(LUẬN văn THẠC sĩ) nghiên cứu xây dựng quy trình realtime RT PCR chẩn đoán vi rút EV71 gây bệnh tay chân miệng ở trẻ em

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN TRẦN VĂN THỊNH NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH REALTIME RT-PCR CHẨN ĐỐN VI RÚT EV71 GÂY BỆNH TAY CHÂN MIỆNG Ở TRẺ EM LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC HÀ NỘI, NĂM 2017 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN TRẦN VĂN THỊNH NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH REALTIME RT-PCR CHẨN ĐỐN VI RÚT EV71 GÂY BỆNH TAY CHÂN MIỆNG Ở TRẺ EM CHUYÊN NGÀNH: DI TRUYỀN HỌC MÃ SỐ: 60420121 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS LÊ THỊ HỘI TS NGUYỄN VĂN SÁNG HÀ NỘI, NĂM 2017 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com LỜI CẢM ƠN Để hồn thành luận văn này, tơi nhận đƣợc giúp đỡ tận tâm thầy, cô,đồng nghiệp, bạn bè gia đình Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành sâu sắc tới TS.Lê Thị Hội, Khoa Xét nghiệm, Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Trung ƣơng, ngƣời hƣớng dẫn trực tiếp, tận tình bảo tạo điều kiện giúp đỡ q trình nghiên cứu, thực đề tài Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành sâu sắc tới TS Nguyễn Văn Sáng, Bộ mộ Di truyền, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội, thầy đồng hƣớng dẫn, ln nhiệt tình giúp đỡ, bảo động viên tơi q trình thực nghiên cứu hồn thành luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn: - Chủ nhiệm đề tài, Ban điều hành, anh chị đồng nghiệp tham gia thực đề tài Tay Chân Miệng cấp Thành phố tạo điều kiện giúp đỡ thu thập số liệu nghiên cứu - Các anh chị em đồng nghiệp khoa Xét nghiệm, Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Trung ƣơng Tôi xin bày tỏ lịng kính trọng cảm ơn chân thành đến tập thể Giáo sƣ, Tiến sĩ Hội đồng khoa học chấm luận văn Tôi vô biết ơn gia đình ngƣời bạn thân thiết đãđộng viên, chia sẻ giúp đỡ suốt trình học tập, nghiên cứu hồn thành luận văn Xin trân trọng cảm ơn! Trần Văn Thịnh TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com MỤC LỤC MỞ ĐẦU Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Khái niệm bệnh Tay Chân Miệng 1.2.Tình hình bệnh Tay Chân Miệng Thế giới Việt Nam 1.2.1 Tình hình bệnh Tay Chân Miệng Thế giới 1.2.2 Tình hình bệnh Tay Chân Miệng Việt Nam 1.3 Cấu trúc phân tử chế gây bệnh Tay Chân Miệng vi rút EV71 1.3.1 Cấu trúc phân tử vi rút EV71 gây bệnh Tay Chân Miệng 1.3.2 Phƣơng thức truyền bệnh EV71 1.4 Các xét nghiệm chẩn đoán bệnh Tay Chân Miệng ƣu, nhƣợc điểm 1.5 Kỹ thuật Realtime PCR sử dụng Taqman Probe Chƣơng ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 11 2.1 Đối tƣợng nghiên cứu 11 2.2 Vật liệu nghiên cứu 11 2.3 Dụng cụ, trang thiết bị 11 2.4 Thiết kế cặp mồi đặc hiệu mẫu dò Taqman probe đểkhuếch đại gen đặc trƣng Vi rút EV71 12 2.4.1.Các nguyên tắc thiết kế mồi 12 2.4.2 Các nguyên tắc thiết kế Probe 12 2.4.3 Các phần mềm sử dụng 13 2.4.4 Phƣơng pháp tiến hành 13 2.5 Phƣơng pháp tách chiết RNA tổng số từ chủng vi rút EV71 14 2.6.Phản ứng Realtime RT-PCR 15 2.7 Phƣơng pháp điện di 16 2.8 Tối ƣu hóa phản ứng Realtime RT-PCR để chẩn đoán vi rút EV71 gây bệnh Tay Chân Miệng 16 2.8.1 Phƣơng pháp RT-PCR nhân gen đặc trƣng virus EV71 16 2.8.2 Tối ƣu nhiệt độ kéo dài 17 2.8.3 Tối ƣu nồng độ Magie 17 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com 2.9 Xác định độ nhạy phản ứng Realtim RT - PCR 17 2.9.1 Phƣơng pháp đo nồng độ xác định số plasmid 17 2.9.2 Phƣơng pháp xác định độ nhạy phản ứng RT-PCR 18 2.10.Xác định độ đặc hiệu phản ứng chủng vi rút khác 19 Chƣơng KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 21 3.1 Phân tích, so sánh trình tự phần mềm ClustalX 21 3.2 Kết thiết kế mồi mẫu dò 22 3.3 Kết khảo sát hoạt động hệ mồi thực nghiệm 25 3.4 Kết tối ƣu nhiệt độ phản ứng RT-PCR 26 3.5 Kết tối ƣu nồng độ Magie phản ứng RT-PCR 28 3.6 Kết khuếch đại đƣờng chuẩn phản ứng RT-PCR 30 3.7 Độ nhạy phản ứng RT-PCR plasmid tách dòng 31 3.8 Độ nhạy phản ứng RT-PCR virut EV71 nuôi cấy 32 3.9 Kết xác định độ đặc hiệu phản ứng Realtimr RT- PCR chủng vi rút khác 33 KẾT LUẬN 41 KIẾN NGHỊ 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1: Thành phần phản ứng Realtime RT-PCRkhuếch đại vùng gen đặc trƣng EV71 15 Bảng 2.2: Thành phần phản ứng RT-PCR khuếch đại gen EV71 16 Bảng 2.3: Thành phần phản ứng RT-PCR khuếch đại gen EV71 18 Bảng 3.1: Mã số truy cập trình tự gene EV71 .21 Bảng 3.2: Trình tự cặp mồi mẫu dò thiết kế 22 Bảng 3.3: Các thông số đặc tính mồi mẫu dị .23 Bảng 3.4: Chu kỳ ngƣỡng RT-PCR nồng độ Magie khác 29 Bảng 3.5: Độ nhạy phản ứng RT-PCR plasmid tách dòng 31 Bảng 3.6: Độ nhạy phản ứng RT-PCR vi rút nuôi cấy 32 Bảng 3.7: Kết xác định độ đặc hiệu phản ứng RT-PCR 33 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Sơ đồ cấu trúc gen EV71 Hình 3.1: Kết sắpdóng cột trình tự EV71 22 Hình 3.2: Kết BLAST trình tự mồi xi NCBI .23 Hình 3.3: Kết BLAST trình tự mồi ngƣợc NCBI 24 Hình 3.4: Kết BLAST trình tự mẫu dò NCBI 24 Hình 3.5: Kết phản ứng Realtime RT-PCR 10 chủng vi rút ni cấy .25 Hình 3.6: Kết điện di sau chạy PCR 10 chủng vi rút ni cấy 26 Hình 3.7: Biểu đồ khuếch đại RT-PCR 52oC .26 Hình 3.8: Biểu đồ khuếch đại RT-PCR 55oC .27 Hình 3.9: Biểu đồ khuếch đại RT-PCR 58oC .27 Hình 3.10: Biểu đồ khuếch đại RT-PCR 60oC .28 Hình 3.11: Đƣờng khuếch đại RT-PCR nồng độ Magie khác .29 Hình 3.12: Đồ thị khuếch đại mẫu plasmid pha loãng 30 Hình 3.13: Đƣờng chuẩn RT-PCR từ plasmid pha lỗng 30 Hình 3.14: Điệndi đồ sản phẩm RT-PCR từ plamid tách dịng pha lỗng 31 Hình 3.15: Đồ thị khuếch đại mẫu vi rút ni cấy pha lỗng 32 Hình 3.16: Điện đồ sản phẩm RT-PCR từ vi rút ni cấy pha lỗng 33 Hình 3.17: Đồ thị phản ứng RT-PCR xác định tính đặc hiệu 34 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT µl Microlit Aci Acinetobacter baumannii BLAST Basic Local Alignment Search Tool bp Base pairs CA Coxsackievirus A CA16 Coxsackievirus A16 CB Coxsackievirus B CMV Cytomegalovirus Ct Threshold Cycle DNA Deoxyribonucleic Acid dNTPs Deoxyribonucleotide Triphosphate E coli Escherichia coli EV71 Enterovirus 71 HSV Hepes simplex virus IDT Integrated DNA Technologies IFA Indirect Immunofluorescence Assay IgM Immunoglobulin M kb Kilobase pairs Kp Klebsiella pneumoniae ml Millilit mM Millimol NCBI National Center for Biotechnology Information PCR Polymerase chain reaction RNA Ribonucleic Acid RT-PCR Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction TPHCM Thành phốHồ Chí Minh UTRs Untranslated Regions UV Ultra violet TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com MỞ ĐẦU Tay Chân Miệnglà bệnh truyền nhiễm lây từ ngƣời sang ngƣời, dễ gây thành dịch Bệnh vi rút đƣờng ruột (enterovirus) gây Trong năm gần đây, bệnh Tay Chân Miệng bệnh truyền nhiễm đƣợc đặc biệt quan tâm không Việt Nam mà cịn tồn giới Các vụ dịch Tay Chân Miệng thƣờng xảy năm toàn quốc bao gồm hai miền Bắc Nam từ tháng đến tháng 11 Các biến chứng nhƣ: hôn mê, co giật, phù phổi cấp, viêm tim khơng đƣợc điều trị kịp thời có tỷ lệ tử vong cao Hơn nữa, biến chứng thần kinh EV71 gây nên kéo theo di chứng tàn tật suốt đời cho trẻ gánh nặng cho bệnh nhân, gia đình xã hội Xét nghiệm chẩn đốn xác định vi rút EV71 phƣơng pháp ni cấy, phân lập thƣờng đòi hỏi thời gian kỹ thuật cao Tại Việt Nam có vài đơn vị có đủ điều kiện thực đƣợc kỹ thuật Vì vậy, khó thực rộng rãi sở y tế bệnh viện, gây khó khăn việc chẩn đoán điều trị kịp thời Hiện nay, kỹ thuật sinh học phân tử đời, mở kỷ nguyên cho việc chẩn đốn ngun gây bệnh nói chung bệnh Tay Chân Miệng nói riêng Cơng nghệ chẩn đốn dựa kỹ thuật Realtime RT-PCR sử dụng công nghệ Taqman probe chẩn đốn đặc hiệu EV71 khơng cho kết nhanh, xác mà cịn xác định đƣợc từ bệnh phẩm vết loét bệnh nhân[50] Kỹ thuật có độ nhạy độ đặc hiệu cao nhiều so với kỹ thuật PCR thơng thƣờng Ngồi kỹ thuật Realtime RT-PCR cho phép chẩn đoán ca bệnh giai đoạn sớm rút ngắn nhiều thời gian xét nghiệm so với phƣơng pháp PCR thông thƣờng phƣơng pháp xét nghiệm miễn dịch kháng nguyên - kháng thể Với đặc điểm trội nhƣ vậy, kỹ thuật nên đƣợc áp dụng bệnh viện đặc biệt bệnh viện có khoa truyền nhiễm, viện vệ sinh phịng dịch, giúp chẩn đốn sớm định hƣớng cho điều trị bệnh nhân, tránh đƣợc biến chứng đáng tiếc xảy chậm trễ q trình chẩn đốn điều trị Ngồi việc chẩn đoán bệnh sớm giúp cho sở y tế có biện pháp phịng bệnh hiệu quả, giám sát chặt chẽ tình hình dịch bệnh xảy Việc phòng chống bệnh Tay Chân Miệng đƣợc Bộ Y tế thức đƣa vào nhóm bệnh truyền nhiễm bắt buộc phải khai báo Và năm gần đây, số ca mắc, chết bệnh Tay Chân Miệng tăng lên nhanh chóng TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com Hiện Việt Nam, việc chẩn đoán vi rút EV71 gây bệnh Tay Chân Miệng sử dụng kit thƣơng mại thƣờng đƣợc nhập từ nƣớc ngồi, có giá thành cao nhiều chẩn đốn khơng xác chủng vi rút lƣu hành Việt Nam Ở nƣớc chƣa có đơn vị xây dựng phát triển quy trìnhkỹ thuật One-Step Realtime RT - PCR chẩn đoán bệnh Tay Chân Miệng Đây hạn chế việc chủ động nhanh chóng phịng chống dịch bệnh nƣớc, tiết kiệm chi phí cho bệnh nhân Các kit thƣơng mại sử dụng test nhanh cho tỉ lệ dƣơng tính giả âm tính giả cao xét nghiệm đƣợc bệnh phẩm máu Kỹ thuật chẩn đốn ni cấy phân lập đƣợc thực vài sở có phịng xét nghiệm an toàn cấp Do việc nghiên cứu xây dựng quy trình Realtime RT-PCR bƣớc tiến cơng nghệ chẩn đốn giúp chẩn đốn nhanh, xác tác nhân gây bệnh giảm chi phí xét nghiệm cho bệnh nhân Đề tài nghiên cứu tập trung vào mục tiêu:Nghiên cứu xây dựng quy trình Realtime RT-PCR chẩn đoán vi rút EV71 gây bệnh Tay Chân Miệng trẻ em, có độ nhạy độ đặc hiệu cao Để đạt đƣợc mục tiêu trên, góp phần vào cơng tác chẩn đốn, điều trị phịng bệnh kịp thời dịch bệnh Tay Chân Miệng EV71 gây nên, tiến hành đề tài với mục tiêu nghiên cứu sau: - Nghiên cứu thiết kế cặp mồi đặc hiệu mẫu dò Taqman Probe để khuếch đại gen đặc trƣng vi rút EV71 kỹ thuật Realtime RT - PCR -Xác định độ nhạy độ đặc hiệu phản ứng Realtime RT - PCR TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com 106 105 104 103 102 101 Hình 3.17: Đồ thị phản ứng RT-PCR xác định tính đặc hiệu Kết cho thấy, phản ứng realtime RT-PCR cho kết dƣơng tính mẫu RNA chủng vi rút EV71 nuôi cấy mẫu bệnh phẩm dƣơng tính EV71, khơng xảy phản ứng chéo với vi rút vi khuẩn gây bệnh khác Nhƣ vậy, độ đặc hiệu phản ứngnày nghiên cứu đạt 100% Kết đƣợc thể bảng 10 hình 18 Nhƣ vậy, phản ứng realtime RT-PCR mà thực đƣợc xác định độ đặc hiệu, đảm bảo độ tin cậy để ứng dụng quy trình chẩn đốn bệnh Tay Chân Miệng dƣơng tính với EV71 từ mẫu bệnh phẩm Quy trình chẩn đốn phƣơng pháp One-Step Realtime RT-PCR đƣợc nhóm nghiên cứu tối ƣu hóa với độ nhạy 100 copies/ml độ đặc hiệu 100% 102 Kết tƣơng đồng với kết nghiên cứu tác giả Tan E.L năm 2008 Singapore [42], tác giả Hwang S năm 2013 Hàn Quốc [22] tác giả Zhang S năm 2014 Trung Quốc [53] Các tác giả đề xuất nên áp dụng phƣơng pháp realtime RT-PCR chẩn đoán EV71 thƣờng quy bệnh viện cơng cụ chẩn đốn nhanh xác EV71 vụ dịch Trong nghiên cứu tác giả Tan E.L độ nhạy realtime RT-PCR việc phát EV71 34 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com từmẫu bệnh phẩm đƣợc so sánh với phƣơng pháp nuôi cấy mô Tổng cộng 67 mẫu bệnh phẩm realtime RT-PCR phát EV71 49 mẫu bệnh phẩm, nhiên phƣơng pháp ni cấy mơ khơng phát EV71 tất mẫu [42] Rất nhiều nghiên cứu phát triển realtime RT-PCR để chẩn đoán nhiều tác nhân lúc: duplex, triplex… nghiên cứu cho thấy sử dụng cặp mồi đặc hiệu vùng VP1 khơng xảy dƣơng tính chéo EV71 Coxsackievirus nhƣcác loại enterovirus khác [22],[53] Để phát đƣợc tải lƣợng vi rút thấp mẫu bệnh phẩm, tác giả Niu P công năm 2016 [33] xuất báo đề xuất sử dụng phƣơng pháp real-time nested RT-PCR nhằm tăng độ nhạy phản ứng Ở Việt Nam chƣa có nhóm nghiên cứu phát triển quy trình One-Step Realtime RT-PCR chẩn đoán vi rút gây bệnh Tay Chân Miệng, đặc biệt EV71 Với độ nhạy độ đặc hiệu phƣơng pháp Realtime RT-PCR, nhóm nghiên cứu đề xuất chuyển giao kỹ thuật cho bệnh viện, sở y tế có đủ điều kiện để áp dụng kỹ thuật vào chẩn đoán thƣờng quy Từ kết trên,quy trình One-Step Realtime RT – PCR đƣợc tóm tắt nhƣ sau: - Nguyên lý kỹ thuật: Bộ Kít ứng dụng kỹ thuật Realtime RT-PCR chẩn đoán vi rút EV71 gây bệnh Tay Chân Miệng, với cặp mồi đặc hiệu để nhân lên đoạn gen đặc trƣng vi rút EV71, mẫu dò đƣợc thiết kế theo cơng nghệ Taqmanprobe Đầu 5’ mẫu dị đƣợc gắn chất hóa học có khả phát huỳnh quang nhận đƣợc nguồn sáng kích thích, đầu cịn lại có khả hấp thụ ánh sáng huỳnh quang, có sản phẩm khuếch đại, có phát quang ống phản ứng, hệ thống camare ghi nhận phát quang đƣa đƣờng biểu diễn khuếch đại huỳnh quang có mặt vi rút EV71 mẫu bệnh phẩm Chƣơng trình chạy RT-PCR: chu kỳ ở 52oC – 15 phút, 95°C- phút, tiế p theo 45 chu kỳ (95°C – 30 giây, 55°C – 30 giây: đọc kết bƣớc này) Vùng gen đặc trƣng virus EV71 đƣợc phát cách đo mật độ quang sau chu kỳ phản ứng 35 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com - Các bƣớc để thực quy trình Kít: + Rã đơng hóa chất trƣớc tiến hành phản ứng + Tính tốn số mẫu thực tế cần phải làm + Số phản ứng = chứng âm + chứng dƣơng + số mẫu cần thực + Chuẩn bị Eppendoft sạch, trộn thành phần phản ứng theo cơng thức + Hút 20µl hỗn hợp Mix vào ống PCR + Hút 5µl mẫu bệnh phẩm, chứng âm, chứng dƣơng vào tube PCR, bị cho vào máy Realtime PCR + Cài đặt chu trình nhiệt theo hƣớng dẫn Kít - Phân tích kết quả: + Mẻ chạy có giá trị chứng âm khơng có đƣờng đồ thị huỳnh quang vịng 40 chu kỳ phản ứng + Chứng dƣơng có đƣờng cong đồ thị huỳnh quang đƣờng chuẩn khoảng chu kỳ 30 tới 33 + Các mẫu có có đƣờng cong đồ thị huỳnh quang đƣờng chuẩn ≤ 35 chu kỳ đƣợc coi dƣơng tính >35 chu kỳ đƣợc coi âm tính 36 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com KẾT QUẢ ỨNG DỤNG KỸ THUẬT REALTIME RT-PCR TRONG XÁC ĐỊNH VI RÚT EV71 GÂY BỆNH TAY CHÂN MIỆNG TẠI BỆNH VIỆN ĐA KHOA ĐỐNG ĐA HÀ NỘI Nhóm nghiên cứu thu thập đƣợc 69 mẫubệnh phẩm dịch ngoáy họng từ 69 bệnh nhân nghi ngờ nhiễm Tay Chân Miệng đƣợc thu thập từ tháng 1/2016 đến tháng 12/2016 đƣợc lấy Khoa Truyền nhiễm bệnh viện Đống Đa EV 71 vi rút thuộc enterovirus đƣờng ruột thuộc họ picornaviridae Vi rút xâm nhập vào thể qua đƣờng tiêu hóa thƣờng khu trú phân vùng hầu họng Do vậy, phân dịch họng bệnh phẩm thƣờng đƣợc nghiên cứu nƣớc lựa chọn để thực xét nghiệm nhằm phát enterovirus phƣơng pháp RT-PCR hay Realtime RT-PCR Ngoài dịch họng bệnh phẩm dễ lấy phƣơng pháp PCR dịch họng đƣợc chứng minh cho độ nhạy độ đặc hiệu cao [3] [16] Do nhóm nghiên cứu đề xuất lấy mẫu dịch ngoáy họng bệnh nhân bệnh viện Đống Đa để làm xét nghiệm chẩn đoán xác định nhiễm EV71 Bệnh phẩm đƣợc tách chiết RNA thực phản ứng Realtime PCR theo quy trình chuẩn Mẫu dƣơng tính Mẫu âm tính 0% 30,4% 69,6% Trong số 69 bệnh nhân đƣợc làm xét nghiệm, có 21 bệnh nhân dƣơng tính với vi rút EV71, số có 10 bệnh nhân nữ, 11 bệnh nhân nam 37 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com Các bệnh nhân tới khám Bệnh viện Đống Đa thƣờng cƣ trú địa bàn quận, khu vực lân cận Do tỷ lệ khơng đại diện để phản ánh đƣợc tỷ lệ nhiễm bệnh Tay Chân Miệng bệnh viện khác địa bàn thành phố Tại thời điểm nghiên cứu, không thu thập đƣợc bệnh nhân nghi nhiễm EV71 bị biến chứng thần kinh, nhiên với quy trình tách chiết RNA chuẩn, với hiệu bắt cặp khuếch đại tác nhân đích cặp mồi- mẫu đị, đƣợc kiểm chứng thông qua việc thực phản ứng Realtime PCR chủng chuẩn đƣợc nuôi cấy, mẫu bệnh phẩm thực tế, đảm bảo Kít phát đƣợc vi rút EV71 bệnh phẩm dịch não tủy bệnh nhân nghi nhiễm Tay Chân Miệng có biến chứng thần kinh Trong số 69 bệnh nhân nghi ngờ nhiễm Tay Chân Miệng đƣợc làm xét nghiệm, có 21 bệnh nhân dƣơng tính với vi rút EV71, chiếm tỷ lệ 30.4% Tỷ lệ thấp tỷ lệ nghiên cứu Niu P cộng năm 2016 (41%) tác giả sử dụng phƣơng pháp Real-time nested RT-PCR nhƣng cao so với phƣơng pháp Realtime RT-PCR mà tác giả sử dụng nghiên cứu (21%) Với phƣơng pháp Real-time nested RT-PCR nghiên cứu Niu P sử dụng đƣợc chứng minh tăng độ nhạy phản ứng nhằm phát tải lƣợng vi rút thấp mẫu bệnh phẩm Trong nghiên cứu gần Nguyễn Kim Thƣ [5], tỷ lệ dƣơng tính với EV71 chiếm 54,5% tổng số 1170 bệnh nhân đƣợc khẳng định dƣơng tính với enterovirus kỹ thuật RT-PCR Trong nghiên cứu chúng tôi, 69 mẫu bệnh phẩm đƣợc thu từ 69 bệnh nhân nghi ngờ nhiễm Tay Chân Miệng Còn nghiên cứu Nguyễn Kim Thƣ 1170 bệnh nhân đƣợc khẳng định nhiễm enterovirus [5] Tỷ lệ nhiễm EV71 nghiên cứu ghi nhận có dao động mức độ khác Tỷ lệ mắc EV71 đợt dịch Thƣợng Hải 86,5% vào năm 2009 84,5% vào năm 2010 [49] Tuy nhiên, năm 2009 tỷ lệ 50,4% Quảng Đông, 36% Bắc Kinh [27] Tiếp theo, đến năm 2012, đợt dịch TCM tỉnh Guangzhou lại ghi nhận 22,4% trƣờng hợp EV71 [48] Tại Đài Loan, giai đoạn 1987-1988, báo cáo ghi nhận tỷ lệ nhiễm EV71 khoảng 60-70% Tuy nhiên, nhữngnăm tiếp 38 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com theo, tỷ lệ nhiễm EV71 giảm xuống, 2% năm 1999 20,5% năm 2000 [44] [20] [19] Tại thành phố Yokohama (Nhật Bản), đợt dịch vào năm từ 1982 đến năm 2000 ghi nhận vai trò EV71 [31] Điều cho thấy tính đa dạng phân bố EV71 vụ dịch TCM Ở Việt Nam, báo cáo tỷ lệ nhiễm EV71 vụ dịch TCM thƣờng lẻ tẻ, tập trung vùng khu vực Các tác giả sử dụng phƣơng pháp khác việc xác định enterovirus EV71 gây bệnh Tay Chân Miệng Tỷ lệ bệnh nhân dƣới tuổi Bệnh viện Đống Đa nghiên cứu chiếm 85% Nhóm tuổi từ 1-2 tuổi chiếm 50% nhóm tuổi 3-6 tuổi chiếm 35% Nhóm tuổi chiếm 15% Kết tƣơng tự với kết nghiên cứu Phan Văn Tú nghiên cứu bệnh nhân TCM năm 2005 miền Nam Việt Nam cho kết 79,9% trẻ dƣới tuổi 43,9% lứa tuổi từ 1-2 Kết nghiên cứu Nguyễn Kim Thƣ nghiên cứu bệnh nhân Tay Chân Miệng toàn quốc năm 2012 có kết tƣơng tự [5] Tỷ lệ bệnh nhân tuổitrong nghiên cứu chúng tơi có tỷ lệ cao so với nghiên cứu tác giả khác[48] Tỷ lệ nhiễm bệnh thấp bệnh nhân tuổi dƣới tuổi giải thích trẻ dƣới tuổi mắc bệnh cịn kháng thể mẹ truyền sang thời kỳ bào thai Lƣợng kháng thể giảm dần nên cháu có nguy mắc bệnh nhiều Các nghiên cứu Trung Quốc, Đài Loan Singapore cho thấy tỷ lệ trẻ có kháng thể kháng EV71 trẻ dƣới tháng 38-44%; trẻ 7-12 tháng 0-15% Kháng thể kháng EV sau tăng dần đạt 50% lứa tuổi ≥ tuổi [WHO 2011] [15], từ tuổi trở lên, tỷ lệ mắc TCM giảm Ngoài ra, lứa tuổi biết đi, cháu thƣờng hay tiếp xúc với bề mặt vật dụng nhà nhƣ sàn nhà, mặt bàn ghế, đồ chơi… nên nhiều nguy mắc bệnh Trong số 21 bệnh nhân bị nhiễm EV71, có 10 bệnh nhân nữ chiếm 47.6%, 11 bệnh nhân nam chiếm 52.4% Nghiên cứu Trƣơng Hữu Khanh năm 2011, Nguyễn Kim Thƣ năm 2012 cho kết cao so với nghiên cứu với tỷ lệ tƣơng tự 62% 63.5% bệnh nhi nam Cho đến chƣa biết xác lý bé trai mắc bệnh nhập viện nhiều bé gái Theo chúng tơi, bé trai thƣờng hiếu động bé gái nên môi trƣờng 39 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com cónguồn lây, bé trai có nguy tiếp xúc với bề mặt nhiễm vi rút gây bệnh nhiều Ngoài nhóm tác giả Đài Loan đề xuất cách giải thích bé trai mắc bệnh nhiều bé gái yếu tố di truyền Tuy nhiên theo nghiên cứu Nguyễn Thị Kim Thƣ tỷ lệ trẻ nam mắc cao so với trẻ nữ, nhƣng kết cho thấy mắc bệnh TCM dù trẻ nam hay nữ, nguy bị bệnh nặng nhƣ 40 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com KẾT LUẬN Chúng thiết kế thành cơng cặp mồi đặc hiệu mẫu dị Taqman Probe để khuếch đại gen đặc trƣng vi rút EV71 kỹ thuật Realtime RT – PCR Đoạn trình tự đích có kích thƣớc 103bp Chúng tơi xây dựng thành cơng quy trình Realtime RT - PCR chẩn đoán vi rút EV71 gây bệnh Tay Chân Miệng trẻ em có độ nhạy độ đặc hiệu cao Độ nhạy phản ứng 100 copies/ml độ đặc hiệu phản ứng 100%, quy trình thực đƣợc nhiều loại bệnh phẩm khác 41 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com KIẾN NGHỊ Vì tính khả thi đề tài cơng trình nghiên cứu tiên phong, đề xuất tiếp tục triển khai thử nghiệm rộng rãi đảm bảo điều kiện ứng dụng kỹ thuật chẩn đoán bệnh Tay Chân Miệng bệnh viện sở y tế tuyến Tỉnh Trung ƣơng 42 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Nguyễn Thị Hồng Hà., (2009) "Tình hình bệnh tay chân miệng phòng khám Nhi- Bệnh viện Trung ƣơng Huế" Y học Việt Nam,356(2): tr 712-714 Trịnh Thị Hồng., Hồ Thị Thanh Thủy., Cao Minh Nga., (2014) Phát Enterovirus 71 phƣơng pháp Realtime RT- PCR Y Học TP Hồ Chí Minh Tập 18, Phụ Số Ngô Văn Huy., (2008) "Nghiên cứu đặc điểm dịch tễ, lâm sàng, cận lâm sàng viêm não Enterovirus trẻ em năm 2006-2008 Bệnh viện Nhi Trung ương".Luận văn tốt nghiệp BSCKII.Đại học Y Hà Nội Trƣơng Hữu Khanh., (2003) "Viêm não cấp trẻ em nhận dạng tác nhân EV71" Tạp chí y học thực hành, cơng trình nghiên cứu khoa học bệnh viện Nhi trung ƣơng 462: tr 210-214 Nguyễn Kim Thƣ., (1016) "Nghiên cứu đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng nguyên vi rút gây bệnh Tay Chân Miệng Việt Nam" Tiếng Anh Akhmadishina., L.V., et al., (2014) "Seroepidemiology and molecular epidemiology of enterovirus 71 in Russia".PLoS One 9(5): p e97404 Anonymous., (1998)."Deaths among children during an outbreak of hand, foot, and mouth disease Taiwan, Republic of China".MMWR Morb Mortal Wkly Rep 47:629±632 Blomberg, J., et al, (1974)."Letter: New enterovirus type associated with epidemic of aseptic meningitis and-or hand, foot, and mouth disease" Lancet 2(7872): p 112 Brown, B.A., et al., (1999) "Molecular epidemiology and evolution of enterovirus 71 strains isolated from 1970 to 1998".J Virol 73(12): pp 9969-9975 10 Cardosa, M.J., et al., (2003)."Molecular epidemiology of human enterovirus 71 strains and recent outbreaks in the Asia-Pacific region: comparative analysis of the VP1 and VP4 genes".Emerg Infect Dis 9(4): p 461-8 43 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com 11 Chang, L.Y., et al., (2002)."Risk factors of enterovirus 71 infection and associated hand, foot, and mouth disease/herpangina in children during an epidemic in Taiwan".Pediatrics 109(6): p e88 12 Chen, K.T., et al., (2007) "Epidemiologic features of hand-foot-mouth disease and herpangina caused by enterovirus 71 in Taiwan, 1998- 2005".Pediatrics.120(2): pp e244-e252 13 Fujimoto, T., et al., (2007) "Outbreak of central nervous system disease associated with hand, foot, and mouth disease in Japan during the summer of 2000: detection and molecular epidemiology of enterovirus 71".Microbiol Immunol, 2002 46(9): p 621-7 14 Gilbert, G.L., et al., (1988) "Outbreak of enterovirus 71 infection in Victoria, Australia, with a high incidence of neurologic involvement".Pediatr Infect Dis J 7(7): p 484-8 15 Hamaguchi T Fujusiwa H, Saika K et al, (2008) "Acute encephalitis caused by intrafamilial transmission of enterovirus 71 in adult." Emerg Infect Dis.14(5): 828-30 16 Herrero L.J., Lee C.S., Hurrelbrink R.J et al (2003) Molecular epidemiology of enterovirus 71 in peninsular Malaysia, 1997-2000, Arch Virol, 148(7), 1369-85 17 Ho, M., et al., (1999)."An epidemic of enterovirus 71 infection in Taiwan Taiwan Enterovirus Epidemic Working Group".N Engl J Med 341(13): pp 929-359 18 Hu, Y.C., et al., (2003)."Formation of enterovirus-like particle aggregates by recombinant baculoviruses co-expressing P1 and 3CD in insect cells".Biotechnol Lett 25(12): pp 919-925 19 Huang S.C., Hsu Y.W., Wang H.C et al (2008) Appearace of intratypic recombination of enterovirus 71 in Taiwan from 2002 to 2005, Virus Research, 131(2), 250-259 20 Huang Y.P., T.L Lin, C.Y Kuo, M.W Lin, C.Y Yao, H.W Liao, L.C Hsu, C.F Yang, J.Y Yang, P.J Chen, and H.S Wu (2008) "The circulation of subgenogroups B5 and C5 of enterovirus 71 in Taiwan from 2006 to 2007." Virus Res137(2): 206 44 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com 21 Huang, Y.P., et al., (2008) "The circulation of subgenogroups B5 and C5 of enterovirus 71 in Taiwan from 2006 to 2007".Virus Res 137(2): pp 206-212 22 Hwang S1, Kang B, Hong J, Kim A, Kim H, Kim K, Cheon DS (2013) Development of duplex real-time RT-PCR based on Taqman technology for detecting simultaneously the genome of pan-enterovirus and enterovirus 71 J Med Virol 2013 Jul;85(7):1274-9 23 Hwang S1, Kang B, Hong J, Kim A, Kim H, Kim K, Cheon DS (2013) Development of duplex real-time RT-PCR based on Taqman technology for detecting simultaneously the genome of pan-enterovirus and enterovirus 71 J Med Virol 2013 Jul;85(7):1274-9 24 Ishimaru, Y., et al., (1980)."Outbreaks of hand, foot, and mouth disease by enterovirus 71 High incidence of complication disorders of central nervous system".Arch Dis Child 55(8): p 583-8 25 Jing Z., L.S.L., Lee K., (2011) "Characterization of Hand, Foot, and Mouth disease in China between 2008 and 2009".Biomed Environ Sci 24(3): pp 214-221 26 Junping Zhu, Zhen Luo, Juan Wang et al (2013) Phylogenectic analysis of enterovirus 71 circulating in Beijing, China from 2007 to 2009, Plos One, 8(2), e56318 27 Junping Zhu, Zhen Luo, Juan Wang et al (2013) Phylogenectic analysis of enterovirus 71 circulating in Beijing, China from 2007 to 2009, Plos One, 8(2), e56318 28 Lin, T.Y., et al., (2002) "The 1998 enterovirus 71 outbreak in Taiwan: pathogenesis and management".Clin Infect Dis 34 Suppl 2: p S52-7 29 Liu, W., et al., (2014) "Co-circulation and genomic recombination of coxsackievirus A16 and enterovirus 71 during a large outbreak of hand, foot, and mouth disease in Central China".PLoS One 9(4): p e96051 30 McMinn, P., et al., (2001) "Phylogenetic analysis of enterovirus 71 strains isolated during linked epidemics in Malaysia, Singapore, and Western Australia".J Virol 75(16): p 7732-8 45 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com 31 Munemura T., Saikusa M., Kawakami C et al (2003) Genetic diversity of enterovirus 71 isolated from cases of hand, foot and mouth disease in Yokohama City between 1982 and 2000, Arch Virol, 148(2), 253-263 32 Nagy, G., et al., (1982) "Virological diagnosis of enterovirus type 71 infections: experiences gained during an epidemic of acute CNS diseases in Hungary in 1978".Arch Virol 71(3): pp 217-227 33 Niu P1, Qi S2, Yu B3, Zhang C1, Wang J1, Li Q4, Ma X5 (2016) Development of a highly sensitive real-time nested RT-PCR assay in a single closed tube for detection of enterovirus 71 in hand, foot, and mouth disease Arch Virol 2016 Nov;161(11):3003-10 34 Niu P1, Qi S2, Yu B3, Zhang C1, Wang J1, Li Q4, Ma X5 (2016) Development of a highly sensitive real-time nested RT-PCR assay in a single closed tube for detection of enterovirus 71 in hand, foot, and mouth disease Arch Virol 2016 Nov;161(11):3003-10 35 Oberste, M.S., et al., (1999)."Molecular evolution of the human enteroviruses: correlation of serotype with VP1 sequence and application to picornavirus classification".J Virol 73(3): p 1941-8 36 Ooi, E.E., et al., (2002) "Seroepidemiology of human enterovirus 71, Singapore".Emerg Infect Dis 8(9): p 995-7 37 Ooi, M.H., et al., (2007)."Evaluation of different clinical sample types in diagnosis of human enterovirus 71-associated hand-foot-and-mouth disease".J Clin Microbiol 45(6): pp 1858-1866 38 Plevka, P., et al., (2012)."Crystal structure of human enterovirus 71".Science 336(6086): p 1274 39 Podin, Y., et al., (2006)."Sentinel surveillance for human enterovirus 71 in Sarawak, Malaysia: lessons from the first years".BMC Public Health 6: p 180 40 Singh, S., et al., (2002) "Direct detection of enterovirus 71 (EV71) in clinical specimens from a hand, foot, and mouth disease outbreak in Singapore by reverse transcription-PCR with universal enterovirus and EV71-specific primers".J Clin Microbiol 40(8): p 2823-7 46 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com 41 Solomon T., L.P., Perera D, (2010) "Virology, epidemiology, pathogenesis, and control of enterovirus 71".Lancet Infect Dis Journal 10: pp 778-790 42 Tan EL1, Yong LL, Quak SH, Yeo WC, Chow VT, Poh CL (2008) Rapid detection of enterovirus 71 by real-time TaqMan RT-PCR J Clin Virol 2008 Jun;42(2):203-6 43 Tu, P.V., et al., (2007)."Epidemiologic and virologic investigation of hand, foot, and mouth disease, southern Vietnam, 2005".Emerg Infect Dis 13(11): pp 1733-1741 44 Wang J Tuan Y, Cui L, et al (2002) "Change of Major Genotype of Enterovirus 71 in Outbreaks of Hand-Foot and Mouth disease in Taiwan between 1998 and 2000." Journal of Clinical Microbiology40(1): 10-15 45 Wang, X., et al., (2012)."A sensor-adaptor mechanism for enterovirus uncoating from structures of EV71".Nat Struct Mol Biol 19(4): p 424-9 46 WHO, W.H.O.- (2008)."Outbreak news: Enterovirus in China".Wkly Epidemiol Rec; 83:169–170 47 Wu, Y., et al., (2010)."The largest outbreak of hand; foot and mouth disease in Singapore in 2008: the role of enterovirus 71 and coxsackievirus A strains".Int J Infect Dis.14(12): pp e1076-1081 48 Xiao-ni Zou, Xiao- zhuang Zhang, Bo Wang et al (2012) Etiologic and epidemiologic analysis of Hand, Foot and Mouth disease in Guangzhou city: a review of 4,753 cases, Braz J Infect Dis, 16(5), 457-65 49 Yan X.F., Gao S., Xia J.F et al (2012) Epidemic characteristics of hand, foot and mouth disease in Shanghai from 2009 to 2010: Enterovirus 71 subgenotype C4 as primary causative agent and a high incidence of mixed infections with coxsackievirus A16, Scand J Infect Dis, 44(4), 297-305 50 Yan, J.J., et al., (2001)."Complete genome analysis of enterovirus 71 isolated from an outbreak in Taiwan and rapid identification of enterovirus 71 and coxsackievirus A16 by RT-PCR".J Med Virol 65(2): p 331-9 47 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com 51 Yang F., Ren L., Xiong Z., Li J., Xiao Y., Zhao R et al (2009) Enterovirus 71 outbreak in the People’s Republic of China in 2008, J Clin Microbiol, 47, 2351–2 52 Yang, F., et al., (2009)."Enterovirus 71 outbreak in the People's Republic of China in 2008".J Clin Microbiol 47(7): p 2351-2 53 Zhang S1, Wang J2, Yan Q2, He S3, Zhou W2, Ge S4, Xia N4 (2014) A onestep, triplex, real-time RT-PCR assay for the simultaneous detection of enterovirus 71, coxsackie A16 and pan-enterovirus in a single tube PLoS One 2014 Jul 16;9(7):e102724 54 Zhang S1, Wang J2, Yan Q2, He S3, Zhou W2, Ge S4, Xia N4 (2014) A onestep, triplex, real-time RT-PCR assay for the simultaneous detection of enterovirus 71, coxsackie A16 and pan-enterovirus in a single tube PLoS One 2014 Jul 16;9(7):e102724 55 Zhang, J., et al., (2012) "Antigenic characteristics of the complete and truncated capsid protein VP1 of enterovirus 71".Virus Res 167(2): pp 337-342 48 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com ... nhân gây bệnh giảm chi phí xét nghiệm cho bệnh nhân Đề tài nghiên cứu tập trung vào mục tiêu :Nghiên cứu xây dựng quy trình Realtime RT- PCR chẩn đốn vi rút EV71 gây bệnh Tay Chân Miệng trẻ em, ... trƣng vi rút EV71 kỹ thuật Realtime RT – PCR Đoạn trình tự đích có kích thƣớc 103bp Chúng tơi xây dựng thành cơng quy trình Realtime RT - PCR chẩn đốn vi rút EV71 gây bệnh Tay Chân Miệng trẻ em. .. TỰ NHIÊN TRẦN VĂN THỊNH NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH REALTIME RT- PCR CHẨN ĐỐN VI RÚT EV71 GÂY BỆNH TAY CHÂN MIỆNG Ở TRẺ EM CHUYÊN NGÀNH: DI TRUYỀN HỌC MÃ SỐ: 60420121 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC