Đặc TínhMồi Kích thƣớc (bp) % GC Tm EV71F 18 57.1 53.6 EV71R 21 47.6 55.8 Taqman EV71 27 48 60.9
Hình 3.2: Kết quả BLAST trình tự mồi xi trên NCBI
Chúng tơi thấy trình tự mồi xi có sự tƣơng đồng 100% giữa các mồi thiết kế và các mẫu trên ngân hàng gen trên thế giới.
Hình 3.3: Kết quả BLAST trình tự mồi ngược trên NCBI
Chúng tơi thấy trìnhtự mồi ngƣợc có sự tƣơng đồng 100% giữa các mồi thiết kế và các mẫu trên ngân hàng gen trên thế giới.
Hình 3.4: Kết quả BLAST trình tự mẫu dị trên NCBI
Chúng tơi thấy trình tự mẫu dị có sự tƣơng đồng 100% giữa các mồi thiết kế và các mẫu trên ngân hàng gen trên thế giới.
3.3. Kết quả khảo sát hoạt động của hệ mồi trên thực nghiệm
Chúng tôi tiến hành tách chiết RNA từ 10 chủng virút đƣợc nuôi cấy và phân lập tại Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ƣơng, sau đó thực hiện phản ứng Realtime RT-PCR (Hình 3.5) để khảo sát hoạt động của mồi và probe trong thực nghiệm. Sau đó tiến hành điện di để kiểm tra kích thƣớc của đoạn sản phẩm khuếch đại đã đúng với thiết kế chƣa và có sự bắt cặp với vùng gen khác của EV71 hay khơng (Hình 3.6).
Hình 3.5: Kết quả phản ứng Realtime RT-PCR trên 10 chủng vi rút nuôi cấy
10 mẫu dƣơng tính có tín hiệu huỳnh quang vƣợt tín hiệu huỳnh quang nền và có dạng tín hiệu của một phản ứng Realtime PCR chuẩn. Mẫu chứng âm có tín hiệu thấp hơn tín hiệu huỳnh quang nền. Nhƣ vậy cặp mồi và probe đƣợc thiết kế cho vùng gen đặc trƣng của EV71 có khả năng nhân bản tốt.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Hình 3.6: Kết quả điện di sau khi chạy PCR trên 10 chủng vi rút nuôi cấy Giếng 1-8 và 10-11: các chủng vi rút nuôi cấy Giếng 1-8 và 10-11: các chủng vi rút nuôi cấy
Giếng 9: Thang AND chuẩn
Kết quả điện di trên gel Agarose cho thấy có một vạch sản phẩm kích thƣớc nhƣ mong đợi (103bp) ở tất cả 10 chủng virus đƣợc thử nghiệm, và không thấy vạch phản ứng với các vi khuẩn và vi rút khác xuất hiện trên các mẫu dƣơng tính, chứng tỏ khơng có sự bắt cặp với các vùng gen khác của EV71.
3.4. Kết quả tối ƣu nhiệt độ của phản ứng RT-PCR
Trong nghiên cứu này chúng tôi thử nghiệm nhiệt độ bắt cặp của Taqman probe ở các nhiệt độ: 52oC, 55oC, 58oC và 60oC. Kết quả đƣợc thể hiện trong hình 3.7, 3.8, 3.9 và 3.10.
Hình 3.7: Biểu đồ khuếch đại RT-PCR ở 52oC
500 bp 400 bp 300 bp 200 bp 100 bp
Hình 3.8: Biểu đồ khuếch đại RT-PCR ở 55oC
Hình 3.10: Biểu đồ khuếch đại RT-PCR ở 60oC
Kết quả cho thấy ở nhiệt độ 55oC đƣờng khuếch đại huỳnh quang cho tín hiệu cao hơn và đƣờng curve đẹp hơn nên chúng tôi chọn nhiệt độ 55oC để tiến hành tối ƣu các điều kiện tiếp theo.
3.5. Kết quả tối ƣu nồng độ Magie của phản ứng RT-PCR
Magie là thành phần quan trong giúp tăng độ nhạy và độ đặc hiệu cảu phản ứng RT-PCR. Theo hƣớng dẫn của nhà sản xuất chúng tôi tiến hành tối ƣu nồng độ MgSO4 ở nồng độ cuối cùng là 4 mM, 5mM và 6mM. (Kết quả thể hiện ở hình 3.11).
Hình 3.11: Đường khuếch đại RT-PCR ở nồng độ Magie khác nhau
Kết quả cho thấy ở cùng một nồng độ RNA ban đầu, đƣờng biểu diễn huỳnh quang ở nồng độ MgS04 5 mM lên sớm hơn khoảng 2 chu kỳ so với 2 nồng độ MgS04 4 mM và 6 mM (bảng 3.4).
Bảng 3.4: Chu kỳ ngưỡng của RT-PCR ở nồng độ Magie khác nhau
Nồng độ MgSO4 Ct
4 mM 30,7
5 mM 27,6
3.6. Kết quả khuếch đại và đƣờng chuẩn của phản ứng RT-PCR
Hình 3.12: Đồ thị khuếch đại của mẫu plasmid pha lỗng
Hình 3.13: Đường chuẩn RT-PCR từ plasmid pha loãng
Kết quả cho thấy đƣờng chuẩn tuyến tính R2 đạt 0.981, Slope -3.33, hiệu quả E là 99%, kết quả lặp lại 3 lần không có sự sai khác. Nhƣ vậy phản ứng RT-PCR trong nghiên cứu này của chúng tơi có kết quả đáng tin cậy.
106 105 104 103 102 101
3.7. Độ nhạy của phản ứng RT-PCR trên plasmid tách dòng
Bảng 3.5: Độ nhạy của phản ứng RT-PCR trên plasmid tách dòng
Số bản sao
plasmid/ml Giá trị Ct Kết quả
106 27,22 + 105 29,63 + 104 32,07 + 103 33,56 + 102 35,04 + 101 42,17 - 100 Khơng xác định -
Hình 3.14: Điệndi đồ sản phẩm RT-PCR từ plamid tách dịng pha lỗng M: thang AND chuẩn
Các giếng cịn lại: Nồng độ pha lỗng plasmid từ 106 - 100
Nhƣ vậy, giới hạn phát hiện của plasmid tách dòng mang gen đặc trƣng của vi rút EV71 trong phản ứng RT-PCR là 100 copies/ml (bảng 3.5, hình 3.14).
3.8. Độ nhạy của phản ứng RT-PCR trên virut EV71 nuôi cấy
Bảng 3.6: Độ nhạy của phản ứng RT-PCR trên vi rút nuôi cấy
Số bản sao vi rút/ml Giá trị Ct Kết quả 106 28,98 + 105 30,71 + 104 31,42 + 103 34,65 + 102 35,13 + 101 Không xác định - 100 Không xác định -
Hình 3.15: Đồ thị khuếch đại của mẫu vi rút ni cấy pha lỗng
106 105 104 103 102 101
Hình 3.16: Điện đi đồ sản phẩm RT-PCR từ vi rút ni cấy pha lỗng M: thang AND chuẩn
Các giếng còn lại: Nồng độ vi rút ni cấy pha lỗng plasmid từ 106 - 100
Kết quả bảng 3.6, hình 3.15, hình 3.16 cho thấy độ nhạy của RT-PCR trên chủng vi rút EV71 nuôi cấy là 100 copies/ml.
3.9. Kết quả xác định độ đặc hiệu của phản ứng Realtimr RT- PCR trên các chủng vi rút khác nhau chủng vi rút khác nhau
Bảng 3.7: Kết quả xác định độ đặc hiệu của phản ứng RT-PCR
Chủng vi khuẩn, vi rút Giá trị Ct Kết quả
EV71- 30FR2 23,57 +
EV71- 36FR2 25,31 +
Mẫu bệnh phẩm dƣơng tính EV71 (02-52) 33,48 + Mẫu bệnh phẩm dƣơng tính EV71 (02-62) 34,17 + Mẫu bệnh phẩm dƣơng tính EV71 (02-63) 29,52 + Mẫu bệnh phẩm dƣơng tính EV71 (02-64) 28,95 +
Cytomegalovirus Không xác định -
Hepes simplex virus Không xác định -
Klebsiella pneumoniae Không xác định -
Acinetobacter baumannii Không xác định -
Hình 3.17: Đồ thị phản ứng RT-PCR xác định tính đặc hiệu
Kết quả cho thấy, phản ứng realtime RT-PCR chỉ cho kết quả dƣơng tính mẫu RNA của chủng vi rút EV71 nuôi cấy và mẫu bệnh phẩm dƣơng tính EV71, khơng xảy ra phản ứng chéo với các vi rút và vi khuẩn gây bệnh khác. Nhƣ vậy, độ đặc hiệu của phản ứngnày trong nghiên cứu của chúng tôi đạt 100%. Kết quả đƣợc thể hiện trong bảng 10 và hình 18.
Nhƣ vậy, phản ứng realtime RT-PCR mà chúng tôi thực hiện đã đƣợc xác định độ đặc hiệu, đảm bảo độ tin cậy để có thể ứng dụng quy trình này trong chẩn đốn bệnh Tay Chân Miệng dƣơng tính với EV71 từ mẫu bệnh phẩm.
Quy trình chẩn đoán bằng phƣơng pháp One-Step Realtime RT-PCR đã đƣợc nhóm nghiên cứu tối ƣu hóa với độ nhạy 100 copies/ml và độ đặc hiệu 100%. Kết quả này tƣơng đồng với kết quả nghiên cứu của tác giả Tan E.L. năm 2008 tại Singapore [42], tác giả Hwang S. năm 2013 tại Hàn Quốc [22] và tác giả Zhang S. năm 2014 tại Trung Quốc [53]. Các tác giả cũng đã đề xuất nên áp dụng phƣơng pháp realtime RT-PCR trong chẩn đoán EV71 thƣờng quy tại các bệnh viện và là cơng cụ chẩn đốn nhanh và chính xác EV71 trong các vụ dịch. Trong nghiên cứu của tác giả Tan E.L. độ nhạy của realtime RT-PCR trong việc phát hiện EV71
102 101 102 103 104 105 106
từmẫu bệnh phẩm đƣợc so sánh với phƣơng pháp nuôi cấy mô. Tổng cộng 67 mẫu bệnh phẩm realtime RT-PCR phát hiện EV71 trong 49 mẫu bệnh phẩm, tuy nhiên phƣơng pháp ni cấy mơ thì khơng phát hiện EV71 trong tất cả các mẫu này [42]. Rất nhiều nghiên cứu phát triển realtime RT-PCR để chẩn đoán nhiều tác nhân cùng một lúc: duplex, triplex… trong các nghiên cứu này cũng cho thấy khi sử dụng cặp mồi đặc hiệu vùng VP1 khơng xảy ra dƣơng tính chéo giữa EV71 và Coxsackievirus cũng nhƣcác loại enterovirus khác [22],[53]. Để có thể phát hiện đƣợc tải lƣợng vi rút thấp trong các mẫu bệnh phẩm, tác giả Niu P. và công sự năm 2016 [33] đã xuất bản một bài báo đề xuất sử dụng phƣơng pháp real-time nested RT-PCR nhằm tăng độ nhạy của phản ứng. Ở Việt Nam chƣa có nhóm nghiên cứu nào phát triển quy trình One-Step Realtime RT-PCR trong chẩn đốn vi rút gây bệnh Tay Chân Miệng, đặc biệt là EV71. Với độ nhạy và độ đặc hiệu của phƣơng pháp Realtime RT-PCR, nhóm nghiên cứu đề xuất chuyển giao kỹ thuật này cho các bệnh viện, cơ sở y tế có đủ điều kiện để áp dụng kỹ thuật này vào chẩn đoán thƣờng quy.
Từ kết quả trên,quy trình One-Step Realtime RT – PCR đƣợc tóm tắt nhƣ sau: - Nguyên lý kỹ thuật: Bộ Kít ứng dụng kỹ thuật Realtime RT-PCR trong chẩn đoán vi rút EV71 gây bệnh Tay Chân Miệng, với cặp mồi đặc hiệu để nhân lên đoạn gen đặc trƣng của vi rút EV71, mẫu dò đƣợc thiết kế theo công nghệ Taqmanprobe. Đầu 5’ của mẫu dò đƣợc gắn một chất hóa học có khả năng phát huỳnh quang khi nhận đƣợc nguồn sáng kích thích, đầu cịn lại có khả năng hấp thụ ánh sáng huỳnh quang, vì vậy chỉ khi có sản phẩm khuếch đại, thì mới có sự phát quang trong ống phản ứng, và hệ thống camare sẽ ghi nhận sự phát quang này và đƣa ra đƣờng biểu diễn khuếch đại huỳnh quang sự có mặt của vi rút EV71 trong mẫu bệnh phẩm.
