thiết lập quy trình real time pcr phát hiện đậu phộng gây dị ứng trong các nguyên liệu sản xuất thực phẩm thương mại

TỔNG QUAN

TỔNG QUAN VỀ ĐẬU PHỘNG

Tên khoa học: Arachis hypogaea L

1.1.2 Nguồn gốc, phân bố và công dụng của đậu phộng

1.1.2.1 Nguồn gốc, phân bố Đậu phộng hay còn gọi là lạc, là cây thực phẩm thuộc họ Đậu có nguồn gốc tại Nam Mỹ (phía nam Bolivia / phía tây bắc Argentina, được phát hiện lần đầu tiên vào khoảng năm 1000 TCN Đậu phộng được trồng phổ biến sang châu Phi, châu Á, châu Âu và quần đảo Thái Bình Dương khoảng vào thế kỷ 16 và 17 với các chuyến đi khám phá của Tây Ban Nha, Bồ Đào Nha, Anh và Hà Lan (Krapovickas, 1969, 1973; Gregort và cộng sự, 1980, 1982; Isleib và cộng sự, 1994) Cây đậu phộng được biết đến ở Trung Quốc và các nước ở Tây Thái Bình Dương như Indonesia, Madagascar nhờ thương nhân người Bồ Đào Nha vào thế kỷ 17 và một loạt các nhà truyền giáo người Mỹ trong thế kỷ 19 và sau đó lan rộng khắp châu Á [1] Ở Việt Nam, lịch sử trồng cây đậu phộng chưa được xác minh rõ ràng, theo kỹ sư Hồ Đình Hải, đậu phộng từ Trung Quốc có thể du nhập vào nước ta khoảng thế kỷ 17-18

Đậu phộng hiện được trồng ở 108 quốc gia, với diện tích khoảng 22,2 triệu ha, trong đó châu Á chiếm 13,69 triệu ha (riêng Ấn Độ là 8 triệu ha và Trung Quốc là 3,84 triệu ha), châu Phi chiếm 7,39 triệu ha (tại khu vực cận Sahara) và Trung, Nam Mỹ chiếm 0,7 triệu ha.

Mỹ Sản lượng trung bình trên quy mô toàn cầu tăng nhẹ từ 1,08 Mt ha-1 trong những năm 1980 lên 1,15 Mt ha-1 vào những năm 1990 (Carley và Fletcher, 1995), và sản lượng toàn cầu là 29 triệu tấn quả Theo thống kê của tổ chức Lương thực và Nông nghiệp Liên hợp Quốc (FAO), Ấn Độ, Trung Quốc và Hoa

Kỳ là những nước đứng đầu về sản xuất và trồng trọt đậu phộng, chiếm khoảng 70% diện tích trồng của thế giới (FAO, 1995-2001) [1]

Công dụng của đậu phộng rất đa dạng, tất cả các bộ phận của cây đều có thể được sử dụng Hạt đậu phộng có thể dùng làm thực phẩm trực tiếp khi luộc hoặc rang, ngoài ra được sử dụng trong các loại món ăn, bánh kẹo nhờ vị thơm và béo của hạt Dầu từ đậu phộng không chỉ được sử dụng cho nấu ăn, sản xuất bơ thực vật, mà còn được sử dụng trong công nghiệp như sản xuất các loại xà phòng trong dân dụng và y tế, là nguồn nhiên liệu cho các động cơ diesel Đậu phộng sau khi ép dầu, phần bã hay còn gọi là bánh dầu vẫn còn chứa một phần chất béo và protein rất cao, được dùng làm nguyên liệu chế biến thức ăn gia súc

Lá và thân cây động phộng giàu nguồn protein và hydrate carbon nên được dùng làm thức ăn tươi hoặc ủ chua cho động vật nhai lại rất tốt Phần vỏ của hạt có thể được sử dụng làm nhiên liệu đốt, làm chất độn cho đất, như một nguồn hóa chất hữu cơ thô Cây đậu phộng có chứa các vi khuẩn cộng sinh tên là Rhizobia, nằm trong các nốt sần của rễ, có khả năng cố định đạm, cung cấp trực tiếp lượng đạm cho cây vừa có tác dụng bổ sung lượng đạm cho vi sinh vật đất (Hồ Đình Hải, 2014)

Các bộ phận từ cây đậu phộng được sử dụng trong cả Đông Y và Tây Y Theo đông y, hạt đậu phộng có vị ngọt, béo và bùi, có tác dụng bổ tỳ, dưỡng vị, nhuận phế, lợi tràng, tiêu đờm, điều hòa khí huyết, tiêu sưng, cầm máu, lợi tiểu, tăng tiết sữa, mát họng, giảm cholesterol, chống lão hóa Theo các nghiên cứu của y học hiện đại, dược tính từ các bộ phận của đậu phộng như acid folic, mangan, amino acid trytophan, vitamin B3, có khả năng giảm nguy cơ sinh con dị tật, ổn định đường huyết, ngăn ngừa sỏi mật, phòng chống trầm cảm, tăng cường trí nhớ, giảm cholesterol, bảo vệ tim mạch, (Hồ Đình Hải, 2014) Tuy nhiên, cũng có một số cảnh báo nguy hiểm đối với người sử dụng đậu phộng Độc tố aflatioxin sinh ra khi đậu phộng nhiễm nấm mốc Aspergillus flavus có khả năng gây ngộ độc thực phẩm trực tiếp và là chất gây ung thư Ngoài ra, hệ miễn dịch của cơ thể một số người có phản ứng quá mẫn đối với

6 các protein chứa trong đậu phộng, gây nên các triệu chứng thể chất nghiêm trọng,.(Hồ Đình Hải, 2014).

ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT HỌC CỦA CÂY ĐẬU PHỘNG

1.2.1 Đặc điểm Đậu phộng là cây thân thảo, thân có thể là thân đứng hoặc thân bò Chiều cao thân khoảng 30-40 cm Thân mọc thẳng, thân non hình tròn, nhưng phần thân mang cành là thân rỗng khi cây ra hoa Thân có 15 - 25 đốt, phần thân gần gốc có đốt ngắn, phần giữa và phía trên thân đốt dài hơn Thân thường có màu xanh hoặc đỏ tím, có lông tơ

Đậu phộng thuộc nhóm thực vật hai lá mầm Đặc điểm dễ nhận dạng là lá mọc đối xứng, xếp xen kẽ nhau Loại lá kép hình lông chim với bốn lá chét có kích thước từ 18-40 mm (dài) và 15-25 mm (rộng) Hình dạng lá chét thường thuôn dài như bầu dục hoặc hình trứng lộn ngược, tạo nên diện mạo đặc trưng cho cây đậu phộng.

Hoa lưỡng tính, thường mọc thành chùm, có 6-7 cái Hoa màu vàng hoặc trắng, cuống hoa dài 2-4 cm, gồm 5 bộ phận: lá bắc, lá đài, tràng hoa, nhị đực,

7 nhụy cái Sau khi thụ phấn, tia củ phát triển dài ra và chui xuống đất, dài 3-7 cm Tia củ ở trên không có màu tím, sau khi xuống đất có màu trắng

Tia củ do mô phân sinh ở gốc bầu hoa hình thành, sau khi thụ tinh, tia củ phát triển đẩy bầu hoa xuống đất Lúc này, quả bắt đầu hình thành và phát triển ở độ sâu 2-7 cm dưới mặt đất Tia củ có cấu tạo như lông hút, nhờ vậy có thể hút được các chất dinh dưỡng như rễ

Quả bao gồm vỏ hạt và 1-4 hạt Vỏ quả gồm có 3 tầng: tầng ngoại bì, tầng trung bì và tầng nội bì Tầng ngoại và tầng trung bì gồm những tế bào cứng, tầng nội bì gồm những tế bào mềm Độ lớn của quả dao động từ 10x5 mm đến 80x12 mm, bề dày của quả biến động từ 0,2-2 mm Số quả trên một cây có thể thay đổi tùy giống và điều kiện trồng trọt

