa khỏi bệnh hoàn toàn đến 95% Còn nếu phát hiện ở giai đoạn cuối,

tỷ lệ sống thêm 5 năm chỉ còn khoảng 5% [68]

Việc phát hiện sớm sự hiện diện và số lượng của các mRNA E6 trên các bệnh nhân nhiễm HPV type 16 ở Việt Nam là rất cần thiết, điều này giúp ích rất nhiều cho việc phòng ngừa và điều trị bệnh ung thư cổ tử cung – một căn bệnh rất nguy hiểm cho phụ nữ

Với những ý nghĩa trên, chúng tôi đã tiến hành “Xây dựng quy trình phát

hiện và định lượng sự biểu hiện mRNA E6 của Human papillomavirus type 16

gây bệnh ung thư cổ tử cung bằng kỹ thuật Real – time RT - PCR”

Nội dung chính của đề tài bao gồm:

⮚ Thiết kế hệ primer và probe chuyên biệt cho gene E6 của virus HPV type 16

⮚ Thiết lập quy trình Real – time RT PCR nhằm phát hiện và định lượng sự biểu hiện của mRNA E6

⮚ Thử nghiệm quy trình trên mẫu bệnh phẩm Pap’smear đã xác định dương tính với HPV type 16

Đề tài này được thực hiện tại Công ty Cổ phần Thương mại Sản xuất và Dịch

vụ Việt Á trong khoảng thời gian từ tháng 2 đến tháng 7 năm 2009

PHẦN I TỔNG QUAN TÀI LIỆU

I ĐỊNH NGHĨA UNG THƯ CỔ TỬ CUNG:

Cổ tử cung (CTC) là phần hẹp, bên dưới tử cung và trên âm đạo Gồm hai phần: cổ ngoài và cổ trong

- Cổ ngoài: là các tế bào biểu mô lát giống tế bào biểu mô lát của âm đạo nhưng trơn láng hơn

- Cổ trong: là biểu mô tuyến gần giống như biểu mô của nội mạc tử cung Chỗ tiếp giáp giữa biểu mô lát của cổ ngoài và biểu mô tuyến của cổ trong

được gọi là lỗ cổ ngoài mô học Đây là vùng chuyển tiếp (transformation zone) của

hai loại biểu mô Các trường hợp ung thư CTC đều xuất phát từ vùng này [1, 2]

Hình 1: Cận cảnh cổ tử cung cho thấy sự phát triển của các tế bào bất thường

trong bệnh ung thư CTC

II TÁC NHÂN GÂY UNG THƯ CỔ TỬ CUNG:

1 Tác nhân:

Hầu hết các trường hợp bị bệnh ung thư CTC là do Human papillomavirus

(HPV) gây ra HPV thuộc giống Papillomavirus, họ Papovaviridae, không có vỏ bao, đường kính 50 - 55nm, capsid hình khối đa diện HPV có bộ gene là chuỗi

sớm (E) và hai gene muộn (L)

Bộ gene HPV có chiều dài khoảng 7906bp Trong đó, hai gene gây ung thư quan trọng nhất là E6 và E7 lần lượt có chiều dài khoảng 500bp và 300bp

HPV rất phổ biến và dễ lây nhiễm, nhất là theo đường tình dục [3 – 5]

Hình 2: Virus HPV

Hình 3: Bộ gene HPV

2 Các type HPV:

Hiện nay, người ta phát hiện có hơn 100 type HPV, mà sự khác nhau về bộ

được chia thành hai loại:

45, 51, 55, 56, 59, 66, 68 Các type này có khả năng gây ung thư cao, thường liên quan đến loạn sản và ung thư CTC

- Type nguy cơ thấp (low – risk type): gồm các type 6, 11, 26, 42, 44, 54, 70,

73, ít có khả năng gây ung thư, chỉ gây ra các mụn cóc vùng sinh dục, hoặc các bất

thường tế bào CTC, hoặc có thể không biểu hiện triệu chứng bệnh trong kết quả lâm sàng [3]

Trong các type nguy cơ cao, hai type có liên quan đến khoảng 70% trường hợp mắc bệnh là HPV type 16 và HPV type 18 [7, 8] Riêng HPV type 16 được nhận thấy là phổ biến nhất, chúng hiện diện trong khoảng 50% trường hợp bị bệnh ung thư CTC [9 – 12]

So sánh về mức độ nguy hiểm giữa các type, theo Giáo sư Anthony Gunnel (Viện Karolisnka, Stockhom), với những phụ nữ nhiễm HPV type 16 nồng độ cao, nguy cơ bị ung thư CTC tăng gấp 6 lần so với phụ nữ nhiễm HPV các type khác [71]

vào bộ gene người:

