Nghiên cứu phát hiện quy trình realtime rt pcr phát hiện virus gây bệnh lở mồm long móng ở động vật

BAN QUẢN LÝ KHU NÔNG NGHIỆP CÔNG NGHỆ CAO TP.HCM TRUNG TÂM NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG NGHIỆP CÔNG NGHỆ CAO BÁO CÁO NGHIỆM THU (Đã chỉnh sửa theo góp ý Hội đồng nghiệm thu) NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN QUY TRÌNH REALTIME RTPCR PHÁT HIỆN VIRUS GÂY BỆNH LỞ MỒM LONG MÓNG Ở ĐỘNG VẬT CHỦ NHIỆM NDNC (Ký tên) Đoàn Thị Quỳnh Hương Nguyễn Văn Lượng CƠ QUAN QUẢN LÝ (Ký tên/đóng dấu xác nhận) CƠ QUAN CHỦ TRÌ (Ký tên/đóng dấu xác nhận) THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH THÁNG 1/2016 TĨM TẮT ĐỀ TÀI Quy trình real-time RT-PCR xây dựng thành công nhằm phát virus FMDV gây bệnh Lở mồm long móng (LMLM) mẫu bệnh phẩm thu nhận từ gia súc bị lở mồm long móng Phương pháp tách chiết RNA cách hấp phụ hạt silica cho để sử dụng tách chiết RNA cho quy trình realtime RT-PCR phát FMDV Độ nhạy kỹ thuật quy trình real-time RT-PCR FMDV 193 copy/mL Độ biến thiên nội phản ứng quy trình real-time RTPCR FMDV có %CV 0,06% độ biến thiên liên phản ứng 1,61% Độ đặc hiệu chẩn đoán độ nhạy chẩn đoán 100% mẫu khảo sát dương tính âm tính chứa khơng chứa chứng dương FMDVc Quy trình phát đặc hiệu FMDV mà khơng có phản ứng chéo với tác nhân khác DNA vật chủ (heo) loài vi khuẩn gồm Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Salmonella enteritidis, Shigella dysneteria, Vibrio cholera cho kết real-time PCR âm tính với cặp primer FMDVf-FMDVr Taqman probe FMDVp lại cho kết real-time PCR dương tính với cặp primer đặc hiệu cho tác nhân Khi áp dụng quy trình mẫu bệnh phẩm thực tế, kết thu nhận hoàn toàn tương đồng với quy trình phát phân type FMDV quy trình real-time RT-PCR kết hợp HRM sẵn có Trung tâm Từ khóa: Bệnh lở mồm long móng, real-time RT-PCR, Taqman probe, độ nhạy kỹ thuật, độ đặc hiệu kỹ thuật ABSTRACT: Foot-and-mouth disease virus (FMDV, family Picornaviridae, genus Aphthovirus) causes an acute vesicular disease of pigs and wild and domesticated ruminants such as cattle, water buffalo, sheep, goats, and deer In this study a realtime reverse transcription-polymerase chain reaction (realtime RT-PCR) was developed to detect FMDV Total RNA was extracted using silica-gel based membranes method The LoD of the FMDV real‐time RT‐PCR assay was 193 copy /mL The intra-assay coefficient of variation was 0,06% The inter-assay coefficient of variation was 1,61% Diagnostic sentitivity and specificity were 100% The i analytical specificity of the FMDV real‐time RT‐PCR assay was evaluated by testing with nucleic acids extracted from pigs, Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Salmonella enteritidis, Shigella dysneteria, Vibrio cholera Negative results were obtained with the FMDV Real Time RT‐PCR Assay in all samples No cross‐reactivity was observed with any panel member tested Being