Hạt đậu phộng gồm vỏ lụa bao bọc bên ngoài và phôi với hai lá mầm Hình dạng của hạt có thể là hình tròn, bầu dục dài hoặc ngắn, có rảnh dọc Lượng dầu trong hạt có thể lên đến 50% [2]

Hình 1.2 Cấu tạo hạt đậu phộng

Protein trong đậu phộng chiếm khoảng 21-36%, gồm hai loại Globulin chớnh, chiếm 90-95% trong cỏc loại protein đậu phộng: Arachin (chiếm ắ) và Conarachin (chiếm ẳ) [3]

Theo phân tích của Bộ Nông nghiệp Hoa Kỳ (USDA), trong 100 g đậu phộng có các thành phần acid amin như sau:

Bảng 1.1 Thành phần các acid amin trong đậu phộng

(tính trên 100g) 1.2.2.2 Lipid Đậu phộng chứa hàm lượng lipid khá cao, khoảng 35-55% Hàm lượng acid oleic chiếm chủ yếu trong các loại acid béo Đặc biệt, đậu phộng có khoảng 7% các acid béo mạch dài C-20 archidic, C-22 behenic, C-24 lignoceric là những acid béo đặc trưng chỉ có chủ yếu trong đậu phộng Hàm lượng glyceride chiếm khoảng 96% trong tổng hàm lượng dầu trong đậu phộng Các glyceride được cấu tạo nên chủ yếu từ các acid béo như palmitic, oleic và linoleic, 80% glyceride trong đầu phộng được tạo nên từ các acid béo không no [2]

Trong đậu phộng chứa 5% monosaccharide, bao gồm 2,9% D-glucose và 2,1% D-fructose Hàm lượng oligosaccharide khoảng 3,3%, bao gồm 0,9% sucrose, 1% raffinose, 0,8% stachyose và 0,3% verbascose (E.W., Lusas, 1979) Trong khi đó, polysaccharide trong đậu phộng chủ yếu gồm: tinh bột, glucan, galactoaraban, hemicellulose và cellulose [2]

Acide phytic và muối phytate đóng vai trò là nguồn dự trữ phosphate, thường hiện diện trong lá mầm Bột đậu phộng sau khi tách béo chứa 1,5-1,7% phytate Mặc dù có những ý kiến lo ngại về sự hấp thụ phytate, nhưng một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng acide phytic đóng vai trò quan trọng trong việc làm giảm hàm lượng glucose trong máu, làm giảm hàm lượng cholesterol cũng như làm giảm nguy cơ mắc bệnh ung thư (Shahidi, 1997)

Ngoài ra, trong đậu phộng còn có một hàm lượng đáng kể các hợp chất phenolic, bao gồm: acide phenolic (caffeic, vanillic, syringic, coumaric) hoặc tannins thường tồn tại ở dạng tự do, ester hoặc các dạng liên kết khác Các hợp chất phenolic có thể tác dụng với protein., gây ra mùi vị không mong muốn, làm sậm màu cũng như giảm giá trị của các khoáng chất [2]

Các nguyên tố khoáng có trong đậu phộng chủ yếu gồm K, P, Mg và Ca Còn có các loại vitamin B1, B2, B3, B5, B6, B9

1.2.3 Protein gây dị ứng trong đậu phộng Đậu phộng chứa nhiều protein khác nhau, mỗi loại đều có cấu trúc riêng biệt Một số protein có khả năng gây dị ứng, có thể kích hoạt các kháng thể IgE, mỗi phân tử kháng thể được đặc hiệu với một chất gây dị ứng nhất định Các protein gây dị ứng bao gồm: Ara H1, Ara H2, Ara H3, Ara H4, Ara H5, Ara H6, Ara H7, Ara H8, Ara Agglutinin, Ara HLTP, Ara Holeosin, Ara HT1 [4] Mỗi chất gây dị ứng sẽ ảnh hưởng và gây phản ứng dị ứng đến từng cá nhân một cách khác nhau Mỗi cá nhân sẽ mẫn cảm với một hoặc nhiều loại protein gây dị ứng và không có phản ứng với các loại protein còn lại Trong đó, protein gây dị ứng thường xuyên được phát hiện là nguyên nhân gây dị ứng đáng kể cho người là Ara H2 Trong nghiên cứu của Koppelman và cộng sự (2004), Ara

H2 đã được công nhận là chất gây dị ứng mạnh nhất trong tất cả các xét nghiệm về việc kích hoạt triệu chứng gây dị ứng Ara H2 gây một phản ứng dị ứng với nồng độ rất thấp, trong khi Ara H1 và Ara H3 thì gây phản ứng dị ứng ở mức độ nhẹ hơn và nồng độ của Ara H1 và Ara H3 cao gấp trăm lần Ara H2 thì phản ứng mới xảy ra Becker và cộng sự (2001) đã tính toán tỷ lệ mẫn cảm với các chất gây dị ứng trong 40 bệnh nhân mẫn cảm với đậu phộng Kết quả chỉ ra rằng, Ara H2 gây dị ứng ở 85% bệnh nhân, Ara H1 65%, Ara H4 53% là những chất gây dị uwsngc hính, còn Ara H5 (13%), Ara H6 (38%) và Ara H7 (43%) là những tác nhân gây dị ứng phụ

Scurlock và cộng sự (2004) cho rằng, sự kích thích phản ứng dị ứng của các protein trong đậu phộng có liên quan đến dân tộc và vùng miền Ngoài ra còn có sự ảnh hưởng của các phương pháp chế biến khác nhau trong sản xuất thực phẩm có đậu phộng Điều này có thể giải thích được tại sao một số vùng dân cư người dân có nguy cơ bị dị ứng cao hơn nhiều so với các vùng dân cư khác.

BỆNH DỊ ỨNG THỰC PHẨM

Dị ứng là một phản ứng rối loạn của cơ thể đối với một chất vô hại được gọi là chất gây dị ứng Chất gây dị ứng là chất có khả năng gây ra phản ứng dị ứng, nhưng dung nạp được và vô hại với các cá thể không bị dị ứng [5]

Phản ứng dị ứng xảy ra do hệ miễn dịch của cơ thể quá mẫn cảm Hệ thống miễn dịch nhận nhầm một chất vốn không có hại thành có hại, sau đó tấn công chất này với cường độ vượt mức [5]

Cơ chế gây dị ứng:

Sau khi tiếp xúc với chất gây dị ứng qua đường ăn uống, hít thở hoặc tiếp xúc ngoài da, các chất này sẽ tương tác với tế bào lympho T, kích hoạt quá trình phản ứng miễn dịch của cơ thể.

Tế bào T gặp chất gây dị ứng sẽ giải phóng cytokine, kích hoạt tế bào B tạo thành tế bào plasma Tế bào plasma sản sinh kháng thể IgE liên kết với tế bào mast Khi chất gây dị ứng liên kết với tế bào mast, tế bào sẽ giải phóng histamine Histamine gây giãn mạch máu, dẫn đến các phản ứng viêm.