Hiện nay, người ta vẫn chưa thể khẳng định việc chuyển biến từ nhiễm HPV sang ung thư CTC theo một cơ chế xác định nào Nhưng với các nghiên cứu từ trước tới nay, quá trình xâm nhiễm và gây bệnh ung thư CTC của HPV type nguy

cơ cao cũng có thể được mô tả khá đầy đủ và rõ nét

CTC bình thường có một chỗ hẹp gọi là “vùng chuyển tiếp tế bào biểu mô

trụ gai” (transformation zone) Sự xâm nhiễm HPV thường xảy ra ở vùng này nhất

do chúng thích hợp với đặc tính biến đổi từ tế bào đáy thành tế bào gai của nó Đầu tiên, HPV sẽ xâm nhiễm vào lớp tế bào đáy, nhân bản tạo ra các bản sao và thể bổ sung, đồng thời biểu hiện các gene sớm E1, E2, E4, E5, … Hoạt động này được tiến hành tách biệt với bộ gene chủ trong nhân tế bào Các lớp tế bào đáy bị nhiễm virus tiếp tục chu trình biệt hoá biến đổi thành tế bào gai, lúc này hai gene muộn L1

và L2 mới được biểu hiện và tạo ra các phần còn lại của virus Nhờ hoạt động tăng sinh liên tục để thay thế các tế bào già, chết, các virus HPV mới tạo thành sẽ được phóng thích ra ngoài [70]

Hình 4: Quá trình xâm nhiễm và gây bệnh của HPV trong tế bào chủ

Việc nhiễm các type HPV là điều kiện cần nhưng chưa đủ để gây ung thư CTC Sự kiện cho việc bắt đầu gây ra bệnh là hiện tượng chèn gene của các type HPV nguy cơ cao vào bộ gene người, dẫn đến rối loạn các chức năng tế bào Hiện tượng này được phát hiện trong hơn 90% trường hợp ung thư CTC [13]

Ở trạng thái bình thường, bộ gene virus HPV tồn tại dưới dạng DNA plasmid, độc lập với nhân tế bào chủ, trong đó có hai gene gây ung thư quan trọng nhất là E6 và E7 Hai gene này chỉ biểu hiện khả năng gây ung thư khi được phiên

mã thành mRNA, sau đó dịch mã thành protein Sở dĩ ở trạng thái bình thường, chúng không phiên mã sang mRNA theo hoạt động nhân bản của virus là do sự ức chế và kìm hãm của gene E2, nên chúng tồn tại độc lập theo bộ gene virus mà không ảnh hưởng đến bộ gene chủ nếu không có hiện tượng chèn gene xảy ra [65]

Việc tế bào bị nhiễm dai dẳng các type nguy cơ cao sẽ làm cấu trúc tế bào CTC bị rối loạn và chu trình tế bào bị xáo trộn Đến một lúc nào đó, khi nhiễm sắc thể người bị mất ổn định, một số vị trí dễ gãy trên nhiễm sắc thể sẽ trở nên lỏng lẻo

và yếu ớt, dưới một điều kiện thuận lợi nào đó, bộ gene virus HPV nguy cơ cao sẽ chèn vào các vị trí trên, gắn kết hai gene E6 và E7 vào bộ gene chủ Từ đó chúng

được phiên mã thành mRNA rồi thành protein lên theo hoạt động tăng sinh của tế bào (Hình 4)

Khi gắn vào bộ gene chủ, hai oncogene E6 và E7 sẽ mất đi sự kiểm soát của gene E2, và biểu hiện rõ khả năng gây ung thư Một vài nghiên cứu cho thấy, E6 và E7 có nhiệm vụ mã hoá cho hai protein làm ức chế hai hệ thống tiêu diệt và đàn áp khối u p53 và pRb Việc bất hoạt hệ thống p53 sẽ dẫn đến hiện tượng bất tử hoá tế

bào (do kích hoạt enzyme telomerase – có vai trò kéo dài đầu telomere của nhiễm

sắc thể) và bất hoạt pRb sẽ làm cho tế bào tăng sinh liên tục, gây mất ổn định tế bào và chuyển thành ung thư CTC [65]

Hình 5: Diễn tiến của hiện tượng chèn gene E6 và E7 vào trong bộ gene chủ

Khi các tế bào ung thư bắt đầu xâm lấn vào mô liên kết, có chiều hướng lan

rộng dọc theo màng đáy được gọi là ung thư xâm lấn (invasive cancer) Ung thư

CTC nếu tiến triển nặng có thể di căn sang bụng, phổi và một số nơi khác

Trước khi chuyển biến thành ung thư, từ giai đoạn nhiễm HPV type nguy cơ cao tế bào còn phải trải qua các giai đoạn thương tổn trong tế bào biểu mô CTC

(CIN) Tuỳ mức độ nặng nhẹ mà người ta chia CIN thành ba loại: CIN I, CIN II và CIN III, trong đó CIN III là thương tổn nặng nhất Hầu hết các nghiên cứu đều cho rằng, hiện tượng chèn gene của HPV chỉ xảy ra ở trường hợp bị CIN II, III và ung thư CTC, còn CIN I chỉ hiện diện DNA virus dưới dạng episome [62]

Một vài thống kê cho thấy, đối với những bệnh nhân đang ở giai đoạn CIN I thì có khoảng 60% trường hợp tự thoái biến, 30% vẫn giữ nguyên tình trạng, 10% tiến triển thành CIN III và 1% trở thành ung thư Với CIN II là 40% tự thoái biến, 40% giữ nguyên tình trạng, 20% tiến triển thành CIN III và 5% chuyển sang ung thư Còn đối với CIN III thì có 33% tự thoái biến và hơn 12% chuyển thành ung thư [63]

Bảng 1: Tỷ lệ tiến triển của các giai đoạn CIN sang ung thư CTC

Tự thoái biến (%)

CIN I (%)

CIN II (%)

CIN III (%)

Ung thư (%)

VÀ Ở VIỆT NAM:

Hiện nay, trên thế giới có khoảng 630 triệu người bị nhiễm HPV, dao động trong khoảng 9 – 13%, trong đó, phụ nữ chiếm tỷ lệ nhiều hơn đàn ông [15, 16]

Ngoài ra, hằng năm thế giới lại có thêm nửa triệu người mắc bệnh ung thư CTC và khoảng 270.000 phụ nữ tử vong vì bệnh này Lượng người bị bệnh và chết chiếm cao nhất ở Châu Phi khu vực phía Nam Sahara, Mỹ La-tinh và Nam Á Tỉ lệ người chết ở các nước đang phát triển cao hơn gấp bốn lần so với các nước công nghiệp Có khoảng 80 – 85% trường hợp chết vì ung thư cổ tử cung nằm ở các nước đang phát triển [20, 21, 15, 22 – 27]

Theo nhiều thống kê thì độ tuổi thường xuyên bị ung thư CTC ở phụ nữ là hơn 40 tuổi, phần lớn khoảng 45 tuổi [8, 17 – 19] Một vài nghiên cứu cho rằng, một nửa các trường hợp ung thư CTC nằm ở độ tuổi 35 và 55

Hình 6: Sơ đồ biểu diễn phân bố tỉ lệ bị ung thư CTC trên thế giới

Hình 7: Đồ thị biểu diễn độ tuổi và so sánh tình trạng tử vong do ung thư CTC

giữa các nước đang phát triển và các nước phát triển

2 Tình hình ở Việt Nam:

Theo điều tra của Cơ quan nghiên cứu ung thư quốc tế (IARC), tại Việt Nam hơn 10 năm qua, đã có khoảng 6000 phụ nữ chết vì ung thư CTC, cao gấp đôi số phụ nữ chết vì bệnh AIDS [66]

Theo số liệu thống kê của bệnh viện Ung bướu TP.HCM năm 2005, cả nước

có thêm 4.471 người mắc bệnh ung thư CTC Theo Globocan, riêng năm 2002 Việt Nam có 6.224 phụ nữ mắc bệnh và 3.334 phụ nữ tử vong vì căn bệnh này Đặc biệt

ở miền Nam, theo công bố gần đây nhất của bệnh viện Ung bướu, ung thư CTC đứng thứ hai trong các loại ung thư cơ quan sinh dục nữ, chỉ sau ung thư vú [67]

Hình 8: Biểu đồ phân bố tỉ lệ KCTC ở các nước vùng Châu Á – Thái Bình Dương

Theo nghiên cứu của bệnh viện Từ Dũ năm 2005 cho biết, tỉ lệ nhiễm HPV

ở các trường hợp có tổn thương tế bào HSIL (CIN 2/3) đạt cao nhất ở HPV-16, sau

đó là hỗn hợp giữa HPV-16 và HPV-18 (hình 9)

Khi bệnh tiến triển khá nặng sẽ xuất hiện nhiều triệu chứng như: chán ăn, sút cân, mệt mỏi, đau khung xương chậu, đau lưng, đau sưng chân, xuất nhiều dịch

âm đạo, rò rỉ nước tiểu hoặc chất cặn từ âm đạo hoặc gãy xương, nếu nặng có thể di căn sang sang bụng, phổi và một số nơi khác

CTC, để xác định tình trạng của những thương tổn tiền ung thư, phục vụ cho mục đích điều trị hoặc nghiên cứu