applied in clinical samples, it was shown that realtime RT-PCR gave results in good correlation with other real-time PCR-high-resolution melt (RT-PCR-HRM) method Results indicate that this real-time RT-PCR could be successfully used as a sensitive and specific diagnostic method Key words: FMD, real-time RT-PCR, Taqman probe, analytical specificity, analytical sensitivity, ii MỤC LỤC Trang Trang phụ bìa Tóm tắt đề tài i Mục lục iii Danh sách chữ viết tắt v Danh sách bảng, đồ thị vi Danh mục hình vii THƠNG TIN ĐỀ TÀI ix MỞ ĐẦU x Chương - TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan bệnh Lở mồm long móng 1.2 Phương pháp chẩn đốn bệnh Lở mồm long móng 1.3 Tổng quan tình hình nghiên cứu Chương – NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 2.1 Nội dung 1: Thiết kế cặp primer Taqman probe đặc hiệu 14 để phát virus FMD 2.2 Nội dung 2: Xây dựng tối ưu hóa quy trình real-time RT-PCR phát virus FMD 2.3 Nội dung 3: Khảo sát đặc tính kỹ thuật quy trình phát 15 16 virus FMD 2.4 Nội dung 4: Áp dụng quy trình phát phân type virus 17 FMD mẫu bệnh phẩm thu thập từ thực địa Chương - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Nội dung 1: Thiết kế cặp primer Taqman probe đặc hiệu 18 để phát virus FMD 3.2 Nội dung 2: Xây dựng tối ưu hóa quy trình real-time RT-PCR phát virus FMD iii 22 3.2.1 Khảo sát nồng độ primer 23 3.2.2 Khảo sát nồng độ Taqman probe FMDVp 24 3.2.3 Khảo sát phương pháp tách chiết RNA 25 3.3 Nội dung 3: Khảo sát đặc tính kỹ thuật quy trình phát virus FMD 3.3.1 Khảo sát độ đặc hiệu kỹ thuật (Analytical specificity) 28 3.3.2 Khảo sát độ nhạy kỹ thuật (Analytical sensitivity) 30 3.3.3 Khảo sát độ biến thiên nội phản ứng 32 3.3.4 Khảo sát hệ số biến thiên liên phản ứng 34 3.3.5 Khảo sát độ nhạy chẩn đoán độ đặc hiệu chẩn đoán 38 3.4 Nội dung 4: Đánh giá quy trình real-time RT-PCR FMDV 40 mẫu thực tế Chương - KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận 42 4.2 Kiến nghị 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO 44 iv DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT VIẾT TẮT THUẬT NGỮ TIẾNG VIỆT FMD Foot and Mouth Disease LMLM Bệnh lở mồm long móng OIE World Organisation for Animal Health - Tổ chức chăm sóc sức khỏe thú y quốc tế IC Internal Control - Chứng nội LOD Limit of Detection - Giới hạn phát FDA Food and Drug Administration RT-PCR Reverse Transcriptas - Polymerase Chain Reaction v DANH SÁCH BẢNG Số Tên bảng số liệu Trang 2.1 Trình tự số đoạn oligonucleotide sử dụng 14 2.2 Thành phần và nồng đô ̣ hóa chất phản ứng tổng hợp cDNA 15 2.3 Thành phần và nồng ̣ hóa chất phản ứng real-time PCR 16 3.1 Kết kiểm tra đặc tính cặp primer probe 20 3.2 Kết khảo sát nồng độ primer phản ứng Real-time RT-PCR phát FMDV 23 3.3 Kết khảo sát nồng độ Taqman probe phản ứng Real-time RT-PCR FMDV 24 3.4 Kết khảo sát hai phương pháp tách chiết RNA 26 3.5 Kết khảo sát độ nhạy kỹ thuật quy trình real-time RT-PCR FMDV 32 3.6 Kết khảo sát độ biến thiên nội phản ứng quy trình Real-time RT-PCR FMDV 33 3.7 Kết khảo sát độ biến thiên liên phản ứng quy trình real-time RT-PCR FMDV 37 3.8 Kết đánh giá quy trình real-time RT-PCR FMDV mẫu thực tế 41 vi DANH SÁCH HÌNH Số Tên hình ảnh Trang 1.1 Bản đồ phân bố typ virus gây bệnh lở mồm long móng gia súc 1.2 Cấu trúc bề mặt virus FMD 1.3 Cấu trúc gen virus FMD 3.1 Kết so hàng trình tự nucleotide vùng gen 3D type FMDV 19 3.2 Kết khảo sát hoạt động cặp primer-probe-chứng dương 22 3.3 Kết khảo sát nồng độ primer phản ứng Real-time RT-PCR phát FMDV 24 3.4 Kết khảo sát nồng độ Taqman probe phản ứng Real-time RT-PCR FMDV 25 3.5 Kết khảo sát phương pháp tách chiết RNA 26 3.6 Kết khảo sát khả nhân chọn lọc cặp primer probe đặc hiệu FMDV 29 3.7 Kết khảo sát khả nhân loại vật liệu di truyền khác 30 3.8 Kết khảo sát độ nhạy kỹ thuật quy trình Real-time RTPCRFMDV 31 3.9 Kết khảo sát biến thiên nội phản ứng quy trình Real-time RTPCRFMDV 33 3.10A Kết khảo sát độ biến thiên liên phản ứng quy trình real-time RT-PCR FMDV đợt 34 3.10B Kết khảo sát độ biến thiên liên phản ứng quy trình real-time RT-PCR FMDV đợt 35 vii 3.10C Kết khảo sát độ biến thiên liên phản ứng quy trình real-time RT-PCR FMDV đợt 35 3.10D Kết khảo sát độ biến thiên liên phản ứng quy trình real-time RT-PCR FMDV đợt 36 3.10E Kết khảo sát độ biến thiên liên phản ứng quy trình real-time RT-PCR FMDV đợt 36 3.11A Kết khảo sát độ đặc hiệu độ nhạy chẩn đốn quy trình real-time RT-PCR FMDV đợt 39 3.11B Kết khảo sát độ đặc hiệu độ nhạy chẩn đốn quy trình real-time RT-PCR FMDV đợt 39 viii THÔNG TIN ĐỀ TÀI Tên đề tài/dự án: Nghiên cứu phát triển quy trình realtime RT-PCR phát virus gây bệnh lở mồm long móng động vật Chủ nhiệm đề tài/dự án:ThS Đoàn Thị Quỳnh Hương & CN Nguyễn Văn Lượng Cơ quan chủ trì: Trung tâm Nghiên cứu & Phát triển Nơng nghiệp Công nghệ Cao TP HCM Thời gian thực hiện: 12 tháng,từ tháng 01/2015 đến tháng 12/2015 Kinh phí duyệt: 129.247.000đồng Mục tiêu: Phát triển quy trình real-time RT-PCR để phát định tính virus FMD gây bệnh LMLM gia súc đáp ứng nhu cầu ngành thú y cơng tác kiểm sốt dịch bệnh Sản phẩm đề tài /dự án: - Bài báo khoa học ix 22.009 22.019 22.014 0.007071 0.032121 10 22.012 22.023 22.0175 0.007778 0.035327 11 22.035 22.017 22.026 0.012728 0.057786 12 22.009 22.028 22.0185 0.013435 0.061017 13 21.998 21.986 21.992 0.008485 0.038583 14 22 22.014 22.007 0.009899 0.044983 15 22.028 21.983 22.0055 0.03182 0.144599 3.3.4 Khảo sát hệ số biến thiên liên phản ứng Độ biến thiên liên phản ứng hai giá trị để đánh giá độ xác (Precision) quy trình chẩn đoán phân tử [16] Độ biến thiên liên phản ứng định nghĩa biến thiên giá trị chẩn đoán đợt phản ứng khác biểu diễn hệ số biến thiên CV với giá trị phần trăm Để khảo sát độ biến thiên liên phản ứng quy trình phát FMDV RT real-time PCR, thực quy trình Real-time