11 máu, tăng tính thấm của mạch máu, gây kích thích thần kinh, dẫn đến sự ửng đỏ, sưng tấy và ngứa, là những triệu chứng cơ bản của dị ứng [5]

Hình 1.3 Cơ chế gây dị ứng [5]

1.3.2 Bệnh dị ứng thực phẩm

Dị ứng với thực phẩm hiện đang là một trong những vấn đề dinh dưỡng cấp thiết, bởi tất cả các thực phẩm có chứa protein đều có thể là tác nhân gây dị ứng

Dị ứng thực phẩm thường gặp nhất là type I do immunoglobulin E xúc tác phản ứng mẫn cảm Biểu hiện lâm sàng của dị ứng thực phẩm khá đa dạng, từ nổi mày đay, ngứa ran, đau bụng, khó thở cho tới sốc phản vệ và có thể dẫn tới tử vong nếu không được cấp cứu kịp thời [6] Dị ứng thực phẩm hiện nay không có thuốc đặc trị Do vậy, đối với người bị dị ứng, hạn chế sử dụng thực phẩm có chứa chất gây dị ứng hoặc sử dụng các thực phẩm không gây dị ứng là giải pháp hữu hiệu duy nhất [7] Vì vậy, các thành phần dị ứng phải được ghi rõ trong danh sách các thành phần, như được quy định trong phần Phụ lục II của

EU Food Information, Consumers Regulation, điều số 1169/2011 và điều luật sửa đổi Commission Delegated Regulation (EU) điều số 78/2014 Phụ lục này trình bày 14 chất gây dị ứng (và các sản phẩm của chúng) phải được dán nhãn hoặc chỉ ra là có mặt trong thực phẩm là:

- Ngũ cốc có chứa gluten, cụ thể là lúa mì, lúa mạch, lúa mạch đen và yến mạch

- Động vật giáp xác, ví dụ như tôm, cua, tôm hùm, tôm càng xanh

- Hạt, cụ thể là: hạnh nhân, quả phỉ, quả óc chó, hạt điều, hạt hồ đào, hạt Brazil, hạt hồ trăng, hạt macadamia (hoặc Queensland)

- Cần tây (bao gồm celeriac)

Điôxít lưu huỳnh/sunfit là các chất bảo quản được sử dụng trong trái cây sấy khô với hàm lượng trên 10mg/kg hoặc 10mg/L trong thành phẩm.

- Lupin, bao gồm hạt lupin và bột, có thể được tìm thấy trong các loại bánh mì, bánh ngọt và mì ống

- Động vật thân mềm như trai, hàu, ốc biển, ốc sên và mực.

BỆNH DỊ ỨNG ĐẬU PHỘNG

1.4.1 Các triệu chứng của bệnh dị ứng đậu phộng

Phản ứng dị ứng với đậu phộng thường xảy ra trong vòng vài phút sau khi tiếp xúc, và các triệu chứng từ nhẹ đến nặng Triệu chứng dị ứng có thể bao gồm: nổi mề đay ở da, màu da có màu đỏ, đặc biệt là vùng da mặt, có thể sưng tấy; đường hô hấp có hiện tượng khó thở, thở khò khè, ho, nghẹt mũi; người bệnh thường bị nôn mửa, tiêu chảy và đau bụng; nặng nề hơn, người bệnh có khả năng bị tụt huyết áp, nhịp tim không đều, thậm chí là tim ngừng đập [8] Đậu phộng là một vấn đề nghiêm trọng đối với các bệnh nhân dị ứng vì hai lý do Đầu tiên, một phần ba của tất cả các phản ứng dị ứng nghiêm trọng là do bệnh nhân dị ứng đậu phộng [9] và thứ hai, lượng đậu phộng rất thấp có thể kích hoạt cỏc phản ứng dị ứng [10] Trong những nghiờn cứu này, khoảng 100 àg protein đậu phộng là đủ để xuất hiện các phản ứng nhẹ ở người dị ứng đậu phộng Một vấn đề khác cho người bị dị ứng đậu phộng là sự ổn định nhiệt của các chất gây dị ứng trong đậu phộng Trong nghiên cứu của Maleki và cộng sự, tác giả đã mô tả rằng phản ứng IgE với các chất gây dị ứng trong đậu phộng

13 thậm chí còn tăng lên sau khi rang [11] Do đó, không thể làm giảm tiềm năng gây dị ứng của đậu phộng bằng cách xử lý nhiệt như các thực phẩm khác [12] Cho đến nay, cách duy nhất để người tiêu dùng bị dị ứng đậu phộng tránh các phản ứng dị ứng là tránh sử dụng các loại thực phẩm chứa đậu phộng một cách nghiêm ngặt [7] Tuy nhiên, một số nghiên cứu cho thấy rằng việc vô tình ăn phải thực phẩm chứa đậu phộng hoặc các chất gây dị ứng trong thực phẩm vẫn rất phổ biến [7]

1.4.2 Tình hình dị ứng đậu phộng

Tỷ lệ dị ứng đậu phộng ở các nước phương Tây đã được tính là cứ 1000 người thì có 1 người bị dị ứng với đậu phộng, thậm chí có những nước cứ 200 người thì có 1 người bị dị ứng đậu phộng [13] Người ta nhận thấy rằng tỷ lệ bị dị ứng đậu phộng đang gia tăng trong những năm vừa qua Nghiên cứu của Sampson và cộng sự (2003) đã chỉ ra rằng tỷ lệ mắc bệnh dị ứng với đậu phộng ở trẻ dưới 5 tuổi ở Mỹ được đã tăng gấp đôi trong 5 năm từ 1998 đến 2003 Một nghiên cứu khác báo cáo rằng dị ứng đậu phộng chiếm 28% số ca bị dị ứng thực phẩm ở trẻ em [14] Thú vị là những người nhập cư vào Mỹ sau khi theo chế độ ăn uống và lối sống của người Mỹ thì nhanh có cùng mức độ dị ứng như dân bản địa Beyer và cộng sự đã chứng minh điều này bằng nghiên cứu thực hiện năm 2001, nghiên cứu chỉ ra rằng mặc dù Trung Quốc là nơi tiêu thụ đậu phộng rất lớn, nhưng số người bị dị ứng với đậu phộng lại thấp hơn rất nhiều so với

Mỹ Thế nhưng dân số người Mỹ gốc Hoa sống tại Mỹ đã có tỷ lệ dị ứng đậu phộng tương tự với dân số Mỹ [15] Nguyên nhân của hiện tượng này vẫn đang là một câu hỏi cho các nhà nghiên cứu Trong một báo cáo khác thực hiện tại

Tại Hoa Kỳ vào năm 2001, trên 32 trường hợp sốc phản vệ thực phẩm, đậu phộng là nguyên nhân tử vong của 14/32 ca Tỷ lệ dị ứng thực phẩm ở châu Á và Việt Nam thấp hơn đáng kể so với châu Âu Tuy nhiên, nghiên cứu của Lee và cộng sự (2013) cho thấy số lượng phản ứng dị ứng đang tăng đáng kể tại châu Á, đặc biệt là với đậu phộng và các loại hạt.

1.4.3 Các phương pháp nghiên cứu phát hiện đậu phộng

Một số nghiên cứu cho thấy rằng việc vô tình ăn phải thực phẩm chứa đậu phộng hoặc các chất gây dị ứng trong thực phẩm rất phổ biến Trong một nghiên cứu của Thụy Điển, xem xét trong 163 trường hợp phản ứng phản vệ nghiêm trọng đối với thực phẩm thì có 62 trường hợp do dán nhãn không đầy đủ trong sản phẩm thương mại và 71 trường hợp là sản phẩm thực phẩm bị nhiễm các thực phẩm gây dị ứng (Malmheden Yman, 2003) Sự nhiễm các chất gây dị ứng ẩn có thể xảy ra do quá trình làm sạch thiết bị sản xuất không đạt, do sử dụng nguyên liệu nhiễm bẩn hoặc do nhãn không được ghi đầy đủ và chính xác [16] Đặc biệt, theo số liệu thống kê từ Tổng cục hải quan cho biết, kim ngạch xuất khẩu bánh kẹo và các sản phẩm từ ngũ cốc của Việt Nam từ đầu năm đến hết tháng 7/2018 đạt 359,4 triệu USD Bánh kẹo và các sản phẩm từ ngũ cốc của Việt Nam được xuất khẩu chủ yếu sang các thị trường Trung Quốc, Mỹ, Hàn Quốc, Đức, Úc, Do đó, việc phát triển các phương pháp phân tích để phát hiện các chất gây dị ứng là cần thiết để giám sát việc thực hiện dán nhãn trên các sản phẩm theo đúng yêu cầu được quy định, nhằm bảo vệ người tiêu dùng khỏi các chất gây dị ứng ẩn và hỗ trợ các nhà sản xuất thiết lập các khái niệm về hệ thống Phân tích mối nguy và điểm kiểm soát tới hạn (HACCPs), kiểm soát các nguy cơ nhiễm

Theo các nghiên cứu trước đây, các xét nghiệm có thể phát hiện cụ thể nồng độ các chất gây dị ứng tương ứng ít nhất ở mức 10 ppm [16][10] Để phát hiện các chất gây dị ứng trong thực phẩm, xét nghiệm miễn dịch liên kết enzyme (ELISA) có lẽ là phương pháp được sử dụng phổ biến nhất [17] Phần lớn các hệ thống ELISA đều dựa trên việc phát hiện protein gây dị ứng của thực phẩm [18] Thế nhưng, ngành công nghiệp thực phẩm sử dụng rất nhiều phương pháp chế biến thực phẩm như xử lý với nhiệt hoặc rang, có thể ảnh hưởng đến tính toàn vẹn và chất lượng của protein (Hird et al., 2003) Một phương pháp được kiến nghị có thể thay thế cho việc phát hiện trực tiếp các protein, đó là các phương pháp dựa trên DNA vì so với protein thì DNA ổn định hơn sau các quá trình sản xuất, chế biến thực phẩm Các phân tử đích của phương pháp phát hiện này không phải protein mà là các chuỗi DNA cụ thể được khuếch đại bằng phản ứng chuỗi polymerase (PCR) Đối với việc phát hiện sự có mặt đậu phộng,

15 các nghiên cứu gần đây đã phát triển phương pháp realtime-PCR, là một phương pháp có thể áp dụng cho mục đích định lượng Ưu điểm chính của việc sử dụng Realtime PCR cho mục đích này là độ đặc hiệu cao Stephan và cộng sự (2004) đã thử nghiệm trên 33 mẫu thực phẩm thương mại bằng cả hai phương pháp ELISA sandwich và Realtime PCR, đã cho kết quả là giá trị Ct thu được bằng phương pháp Realtime PCR ở tất cả các mẫu dương tính phản ánh tương đương lượng protein được đo bằng phương pháp ELISA sandwich [19] Điều này nhấn mạnh rằng realtime-PCR có thể được sử dụng là phương pháp bán định lượng để phát hiện sự hiện diện của đậu phộng Bên cạnh đó, các phương pháp về sinh học phân tử có tính đặc hiệu tốt hơn các phương pháp miễn dịch [17] Do đó, khảo sát và xây dựng quy trình phát hiện các chất gây dị ứng ở đậu phộng bằng kỹ thuật Realtime PCR là cần thiết

Trong nghiên cứu của Stephan và cộng sự (2004), giới hạn nồng độ thấp nhất để phát hiện được đậu phộng là 10 ppm đậu phộng [16], tương đương với 0.001% Ngưỡng gây dị ứng được chứng minh trong nghiên cứu của Taylor và cộng sự (2002) là 1 mg đậu phộng, đây là ngưỡng gây dị ứng thấp nhất được khảo sát trong những nghiên cứu trước đây Giả sử mẫu thực phẩm có nồng độ

10 ppm đậu phộng, thì người bệnh có khả năng tiêu thụ một lượng thực phẩm lớn hơn 100 g (chứa nhiều hơn 1 mg đậu phộng) và gây ra phản ứng dị ứng Do đó, để đảm bảo tính hiệu quả của quy trình, thí nghiệm cần khảo sát được nồng độ đậu phộng tối thiểu là 0.001% Từ đó, xác định được nồng độ đậu phộng thấp nhất mà quy trình có thể phát hiện được.

PHƯƠNG PHÁP REAL-TIME PCR

Real-time PCR hay còn gọi là PCR thời gian thực là kỹ thuật PCR mà kết quả khuếch đại DNA đích hiển thị ngay sau mỗi chu kỳ nhiệt của phản ứng Kết quả cuối cùng của phản ứng khuếch đại cũng được hiển thị ngay sau khi phản hoàn thành phản ứng khuếch đại Nhờ đó, với real-time PCR, người làm thí nghiệm không cần phải thiết lập các bước thí nghiệm khác để đọc và phân tích kết quả Real-time PCR được thực hiện trong máy có buồng ủ nhiệt, chạy được chương trình luân nhiệt như máy PCR bình thường, nhưng có thêm một thiết bị

16 có khả năng phát ra các tia sáng kích thích (excitation light) lên các mẫu với chiều dài bước sóng nhất định và có camera hoặc cảm biến quang xác định được ánh sáng huỳnh quang phát ra ( từ các phân tử huỳnh quang đã được kích hoạt

Từ đó máy có thể xác định được tín hiệu huỳnh quang thay đổi sau mỗi chu kỳ do số lượng phân tử DNA được tổng hợp tăng lên

Trong định lượng PCR theo thời gian thực, có hai phương pháp phổ biến dùng chất huỳnh quang và đầu dò huỳnh quang Chất huỳnh quang liên kết chặt với DNA sợi đôi, tạo ra ánh sáng huỳnh quang khi được kích thích Khi không có sản phẩm khuếch đại, chất huỳnh quang không phát huỳnh quang đáng kể Ngược lại, khi có sản phẩm khuếch đại, chất huỳnh quang làm phát huỳnh quang ống phản ứng Đầu dò huỳnh quang là các oligonucleôtit sợi đơn, liên kết bổ sung với trình tự đặc hiệu trên sản phẩm khuếch đại Khi có mặt sản phẩm khuếch đại, đầu dò sẽ bắt cặp và phát huỳnh quang khi được kích thích.

1.5.2 Biểu đồ khuếch đại của real-time PCR

Người làm thí nghiệm có thể quan sát được kết quả khuếch đại trong quá trình nhân bản DNA trong real-time PCR nhờ vào biểu đồ khuếch đại (amplification graph) Biểu đồ có trục tung (Y) là cường độ huỳnh quang phát ra từ các ống phản ứng khi nhận ánh sách kích thích, còn trục hoành (X) là các chu kỳ nhiệt Ở biểu đồ khuếch đại của real-time PCR, giai đoạn đầu tiên, khi mà cường độ huỳnh quang mà máy ghi nhận được trong những chu kỳ đầu rất thấp và hầu như không thấy, biểu đồ sẽ hiển thị bằng một đường thằng nằm ngang, được gọi là “giai đoạn ủ” hay “giai đoạn tiềm phục” Khi số lượng bản sao của DNA đích đạt đến một ngưỡng nhất định thì ánh sáng huỳnh quang phát ra sẽ đủ cường độ để được máy ghi nhận, lúc này đường biểu diễn khuếch đại

17 sẽ bắt đầu đi lên Cường độ huỳnh quang trong ống phản ứng từ lúc này sẽ tăng nhanh sau mỗi chu kỳ nhiệt do số lượng bản sao DNA địch tăng gấp đôi sau mỗi chu kỳ Giai đoạn này được gọi là “giai đoạn lũy thừa Khi phản ứng đã cạn dần dNTP và enzyme taq polymerase, cường độ huỳnh quang sẽ chậm dần và đạt đến bình nguyên, giai đoạn này được gọi là “giai đoạn bình nguyên” Các giá trị thể hiện trong biểu đồ của Realtime-PCR gồm có: (1) Baseline (đường nền) là giá trị tín hiệu huỳnh quang tại các chu kỳ đầu của phản ứng; (2) Threshold (ngưỡng) là điểm bắt đầu của sự phát hiện tín hiệu huỳnh quang, tại thời điểm này có thể phân biệt sản phẩm PCR với đường nền; (3) Cycle thresold (Ct – chu kỳ ngưỡng hay Cq – chu kì định lượng) là số chu kỳ mà tại đó sản phẩm khuếch đại có thể được phát hiện bởi sự thay đổi của tín hiệu huỳnh quang; (4) Amplification curve (đường biểu diễn) cho biết tín hiệu huỳnh quang phát ra tại từng chu kỳ phản ứng PCR Ngoài ra còn có các khái niệm khác như Melting curve (phân tích độ đặc hiệu dựa trên nhiệt độ nóng chảy), Standard curve (đường chuẩn),…[20]

Hình 1.4 Biểu đồ đường biểu diễn khuếch đại của phản ứng real-time PCR[20]

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

VẬT LIỆU

2.1.1 Các phần mềm và trang web được sử dụng

NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/): Ngân hàng cơ sở dữ liệu dùng cho việc khai thác thông tin

BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi): Công cụ trực tuyến trên NCBI giúp so sánh, tìm kiếm các trình tự tương đồng trên ngân hàng cơ sở dữ liệu với trình tự mục tiêu

IDT analyzer (https://sg.idtdna.com/calc/analyzer): phần mềm trực tuyến giúp xác định các thông số vật lí của mồi: chiều dài mồi, %GC, nhiệt độ nóng chảy, khả năng hình thành các cấu trúc thứ cấp (Hairpin-dimer, Self-dimer, Hetero-dimer)

Annhyb (phiên bản 4.946): khảo sát sự bắt cặp đặc hiệu của mồi với các trình tự gene mục tiêu

Clustal X (phiên bản 2.1): phần mềm hỗ trợ sắp gióng cột các trình tự, phân tích tương đồng

Bảng 2.2 Các loại mẫu sử dụng cho nghiên cứu

2.1.3 Dụng cụ, thiết bị, hóa chất

Các dụng cụ thông thường trong phòng thí nghiệm sinh học phân tử Các dụng cụ chính bao gồm: Muỗng lấy mẫu, Đèn cồn, eppendorf, cột silica, pipetteman, đầu tips, ống đong, cân

Máy vortex (Vortex ZX3, Velp Ý), Máy ly tâm (MRC ECEN-205, MRC), Máy ủ nhiệt khô (SHB130 STUART, Anh), Tủ hút khí độc (FurniLAB, Việt Nam), Máy Realtime PCR (LightCycler® 96, Roche), Bộ điện di

2.1.3.3 Hóa chất cho quá trình tách chiết:

Mẫu được khảo sát quy trình tách chiết bằng ba bộ kit tách chiết DNA của công ty ABT

- Các hóa chất trong bộ HI-121-DNA Plant Extraction Kit của công ty ABT: CL Buffer, WB1 Buffer, WB2 buffer, EB buffer, Proteinase K, Ethanol

- Các hóa chất trong bộ HI-111-DNA Genome Extraction Kit của công ty ABT: PLS1 Buffer, PLS2 Buffer, PBB Buffer, PWB Buffer, EB Buffer, Ethanol, Rnase A

- Các hóa chất trong phương pháp Phenol/Chloroform: Dung dịch đồng nhất, SDS, Proteinase K, NaCl, dung dịch Phenol, Chloroform buffer, Isoamyl buffer, NaOAC buffer, Isopropanol buffer, EtOH buffer, TE 1X buffer

2.1.3.4 Hóa chất cho quá trình real-time PCR và điện di

SensiMix Probe No Rox (Bioline), Primer forward 100nM, Primer reverse

100 nM, Taqman probe FAM, dd H2O (đã hấp), Agarose (cat# AB0013), TBE 1X (DD-027), Gelred DNA loading buffer tricolor 6X, thang chuẩn 100bp và một số hóa chất khác

PHƯƠNG PHÁP

To investigate peanut allergies, peanut allergens, and peanut detection research, databases such as NCBI were searched using keywords like "peanut," "Allergy," "Arachis Hypogaea," "Detection peanut," "Ara H2," etc Relevant articles were gathered from reputable journals including Journal of Clinical Oncology, Journal of Allergy and Clinical Immunology, Journal of Immunological Methods, Clinical and Experimental Allergy, European Food Research and Technology, Current Biology, and Journal of Agricultural and Food Chemistry.

Dựa vào những công trình nghiên cứu tìm được trên các tạp chí uy tín thế giới liên quan đến các việc phát hiện đậu phộng trên các loại mẫu, tiến hành thu thập các phương pháp sử dụng trong nghiên cứu, loại mẫu, cỡ mẫu Thu thập thông tin và trình tự các cặp mồi khuếch đại các gen mục tiêu từ các bài báo trên NCBI Việc đánh giá mồi bằng phần mềm trực tuyến IDT dựa theo những tiêu chí sau: chiều dài nằm trong khoảng 17-28 bp, %GC nằm trong khoảng 40-60% (nếu hàm lượng %GC cao hơn có thể không biến tính tốt trong quá trình realtime PCR), nhiệt độ nóng chảy Tm nằm trong khoảng 50-65 o C, các cấu trúc thứ cấp như Hairpin loop (cấu trúc kẹp tóc), Self dimer (cấu trúc tự bắt cặp), Hetero dimer (cấu trúc dị bắt cặp) Cách xác định độ bền vững giữa các cấu trúc này dựa trên mức năng lượng tự do delta G (Delta G phải lớn hơn hoặc nằng -9 kcal/mole) Xác định tính đặc hiệu, độ tương đồng của mồi bằng công cụ BLAST, phần mềm Annhyb.

QUY TRÌNH THỰC NGHIỆM

2.3.1 Thí nghiệm 1: Chứng minh tính chuyên biệt của mồi, tối ưu phản ứng Real-time PCR phát hiện đậu phộng

- Tách chiết 3 mẫu đậu bằng phương pháp tách chiết cột với bộ HI-121-DNA Plant Extraction Kit của công ty ABT

22 o Bước 1: Nghiền nhỏ 100 mg mẫu và cho vào tube 1.5 ml cùng với

600 àl PLS1 buffer Cho tiếp 10 àl dung dịch Rnase A vào, vortex đều và ủ ở 65 o C trong 10 phút o Bước 2: Thờm 130 àl PLS2 buffer vào, trộn đều và ủ 5 phỳt trong tủ mát o Bước 3: Ly tõm ở tốc độ 13000 rpm trong 5 phỳt Hỳt 300 àl dịch nổi, chuyển sang tube 1.5 ml mới Thờm vào 450 àl PBB buffer, vortex đều o Bước 4: Chuyển hỗn hợp sang cột silica đặt sẵn trong tube 2 ml Ly tâm ở tốc độ 13000 rpm trong 1 phút Giữ lại cột và loại bỏ phần chất lỏng bên dưới o Bước 5: Đặt lại cột vào tube 2 ml cũ Thờm 500 àl PWB buffer và ly tâm ở tốc độ 13000 rpm trong 1 phút Giữ lại cột và loại bỏ phần chất lỏng bên dưới o Bước 6: Đặt lại cột vào tube 2 ml cũ Thờm 500 àl PWB buffer và ly tâm ở tốc độ 13000 rpm trong 1 phút o Bước 7: Chuyển cột sang tube 1.5 ml mới Thờm 100 àl EB buffer và ủ 1 phút ở nhiệt độ phòng Ly tâm ở tốc độ 13000 rpm trong 1 phút Thu phần dịch chứa DNA bên dưới

- Đo OD xác định nồng độ và độ tinh sạch của DNA sau khi tách chiết

- Thực hiện phản ứng Realtime PCR sử dụng cặp mồi và probe đã khảo sát để khuếch đại gen AraH2 Cặp mồi đã được kiểm tra độ đặc hiệu, đánh giá về các thông số vật lí và kích thước sản phẩm khuếch đại

- Khảo sát nhiệt độ bắt cặp và thời gian kéo dài của bộ mồi theo kết quả khảo sát ở các nguyên cứu trước đây, khảo sát nồng độ mồi xuôi và mồi ngược ở 200 – 600 nM, nồng độ của probe từ 100 – 200 nM, nhằm hạn chế sản phẩm kí sinh không đặc hiệu

- Điện di: tiến hành điện di trên gel Agarose 2%, dung dịch đệm TBE, điện thế 100V trong 30 phút

- Lặp lại thí nghiệm 3 lần để kết quả chính xác và khách quan

- Khảo sát độ nhạy của phản ứng Real-time PCR bằng cách pha loãng các mẫu DNA đậu phộng tách chiết đã được đo OD theo các tỉ lệ 1/10, 1/10 2 , 1/10 3 , 1/10 4 , 1/10 5 , 1/10 6 ; sau đó thực hiện phản ứng Real-time PCR theo số liệu đã khảo sát Xác định được nồng độ DNA thấp nhất mà phản ứng có thể phát hiện

2.3.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát quy trình trên mẫu nguyên liệu thực phẩm

2.3.2.1 So sánh nồng độ DNA mục tiêu ở đậu phộng thô và đậu phộng đã qua chế biến

- Tách chiết 100 mg 1 mẫu đậu phộng thô và 3 mẫu đậu phộng đã qua chế biến (rang, luộc và bơ đậu phộng) bằng phương pháp tách chiết cột với bộ HI-121-DNA Plant Extraction Kit của công ty ABT Sử dụng chứng nội để đánh giá khả năng ức chế phản ứng

- Thực hiện phản ứng Realtime PCR sử dụng cặp mồi và probe đã khảo sát để khuếch đại gen AraH2 Cặp mồi đã được kiểm tra độ đặc hiệu, đánh giá về các thông số vật lí và kích thước sản phẩm khuếch đại

- So sánh chu kỳ ngưỡng của các mẫu đậu phộng

- Lặp lại thí nghiệm 3 lần để có kết quả chính xác và khách quan

2.3.2.2 Khảo sát quy trình trên các mẫu nguyên liệu thực phẩm

- Tách chiết 5 mẫu bột không chứa đậu phộng, 4 mẫu bột có chứa đậu phộng theo tỉ lệ đậu phộng lần lượt là: 0,1%, 0,2%, 0,5%, 1% và đậu phộng thô (như là chứng dương) bằng bộ HI-121-DNA Plant Extraction Kit của công ty ABT, bộ HI-111-DNA Genome Extraction Kit của công ty ABT và phương pháp Phenol/Chloroform

Tiến hành tách chiết 5 mẫu bột không đậu phộng và 4 mẫu bột chứa đậu phộng (tỷ lệ đậu phộng lần lượt là: 0,1%, 0,2%, 0,5%, 1%) cùng với mẫu đậu phộng thô (mẫu chứng dương) bằng bộ sản phẩm HI-121-DNA Plant Extraction Kit của công ty ABT Đối với mỗi mẫu, nghiền nhỏ 100 mg mẫu và cho vào ống nghiệm 1,5 ml, sau đó thêm vào 400 μl dung dịch đệm tách chiết Lysis A và 20 μl dung dịch Rnase A.

600 àl PLS1 buffer Cho tiếp 10 àl dung dịch Rnase A vào, vortex đều và ủ ở 65 o C trong 10 phút

24 o Bước 2: Thờm 130 àl PLS2 buffer vào, trộn đều và ủ 5 phỳt trong tủ mát o Bước 3: Ly tõm ở tốc độ 13000 rpm trong 5 phỳt Hỳt 300 àl dịch nổi, chuyển sang tube 1.5 ml mới Thờm vào 450 àl PBB buffer, vortex đều o Bước 4: Chuyển hỗn hợp sang cột silica đặt sẵn trong tube 2 ml Ly tâm ở tốc độ 13000 rpm trong 1 phút Giữ lại cột và loại bỏ phần chất lỏng bên dưới o Bước 5: Đặt lại cột vào tube 2 ml cũ Thờm 500 àl PWB buffer và ly tâm ở tốc độ 13000 rpm trong 1 phút Giữ lại cột và loại bỏ phần chất lỏng bên dưới o Bước 6: Đặt lại cột vào tube 2 ml cũ Thờm 500 àl PWB buffer và ly tâm ở tốc độ 13000 rpm trong 1 phút o Bước 7: Chuyển cột sang tube 1.5 ml mới Thờm 100 àl EB buffer và ủ 1 phút ở nhiệt độ phòng Ly tâm ở tốc độ 13000 rpm trong 1 phút Thu phần dịch chứa DNA bên dưới

- Tách chiết 5 mẫu bột không chứa đậu phộng, 4 mẫu bột có chứa đậu phộng theo tỉ lệ đậu phộng lần lượt là: 0,1%, 0,2%, 0,5%, 1% và đậu phộng thô (như là chứng dương) bằng bộ HI-111-DNA Genome Extraction Kit của công ty ABT: o Bước 1: 100 mg mẫu được nghiền nhỏ và cho vào tube 1.5 mL cùng với 500 àl CL buffer và 20 àl Proteinase K, vortex đều và ủ ở 65 o C,

10 phút o Bước 2: Thờm 250 àl Ethanol (96-100%), vortex và ly tõm ở tốc độ

6000 rpm trong 30 giây o Bước 3: Thu 600 àl dịch và chuyển sang cột sillica đặt sẵn trong tube

2 mL Ly tâm ở tốc độ 13000 rpm trong 1 phút Giữ lại cột và loại bỏ phần chất lỏng bên dưới o Bước 4: Đặt lại cột và tube 2 ml cũ Thờm 500 àl WB1 buffer và ly tâm ở 13000 rpm trong 1 phút Giữ lại cột và loại bỏ phần chất lỏng bên dưới

25 o Bước 5: Đặt lại cột và tube 2 ml cũ Thờm 500 àl WB2 buffer và ly tâm ở 13000 rpm trong 1 phút Giữ lại cột và loại bỏ phần chất lỏng bên dưới o Bước 6: Chuyển cột sang 1.5 ml mới Thờm 100 àl EB buffer và ủ một phút ở nhiệt độ phòng Ly tâm ở tốc độ 13000 rpm trong 1 phút, thu phần dịch chứa DNA bên dưới

Chúng tôi đã chiết xuất 5 mẫu bột không chứa đậu phộng và 4 mẫu bột có chứa đậu phộng theo nồng độ 0,1%, 0,2%, 0,5%, 1% và đậu phộng thô (đối chứng dương) bằng phương pháp Phenol/Chloroform Đầu tiên, chúng tôi phá vỡ các tế bào để giải phóng DNA.

Nghiền nhỏ 100 mg mẫu và cho vào tube 1.5 ml cựng với 750 àl dung dịch đồng nhất (NaCl 0,4M; Tris HCl 10mM; EDTA 1mM,

Thờm 30 àl SDS 10% và 20 àl Proteinase K 1 mg/ml, đảo đều ống Ủ qua đêm ở nhiệt độ 65 o C o Bước 2: Loại bỏ protein và các thành phần phụ khác

Thờm 250 àl NaCl bóo hũa và ủ 30 phỳt ở nhiệt độ 4 o C

Tiến hành ly tâm 13.000 vòng/phút trong 15 phút Thu 700 àl dịch nổi, loại bỏ phần cặn, bổ sung 700 àl PCI buffer, lắc đều ống và ly tâm 13.000 vòng/phút trong 10 phút

Thu 600 àl dịch nổi, loại bỏ phần cặn, bổ sung 600 àl PCI buffer, lắc đều ống là ly tâm 13.000 vòng/phút trong 10 phút

Thu 500 àl dịch nổi, loại bỏ phần cặn, bổ sung 500 àl Chloroform, lắc đều ống và ly tâm 13.000 vòng/phút trong 10 phút

Thu 400 àl dịch nổi, loại bỏ phần cặn, bổ sung 400 àl Chloroform, lắc đều ống và ly tâm 13.000 vòng/phút trong 10 phút o Bước 3: Tủa DNA

Thu 350 àl dịch nổi, 35 àl dung dịch NaOAc 3M, 350 àl dung dịch Isopropanol, lắc đều và ủ ở nhiệt độ -20 o C trong 2 giờ

Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 20 phút Loại bỏ dịch nổi và thu tủa

Thêm 1 ml Ethanol 70 o Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 10 phút, loại bỏ dịch nổi

Phơi qua đêm ở nhiệt độ phòng (loại bỏ ethanol) o Bước 4: Bảo quản

Bổ sung 100 àl TE 1X Lưu trữ mẫu ở -20 o C

- Đo OD: Tiến hành đo OD ở các bước sóng 260nm và 280 nm để xác định độ tinh sạch, nồng độ và các thông số liên quan Tỷ số A260/A280 nằm trong khoảng 1,8 đến 2,0 cho thấy DNA đã tinh sạch

Kết quả khảo sát nồng độ mồi sử dụng trong Realtime PCR mẫu đậu phộng 34

Nhằm tối ưu phản ứng Realtime PCR, nghiên cứu đã khảo sát nồng độ mồi xuôi và mồi ngược trong khoảng 200 nM – 600 nM trên mẫu DNA đậu phộng thô, cụ thể là các nồng độ: 200 nM, 300 nM, 400 nM, 500 nM 600 nM Khảo sát được lặp lại 3 lần trên mỗi nồng độ, được ký hiệu như sau: C11 – C13 (200 nM), C21 – C23 (300 nM), C31 – C33 (400 nM), C41 – C43 (500 nM), C51 – C53 (600 nM)

Hình 3.10 Kết quả Realtime PCR trình tự DNA đậu phộng với các nồng độ từ

Kết quả Realtime PCR cho thấy tất cả 15 mẫu đều vượt qua giá trị nền và giá trị chu kì ngưỡng nằm trong khoảng từ 26 – 27 chu kì Các kết quả này thể hiện rằng nồng độ mồi trong khoảng 200 – 600 nM không ảnh hưởng đến quá trình khuếch đại trình tự AraH2 có trong đậu phộng Tuy nhiên, nồng độ mồi

300 nM ở mẫu C22 cho kết quả chu kì ngưỡng sớm nhất là 26,66 chu kì Vì vậy, nghiên cứu sử dụng nồng độ mồi là 300 nM và giữ nguyên nồng độ probe để mang lại kết quả chính xác nhất, đồng thời giảm chi phí cho toàn bộ nghiên cứu

STT Mẫu Chu kì ngưỡng

Bảng 3.6 Kết quả chu kì ngưỡng Ct trình tự DNA đậu phộng với các nồng độ mồi từ 200 – 600 nM

Kết quả khảo sát độ nhạy của phản ứng Realtime PCR trên mẫu đậu phộng 36

Mẫu DNA tách chiết từ đậu phộng thô sau khi đo OD cho giá trị nồng độ DNA là 38,598 ng/μl, được pha loãng theo các tỉ lệ: 10 -1 , 10 -2 , 10 -3 , 10 -4 , 10 -5 ,

10 -6 và thực hiện phản ứng Realtime PCR nhằm khảo sát độ nhạy của quy trình trên mẫu đậu phộng Thí nghiệm được lặp lại hai lần để kết quả chính xác và khách quan

Hình 3.11 Kết quả Realtime PCR trình tự DNA đậu phộng được pha loãng

Kết quả Realtime PCR cho thấy có 7/12 mẫu dương tính với nồng độ pha loãng từ 10-1 đến 10-3, tương ứng với lượng mẫu ban đầu là 0,1 mg Độ nhạy của quy trình khá cao, với nồng độ thấp nhất được khuếch đại là 38,598.10-3 ng/μl Ngưỡng gây dị ứng của đậu phộng được xác định trong nghiên cứu của Taylor và cộng sự (2002) là 1 mg, thấp hơn so với các nghiên cứu trước đây.

Do đó, phản ứng này cho kết quả phù hợp với yêu cầu của nghiên cứu

STT Độ pha loãng Chu kì ngưỡng

Bảng 3.7 Kết quả chu kì ngưỡng Ct trình tự DNA được pha loãng

Thí nghiệm 2: Khảo sát quy trình trên mẫu nguyên liệu thực phẩm 38

3.3.2.1 Kết quả so sánh nồng độ đậu phộng ở đậu phộng thô và đậu phộng đã qua chế biến Đậu phộng được sử dụng trong sản xuất thực phẩm thường được xử lý bằng nhiều phương pháp khác nhau để làm chín đậu phộng như luộc, rang hoặc chế biến thành dạng bơ,… Do đó, thí nghiệm được thực hiện nhằm khảo sát sự ảnh hưởng của việc xử lý nhiệt đến nồng độ DNA cũng như độ nhạy của quy trình Thí nghiệm sử dụng đậu phộng thô và 3 mẫu đậu phộng đã qua chế biến là rang, luộc và bơ đậu phộng, được ký hiệu như sau: P11 – P13 (đậu phộng thô), P21 – P23 (đậu phộng rang), P31 – P33 (đậu phộng luộc), P41 – P43 (bơ đậu phộng) Mẫu được cân chính xác, tách chiết và đo OD để kiếm tra độ tinh sạch, kết quả đo OD cho tỉ số A260/A280 đều nằm trong khoảng 1,8 – 2, cho thấy DNA đã được tinh sạch, nồng độ DNA tương đối cao, đủ điều kiện để thực hiện các bước tiếp theo (Dữ liệu không trình bày)

Hình 3.12 Kết quả Reatime PCR trình tự DNA mẫu đậu phông thô và đậu phộng đã qua chế biến

Phản ứng Realtime PCR đã khuếch đại được hoàn toàn trình tự gen AraH2 có trong đậu phộng, thể hiện ở kết quả dương tính ở tất cả 12 mẫu ( hình 3.12 ) Kết quả chu kì ngưỡng ở bảng 3.8 cho thấy các mẫu đậu phộng thô có chu kì sớm nhất trong 4 loại đậu phộng, nằm trong khoảng từ 25 – 26 chu kì, tương đương với nồng độ DNA ban đầu cao hơn so với các loại đậu phộng đã qua xử lý nhiệt, các mẫu đậu phộng rang có kết quả chu kì ngưỡng cao nhất trong khoảng 32 – 33 chu kì, các loại đậu phộng khác cũng nằm trong khoảng chu kì

STT Mẫu Chu kì ngưỡng

Bảng 3.8 Kết quả chu kì ngưỡng Ct trình tự DNA mẫu đậu phộng thô và đậu phộng đã qua chế biến

Như vậy, các phương pháp xử lý nhiệt làm giảm nồng độ DNA đậu phộng trong các loại mẫu Tuy nhiên, theo nghiên cứu trước đây, Maleki và cộng sự (2000) cho rằng phản ứng IgE với các chất gây dị ứng trong đậu phộng tăng lên sau khi rang Do đó, nghiên cứu sử dụng mẫu đậu phộng rang cho thí nghiệm khảo sát độ nhạy nhằm mang lại kết quả có tính hiệu quả và ý nghĩa hơn Ngoài ra, trong quá trình kiểm tra sự hiện diện của đậu phộng trong các loại mẫu, nên kiểm tra ở nhiều lượng mẫu khác nhau để mang lại kết quả kiểm tra chính xác nhất

3.3.2.2 Kết quả khảo sát quy trình trên các mẫu nguyên liệu thực phẩm

3.3.2.2.1 Kết quả khảo sát quy trình tách chiết mẫu nguyên liệu thực phẩm

Nhằm xác định được phương pháp tách chiết tối ưu cho các mẫu nguyên liệu thực phẩm, thí nghiệm đã khảo sát các quy trình tách chiết khác nhau Các phương pháp được khảo sát trong thí nghiệm bao gồm phương pháp Phenol/Chloroform, là phương pháp tách chiết DNA chung dành cho tất cả các loại mẫu, phương pháp tách chiết cột bằng bộ kit HI-121-DNA Plant Extraction Kit của công ty ABT và tách chiết cột bằng bộ kit HI-111-DNA Genome Extraction Kit của công ty ABT Thí nghiệm sử dung 10 mẫu bao gồm: đậu phộng thô (D01), 5 mẫu bột không chứa đậu phộng (B01 – B05), 4 mẫu bột có chứa đậu phộng (M01 – M04) DNA sau khi tách chiết được đo OD để xác định nồng độ và độ tinh khiết của sản phẩm

Nồng độ DNA của các loại mẫu được thể hiện ở bảng 3.9 Trong ba phương pháp tách chiết, tách chiết bằng phương pháp Phenol/Chloroform cho nồng độ DNA cao hơn hẳn so với các phương pháp còn lại do quá trình ly giải tế bào và tủa DNA có thời gian lâu hơn Ngoài ra, phương pháp Phenol/Chloroform là phương pháp chung dành cho tất cả các loại mẫu, do đó, lượng DNA thu được từ phương pháp này là cao hơn các bột kit Genome và Plant Về độ tinh sạch, kết quả đo OD của các phương pháp tách chiết đều cho tỉ số A260/A280 đều nằm trong khoảng 1,8 – 2, cho thấy DNA đã được tinh sạch (Dữ liệu không trình bày)

STT Mẫu Nồng độ DNA (ng/μl)

Bảng 3.9 Kết quả đo OD nồng độ DNA sau khi tách chiết

DNA sau khi tách chiết đã được tiến hành khuếch đại bằng phương pháp Realtime PCR với cặp mồi và probe đã được khảo sát

Kết quả Realtime PCR trình tự DNA tách chiết bằng phương pháp Phenol/Chloroform cho thấy sự hiện diện của đậu phộng trong các mẫu đậu phộng thô và mẫu bột có chứa đậu phộng là 5/5 (100%), các mẫu bột không chứa đậu phộng là 0/5 (0%), hoàn toàn đúng với kết quả mong đợi Phản ứng Realtime PCR trình tự DNA tách chiết bằng bộ kit Plant cũng có kết quả tương tự, tức là 5/5 (100%) mẫu đậu phộng thô và mẫu bột có chứa đậu phộng, 0/5 (0%) với mẫu bột không chứa đậu phộng Đối với kết quả Realtime PCR trình tự DNA tách chiết bằng bộ kit Genome, chỉ phát hiện được sự hiện diện của gen

Phân tích định tính bằng kỹ thuật PCR cho thấy sản phẩm DNA AraH2 ở mẫu đậu phộng thô và các mẫu bột chứa đậu phộng hoàn toàn không được phát hiện Kết quả này chỉ ra rằng bộ kit tách chiết DNA Genome không phù hợp để sử dụng với các mẫu bột.

So sánh nồng độ DNA đo được bằng phương pháp đo OD và kết quả chu kì ngưỡng giữa phương pháp Phenol/Chloroform và phương pháp tách chiết cột bằng bộ kit Plant, ta thấy mặc dù nồng độ DNA thu được ở phương pháp Phenol/Chloroform là cao hơn hẳn so với phương pháp còn lại nhưng kết quả Realtime PCR lại cho chu kì ngưỡng tương đương với nhau, thậm chí chu kì ngưỡng của mẫu đậu phộng thô tách bằng bộ kit Plant (23,82) là sớm hơn so với mẫu đậu phộng tách bằng phương pháp Phenol/Chloroform (25,00)

Hình 3.13 Kết quả Realtime PCR trình tự DNA các mẫu nguyên liệu thực phẩm tách chiết bằng các phương pháp khác nhau

STT Mẫu Chu kì ngưỡng

Bảng 3.10 Kết quả chu kì ngưỡng trình tự DNA các mẫu nguyên liệu thực phẩm tách chiết bằng các phương pháp khác nhau

Sau khi khảo sát các phương pháp, nghiên cứu nhận thấy cả phương pháp Phenol/Chloroform và phương pháp tách chiết cột bằng bộ kit Plant đều phù hợp để tách chiết các loại mẫu bột nhằm phát hiện đậu phộng Tuy nhiên, phương pháp Phenol/Chloroform lại tốn nhiều thời gian hơn so với phương pháp tách chiết cột bằng bộ kit Plant Ngoài ra, tuy lượng DNA thu được bằng phương pháp tách chiết cột bằng bộ kit Plant không cao như lượng DNA tách chiết ở phương pháp Phenol/Chloroform nhưng không ảnh hưởng đến độ nhạy của toàn bộ quy trình Do đó, phương pháp tách chiết cột bằng bộ kit Plant là hoàn toàn tối ưu hơn so với các phương pháp còn lại.

Thí nghiệm 3: Khảo sát độ nhạy của toàn bộ quy trình trên mẫu nguyên liệu thực phẩm chứa đậu phộng

Trong nghiên cứu của Stephan và cộng sự (2004), giới hạn nồng độ thấp nhất để phát hiện được đậu phộng là 10 ppm đậu phộng [16], tương đương với 0.001% Ngưỡng gây dị ứng được chứng minh trong nghiên cứu của Taylor và cộng sự (2002) là 1 mg đậu phộng, đây là ngưỡng gây dị ứng thấp nhất được khảo sát trong những nghiên cứu trước đây Giả sử mẫu thực phẩm có nồng độ

10 ppm đậu phộng, thì người bệnh có khả năng tiêu thụ một lượng thực phẩm lớn hơn 100 g (chứa nhiều hơn 1 mg đậu phộng) và gây ra phản ứng dị ứng Do đó, để đảm bảo tính hiệu quả của quy trình, thí nghiệm cần khảo sát được nồng độ đậu phộng tối thiểu là 0.001% Từ đó, xác định được nồng độ đậu phộng thấp nhất mà quy trình có thể phát hiện được

Để xác định nồng độ đậu phộng có trong mẫu, thí nghiệm sử dụng phương pháp trộn đậu phộng xay nhuyễn với bột mì (mẫu âm tính) theo các tỷ lệ khác nhau: 0,1%, 0,2%, 0,5%, 1% Mỗi tỷ lệ được lấy 5 mẫu để đảm bảo tính chính xác và khách quan của quá trình phân tích.

100 mg mẫu được tách chiết bằng bộ HI-121-DNA Plant Extraction Kit của công ty ABT và đo OD để kiểm tra sự tinh sạch Kết quả đo OD cho tỉ số A260/A280 đều nằm trong khoảng 1,8 – 2, cho thấy DNA đã được tinh sạch, nồng độ DNA tương đối cao, đủ điều kiện để thực hiện các bước tiếp theo (Dữ liệu không trình bày)

Hình 3.14 Kết quả Realtime PCR trình tự DNA mẫu nguyên liệu thực phẩm có chứa đậu phộng

Phản ứng Realtime PCR cho kết quả dương tính 20/20 mẫu (100%) Ngoài ra kết quả phân tích chu kì ngưỡng thể hiện được tương đối nồng độ đậu phộng có chứa trong mẫu Cụ thể, mẫu chứa 0,1 % đậu phộng có chu kì nằm trong khoảng 34 – 37 chu kì, mẫu chứa 0,2% đậu phộng nằm trong khoảng 32 – 35 chu kì, mẫu chứa 0,5% đậu phộng nằm trong khoảng chu kì 31 – 33, mẫu chứa 1% đậu phộng có chu kì nằm trong khoảng 30 – 32 chu kì

STT Mẫu Chu kì ngưỡng

Bảng 3.11 Kết quả chu kì ngưỡng Ct trình tự DNA mẫu nguyên liệu thực phẩm có chứa đậu phộng

Vì kết quả của phản ứng Realtime PCR với các mẫu có tỉ lệ đậu phộng khác nhau ở trên đều dương tính, nên thí nghiệm tiếp tục thực hiện pha loãng mẫu DNA xuống các nồng độ thấp hơn để xác định nồng độ đậu phộng thấp nhất mà quy trình có thể phát hiện được Mẫu DNA tách chiết có tỉ lệ đậu phộng 1% được pha loãng theo cơ số 10, cụ thể là 10 -1 , 10 -2 , 10 -3 , 10 -4 , 10 -5 , 10 -6 và thực hiện phản ứng Realtime PCR với cặp mồi và probe đã được khảo sát Thí nghiệm lặp lại 2 lần để kết quả chính xác và khách quan hơn

Hình 3.15 Kết quả Realtime PCR trình tự DNA mẫu nguyên liệu thực phẩm chứa đậu phộng được pha loãng

STT Độ pha loãng Chu kì ngưỡng

Bảng 3.12 Kết quả chu kì ngưỡng Ct trình tự DNA mẫu nguyên liệu thực phẩm được pha loãng

Kết quả Realtime PCR cho thấy có 6/12 mẫu dương tính, thể hiện ở đường biểu diễn khuếch đại vượt qua giá trị nền Các mẫu dương tính là các mẫu có nồng độ pha loãng 10 -1 , 10 -2 , 10 -3 với các giá trị chu kì ngưỡng chênh lệch không nhiều giữa các lần lặp lại Trong đó, nồng độ đậu phộng thấp nhất mà phản ứng khuếch đại được là 0,001%, tương đương với 0,001 mg đậu phộng Kết quả này hoàn toàn đáp ứng được mong muốn đã đề ra