Kết quả mà phương pháp này mang lại khá ấn tượng, đóng một vai trò không nhỏ trong việc tầm soát và chẩn đoán bệnh ung thư CTC Nó góp phần làm giảm tỉ lệ ung thư CTC và tỉ lệ tử vong giảm xuống 2/3 các trường hợp Tuy nhiên, nhược điểm của Pap’smear là có thể có trường hợp âm tính giả với tỉ lệ khá cao do chỉ kiểm tra trên tế bào đơn, độ nhạy thấp (37 – 84%) [29, 30 – 32] Vì vậy, phải thực hiện xét nghiệm Pap’smear nhiều lần để giảm bớt các trường hợp âm tính giả,

và khoảng thời gian giữa hai lần xét nghiệm càng ngắn càng tốt Thống kê của IARC cho thấy nếu giữa hai lần xét nghiệm cách nhau 1 năm, tỉ lệ giảm ung thư CTC cộng dồn đạt đến 93.5%

Hình 10: Xét nghiệm tế bào học

❖ ThinPrepTM Pap Test:

Đây là phương pháp cải tiến từ Pap’smear nhằm mục đích làm giảm tỉ lệ mẫu lấy không đạt yêu cầu, giảm bớt các trường hợp âm tính giả do nguyên nhân từ khâu lấy mẫu Các mẫu tế bào CTC mới lấy sẽ được trộn vào một dung dịch, sau

đó lọc hỗn hợp này để loại bỏ các tạp chất, chất nhầy, nấm, mảnh vụn và nhiều thứ khác làm ảnh hưởng đến độ chính xác của xét nghiệm [33, 34]

❖ Phương pháp soi CTC:

Chỉ thực hiện khi bệnh nhân có kết quả phết tế bào CTC bị bất thường Phương pháp soi giúp xác định rõ vị trí và mức độ lan toả của tổn thương, đồng thời hướng dẫn cho bệnh nhân sinh thiết CTC

❖ Phương pháp sinh thiết CTC:

Sinh thiết là phương tiện sau cùng của chẩn đoán bệnh ung thư CTC và cho kết quả chính xác hơn cả, giúp chẩn đoán về mặt giải phẫu bệnh Sinh thiết CTC được thực hiện dưới hướng dẫn của máy soi

2.2 Xét nghiệm tìm HPV DNA:

Từ những mẫu phết CTC hay âm đạo, xét nghiệm HPV DNA có thể phát hiện DNA của các type HPV nguy cơ cao Phương pháp này có độ nhạy cao hơn Pap’smear (97.1 – 100%), do đó, việc bỏ sót trường hợp âm tính giả rất thấp Ngoài

ra, xét nghiệm HPV DNA không mang tính chủ quan như các xét nghiệm tầm soát

tế bào Bên cạnh việc có thể phát hiện ra những mẫu đã mắc bệnh, phương pháp này còn có thể nhận biết được những mẫu có nguy cơ tiến triển sang ung thư CTC [35]

1.2.1 HPV DNA PCR:

Phương pháp này có thể phát hiện và định type HPV kể cả với mẫu chỉ có một số lượng nhỏ virus, dựa trên nguyên tắc cơ bản của phản ứng PCR

1.2.2 HPV DNA Hybrid Capture (HC2 test):

Phương pháp này xác định được bệnh nhân nhiễm HPV nhóm nguy cơ cao hay nguy cơ thấp, nhưng chỉ có thể phát hiện được 13 type HPV Để thực hiện HPV DNA Hybrid Capture thì mẫu cần phải có một số lượng virus nhiều hơn phương pháp HPV DNA PCR Thông thường có thể biết kết quả xét nghiệm sau 6 – 8 tiếng Ưu điểm của phương pháp này là có độ nhạy cao hơn các phương pháp phát hiện bằng mắt thường và xét nghiệm tế bào học, nhược điểm là đòi hỏi điều

kiện phòng thí nghiệm phải tốt, thiết bị đặc biệt và kỹ thuật viên phải được huấn luyện về trình độ và thao tác [36 – 38]

1.2.3 Phương pháp Southern blot:

Đây là một phương pháp thường xuyên được dùng trong sinh học phân tử để phát hiện DNA trong mẫu Phương pháp này là sự kết hợp giữa kỹ thuật điện di trên thạch agarose để phân tách DNA dựa trên kích thước, sau đó các DNA này sẽ được chuyển qua một màng lọc để lai với probe (probe) [37] Việc lai probe với đoạn DNA đặc hiệu trên màng giúp nhận biết được đoạn nào có chưa trình tự DNA

có khả năng bắt cặp bổ sung với probe

ĐOÁN BỆNH UNG THƯ CỔ TỬ CUNG:

Năm 1985, Kary B.Mullis cùng các cộng sự đã phát minh ra phương pháp

PCR (polymerase chain reaction – phản ứng chuỗi polymerase) Đây là một kỹ

thuật tạo dòng in vitro nhằm khuếch đại đặc trưng một đoạn DNA nằm giữa hai trình tự oligonucleotide đã biết trước Hai trình tự oligonucleotide này được gọi là

mồi xuôi (forward primer) bắt cặp với mạch dương DNA và mồi ngược (reverse

primer) bắt cặp với mạch âm DNA Một phản ứng PCR bao gồm nhiều chu kỳ giống nhau được lặp đi lặp lại nhiều lần Một chu kỳ PCR bình thường gồm 3 bước:

- Bước 1: Nhiệt độ phản ứng là 95°C, hai mạch DNA khuôn bị biến tính, duỗi xoắn và tách ra

- Bước 2: Nhiệt độ phản ứng được hạ thấp xuống nhiệt độ Tm (nhiệt độ bắt cặp) của primer Thông thường khoảng từ 55 – 65°C

- Bước 3: nhiệt độ phản ứng được nâng lên 72°C Đây là nhiệt độ tối ưu

cho enzyme DNA Taq polymerase hoạt động để tổng hợp mạch DNA mới

Thông thường, một phản ứng PCR không được vượt quá 40 chu kỳ [40]

2 Các thành phần trong phản ứng PCR:

Một phản ứng PCR thường gồm 7 thành phần cơ bản sau:

2.1 Enzyme chịu nhiệt Taq polymerase: enzyme này có thể chịu được

nhiệt độ tới 95°C Một phản ứng PCR từ 25 – 50μl thông thường có liều lượng Taq

polymerase nằm trong giới hạn từ 0.5 – 2.5 đơn vị [41, 42]

2.2 Dung dịch đệm PCR: Dung dịch này có vai trò cung cấp những ion cần

thiết cho phản ứng xảy ra Tuỳ theo nguồn DNA polymerase mà nồng độ và pH của dung dịch đệm cũng như nồng độ KCl tối ưu sẽ thay đổi cho phù hợp Thông thường, một phản ứng PCR sẽ có dung dịch đệm điển hình là: 50mM KCl, 10mM Tris – HCl, pH 8.3 ở nhiệt độ phòng [42, 43]

2.3 MgCl 2 : có vai trò là một cofactor cho enzyme DNA polymerase hoạt động Ngoài ra, primer, DNA bản mẫu, dNTPs, EDTA cũng có thể liên kết với

nhất cho từng phản ứng PCR cụ thể, thông thường là từ 1.5 mM – 4mM (41 – 43)

2.4 dNTPs (deoxynucleotide triphosphates): gồm 4 loại nucleotide được dùng trong phản ứng PCR là: dATP, dTTP, dGTP và dCTP Nồng độ của mỗi loại

dNTPs cao hơn 4μl sẽ làm giảm hiệu quả khuếch đại phản ứng PCR, và sự mất cân bằng nồng độ giữa các loại nu sẽ làm tăng lỗi sao chép của DNA polymerase [41]

2.5 Primer (mồi): đây là một trong những yếu tố quan trọng nhất trong

phản ứng PCR, có vai trò làm mồi cho hoạt động kéo dài mạch của DNA polymerase Do đó, việc thiết kế primer phải được tiến hành thật chính xác, tránh ảnh hưởng đến hiệu quả và độ chuyên biệt của phản ứng PCR Nồng độ primer trong mỗi phản ứng PCR phải được tính toán tối ưu bằng thực nghiệm Nếu nồng

độ primer quá cao sẽ dẫn đến hiện tượng khuếch đại ký sinh, ngược lại sẽ làm hiệu quả khuếch đại của phản ứng không cao Giới hạn nồng độ primer thường là 0.1 – 1

μl

2.6 DNA mạch khuôn: DNA mạch đôi hay mạch đơn đều có thể là nguồn

vật chất ban đầu cho phản ứng PCR, chúng được tách chiết từ tế bào động vật, thực vật, vi khuẩn hoặc virus Ngoài ra, RNA cũng là một nguồn vật liệu cho phản ứng

khuếch đại nếu nó được phiên mã ngược thành cDNA Nồng độ DNA ban đầu

trong phản ứng không được quá cao, có thể chỉ cần một phân tử DNA ban đầu cho một phản ứng Thông thường, nồng độ DNA ban đầu tốt nhất trong phản ứng PCR

2.7 Các chất tăng cường: có nhiệm vụ giúp phản ứng PCR xảy ra hiệu quả

hơn Nhưng nếu dùng với liều lượng không thích hợp, các chất này sẽ có tác dụng ngược lại, ảnh hưởng không tốt đến phản ứng PCR Các chất tăng cường thường là: betain, DMSO, glycerol, … [42, 43]

3.1 RT – PCR:

Nguyên lý hoạt động của RT – PCR cũng dựa trên nguyên tắc PCR bình thường, chỉ khác ở vật liệu cần khuếch đại ban đầu Trong RT – PCR, vật liệu ban

đầu là RNA, chúng sẽ được phiên mã ngược thành cDNA nhờ enzyme Reverse

transcriptase, sau đó các cDNA này tiếp tục được nhân bản qua các bước như trong PCR

Thành phần cơ bản của phản ứng RT- PCR gồm có: RNA bản mẫu, primer

ngược, dNTPs, dung dịch đệm cho phản ứng RT- PCR, enzyme reverse

transcriptase Các điều kiện về nồng độ RNA ban đầu cũng tương tự như của DNA trong PCR (56)

3.2 Real - time PCR:

Nguyên tắc Real - time PCR cũng dựa trên PCR thường, nhưng phương pháp này có thể định lượng được hàm lượng DNA/RNA có trong mẫu nhờ các chất

nhuộm phát huỳnh quang (fluorescent dye) Sau khi nhân bản, các sản phẩm PCR

mục tiêu sẽ được theo dõi hàm lượng theo một thời gian thật (real time) của phản ứng

Việc định lượng số bản sao khuếch đại sẽ dựa vào probe (mẫu dò) Probe là một đoạn oligonucleotide ngắn xác định, được đánh dấu bằng nhiều phương pháp khác nhau dùng để nhận diện các đoạn acid nucleic khác có trình tự bổ sung với nó [49] Về cơ bản, probe cũng tương tự như primer, chỉ khác ở chỗ probe được gắn

phát huỳnh quang) [50, 51]

Hiện nay có bốn phương pháp định lượng sản phẩm khuếch đại nhờ probe

có gắn chất phát huỳnh quang [56]:

⮚ Molecular beacon: loại probe này có cấu trúc dạng vòng và cuống

Phần cấu trúc dạng vòng sẽ bắt cặp bổ sung đặc hiệu với trình tự DNA mục tiêu, còn phần cấu trúc dạng cuống được tạo thành từ các base nằm ở hai đầu mút của probe bắt cặp bổ sung với nhau nhờ liên kết hydro Một đầu probe sẽ được gắn một chất hóa học phát huỳnh quang, đầu kia được gắn một chất hóa học khác có nhiệm

vụ ˝dập tắt˝ (quencher) bằng cách làm tiêu giảm năng lượng dưới dạng nhiệt mà nó nhận được từ chất phát huỳnh quang, ngăn cản ánh sáng huỳnh quang không phát

ra Ở trạng thái tự do trong không gian, phần cấu trúc dạng cuống làm cho hai đầu của probe gần nhau, lúc đó phần quencher sẽ phát huy tác dụng Nhưng khi bắt cặp

bổ sung đặc hiệu với một trình tự mục tiêu, dạng vòng cuống của probe sẽ mất đi

và trở thành dạng thẳng, khoảng cách giữa chất phát huỳnh quang và probe gia tăng làm cho chất huỳnh quang có khả năng phát sáng, lúc đó các thiết bị chuyên dụng

sẽ tiếp nhận và phân tích tín hiệu

Molecular beacon có tính đặc hiệu rất cao do yêu cầu của chúng về khả năng bắt cặp bổ sung với trình tự DNA là tuyệt đối Vì xét về mặt nhiệt động học, sự hình thành cấu trúc kẹp tóc ở beacon thuận lợi hơn sự hình thành các phân tử lai không hoàn chỉnh, nếu beacon không bắt cặp bổ sung hoàn toàn với trình tự mục tiêu, hiện tượng lai sẽ không xảy ra, và đương nhiên tín hiệu huỳnh quang sẽ không

có Việc thiết kế probe dạng beacon rất khó và quan trọng, trình tự nucleotide trong phần cấu trúc dạng cuống phải được thiết kế sao cho quencher và chất phát huỳnh quang phải tiếp xúc với nhau, nếu không sẽ làm một phần ánh sáng huỳnh quang

phóng thích không đặc hiệu dẫn đến sai lệch trong kết quả định lượng Mặt khác các liên kết trong cấu trúc dạng cuống không được quá mạnh, như thế sẽ làm cản trở sự bắt cặp giữa beacon và trình tự DNA mục tiêu

Hình 11: Quá trình phát tín hiệu huỳnh quang của Molecular beacon

⮚ Chất nhuộm gắn với DNA mạch đôi: chất nhuộm này gắn với mọi

phân tử DNA mạch đôi và chỉ phát tín hiệu huỳnh quang khi gắn vào chúng Cường độ huỳnh quang phát ra của chất nhuộm này sẽ tỷ lệ thuận với hàm lượng DNA có trong phản ứng PCR Hai chất nhuộm phát huỳnh quang thường được sửu dụng là SYBR Green I và Ethidium bromide Trong phản ứng PCR, các chất nhuộm sẽ gắn vào DNA mạch đôi mời được tổng hợp trong bước kéo dài và rời ra khi các phân tử DNA bị biến tính Nhược điểm của phương pháp này phản ứng sẽ cho kết quả định lượng không chính xác nếu có sản phẩm ký sinh

Chất phát huỳnh quang Quencher

Phát tín hiệu huỳnh quang

Hình 12: Cơ chế phát huỳnh quang của chất nhuộm SYBR Green I

⮚ Probe đôi (Hybridization probe): phương pháp này có độ đặc hiệu rất

cao do việc sử dụng cùng lúc hai probe bắt cặp với trình tự DNA mục tiêu Một

probe sẽ gắn chất cho huỳnh quang (fluorescein donor) ở đầu 3’ phát ánh sáng xanh, một probe sẽ gắn chất nhận huỳnh quang (fluorescein accepter) ở đầu 5’và luôn chặn ở đầu 3’ DNA sao cho Taq polymerase không thể kéo dài mạch từ đầu

này Trong dung dịch phản ứng, khi chất cho và chất nhận cách xa nhau thì tín hiệu nền là tín hiệu huỳnh quang do chất cho phát ra (màu xanh), nhưng khi có sự bắt cặp xảy ra, hai probe sẽ được sắp xếp sao cho phần đầu của probe này tiếp xúc với phần cuối của probe kia, lúc đó chất nhận huỳnh quang sẽ phát ra một ánh sáng huỳnh quang mới có bước sóng lớn hơn ánh sáng mà nó nhận được (màu đỏ) nhờ hiệu ứng FRET (sự chuyển năng lượng huỳnh quang kiểu cộng hưởng) Cường độ ánh sáng huỳnh quang phát ra tỷ lệ thuận với hàm lượng DNA trong mẫu Ưu điểm của phương pháp này là việc thiết kế probe tương đối linh động, dễ dàng hơn so với việc thiết kế beacon

⮚ Probe thủy giải (Hydrolysis probe): còn được gọi là Taqman probe

Probe này được gắn một chất phát huỳnh quang ở đầu 5’ và một chất “dập tắt” huỳnh quang (Quencher) ở đầu 3’ sao cho ánh sáng huỳnh quang phát ra bị hấp thu bởi quencher Trong phản ứng PCR, probe này sẽ bắt cặp bổ sung đặc hiệu với trình tự DNA mục tiêu, khi Taq polymerase kéo dài mạch bổ sung từ đầu 3’ của primer đến tiếp xúc với probe, nó sẽ thể hiện hoạt tính 5’ – 3’ exonuclease là loại

bỏ các nucleotide ở đầu của probe và thay bằng nucleotide mới, lúc đó, chất phát huỳnh quang sẽ tách rời khỏi probe và phát tín hiệu, còn quencher bị mất tác dụng dập tắt Tương tự như ba probe trên, cường độ ánh sáng huỳnh quang phát ra sẽ tỷ

lệ thuận với hàm lượng DNA có trong phản ứng Taqman probe có tính đặc hiệu cao, chỉ bắt cặp và phát tín hiệu nếu trình tự bổ sung với mạch khuôn là hoàn toàn,

vì vậy các sản phẩm ký sinh nếu có cũng không được phát hiện Thông thường, Taqman probe có nhiệt độ nóng chảy (Tm) cao hơn cặp primer từ 8 – 10ºC nhằm tạo điều kiện cho việc bắt cặp và thủy giải probe bởi Taqman polymerase

Cả bốn phương pháp trên đều có độ nhạy tương đương nhau, nhưng đơn giản nhất là sử dụng chất hoá học phát huỳnh quang gắn với DNA mạch đôi, các phương pháp còn lại sử dụng các probe có đánh dấu bằng chất phát huỳnh quang nhằm mục đích lai đặc hiệu với sản phẩm PCR mục tiêu [56]

Ngoài ra, trong kỹ thuật Real - time PCR còn có hai khái niệm sau:

⮚ Chu kỳ ngưỡng (Ct): đây là khái niệm trung tâm của kỹ thuật Real –

chuẩn (standar curve) được xây dựng từ các giá trị chu kỳ ngưỡng của các mẫu đã biết trước nồng độ DNA

Chu kỳ ngưỡng của một mẫu là chu kỳ mà tại đó tín hiệu huỳnh quang mẫu vượt lên tín hiệu huỳnh quang nền của phản ứng PCR và được các thiết bị cảm biến ghi nhận Tín hiệu huỳnh quang nền do các chất phát huỳnh quang có nồng độ xác định có sẵn trong thành phần phản ứng PCR, nhưng đối với phản ứng Real – time PCR sử dụng Taqman probe, thì chính quencher sẽ tạo tín hiệu nền cho phản ứng

Các mẫu có nồng độ DNA ban đầu lớn sẽ có Ct nhỏ và ngược lại [56]

⮚ Đường cong chuẩn (Standar curve): được xây dựng dựa trên chu kỳ

ngưỡng (Ct) của các mẫu đã có nồng độ DNA biết trước (các mẫu chuẩn) bằng các thiết bị thực hiện phản ứng Real – time PCR Sau đó, hàm lượng sản phẩm PCR của mẫu xét nghiệm sẽ được xác định bằng cách so sánh với hàm lượng sản phẩm PCR từ các mẫu chuẩn được nhân bản cùng lúc thông qua đường cong chuẩn vừa xây dựng này [56]

PHẦN II VẬT LIỆU & PHƯƠNG PHÁP

I VẬT LIỆU THIẾT BỊ:

1.1 Vật liệu sinh học:

Mẫu bệnh phẩm Pap’smear (bảo quản trong 50μl TE 1X) được lấy từ Công

ty Thương mại Cổ phần Sản xuất và Dịch vụ Việt Á Các mẫu này đã được định type 16 bằng phương pháp Reverse dot blot (RDB)

1.2 Hoá chất:

1.2.1 Dùng cho tách chiết RNA:

- Dung dịch đệm cho phản ứng PCR: 50mM KCl, Tris pH 8 10mM

năng gây ung thư rất cao

- Máy ly tâm tốc độ 13000 vòng/phút dùng cho eppendorf

- Tủ tách chiết DNA/RNA vô trùng

- Tủ đặt phản ứng PCR vô trùng

- Máy ủ nhiệt

- Máy RT – PCR Bio – rad

- Máy Real – time PCR Stratagene

- Các dụng cụ khác như: micropipettes (10μl, 200μl, 1000μl), đầu típ các loại, eppendorf các loại

- Vật liệu tiêu hao: găng tay không phấn, khẩu trang, đầu tip có phin lọc

II PHƯƠNG PHÁP:

Primer là một trong những yếu tố quan trọng nhất trong phản ứng PCR, có ảnh hướng rất lớn đến độ chính xác và độ đặc hiệu của phản ứng Thiết kế primer là khâu đầu tiên và cũng là khâu quan trọng nhất khi xây dựng quy trình PCR, nên việc thiết kế cần phải được tiến hành thật kỹ lưỡng và cẩn thận

Trong bài này, chúng tôi sử dụng phương pháp Real-time PCR, do đó ngoài việc thiết kế primer chúng tôi cũng cần phải thiết kế probe cho phản ứng

Việc thiết kế probe cũng tương tự như primer, chỉ khác là probe được gắn thêm một chất có thể phát tín hiệu huỳnh quang Với yêu cầu và mục đích đề tài, chúng tôi sẽ chọn kiểu phản ứng sử dụng Taqman probe

1.1 Các phần mềm sử dụng:

- Clustal X 1.81 ((EMBL, Châu Âu)

- Annhyb 4.922 năm 2004 (Olivier Friard, Hoa Kỳ)

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/

- Phần mềm trực tuyến Oligo Analyzer 3.0 (IDT, Hoa Kỳ)

1.2 Phương pháp tiến hành:

Quy trình thiết kế hệ primer – probe gồm 5 bước:

- Bước 1: Thu thập các trình tự gene của gene E6 HPV – 16 từ ngân hàng gene của NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov)

- Bước 2: Chạy clustal các đoạn gene trên, so sánh trình tự và xác định vùng bảo tồn (vùng có các trình tự tương đồng của tất cả các đoạn gene)

- Bước 3: Tìm các cặp primer và probe đã được công bố trên các bài báo

uy tín quốc tế

- Bước 4: Chạy clustal các đoạn gene E6 với từng primer xuôi, primer ngược và probe, đánh giá mức độ tương đồng của các đoạn trên

- Bước 5: Phân tích và đánh giá các primer và probe về Tm, %GC, hairpin (kẹp tóc), self – dimer, hetero – dimer, độ tương đồng, kích thước sản phẩm PCR tạo thành bằng các chương trình BLAST, Oligo Analyzer, Annhyb, từ đó chọn cặp primer và probe tốt nhất để chạy phản ứng Real - time PCR

2.1 Nguyên tắc:

Hiện nay có nhiều phương pháp tách chiết RNA, nhưng trong đề tài này, chúng tôi chọn phương pháp tách chiết có thể tiết kiệm được thời gian và đơn giản hoá về mặt thao tác cho người thực hiện Phương pháp này dựa trên việc loại bỏ các tạp nhiễm, nhất là protein dựa trên nguyên tắc hoà tan khác nhau của các phân

tử khác nhau (acid nucleic/protein) trong hai pha không hoà tan lẫn nhau (phenol, chloroform/nước) Trong qua trình tách chiết RNA, cần chú ý khi thực hiện tách chiết, vì RNA là phân tử kém bền, rất nhạy cảm với môi trường nên để có kết quả tốt nhất, thao tác tách chiết phải được thực hiện trong những điều kiện nghiêm ngặt như lạnh, mang găng tay, thao tác trong tủ cấy vô trùng Quy trình tách chiết RNA gồm các bước cơ bản sau: