Nghiên cứu triển khai quy trình phát hiện một số dòng bắp, đậu nành và sản phẩm có nguồn gốc từ bắp đậu nành biến đổi gen

SỞ NÔNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG THÔN THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRUNG TÂM CƠNG NGHỆ SINH HỌC BÁO CÁO NGHIỆM THU NHIỆM VỤ KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ CẤP CƠ SỞ Tên : NGHIÊN CỨU TRIỂN KHAI QUY TRÌNH PHÁT HIỆN MỘT SỐ DỊNG BẮP, ĐẬU NÀNH VÀ SẢN PHẨM CÓ NGUỒN GỐC TỪ BẮP, ĐẬU NÀNH BIẾN ĐỔI GEN Đơ ị c ủ trì C ủ Cá t a : P ò g CNSH T ực ật : TS Nguyễ Xuâ Dũ g g a: KS Huỳ Nguyễ M KS Nguyễ T ị K T Ng ĩa a T S Bù T ị Tuyết KS Nguyễ T ị H Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 07 năm 2019 g Trâ MỤC LỤC MỤC LỤC i DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT v DANH MỤC HÌNH vi DANH MỤC BẢNG BIỂU x TÓM TẮT PHẦN THÔNG TIN CHUNG PHẦN NỘI DUNG KHOA HỌC I ĐẶT VẤN ĐỀ II TỔNG QUAN TÀI LIỆU II.1 Những vấn đề trồng biến đổi gen II.1.1 Khái niệm sinh vật biến đổi gen (GMOs) II.1.2 Đặc điểm trồng biến đổi gen II.1.2.1 Cấu trúc gen chuyển nạp III.1.2.2 Các phương pháp chuyển gen vào tế bào thực vật II.1.3 Quan điểm trồng biến đổi gen II.1.4 Tình hình phát triển trồng biến đổi gen giới II.1.5 Tình hình phát triển trồng biến đổi gen Việt Nam 13 II.1.6 Quy định quản lý an toàn trồng biến đổi gen 15 II.1.6.1 Các quy định Châu Âu 15 II.1.6.2 Các quy định Việt Nam 16 II.1.7 Các phương pháp phát biến đổi gen 17 III.1.7.1 Phương pháp dựa vào protein 17 II.1.7.2 Phương pháp dựa vào DNA 17 II.1.7.3 Đánh giá lựa chọn phương pháp cho nghiên cứu 20 II.1.8 Tình hình nghiên cứu phát kiện trồng biến đổi gen sản phẩm liên quan Việt Nam 20 III VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 III.1 Vật liệu 21 III.2 Phương pháp nghiên cứu 21 III.2.1 Thu thập nguồn mẫu dùng cho thí nghiệm 21 i III.2.2 Tách chiết DNA phân tích sản phẩm thu sau tách chiết 21 III.2.2.1 Tách chiết DNA phương pháp phenol/chloroform 22 III.2.2.2 Tách chiết DNA Kit 23 III.2.2.3 Phân tích sản phẩm thu sau tách chiết DNA 23 III.2.2.4 Chuẩn bị mẫu chuẩn DNA có tỷ lệ GMO theo u cầu thí nghiệm 23 III.2.3 Thiết lập phản ứng PCR phát định tính 24 III.2.3.1 Phát định tính dựa vào trình tự promoter 35S 24 III.2.3.2 Phát dựa vào trình tự terminator NOS 26 III.2.3.3 Phát dựa vào cấu trúc đặc thù kiện chuyên biệt 27 III.2.4 Thiết lập phản ứng Real-tme PCR phát định lượng 31 III.2.4.1 Thử nghiệm phản ứng Real-time PCR 31 III.2.4.2 Dựng đường chuẩn 33 III.2.4.3 Định lượng mẫu 33 III.3 Phê duyệt phương pháp 33 III.3.1 Xác định ảnh hưởng mẫu 33 III.3.2 Xác định giới hạn phát (LOD) 34 III.3.3 Xác định giới hạn định lượng (LOQ) 34 III.4 Phát diện kiện biến đổi gen mẫu thu thập 35 IV KẾT QUẢ - THẢO LUẬN 35 IV.1 Thu thập nguồn mẫu 35 IV.1.1 Thu thập mẫu chuẩn 35 IV.1.2 Thu thập mẫu nguyên liệu 37 IV.2 Tách chiết DNA phân tích sản phẩm 39 IV.2.1 Tách chiết DNA từ mẫu chuẩn 39 IV.2.1 Tách chiết DNA từ mẫu thu thập 40 IV.3 Thiết lập phản ứng PCR phát định tính 42 IV.3.1 Phát dựa vào trình tự promoter 35S 42 IV.3.1.1 Xác định nhiệt độ bắt cặp tối ưu cho mồi 35s-1/35s-2 phát promoter 35S 42 ii IV.3.1.2 Xác định nhiệt độ bắt cặp tối ưu cho mồi ZEIN3/ZEIN4 phát gen nội chuẩn zein bắp 43 V.3.1.3 Xác định nhiệt độ bắt cặp tối ưu cho mồi GMO3/GMO4 phát gen nội chuẩn lectin đậu nành 43 IV.3.1.4 Xác định nồng độ enzyme taq polymerase thích hợp cho phản ứng phát promoter 35S 44 IV.3.1.5 Phát mẫu bắp biến đổi gen dựa vào promoter 35S 45 IV.3.2 Phát dựa vào trình tự terminator NOS 46 IV.3.2.1 Xác định nhiệt độ bắt cặp tối ưu cho mồi HA-nos 118f/ HA-nos 118r phát terminator NOS 46 IV.3.2.2 Phát mẫu bắp biến đổi gen dựa vào terminator NOS 46 IV.3.3 Phát dựa vào cấu trúc đặc thù kiện chuyên biệt 47 IV.3.3.1 Phát dòng bắp Bt11 với cặp mồi IVS2-2/PAT-B 47 IV.3.3.2 Phát dòng bắp Bt176 với cặp mồi Cry03/Cry04 48 IV.3.3.3 Phát dòng bắp GA21 với cặp mồi GA21F/GA21R 50 IV 3.3.4 Phát dòng đậu nành 356043 với cặp mồi DP-5-F/DP-5-R 51 IV.3.3.5 Phát dòng đậu nành biến đổi gen 305423 với cặp mồi NJ23-1-F/NJ23-1-R 52 IV.4 Thiết lập phản ứng Realtime PCR phát định lượng 54 IV.4.1 Thử nghiệm phản ứng Real-time PCR 54 IV.4.1.1 Phản ứng Real-time PCR phát promoter 35S terminator NOS 54 IV.4.1.2 Phản ứng Real-time PCR với trình tự chuyên biệt 55 IV.4.2 Dựng đường chuẩn 58 IV.4.2.1 Phát promoter 35S terminator NOS 58 IV.4.2.2 Phát ự iện chuyên biệt 59 IV.4.3 Định lượng mẫu 62 IV.5 Phê duyệt phương pháp 62 IV.5.1 Xác định ảnh hưởng mẫu 62 IV.5.2 Xác định giới hạn phát (LOD) 64 IV.5.2.1 Trường hợp định tính 64 iii IV.5.2.2 Trường hợp định lượng 71 IV.5.3 Xác định giới hạn định lượng (LOQ) 77 IV.5.3.1 Xác định giới hạn định lượng promoter 35S terminator NOS 77 IV.5.3.2 Xác định giới hạn định lượng kiện chuyên biệt 77 IV.6 Phát diện kiện biến đổi gen mẫu thu thập 78 IV.6.1 Phát định tính 78 IV.6.2 Phát định lượng 82 V KẾT ẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 82 V.1 Kết luận 82 V.2 Đề nghị 82 PHẦN SẢN PHẨM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ 83 PHẦN TÀI LIỆU THAM KHẢO 84 I TIẾNG VIỆT 84 II TIẾNG ANH 85 PHỤ ỤC 88 iv DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT bp Base pair Bt Bacillus thuringiensis CaMV Cauliflower mosaic virus Ct Threshold cycle CB Chế biến CTAB Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide DL Dạng lỏng DNA Deoxyribonucleic acid ELISA Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay EPA Environmental Protection Agency GMOs Genetically modified organisms ERM European Reference Materials NL Nguyên liệu nptII Neomycine- 3’- phosphotransferase II P-35S 35S CaMV promoter PCR Polymerase Chain Reaction S Svedberg T-35S 35S CaMV terminator TACN Thức ăn chăn nuôi TAE Tris - Acetic acid – EDTA Taq Thermus aquaticus TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam TE Tris - Ethylenediaminetetraacetic acid T-NOS Agrobacterium tumefaciens nopaline synthase terminator v DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Sơ đồ minh họa phương thức phát GMO dựa vào DNA 18 Hình 4.1 Mẫu chuẩn bắp đậu nành biến đổi gen 36 Hình 4.2 Một số loại mẫu bắp đậu nành thu thập 38 Hình 4.3 Kết điện di DNA tổng số tách chiết từ mẫu chuẩn 40 Hình 4.4 Kết điện di DNA tổng số tách chiết từ mẫu snack bắp (trái) sữa bắp (phải) 42 Hình 4.5 Kết điện di sản phẩm PCR phát promoter 35S với cặp mồi 35s-1/35s-2 nhiệt độ Ta 43 Hình 4.6 Kết điện di sản phẩm PCR phát gen zein với cặp mồi ZEIN3/ZEIN4 nhiệt độ Ta 43 Hình 4.7 Kết điện di sản phẩm PCR phát gen lectin với cặp mồi GMO3/GMO4 nhiệt độ Ta 44 Hình 4.8 Kết điện di sản phẩm PCR phát promoter 35S nồng độ enzyme taq polymerase khác 45 Hình 4.9 Kết điện di sản phẩm PCR phát bắp Bt176 Bt11 dựa vào promoter 35S 45 Hình 4.10 Kết điện di sản phẩm PCR phát terminator NOS với cặp mồi HA-nos 118f/ HA-nos nhiệt độ Ta 46 Hình 4.11 Kết điện di sản phẩm PCR phát bắp Bt11 GA21 dựa vào terminator NOS 47 Hình 4.12 Kết điện di sản phẩm PCR phát bắp biến đổi gen Bt11 với cặp mồi IVS2-2/ PAT-B nhiệt độ Ta 47 Hình 4.13 Kết điện di sản phẩm PCR phát mẫu bắp Bt11 với cặp mồi IVS2-2/ PAT-B 48 Hình 4.14 Kết điện di sản phẩm PCR phát bắp t176 với cặp mồi Cry03/Cry04 nhiệt độ Ta 49 Hình 4.15 Kết điện di sản phẩm phản ứng PCR phát mẫu bắp Bt11 với cặp mồi IVS2-2/ PAT-B 49 Hình 4.16 Kết điện di sản phẩm PCR phát bắp GA21 với cặp mồi GA21F/GA21R nhiệt độ Ta 50 vi Hình 4.17 Kết điện di sản phẩm phản ứng PCR phát bắp GA21 với cặp mồi GA21F/GA21R 51 Hình 4.18 Kết điện di sản phẩm PCR phát đậu nành 356043 với cặp mồi DP-5-F/DP-5-R nhiệt độ Ta khác 51 Hình 4.19 Kết điện di sản phẩm PCR phát đậu nành 356043 với cặp mồi DP-5-F/DP-5-R 52 Hình 4.20 Kết điện di sản phẩm PCR phát đậu nành 305423 với cặp mồi NJ23-1-F/NJ23-1-R nhiệt độ Ta 53 Hình 4.21 Kết điện di sản phẩm PCR phát đậu nành 305423 với cặp mồi NJ23-1-F/NJ23-1-R 53 Hình 4.22 Biểu đồ khuếch đại promotor 35S (trái) terminator NOS (phải) dựa tính hiệu huỳnh quang 54 Hình 4.23 Biểu đồ phân tích nhiệt độ nóng chảy sản phẩm huếch đại promotor 35S trái t rminator N S phải 54 Hình 4.24 Biểu đồ tín hiệu huỳnh quang trái ph n tích nhiệt độ nóng chảy sản phẩm huếch đại ự iện bắp t11 phải 55 Hình 4.25 Biểu đồ tín hiệu huỳnh quang trái ph n tích nhiệt độ nóng chảy phải sản phẩm huếch đại ự iện bắp Bt176 56 Hình 4.26 Biểu đồ tín hiệu huỳnh quang trái ph n tích nhiệt độ nóng chảy phải sản phẩm huếch đại ự iện bắp G 21 56 Hình 4.27 Biểu đồ tín hiệu huỳnh quang trái ph n tích nhiệt độ nóng chảy phải sản phẩm huếch đại ự iện đậu nành 356043 57 Hình 4.28 Biểu đồ tín hiệu huỳnh quang trái ph n tích nhiệt độ nóng chảy phải sản phẩm huếch đại ự iện đậu nành 305423 57 Hình 4.29 Biểu đồ đường chuẩn phản ứng huếch đại promotor 35S (A) t rminator NOS (B) 58 Hình 4.30 Biểu đồ đường chuẩn phản ứng huếch đại ự iện bắp chuyển g n Bt11 59 Hình 4.31 Biểu đồ đường chuẩn phản ứng huếch đại ự iện bắp chuyển g n t176 60 Hình 4.31 Biểu đồ đường chuẩn phản ứng huếch đại ự iện bắp chuyển g n G 21 60 vii Hình 4.32 Biểu đồ đường chuẩn phản ứng huếch đại ự iện đậu nành chuyển g n 356 43 61 Hình 4.33 Biểu đồ đường chuẩn phản ứng huếch đại ự iện đậu nành chuyển g n 305423 62 Hình 4.34 Kết điện di sản phẩm PCR phát promoter 35S với cặp mồi 35s-1/35s-2 tỉ lệ GMO khác 64 Hình 4.35 Kết điện di sản phẩm PCR phát promoter 35S với cặp mồi 35s-1/35s-2 mẫu có tỉ lệ GMO 0,1% 65 Hình 4.36 Kết điện di sản phẩm PCR phát terminator NOS với cặp mồi HA-nos 118f/HA-nos 118r tỉ lệ GMO khác 65 Hình 4.37 Kết điện di sản phẩm PCR phát terminator NOS với cặp mồi HA-nos 118f/HA-nos 118r mẫu có tỉ lệ GMO 0,1% 66 Hình 4.38 Kết điện di sản phẩm PCR phát kiện Bt11 với cặp mồi IVS2-2/PAT- B tỉ lệ GMO khác 66 Hình 4.39 Kết điện di sản phẩm PCR phát kiện Bt11 với cặp mồi IVS2-2/PAT- B 67 Hình 4.40 Kết điện di sản phẩm PCR phát kiện Bt176 với cặp mồi Cry03/Cry04 tỉ lệ GMO khác 67 Hình 4.41 Kết điện di sản phẩm PCR phát kiện Bt176 với cặp mồi Cry03/Cry04 68 Hình 4.42 Kết điện di sản phẩm PCR phát kiện GA21 với cặp mồi GA21F/GA21R tỉ lệ GMO khác 68 Hình 4.43 Kết điện di sản phẩm PCR phát kiện GA21 với cặp mồi GA21F/GA21R 69 Hình 4.44 Kết điện di sản phẩm PCR phát kiện 356043 với cặp mồi DP-5-F/DP-5-R tỉ lệ GMO khác 69 Hình 4.45 Kết điện di sản phẩm PCR phát kiện 356043 với cặp mồi DP-5-F/DP-5-R 70 Hình 4.46 Kết điện di sản phẩm PCR phát kiện 305423 với cặp mồi NJ23-1-F/NJ23-1-R tỉ lệ GMO khác 70 Hình 4.47 Kết điện di sản phẩm PCR phát kiện 305423 với cặp mồi NJ23-1-F/NJ23-1-R 71 viii Hình 4.48 Biểu đồ tín hiệu huỳnh quang phản ứng phát promotor 35S với cặp mồi 35s-1/35s-2 72 Hình 4.49 Biểu đồ tín hiệu huỳnh quang phản ứng phát terminator NOS với cặp mồi HA-nos 118f/HA-nos 118r 72 Hình 4.50 Biểu đồ tín hiệu huỳnh quang phản ứng phát kiện Bt11 73 Hình 4.51 Biểu đồ tín hiệu huỳnh quang phản ứng phát kiện Bt176 74 Hình 4.52 Biểu đồ tín hiệu huỳnh quang phản ứng phát kiện GA21 với cặp mồi GA21F/GA21R 75 Hình 4.53 Biểu đồ tín hiệu huỳnh quang phản ứng phát kiện 356043 với cặp mồi DP-5-F/DP-5-R 76 Hình 4.54 Biểu đồ tín hiệu huỳnh quang phản ứng phát kiện 305423 với cặp mồi NJ23-1-F/NJ23-1-R 76 ix 3.1.4 Phát hi đị lượng dựa vào terminator NOS a Hóa chất - Maxima SYBR Green/ROX qPCR Master Mix (2X) - Nuclease-free Water - Cặp mồi HA-nos 118-f: 5' - GCATGACGTTATTTATGAGATGGG - 3' HA-nos 118-r: 5' - GACACCGCGCGCGATAATTTATCC - 3' b Thiết bị - Máy Real-time PCR LightCycler 96 - Bộ Micropipete c Các bước tiến hành * Tách chiết DNA (xem phụ lục 2) * Thực hi n phản ứng Real-time PCR Thực phản ứng Real-time PCR với mẫu chuẩn có tỷ lệ biến đổi gen từ , đến 1% mẫu cần định lượng với hai cặp mồi HA-nos 118-f/ HA-nos 118-r ZEIN3/ZEIN4 Các thành phần, nồng độ hóa chất chương trình nhiệt cho phản ứng trình bày bảng Bảng Thành phần phản ứng Real-time PCR với cặp mồi HA-nos 118-f/ HA-nos 118-r Thành phần hóa chất g độ Thể tích (l) 10,9 1x 12,5 0,3 0,2 M 0,3 0,2 M 1,0 25 N Nước 2X Maxima SYBR Green/Rox qPCR MasterMix Mồi HA-nos 118-f, 10 mol/l Mồi HA-nos 118-r, 10 mol/l DNA mẫu/đối chứng ng/μl Tổng Bả g Chương trình nhiệt cho phản ứng R al-tim PCR với cặp mồi H -nos 118-f/ HA-nos 118-r Nội dung Biến tính ban đầu Số chu kỳ Khuếch đại 40 Melt-Curve Nhi t độ/thời gian 95°C/10 phút 95oC/25 giây 62oC/30 giây 72oC/45 giây 72oC/3 phút 95oC/1 giây 65oC/1 phút 97oC/1 giây Các iểm chứng thực tương tự mục 3.1.1 Với trường hợp g n zein: thực tương tự mục 3.1.3 96 * Phân tích kết Kết phản ứng phân tích phần mềm LightCycler 96 Xác định chu kỳ ngưỡng (Ct) nos zein mẫu chuẩn để dựng đường chuẩn Y = aX + b, đó: Y: ∆Ct = Ct (nos) – Ct (zein) X: Logarit tỷ lệ biến đổi gen mẫu a: Hệ số dốc b: Điểm cắt theo lý thuyết Từ phương trình đường chuẩn ∆Ct mẫu cần định lượng, xác định tỷ lệ biến đổi gen mẫu 3.2 Quy trình phát hi n chuyên bi t ki n 3.2.1 Phát hi định tính ki n bắp Bt11 a Hóa chất - 10X DreamTaq Buffer (có 20 mM MgCl2) - dNTPs, mM - Nuclease-free Water - Dream Taq ADN polymeraza, U/l - Cặp mồi IVS2-2: 5’ - CTGGGAGGCCAAGGTATCTAAT - 3’ PAT- : 5’ - GCTGCTGTAGCTGGCCTAATCT - 3’ b Thiết bị d ng c - Máy PCR - Bồn điện di - Máy đọc gel - Bộ Micropipete c Các bước tiến hành * Tách chiết DNA (xem phụ lục 2) * Thực hi n phản ứng PCR Thực phản ứng PCR với cặp mồi IVS2-2/PAT-B Các thành phần, nồng độ hóa chất chương trình nhiệt phản ứng trình bày bảng Bảng Thành phần phản ứng PCR với cặp mồi IVS2-2/PAT-B Thành phần hóa chất Nước 10X DreamTaq Buffer (có 20 mM MgCl2) dNTPs, mM Mồi IVS2-2, 10 M Mồi PAT-B, 10 M Dream Taq ADN polymeraza, U/l N g độ 1x 0,8 mM 0,2 M 0,2 M 1,25 U Thể tích (l) 10,5 2,5 2,5 0,5 0,5 0,25 97 DNA mẫu/đối chứng ng/μl Tổng 1,0 25 Bả g Chương trình nhiệt cho phản ứng PCR với cặp mồi IVS2-2/PAT-B Nội dung Số chu kỳ Nhi t độ/thời gian Biến tính ban đầu 95°C/12 phút 95oC/30 giây Khuếch đại 40 64oC/30 giây 72oC/30 giây Kéo dài sau 72oC/10 phút Các iểm chứng thực tương tự mục 3.1.1 Với trường hợp phát gen zein: thực tương tự mục 3.1.1 * Đ n di sản phẩm PCR Kết phản ứng phân tích điện di gel agarose 1,5% với hiệu điện 100 volt thời gian 30 phút, nhuộm g l au hi điện di với ethidium bromide (0,4 ng/µl) 15 phút Quan sát kết máy đọc gel Kích thước sản phẩm khuếch đại tương ứng cho cặp mồi: 189 bp (cặp mồi IVS2-2/PAT-B); 277 bp (cặp mồi ZEIN3/ZEIN4) 3.2.2 Phát hi định tính ki n bắp BT176 a Hóa chất - 10X DreamTaq Buffer (có 20 mM MgCl2) - dNTPs, mM - Nuclease-free Water - Dream Taq ADN polymeraza, U/l - Cặp mồi Cry03: '5 - CTCTCGCCGTTCATGTCCGT - 3' Cry04: 5' GGTCAGGCTCAGGCTGATGT - 3' b Thiết bị - Máy PCR - Bồn điện di - Máy đọc gel - Bộ Micropipete c Các bước tiến hành * Tách chiết DNA (xem phụ lục 2) * Thực hi n phản ứng PCR Thực phản ứng PCR với cặp mồi Cry03/Cry04 Các thành phần hóa chất chương trình nhiệt phản ứng trình bày bảng 98 Bảng Thành phần phản ứng PCR với cặp mồi Cry03/Cry04 Thành phần hóa chất N g độ Thể tích (l) Nước 17,75 10X DreamTaq Buffer (có 20 mM MgCl2) 1x 2,5 dNTPs, mM 0,8 mM 2,5 0,5 Mồi Cry03, 10 M 0,2 M 0,5 Mồi Cry04, 10 M 0,2 M 1,25 U 0,25 Dream Taq ADN polymeraza, U/l DNA mẫu/đối chứng ng/μl 1,0 Tổng 25 Bả g Chương trình nhiệt cho phản ứng PCR với cặp mồi Cry 3/Cry Nội dung Số chu kỳ Nhi t độ/thời gian Biến tính ban đầu 95°C/12 phút 95oC/30 giây Khuếch đại 40 63oC/30 giây 72oC/30 giây Kéo dài sau 72oC/6 phút Các iểm chứng thực tương tự mục 3.1.1 Với trường hợp phát gen zein: thực tương tự mục 3.1.1 * Đ n di sản phẩm PCR Kết phản ứng phân tích điện di gel agarose 1,5% với hiệu điện 100 volt thời gian 30 phút, nhuộm g l au hi điện di với ethidium bromide (0,4 ng/µl) 15 phút Quan sát kết máy đọc gel Kết phản ứng phân tích điện di g l agaro Kích thước sản phẩm khuếch đại tương ứng cho cặp mồi: 211 bp (cặp mồi Cry03/Cry04); 277 bp (cặp mồi ZEIN3/ZEIN4) 3.2.3 Phát hi định tính ki n bắp GA21 a Hóa chất - 10X DreamTaq Buffer (có 20 mM MgCl2) - dNTPs, mM - Nuclease-free Water - Dream Taq ADN polymeraza, U/l - Cặp mồi GA21F: 5'- GAAGCCTCGGCAACGTCA-3' GA21R: 5' ATCCGGTTGGAAAGCGACTT - 3' b Thiết bị d ng c - Máy PCR - Bồn điện di 99 - Máy đọc gel - Bộ Micropipete c Các bước tiến hành * Tách chiết DNA (xem phụ lục 2) * Thực hi n phản ứng PCR Thực phản ứng PCR với cặp mồi GA21F/GA21R Các thành phần hóa chất chương trình nhiệt phản ứng trình bày bảng Bảng Thành phần phản ứng PCR với cặp mồi GA21F/GA21R Thành phần hóa chất N g độ Thể tích (l) Nước 17,75 10X DreamTaq Buffer (có 20 mM MgCl2) 1x 2,5 dNTPs, mM 0,8 mM 2,5 0,5 Mồi GA21F, 10 M 0,2 M 0,5 Mồi GA21R, 10 M 0,2 M 1,25 U 0,25 Dream Taq DNA polymeraza, U/l DNA mẫu/đối chứng ng/μl 1,0 Tổng 25 Bả g Chương trình nhiệt cho phản ứng PCR với cặp mồi GA21 3-5’/G 21 5-3’ Nội dung Số chu kỳ Nhi t độ/thời gian Biến tính ban đầu 95°C/12 phút 95oC/30 giây Khuếch đại 40 63oC/30 giây 72oC/30 giây Kéo dài sau 72oC/6 phút Các iểm chứng thực tương tự mục 3.1.1 Với trường hợp phát gen zein: thực tương tự mục 3.1.1 c Đ n di sản phẩm PCR Kết phản ứng phân tích điện di gel agarose 1,5% với hiệu điện 100 volt thời gian 30 phút, nhuộm g l au hi điện di với ethidium bromide (0,4 ng/µl) 15 phút Quan sát kết máy đọc gel.Kết phản ứng phân tích điện di g l agaro Kích thước sản phẩm khuếch đại tương ứng cho cặp mồi: 133 bp (cặp mồi GA21 35’/G 21 5-3’ ; 277 bp (cặp mồi ZEIN3/ZEIN4) 3.2.4 Phát hi định tính ki đậu nành 356043 a Hóa chất - 10X DreamTaq Buffer (có 20 mM MgCl2) - dNTPs, mM - Nuclease-free Water 100 - Dream Taq ADN polymeraza, U/l - Cặp mồi DP-5-F: 5’- GGCCACTAGTGAGCTCGGTA - 3’ DP-5-R: 5’- GATGGTCTTTCTATTCCCCTAGCG - 3’ - Cặp mồi GM 3: 5’- GCCCTCTACTCCACCCCCATCC -3’ GM 4: 5’- GCCCATCTGCAAGCCTTTTTGTG - 3’ b Thiết bị d ng c - Máy PCR - Bồn điện di - Máy đọc gel - Bộ Micropipete c Các bước tiến hành * Tách chiết DNA (xem phụ lục 2) * Thực hi n phản ứng PCR Thực phản ứng PCR với cặp mồi DP-5-F/DP-5-R Các thành phần hóa chất chương trình nhiệt phản ứng trình bày bảng Bảng Thành phần phản ứng PCR với cặp mồi DP-5-F/DP-5-R Thành phần hóa chất N g độ Thể tích (l) Nước 17,75 10X DreamTaq Buffer (có 20 mM MgCl2) 1x 2,5 dNTPs, mM 0,8 mM 2,5 0,5 Mồi DP-5-F, 10 M 0,2 M 0,5 Mồi DP-5-R, 10 M 0,2 M 1,25 U 0,25 Dream Taq ADN polymeraza, U/l DNA mẫu/đối chứng ng/μl 1,0 Tổng 25 Bả g Chương trình nhiệt cho phản ứng PCR với cặp mồi DP-5-F/DP-5-R Nội dung Biến tính ban đầu Số chu kỳ Khuếch đại 40 Kéo dài sau Nhi t độ/thời gian 95°C/10 phút 95oC/30 giây 53oC/30 giây 72oC/30 giây 72oC/7 phút Các iểm chứng thực tương tự nội dung mục 3.1.1 Với trường hợp phát gen nội chuẩn lectin, thực phản ứng PCR với cặp mồi GMO3/GMO4 Thành phần hóa chất chương trình nhiệt phản ứng trình bày bảng 101 Bảng Thành phần phản ứng PCR với cặp mồi GMO3/GMO4 Thành phần hóa chất N g độ Thể tích (l) Nước 17,75 10X DreamTaq Buffer (có 20 mM MgCl2) 1x 2,5 dNTPs, mM 0,8 mM 2,5 0,5 Mồi GMO3, 10 M 0,2 M 0,5 Mồi GMO4, 10 M 0,2 M 1,25 U 0,25 Dream Taq ADN polymeraza, U/l DNA mẫu/đối chứng ng/μl 1,0 Bảng Chương trình cho phản ứng PCR với cặp mồi GMO3/GMO4 Nội dung Số chu kỳ Nhi t độ/ Thời gian Biến tính ban đầu 95°C/10 phút 95oC/20 giây Khuếch đại 40 62oC/40 giây 72oC/60 giây Kéo dài sau 72oC/3 phút * Đ n di sản phẩm PCR Kết phản ứng phân tích điện di gel agarose 1,5% với hiệu điện 100 volt thời gian 30 phút, nhuộm g l au hi điện di với ethidium bromide (0,4 ng/µl) 15 phút Quan sát kết máy đọc gel Kết phản ứng phân tích điện di g l agaro Kích thước sản phẩm khuếch đại tương ứng cho cặp mồi: 176 bp (cặp mồi DP-5-F/DP-5R); 118 bp (cặp mồi GMO3/GMO4) 3.2.5 Phát hi n định tính ki đậu nành 305423 a Hóa chất - 10X DreamTaq Buffer (có 20 mM MgCl2) - dNTPs, mM - Nuclease-free Water - Dream Taq ADN polymeraza, U/l - Cặp mồi NJ23-1-F: 5’- CGTCAGGAATAAAGGAAGTACAGTA - 3’ NJ23-1-R: 5’- CAACCAAATGCCCTAAAGGATGCGT - 3’ b Thiết bị - Máy PCR - Bồn điện di - Máy đọc gel - Bộ Micropipete c Các bước tiến hành * Tách chiết DNA (xem phụ lục 2) 102 * Thực hi n phản ứng PCR Thực phản ứng PCR với cặp mồi NJ23-1-F/NJ23-1-R Các thành phần hóa chất chương trình nhiệt cho phản ứng trình bày bảng Bảng Thành phần phản ứng PCR với cặp mồi NJ23-1-F/NJ23-1-R Thành phần hóa chất N g độ Thể tích (l) Nước 17,75 10X DreamTaq Buffer (có 20 mM MgCl2) 1x 2,5 dNTPs, mM 0,8 mM 2,5 0,5 Mồi NJ23-1-F, 10 M 0,2 M 0,5 Mồi NJ23-1-R, 10 M 0,2 M 1,25 U 0,25 Dream Taq ADN polymeraza, U/l DNA mẫu/đối chứng ng/μl 1,0 Tổng 25 Bả g Chương trình nhiệt cho phản ứng PCR với cặp mồi DP-5-F/DP-5-R Nội dung Số chu kỳ Nhi t độ/thời gian Biến tính ban đầu 95°C/10 phút 95oC/30 giây Khuếch đại 40 63oC/30 giây 72oC/30 giây Kéo dài sau 72oC/3 phút Các iểm chứng thực tương tự mục 3.1.1 Với trường hợp phát gen lectin: thực tương tự mục 3.2.4 * Đ n di sản phẩm PCR Kết phản ứng phân tích điện di gel agarose 1,5% với hiệu điện 100 volt thời gian 30 phút, nhuộm g l au hi điện di với ethidium bromide (0,4 ng/µl) 15 phút Quan sát kết máy đọc gel Kết phản ứng phân tích điện di g l agaro Kích thước sản phẩm khuếch đại tương ứng cho cặp mồi: 224 bp (cặp mồi NJ23-1-F/ NJ23-1-R); 118 bp (cặp mồi GMO3/GMO4) 3.2.6 Phát hi đị lượng ki n bắp Bt11 a Hóa chất - Maxima SYBR Green/ROX qPCR Master Mix (2X) - Nuclease-free Water - Cặp mồi IVS2-2: 5’ -CTGGGAGGCCAAGGTATCTAAT - 3’ P T: 5’ - GCTGCTGTAGCTGGCCTAATCT - 3’ b Thiết bị - Máy Real-time PCR LightCycler 96 - Bộ Micropipete 103 c Các bước tiến hành * Tách chiết DNA (xem phụ lục 2) * Thực hi n phản ứng PCR Thực phản ứng Real-time PCR với mẫu chuẩn có tỷ lệ biến đổi gen từ , đến 1% mẫu cần định lượng với hai cặp mồi IVS2-2/PAT-B ZEIN3/ZEIN4 Đối với Bt11, thành phần, nồng độ hóa chất chương trình nhiệt cho phản ứng trình bày bảng Bảng Thành phần phản ứng PCR với cặp mồi IVS2-2/PAT-B Thành phần hóa chất N g độ Thể tích (l) Nước 10,5 2X Maxima SYBR Green/Rox qPCR MasterMix 1x 12,5 1,25 Mồi IVS2-2, 10 M 0,5 M 1,25 Mồi PAT-B, 10 M 0,5 M DNA mẫu/đối chứng ng/μl 1,0 Tổng 25 Bả g Chương trình nhiệt cho phản ứng PCR với cặp mồi IVS2-2/PAT-B Nội dung Số chu kỳ Nhi t độ/thời gian Biến tính ban đầu 95°C/12 phút 95oC/30 giây Khuếch đại 40 64oC/30 giây 72oC/30 giây 72oC/3 phút 95oC/1 giây Melt-Curve 65oC/1 phút 97oC/1 giây Các iểm chứng thực tương tự mục 3.1.1 Đối với trường hợp phát gen zein: thực tương tự mục 3.1.3 * Phân tích kết Kết phản ứng phân tích phần mềm LightCycler 96 Xác định chu kỳ ngưỡng (Ct) Bt11 zein mẫu chuẩn để dựng đường chuẩn Y = aX + b, Y: ∆Ct = Ct (Bt11) – Ct (zein) X: Logarit tỷ lệ biến đổi gen mẫu a: Hệ số dốc b: Điểm cắt theo lý thuyết Từ phương trình đường chuẩn ∆Ct mẫu cần định lượng, xác định tỷ lệ biến đổi g n mẫu 104 3.2.7 Phát hi đị lượng ki n bắp Bt176 a Hóa chất - Maxima SYBR Green/ROX qPCR Master Mix (2X) - Nuclease-free Water - Cặp mồi Cry03: 5’ - CTCTCGCCGTTCATGTCCGT - 3’ Cry04: 5’ GGTCAGGCTCAGGCTGATGT - 3’ b Thiết bị - Máy Real-time PCR LightCycler 96 - Bộ Micropipete c Các bước tiến hành * Tách chiết DNA (xem phụ lục 2) * Thực hi n phản ứng Real - time PCR Thực phản ứng Real-time PCR với mẫu chuẩn có tỷ lệ biến đổi gen từ , đến 1% mẫu cần định lượng với hai cặp mồi Cry03/Cry04 ZEIN3/ZEIN4 Các thành phần hóa chất chương trình nhiệt phản ứng trình bày bảng Bảng Thành phần phản ứng PCR với cặp mồi Cry03/Cry04 Thành phần hóa chất N g độ Thể tích (l) Nước 2X Maxima SYBR Green/Rox qPCR MasterMix 1x Mồi Cry03, 10 M 0,2 M Mồi Cry04, 10 M 0,2 M DNA mẫu/đối chứng ng/μl Tổng 17,75 12,5 0,5 0,5 1,0 25 Bả g Chương trình nhiệt cho phản ứng PCR với cặp mồi Cry 3/Cry Nội dung Biến tính ban đầu Số chu kỳ Khuếch đại 40 Melt-Curve Nhi t độ/thời gian 95°C/12 phút 95oC/30 giây 63oC/30 giây 72oC/30 giây 72oC/3 phút 95oC/1 giây 65oC/1 phút 97oC/1 giây Các iểm chứng thực tương tự mục 3.1.1 Với trường hợp phát gen zein: thực tương tự mục 3.1.3 105 * Phân tích kết Kết phản ứng phân tích phần mềm LightCycler 96 Xác định chu kỳ ngưỡng (Ct) 35S zein mẫu chuẩn để dựng đường chuẩn Y = aX + b, đó: Y: ∆Ct = Ct (35s) – Ct (zein) X: Logarit tỷ lệ biến đổi gen mẫu a: Hệ số dốc b: Điểm cắt theo lý thuyết Từ phương trình đường chuẩn ∆Ct mẫu cần định lượng, xác định tỷ lệ biến đổi g n mẫu 3.2.8 Phát hi đị lượng ki n bắp GA21 a Hóa chất - Maxima SYBR Green/ROX qPCR Master Mix (2X) - Nuclease-free Water - Cặp mồi GA21 3-5’: 5'- GAAGCCTCGGCAACGTCA-3' GA21 53’: 5'- ATCCGGTTGGAAAGCGACTT - 3' b Thiết bị - Máy Real-time PCR LightCycler 96 - Bộ Micropipete c Các bước tiến hành * Tách chiết DNA (xem phụ lục 2) * Thực hi n phản ứng Real – time PCR Thực phản ứng Real-time PCR với mẫu chuẩn có tỷ lệ biến đổi gen từ 0,05% đến 1% mẫu cần định lượng với hai cặp mồi GA21F/GA21R ZEIN3/ZEIN4 Các thành phần hóa chất chương trình nhiệt phản ứng trình bày bảng Bảng Thành phần phản ứng PCR với cặp mồi GA21F/GA21R Thành phần hóa chất N ng độ Nước Thể tích (l) 17,75 2X Maxima SYBR Green/Rox qPCR MasterMix 1x 12,5 Mồi GA21F, 10 M 0,2 M 0,5 Mồi GA21R, 10 M 0,2 M 0,5 DNA mẫu/đối chứng ng/μl Tổng 1,0 25 106 Bả g Chương trình nhiệt cho phản ứng PCR với cặp mồi GA21 3-5’/G 21 5-3’ Nội dung Biến tính ban đầu Số chu kỳ Khuếch đại 40 Melt-Curve Nhi t độ/thời gian 95°C/12 phút 95oC/30 giây 63oC/30 giây 72oC/30 giây 72oC/3 phút 95oC/1 giây 65oC/1 phút 97oC/1 giây Các iểm chứng thực tương tự mục 3.1.1 Với trường hợp phát gen zein: thực tương tự mục 3.1.3 * Phân tích kết Kết phản ứng phân tích phần mềm LightCycler 96 Xác định chu kỳ ngưỡng (Ct) 35S zein mẫu chuẩn để dựng đường chuẩn Y = aX + b, đó: Y: ∆Ct = Ct (GA21) – Ct (zein) X: Logarit tỷ lệ biến đổi gen mẫu a: Hệ số dốc b: Điểm cắt theo lý thuyết Từ phương trình đường chuẩn ∆Ct mẫu cần định lượng, xác định tỷ lệ biến đổi gen mẫu 3.2.9 Phát hi đị lượng ki đậu nành 356043 a Hóa chất - Maxima SYBR Green/ROX qPCR Master Mix (2X) - Nuclease-free Water - Cặp mồi DP-5-F: 5’- GGCCACTAGTGAGCTCGGTA - 3’ DP-5-R: 5’- GATGGTCTTTCTATTCCCCTAGCG - 3’ - Cặp mồi GM 3: 5’- GCC CTC TAC TCC ACC CCC ATCC - 3’ GM 4: 5’- GCC CAT CTG CAA GCC TTT TTG TG - 3’ b Thiết bị - Máy Real-time PCR LightCycler 96 - Bộ Micropipete c Các bước tiến hành * Tách chiết DNA (xem phụ lục 2) * Thực hi n phản ứng Real - time PCR 107 Thực phản ứng Real-time PCR với mẫu chuẩn có tỷ lệ biến đổi gen từ ,1 đến 5% mẫu cần định lượng với hai cặp mồi DP-5-F/DP-5-R GMO3/GMO4 Đối với trường hợp 356043, thành phần hóa chất chương trình nhiệt phản ứng trình bày bảng Bảng Thành phần phản ứng PCR với cặp mồi DP-5-F/DP-5-R Thành phần hóa chất N g độ Thể tích (l) Nước 17,75 2X Maxima SYBR Green/Rox qPCR MasterMix 1x 12,5 0,5 Mồi DP-5-F, 10 M 0,2 M 0,5 Mồi DP-5-R, 10 M 0,2 M DNA mẫu/đối chứng ng/μl 1,0 Tổng 25 Bả g Chương trình nhiệt cho phản ứng PCR với cặp mồi DP-5-F/DP-5-R Nội dung Số chu kỳ Nhi t độ/thời gian Biến tính ban đầu 95°C/10 phút 95oC/30 giây Khuếch đại 40 53oC/30 giây 72oC/30 giây Kéo dài sau 72oC/7 phút Các iểm chứng thực tương tự phụ lục Đối với trường hợp phát gen nội chuẩn lectin, thực phản ứng PCR với cặp mồi GMO3/GMO4 Thành phần hóa chất chương trình nhiệt cho phản ứng trình bày bảng Bảng Thành phần phản ứng PCR với cặp mồi GMO3/GMO4 Thành phần hóa chất N g độ Thể tích (l) Nước 17,75 2X Maxima SYBR Green/Rox qPCR MasterMix 1x 2,5 0,5 Mồi GMO3, 10 M 0,2 M 0,5 Mồi GMO4, 10 M 0,2 M DNA mẫu/đối chứng ng/μl 1,0 Tổng 25 Bảng Chương trình cho phản ứng PCR với cặp mồi GMO3/GMO4 Nội dung Số chu kỳ Nhi t độ/ Thời gian Biến tính ban đầu 95°C/10 phút 95oC/20 giây Khuếch đại 40 62oC/40 giây 72oC/60 giây Melt-Curve 72oC/3 phút 108 95oC/1 giây 65oC/1 phút 97oC/1 giây * Phân tích kết Kết phản ứng phân tích phần mềm LightCycler 96 Xác định chu kỳ ngưỡng (Ct) 35s zein mẫu chuẩn để dựng đường chuẩn Y = aX + b, đó: Y: ∆Ct = Ct (356043) – Ct (zein) X: Logarit tỷ lệ biến đổi gen mẫu a: Hệ số dốc b: Điểm cắt theo lý thuyết Từ phương trình đường chuẩn ∆Ct mẫu cần định lượng, xác định tỷ lệ biến đổi gen mẫu 3.2.10 Phát hi đị lượng ki đậu nành 305423 a Hóa chất - Maxima SYBR Green/ROX qPCR Master Mix (2X) - Nuclease-free Water - Cặp mồi NJ23-1-F: 5’- CGTCAGGAATAAAGGAAGTACAGTA-3’ NJ23-1-R: 5’-CAACCAAATGCCCTAAAGGATGCGT-3’ b Thiết bị - Máy Real-time PCR LightCycler 96 - Bộ Micropipete c Các bước tiến hành * Tách chiết DNA (xem phụ lục 2) * Thực hi n phản ứng Real – time PCR Thực phản ứng Real-time PCR với mẫu chuẩn có tỷ lệ biến đổi gen từ ,1 đến 5% mẫu cần định lượng với hai cặp mồi cặp mồi NJ23-1-F/ NJ23-1-R GMO3/GMO4 Đối với trường hợp 305423, thành phần hóa chất chương trình nhiệt cho phản ứng trình bày bảng Bảng Thành phần phản ứng PCR với cặp mồi NJ23-1-F/ NJ23-1-R Thành phần hóa chất N g độ Nước 2X Maxima SYBR Green/Rox qPCR MasterMix Thể tích (l) 17,75 1x 12,5 Mồi NJ23-1-F, 10 M 0,2 M 0,5 Mồi NJ23-1-R, 10 M 0,2 M 0,5 109 DNA mẫu/đối chứng ng/μl Tổng 1,0 25 Bả g Chương trình nhiệt cho phản ứng PCR với cặp mồi DP-5-F/DP-5-R Nội dung Số chu kỳ Nhi t độ/thời gian Biến tính ban đầu 95°C/10 phút 95oC/30 giây Khuếch đại 40 63oC/30 giây 72oC/30 giây 72oC/3 phút 95oC/1 giây Melt-Curve 65oC/1 phút 97oC/1 giây Các iểm chứng thực tương tự mục 3.1.1 Với trường hợp phát gen lectin: thực tương tự mục 3.2.9 c Phân tích kết Kết phản ứng phân tích phần mềm LightCycler 96 Xác định chu kỳ ngưỡng (Ct) 35S zein mẫu chuẩn để dựng đường chuẩn Y = aX + b, đó: Y: ∆Ct = Ct 5423 – Ct(zein) X: Logarit tỷ lệ biến đổi gen mẫu a: Hệ số dốc b: Điểm cắt theo lý thuyết Từ phương trình đường chuẩn ∆Ct mẫu cần định lượng, xác định tỷ lệ biến đổi g n mẫu 110