Chƣơng trình chạy RT-PCR: 1 chu kỳ ở 52oC – 15 phút, 95°C- 2 phút, tiếp theo là 45 chu kỳ (95°C – 30 giây, 55°C – 30 giây: đọc kết quả tại bƣớc này). Vùng gen đặc trƣng của virus EV71 sẽ đƣợc phát hiện bằng cách đo mật độ quang sau mỗi chu kỳ của phản ứng
- Các bƣớc để thực hiện quy trình của bộ Kít: + Rã đơng các hóa chất trƣớc khi tiến hành phản ứng + Tính tốn số mẫu thực tế cần phải làm
+ Số phản ứng = chứng âm + chứng dƣơng + số mẫu cần thực hiện
+ Chuẩn bị một Eppendoft sạch, trộn các thành phần của phản ứng theo công thức trên
+ Hút 20µl hỗn hợp Mix vào từng ống PCR
+ Hút 5µl mẫu bệnh phẩm, chứng âm, chứng dƣơng vào các tube PCR, bị cho vào máy Realtime PCR
+ Cài đặt chu trình nhiệt theo hƣớng dẫn của bộ Kít. - Phân tích kết quả:
+ Mẻ chạy chỉ có giá trị khi chứng âm khơng có đƣờng đồ thị huỳnh quang trong vòng 40 chu kỳ của phản ứng.
+ Chứng dƣơng có đƣờng cong đồ thị huỳnh quang trên đƣờng chuẩn cơ bản trong khoảng chu kỳ 30 tới 33.
+ Các mẫu có có đƣờng cong đồ thị huỳnh quang trên đƣờng chuẩn cơ bản ≤ 35 chu kỳ đƣợc coi là dƣơng tính và >35 chu kỳ đƣợc coi là âm tính.
KẾT QUẢ ỨNG DỤNG KỸ THUẬT REALTIME RT-PCR TRONG XÁC ĐỊNH VI RÚT EV71 GÂY BỆNH TAY CHÂN MIỆNG TẠI BỆNH
VIỆN ĐA KHOA ĐỐNG ĐA HÀ NỘI
Nhóm nghiên cứu đã thu thập đƣợc 69 mẫubệnh phẩm dịch ngoáy họng từ 69 bệnh nhân nghi ngờ nhiễm Tay Chân Miệng đƣợc thu thập từ tháng 1/2016 đến tháng 12/2016 đã đƣợc lấy tại Khoa Truyền nhiễm bệnh viện Đống Đa. EV 71 là vi rút thuộc enterovirus đƣờng ruột thuộc họ picornaviridae. Vi rút xâm nhập vào cơ thể qua đƣờng tiêu hóa và thƣờng khu trú trong phân và ở vùng hầu họng. Do vậy, phân và dịch họng là những bệnh phẩm thƣờng đƣợc các nghiên cứu trong và ngoài nƣớc lựa chọn để thực hiện xét nghiệm nhằm phát hiện enterovirus bằng phƣơng pháp RT-PCR hay Realtime RT-PCR. Ngoài ra dịch họng là bệnh phẩm dễ lấy và phƣơng pháp PCR dịch họng đã đƣợc chứng minh cho độ nhạy và độ đặc hiệu cao [3] [16]. Do đó nhóm nghiên cứu đã đề xuất lấy mẫu dịch ngoáy họng trên bệnh nhân ở bệnh viện Đống Đa để làm xét nghiệm chẩn đoán xác định nhiễm EV71. Bệnh phẩm đƣợc tách chiết RNA và thực hiện phản ứng Realtime PCR theo đúng quy trình chuẩn.
Trong số 69 bệnh nhân đƣợc làm xét nghiệm, có 21 bệnh nhân dƣơng tính với vi rút EV71, trong số đó có 10 bệnh nhân nữ, 11 bệnh nhân nam.
30,4%
69,6% 0%
Các bệnh nhân tới khám tại Bệnh viện Đống Đa thƣờng cƣ trú trên địa bàn quận, và các khu vực lân cận. Do vậy có thể tỷ lệ này không đại diện để phản ánh đƣợc tỷ lệ nhiễm bệnh Tay Chân Miệng ở các bệnh viện khác trên địa bàn thành phố.
Tại thời điểm nghiên cứu, chúng tôi không thu thập đƣợc bệnh nhân nào nghi nhiễm EV71 bị biến chứng thần kinh, tuy nhiên với quy trình tách chiết RNA chuẩn, với hiệu quả bắt cặp và khuếch đại tác nhân đích của cặp mồi- mẫu đị, đã đƣợc kiểm chứng thông qua việc thực hiện phản ứng Realtime PCR trên các chủng chuẩn đã đƣợc ni cấy, trên các mẫu bệnh phẩm thực tế, có thể đảm bảo rằng bộ Kít phát hiện đƣợc vi rút EV71 đối với bệnh phẩm là dịch não tủy ở những bệnh nhân nghi nhiễm Tay Chân Miệng có biến chứng thần kinh.
Trong số 69 bệnh nhân nghi ngờ nhiễm Tay Chân Miệng đƣợc làm xét nghiệm, có 21 bệnh nhân dƣơng tính với vi rút EV71, chiếm tỷ lệ 30.4%. Tỷ lệ này thấp hơn tỷ lệ trong nghiên cứu của Niu P. và cộng sự năm 2016 (41%) khi tác giả sử dụng phƣơng pháp Real-time nested RT-PCR nhƣng cao hơn so với phƣơng pháp Realtime RT-PCR mà tác giả đã sử dụng trong cùng nghiên cứu (21%). Với phƣơng pháp Real-time nested RT-PCR trong nghiên cứu của Niu P sử dụng đã đƣợc chứng minh tăng độ nhạy của phản ứng nhằm phát hiện tải lƣợng vi rút thấp trong các mẫu bệnh phẩm. Trong nghiên cứu gần đây nhất của Nguyễn Kim Thƣ [5], tỷ lệ dƣơng tính với EV71 chiếm 54,5% trong tổng số 1170 bệnh nhân đã đƣợc khẳng định dƣơng tính với enterovirus bằng kỹ thuật RT-PCR. Trong nghiên cứu của chúng tôi, 69 mẫu bệnh phẩm đƣợc thu từ 69 bệnh nhân nghi ngờ nhiễm Tay Chân Miệng. Cịn trong nghiên cứu của Nguyễn Kim Thƣ thì 1170 bệnh nhân này đã đƣợc khẳng định nhiễm enterovirus [5]. Tỷ lệ nhiễm EV71 trong các nghiên cứu cũng ghi nhận có sự dao động ở các mức độ khác nhau. Tỷ lệ mắc EV71 trong đợt dịch tại Thƣợng Hải là 86,5% vào năm 2009 và 84,5% vào năm 2010 [49]. Tuy nhiên, cũng năm 2009 tỷ lệ này chỉ là 50,4% tại Quảng Đông, 36% tại Bắc Kinh [27]. Tiếp theo, đến năm 2012, đợt dịch TCM tại tỉnh Guangzhou lại chỉ ghi nhận 22,4% các trƣờng hợp do EV71 [48]. Tại Đài Loan, trong giai đoạn 1987-1988, các báo cáo ghi nhận tỷ lệ nhiễm EV71 khoảng 60-70%. Tuy nhiên, nhữngnăm tiếp
theo, tỷ lệ nhiễm EV71 giảm xuống, còn 2% trong năm 1999 và 20,5% trong năm 2000 [44] [20] [19]. Tại thành phố Yokohama (Nhật Bản), các đợt dịch vào các năm từ 1982 đến năm 2000 đều ghi nhận vai trị của EV71 [31]. Điều đó cho thấy tính đa dạng trong sự phân bố EV71 tại các vụ dịch TCM. Ở Việt Nam, các báo cáo về tỷ lệ nhiễm EV71 trong các vụ dịch TCM thƣờng lẻ tẻ, tập trung tại một vùng hoặc khu vực. Các tác giả cũng sử dụng các phƣơng pháp khác nhau trong việc xác định enterovirus và EV71 gây bệnh Tay Chân Miệng.
Tỷ lệ bệnh nhân dƣới 6 tuổi tại Bệnh viện Đống Đa trong nghiên cứu chiếm 85%. Nhóm tuổi từ 1-2 tuổi chiếm 50% và nhóm tuổi 3-6 tuổi chiếm 35%. Nhóm tuổi trên 6 chiếm 15%. Kết quả này tƣơng tự với các kết quả nghiên cứu của Phan Văn Tú nghiên cứu trên các bệnh nhân TCM năm 2005 tại miền Nam Việt Nam cũng cho kết quả 79,9% trẻ dƣới 3 tuổi trong đó 43,9% trong lứa tuổi từ 1-2. Kết quả nghiên cứu Nguyễn Kim Thƣ nghiên cứu trên các bệnh nhân Tay Chân Miệng trên toàn quốc năm 2012 cũng có kết quả tƣơng tự [5]. Tỷ lệ bệnh nhân trên 6 tuổitrong nghiên cứu của chúng tơi có tỷ lệ cao hơn so với nghiên cứu của các tác