RT-PCR FMDV mẫu chứng dương FMDVc đợt phản ứng khác nhau, đợt lặp lại lần Kết realtime PCR trình bày Hình 3.10A đến Hình 3.10E Hình 3.10A Kết khảo sát độ biến thiên liên phản ứng quy trình real-time RT-PCR FMDV đợt 34 Hình 3.10B Kết khảo sát độ biến thiên liên phản ứng quy trình real-time RT-PCR FMDV đợt Hình 3.10C Kết khảo sát độ biến thiên liên phản ứng quy trình real-time RT-PCR FMDV đợt 35 Hình 3.10D Kết khảo sát độ biến thiên liên phản ứng quy trình real-time RT-PCR FMDV đợt Hình 3.10E Kết khảo sát độ biến thiên liên phản ứng quy trình real-time RT-PCR FMDV đợt 36 Các giá trị chu kỳ ngưỡng khảo sát độ biến thiên liên phản ứng trình bày Bảng 3.7 Bảng 3.7 Kết khảo sát độ biến thiên liên phản ứng quy trình real-time RTPCR FMDV Đợt Lần lặp Ct 6 22.07 22.058 22.094 22.027 22.098 22.094 21.401 21.354 21.596 21.443 20.709 21.447 22.077 22.188 22.091 22.046 22.109 22.089 22.576 22.651 22.521 21.909 21.316 22.147 22.097 22.055 22.086 22.124 22.116 22.041 37 Trung bình 22.073 21.325 22.1 22.186 22.086 Theo Bảng 3.7, giá trị trung bình trung bình (Mean of means) xác định 21,954 độ lệch chuẩn trung bình (Standard deviation of means) 0,354 Như vậy, giá trị %CV độ biến thiên liên phản ứng giá trị độ lệch chuẩn trung bình chia cho giá trị trung bình trung bình nhân với 100 Theo công thức này, giá trị %CV là: 1,615% Trên nguyên tắc quy trình real-time PCR có độ biến thiên nội phản ứng liên phản ứng nhỏ kết thu nhận đáng tin cậy Theo Bustin (2002) độ biến thiên nội phản ứng liên phản ứng khảo sát Ct phản ứng real-time PCR sử dụng Taqman probe nên nhỏ 2% (giá trị %CV) [15] Độ biến thiên nội phản ứng quy trình real-time RT-PCR FMDV có %CV 0,06% độ biến thiên liên phản ứng 1,61% Như quy trình phát FMDV nghiên cứu có độ xác đạt yêu cầu 3.3.5 Khảo sát độ nhạy chẩn đoán độ đặc hiệu chẩn đốn Hai đặc tính kỹ thuật cuối khảo sát cho quy trình real-time RTPCR độ đặc hiệu chẩn đoán độ nhạy chẩn đốn Hai đặc tính kỹ thuật phân biệt với độ đặc hiệu kỹ thuật độ nhạy kỹ thuật quy trình Độ đặc hiệu kỹ thuật đặc tính nói lên khả phát đặc hiệu tác nhân gây bệnh mẫu khảo sát, độ đặc hiệu chẩn đốn đặc tính phát xác mẫu âm tính tổng số mẫu khảo sát không chứa tác nhân gây bệnh Tương tự, độ nhạy kỹ thuật khả phát tác nhân mục tiêu nồng độ thấp độ nhạy chẩn đoán khả phát mẫ dương tính tổng số mẫu khảo sát có chứa tác nhân mục tiêu Độ đặc hiệu kỹ thuật độ nhạy kỹ thuật hai đặc tính để đánh giá khả nội quy trình chẩn đốn phân tử cịn độ đặc hiệu chẩn đốn độ nhạy chẩn đoán dùng để đánh giá khả chẩn đoán bệnh mẫu thực tế quy trình chẩn đốn Để đánh giá độ nhạy độ đặc hiệu chẩn đốn quy trình real-time RTPCR FMDV, việc phát FMDV thực 30 mẫu khơng có chứa mẫu chứng dương FMDVc 30 mẫu có chứa chứng dương Các mẫu mã 38 hóa để q trình đánh giá diễn theo phương cách làm mù (blind test) nhằm tránh tượng thiên vị (bias) Hình 3.11A Kết khảo sát độ đặc hiệu độ nhạy chẩn đốn quy trình realtime RT-PCR FMDVđợt Hình 3.11B Kết khảo sát độ đặc hiệu độ nhạy chẩn đoán quy trình realtime RT-PCR FMDVđợt 39 Kết Hình 3.11A 3.11B cho thấy mẫu chứng âm cho kết âm tính cịn mẫu chứng dương cho kết dương tính Các mẫu khảo sát có mẫu âm mẫu dương xen kẻ Sau giải mã mẫu thí nghiệm mã hóa, chúng tơi thu nhận kết sau: tất 30 mẫu chứa chứng dương FMDVc cho kết real-time PCR dương tính tất 30 mẫu khơng chứa chứng dương FMDVc cho kết real-time PCR âm tính Như vậy, quy trình real-time RTPCR FMDV có độ nhạy lâm sàng 100% độ đặc hiệu chẩn đoán 100% Trên thực tế để thu nhận mẫu khảo sát dương tính âm tính cho thí nghiệm đánh giá độ đặc hiệu chẩn đoán độ nhạy chẩn đoán, người ta thường dùng phương pháp chuẩn (gold standard method) để xác định có hay khơng có tác nhân mục tiêu mẫu khảo sát Từ mẫu dương tính âm tính xác định phương pháp chuẩn tiến hành đánh giá độ đặc hiệu chẩn đốn độ nhạy chẩn đốn quy trình xây dựng Trong nghiên cứu này, khó khăn việc thu nhận mẫu bệnh phẩm thực tế chứa FMDV nên sử dụng mẫu khảo sát chứa chứng dương FMDVc làm mẫu dương tính mẫu khảo sát không chứa chứng dương FMDVc làm mẫu âm tính Việc xây dựng mẫu âm tính dương tính với chứng dương cho phép trường hợp thu nhận mẫu khảo sát dương tính âm tính thực tế chưa có phương pháp chuẩn để xác nhận mẫu khảo sát thực tế dương tính hay âm tính với tác nhân mục tiêu [16] 3.4 Nội dung 4: Đánh giá quy trình real-time RT-PCR FMDV mẫu thực tế Quy trình real-time RT-PCR nhằm phát FMDV thực mẫu thực tế để đánh giá hiệu phát FMDV quy trình Việc đánh giá thực Trung tâm Công nghệ Sinh học TP HCM 10 mẫu bệnh phẩm thực tế sử dụng hai quy trình: quy trình phát FMDV kỹ thuật real-time RT-PCR xây dựng nghiên cứu quy trình phát phân type FMDV kỹ thuật real-time RT-PCR kết hợp HRM sẵn có Trung tâm Cơng nghệ Sinh học Kết đánh giá trình bày Bảng 3.8 40 Bảng 3.8 Kết đánh giá quy trình real-time RT-PCR FMDV mẫu thực tế Mẫu 10 Thông tin mẫu FMDV type O FMDV type O FMDV type O FMDV type O FMDV type O FMDV type O FMDV type O FMDV type A FMDV type A FMDV type O Kết (Ct) 36 36 30 28 28 25 25 21 21 18 Kết luận FMDV dương tính FMDV dương tính FMDV dương tính FMDV dương tính FMDV dương tính FMDV dương tính FMDV dương tính FMDV dương tính FMDV dương tính FMDV dương tính Tất 10 mẫu bệnh phẩm chứa FMDV thuộc hai type O A xác định theo quy trình phát phân type FMDV Trung tâm Công nghệ Sinh học Kết phát FMDV quy trình real-time RT-PCR xây dựng đề tài hoàn toàn tương đồng với kết phát phân type FMDV Trung tâm Công nghệ Sinh học TP HCM 41 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Đề tài xây dựng thành cơng quy trình trình real-time RT-PCR nhằm phát FMDV mẫu bệnh phẩm thu nhận từ gia súc bị lở mồm long móng Phương pháp hấp phụ RNA silica chọn làm phương pháp tách chiết cho quy trình real-time RT-PCR FMDV Nồng độ cặp primer FMDVf/FMDVr 500 nM/phản ứng Taqman probe FMDVp 500 nM/phản ứng cho quy trình real-time PCR FMDV Độ nhạy kỹ thuật quy trình real-time RT-PCR FMDV 193 copy/mL Độ biến thiên nội phản ứng quy trình real-time RT-PCR FMDV có %CV 0,06% độ biến thiên liên phản ứng 1,61% Độ đặc hiệu chẩn đoán độ nhạy chẩn đoán 100% mẫu khảo sát dương tính âm tính chứa khơng chứa chứng dương FMDVc Quy trình real-time RT-PCR FMDV có độ đặc hiệu chẩn đoán 100% độ nhạy chẩn đoán quy trình 100% Quy trình phát đặc hiệu FMDV mà khơng có phản ứng chéo với tác nhân khác DNA vật chủ (heo) loài vi khuẩn gồm Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Salmonella enteritidis, Shigella dysneteria, Vibrio cholera cho kết real-time PCR âm tính với cặp primer FMDVf-FMDVr Taqman probe FMDVp lại cho kết real-time PCR dương tính với cặp primer đặc hiệu cho tác nhân Kết áp dụng quy trình mẫu bệnh phẩm thực tế, có kết hồn tồn tương đồng với quy trình phát phân type FMDV quy trình real-time RT-PCR kết hợp HRM sẵn có Trung tâm 4.2.Kiến nghị Trong hướng nghiên cứu tới, đề nghị tiến hành so sánh việc phát FMDV quy trình xây dựng với kit thương mại hóa Việc so sánh cần thiết để đánh giá chất lượng quy trình xây dựng Nếu kết đánh 42 giá tương đương quy trình xây dựng nghiên cứu với kit thương mại hóa sở vững nhằm phát triển quy trình thành kit để sử dụng phát FMDV thực tế Trong hướng phát triển quy trình thành kit phát FMDV, tiếp tục đánh giá tiêu quan trọng khác thời gian bảo quản, khả chống chịu điều kiện bất lợi để hoàn thành hồ sơ chất lượng cần thiết kit chẩn đốn phân tử để đưa kit vào ứng dụng rộng rãi thực tế 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt: [1] Cục Thú y (2015), Chương trình quốc gia phịng, chống bệnh lở mồm long móng giai đoạn 2015-2020 [2] Hồ Đình Chúc, Ngơ Thanh Long (2003), Phát trâu bị nhiễm virus lở mồm long móng KIT ELISA CHEKIT-FMD-3ABC, Tạp chí Khoa học Kỹ thuật Thú y, 10, 14-32 [3] Nguyễn Thị Thu Hằng, Phạm Thị Nga,Trần thị Thanh Hà, Hồng Cơng Thành, Phạm Sơn Hổ, Nguyễn Thị Huyền, Nguyễn Viết Không (2015), Đặc điểm di truyền học củng virus lở mồm long móng VP02 Type O gây bệnh trâu, bò lợn Việt Nam, Tạp chí Khoa học Kỹ thuật Thú y, (1): 5-13 [4] Nguyễn Xuân Hòa, Bùi Thị Phương (2015), Khảo sát số yếu tố nguy dẫn đến dịch bệnh lở mồm long móng, xác định tỷ lệ nhiễm định serotype virus gây bệnh địa bàn huyện Cẩm Xuyên, tỉnh Hà Tĩnh, Tạp chí Khoa học Kỹ thuật Thú y, (1) 14-21 [5] Nguyễn Viết Không, Nguyễn Văn Hưng, Lê Thắng (2006), Phát type Asia virut LMLM lần Khánh Hòa kỹ thuật RT- PCR Khoa học kỹ thuật thú y 18(4): 96-97 [6] Nguyễn Thanh Liêm, Thái Quốc Hiếu, Nguyễn Văn Hân, Hồ Huỳnh Mai, Trần Thị Dân, Nguyễn Ngọc (2011), Khảo sát biểu lâm sàng yếu tố nguy dịch lở mồm long móng heo vào đầu năm 2011 huyện Chợ Gạo, tỉnh Tiền Giang, Tạp chí Khoa học Kỹ thuật Thú y, (6): 5-10 [7] Tạ Hoàng Long, Nguyễn Văn Hưng, Trịnh Quang Đại, Trương Anh Đức, Nguyễn Thị Hồng Thắm Nguyễn Viết Không (2011), Giám sát phân tử nguyên nhân diễn biến phức tạp cảu dịch lở mồm long móng, Tạp chí Khoa học Kỹ thuật Thú y, (1): 1-10 44 [8] Thái Thị Thúy Phượng, Lê Thanh Hòa (2007), Định type virus LMLM heo, bò Tiền Giang Đồng Tháp qua thị phân tử gene kháng nguyên 1D-2A-2B (VP1-2A-2B), Tạp chí Khoa học Kỹ thuật Thú y, (14) 12-20 [9] Thái Thị Thúy Phượng, Lê Thanh Hòa (2006), Phát topotype khác biệt virus LMLM từ bò lai F1 Đồng Tháp qua giám định phân tử thị 5'-URT, Tạp chí KHKT Thú y, (13) 5-18 [10] Tô Long Thành, Trương Văn Dung, Lê Trần Phan, Đình Duy Kháng Dương Hồng Quân (2004), Thiết lập phương pháp RT-PCR để chẩn đốn định type lở mồm long móng từ bệnh phẩm thực địa, Tạp chí Khoa học Kỹ thuật Thú y, (9) 15-21 [11] Nguyễn Thu Thủy, Nguyễn Văn Long, Phan Quang Minh, Nguyễn Bá Hiên Hoàng Đạo Phấn (2013) Đặc điểm dịch tễ không gian thời gian dịch lở mồm long móng Việt Nam, giai đoạn 2006-2012, Tạp chí Khoa học Kỹ thuật Thú y, (1): 1-10 [12] Nguyễn Thu Thủy, Nguyễn Văn Long, Phan Quang Minh, Trần Thị Thu Phương, Nguyễn Quang Anh, Nguyễn Ngọc Tiến, Nguyễn Đăng Thọ Ngô Thanh Long Nguyễn Bá Hiên (2014), Mức độ lưu hành virus lở mồm long móng yếu tố nguy số tỉnh trọng điểm từ tháng 10 đến tháng 12 năm 2012, Tạp chí Khoa học Phát triển, 12 (3): 345-353 Tài liệu Tiếng Anh: [13] Anonymous (2000), FMD in the Republic of Korea, Australian Veterinary Journal, 78: 445–6 [14] Arzt J., Juleff N., Zhang Z., & Rodriguez L.L., (2011), The Pathogenesis of Foot-and-Mouth Disease I: Viral Pathways in Cattle, Transboundary and emerging diseases, 58(4): 291-304 [15] Bustin S.A.,(2002), Quantification of mRNA using real-time reverse transcription PCR (RT-PCR): trends and problems, Journal of Molecular Endocrinology, 29: 23–39 45 [16] Burd E., (2010), Validation of laboratory-developed molecular assays for infectious diseases, Clinical Microbiology Review, 23: 550-576 [17] Chen T.H., Lee F., Lin Y.L., Dekker A., Chung W.B., Pan C.H., & Tsai H J (2011), Differentiation of foot-and-mouth disease-infected pigs from vaccinated pigs using antibody-detecting sandwich ELISA, The Journal of veterinary medical science/the Japanese Society of Veterinary Science, 73(8): 977-984 [18] Collins R.A., Ko L.S., Fung K.Y., Lau L.T., Xing J., and Yu A.C.,(2002), A method to detect major serotypes of foot-and-mouth disease virus, Biochemical and biophysical research communications, 297(2): 267-274 [19] Daoud H.M., and Soliman E.M., (2015), Evaluation of Spirulina platensis extract as natural antivirus against foot and mouth disease virus strains (A, O, SAT2) Veterinary World, 8(10): 1260-1265 [20] Feng Q., Chen X., Ma O., Liu Y., Ding M., Collins R A., & Chen J., (2003), Serotype and VP1 gene sequence of a foot-and-mouth disease virus from Hong Kong (2002), Biochemical and biophysical research communications, 302(4): 715721 [21] Gleeson L J., (2002), A review of the status of foot and mouth disease in South-East Asia and approaches to control and eradication, Revue scientifique et technique-Office international des épizooties, 21(3): 465-472 [22] Grubman M J., & Baxt B., (2004), Foot-and-mouth disease, Clinical microbiology reviews, 17(2): 465-493 [23] Jackson A L., O'neill H., Maree F., Blignaut B., Carrillo C., Rodriguez L., & Haydon D.T., (2007), Mosaic structure of foot-and-mouth disease virus genomes Journal of general virology, 88(2): 487-492 46 [24] Jamal S.M., and Belsham G.J., (2013), Foot-and-mouth disease: past, present and future, Veterinary Research 44:116 [25] Liferiver (2012), Foot and Mouth Disease virus (FMDV) real-time RT-PCR kit User manual [26] Niedbalski W (2004), Comparison of three ELISA kits for the detection of antibodies against foot-and-mouth disease virus non-structural proteins, Bull Vet Inst Pulawy, 49(2): 147-151 [27] OIE (2012) Foot and Mouth disease, OIE Terrestrial Manual Chapter 2.1.5\ [28] Oem J K et al (2005), Identification and antigenic site analysis of foot-andmouth disease virus from pigs and cattle in Korea, Journal Veterinary Science, 6: 117-124 [29] Olatunde H.O., Kazeem H.M., and Mashood A.R., (2014), Diagnosis of bovine foot and mouth disease virus by real-time polymerase chain reaction and nucleotide sequencing from outbreak herd samples in Ilesha Baruba, Kwara state, Nigeria Veterinary World, 7(10): 868-875 [30] Park J.H., Lee K.N., Ko Y.J., Kim S.M., Lee H.S., Shin Y.K., Sohn H.J., Park J.Y., Yeh J.Y., Lee Y.H., Kim M.J., Joo Y.S., Yoon H., Yoon S.S., Cho I.S., Kim B., (2013), Control of foot-and-mouth disease during 2010–2011 epidemic, South Korea, Emergency Infection Disease, 19: 655-659 [31] Pacheco J.M., Mason P.W (2010), Evaluation of infectivity and transmission of different Asian foot-and-mouth disease viruses in swine, Journal Veterinary Science, 11(2): 133-142 [32] Roche Molecular System Inc (2008), COBAS AmpliPrep/COBAS taqman HCV test package insert [33] Roche (2015), FasStart Taqman probe master Instruction for use [34] Reid S M., Hutchings G.H., Ferris N.P., Zhang Z., Belsham G.K., Alexandersen S (2002), Detection of all seven serotyps of foot-and-mouth disease 47 virus by realtime, fluorogenic reverse transcription polymerase chain reaction assay, Journal Virology Methods, 105: 67-80 [35] Van Phan Le, Tung N., Lee K.N., Ko Y.J., Lee H.S., Van C.N., Thuy D.M., Thi H.D., Kim S.M., Cho I.S and Park J.H (2010), Molecular characterization of serotype A foot-and-mouth disease viruses circulating in Vietnam in 2009, Veterinary Microbiology, 144: 58-66 [36] Van Phan Le, Tung N., Park J.H., Kim S.M., Ko Y.J., Lee H.S., Van C.N., Thuy D.M., Thi H.D., Cho I.S and Lee K.N (2010), Heterogeneity and genetic variations of serotypes O and Asia foot-and-mouth disease viruses isolated in Vietnam, Veterinary Microbiology, 145: 220-229 48