Phát triển quy trình sàng lọc nhanh sản phẩm thức ăn chăn nuôi có nguồn gốc từ ngô và đậu nành biến đổi gen bằng phương pháp duplex pcr

BAN QUẢN LÝ KHU NÔNG NGHIỆP CÔNG NGHỆ CAO TP HCM TRUNG TÂM NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG NGHIỆP CÔNG NGHỆ CAO BÁO CÁO NGHIỆM THU PHÁT TRIỂN QUY TRÌNH SÀNG LỌC NHANH SẢN PHẨM THỨC ĂN CHĂN NI CĨ NGUỒN GỐC TỪ NGƠ VÀ ĐẬU NÀNH BIẾN ĐỔI GEN BẰNG PHƯƠNG PHÁP DUPLEX PCR CN Nguyễn Văn Lượng Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 01/2018 BAN QUẢN LÝ KHU NÔNG NGHIỆP CÔNG NGHỆ CAO TP HCM TRUNG TÂM NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG NGHIỆP CÔNG NGHỆ CAO BÁO CÁO NGHIỆM THU (Đã chỉnh sửa theo góp ý Hội đờng nghiệm thu) PHÁT TRIỂN QUY TRÌNH SÀNG LỌC NHANH SẢN PHẨM THỨC ĂN CHĂN NI CĨ NGUỒN GỐC TỪ NGÔ VÀ ĐẬU NÀNH BIẾN ĐỔI GEN BẰNG PHƯƠNG PHÁP DUPLEX PCR CƠ QUAN CHỦ TRÌ (Ký tên, đóng dấu xác nhận) CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI (Ký tên) Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 01/2018 This study has developed a method for detection GMO in livestock feed products from corn and soybean by duplex PCR This method based on the detection of sequence promoter P35S, terminator nos, Cry1Ab and epsps gene In this study, the primer pairs concentration, annealing time and temperature, alongated time and temperature were optimized Duplex PCR optimized for GM corn by detection P35S with P35S/zein primer pair concentration was 0,2µM/0,4µM, annealing at 60ºC in 4s, elongated at 72 C in 120s; detection t-nos with t-nos/zein primer pair concentration was 0,2µM/0,4µM, annealing at 58ºC in 30s, elongated at 68 C in 60s; detection Cry1Ab gene with Cry/zein primer pair concentration was 3µM/0,4µM, annealing at 60ºC in 30s, elongated at 68 C in 120s Duplex PCR optimized in soybean for detection P35S with P35S/lectin primer pair concentration was 0,5µM/0,2µM, annealing at 58ºC in 30s, elongated at 72 C in 120s; detection t-nos with t-nos/lectin primer pair concentration was 0,5µM/0,5µM, annealing at 60ºC in 45s, elongated at 68 C in 60s; detection epsps gene with epsps/lectin primer pair concentration was 0,3µM/0,4µM, annealing at 58ºC in 30s, elongated at 68 C in 60s Duplex PCR method had high sensitivity with the dectection limit at 0,5% This method has shown the effective in detection GMO as some commercial GMO detection Kit Keyword: corn, duplex, GMO, PCR, livestock feed, soybean iii Nghiên c ng quy trình sàng l c GMO có ngu n g c t nành b u n trình t promoter P35S, terminator nos, gen kháng sâu b Cry1Ab, gen ch ng ch u thu c tr c epsps Quy trình duplex PCR v i c p m i phát hi n GMO m thông s : nhi ct th i gian b t c p, nhi th i gian kéo dài, t l n m i c a c p m i duplex PCR Duplex PCR P35S i P35S/zein 0,2µM/0,4µM 608ºC 45 72 C 120 giây; 0,2µM/0,4µM ºC dài 68 C 60 giây; 3µM/0,4µM 60ºC 68 C 120 giây Duplex PCR 0,5µM/0,2µM 58ºC 72 C 120 giây; 0,5µM/0,5µM 60ºC giây; 68 C 60 epsp 0,3µM/0,4µM 58ºC PCR v ng GMO 68 C 60 giây Quy trình duplex nh y có th sàng l c s n ph m ngô m duplex, u nành chuy n gen v i hàm nh y cao so v i v i Kit phát hi n GMO th ngô, iv ng Trang iii ABSTRACT iv C v vii viii x 3 1.2 Các gen m c tiêu bi n n p ph bi n: (Nguy n Th M Linh, 2015) 1.3 C n c a gen chuy n: (Lê Th Thu Hi n, 2007) 1.3.1 CaMV 35S promoter 1.3.2 NOS teminator 1.3.4 Các gen m c tiêu bi n n p ph bi n vào tr ng 1.4 Tình hình canh tác tr ng bi i gen 1.5 Các nghiên c u tron c 1.5.1 Tình hình nghiên c c 1.5.2 Tình hình nghiên c c 10 10 10 10 10 11 11 15 v 18 20 monoplex PCR 20 21 21 gen 22 24 27 27 28 30 31 ngô thu 31 3.4.2 ng d ph m th sàng l c m u s n ng ct u nành chuy trích DNA 32 34 4.1 34 4.2 34 35 vi DNA Deoxyribonucleic acid GMO Genetically Modified Organism LOD Limit of Detection PCR Polymerase Chain Reaction TAE Tris Acetate EDTA vii NG T 2.1 Trang 12 duplex PCR 2.2 13 2.3 13 2.4 14 EPSPSf/EPSPSr 2.5 14 2.6 15 2.7 164 gen 2.8 16 gen 2.9 gen duplex 2.10 17 17 phát 2.11 2.12 18 18 viii T Trang 3.1 3.2 21 28 ngô 3.3 29 ngô nguyên 3.4 30 3.5 31 3.6 32 ix Tên hình Trang 3.1 20 3.2 20 3.3 3.4 TnosZein; P35S-Zein; Cry- -68-72ºC zSSllb, 22 22 duplex PCR gen - 3.5 ZEIN; P35S-ZEIN; EPSPS- 23 120s 180s 3.6 Lectin; P35S-lectin; EPSPS- 60s; 23 120s 180s -1/2 3.7 -lectin; EPSPS-lectin; Tnos- 24 -60-62-65ºC 3.8 -ZEIN; EPSPS-ZEIN; Tnos- 24 58-60-62-65ºC 3.9 K t qu t fw/Lectin-rv K t qu t 3.10 m i P35S-fw/P35S-rv Lectin- m i Tnos-fw/ Tnos-rv Lectin-fw/ Lectin-rv Gi ng 1-5: N ng 25 25 Lectin/Tnos 3.11 -fw/ EPSPS-rv x 25 - -fw/ P35S-rv Lectin-fw/ Lectin-rv P35S-fw/ P35S-rv Lectin- fw/ Lectin-rv -lectin 0,5µM/0,2µM P35S-fw/P35S-rv Lectin-fw/Lectin-rv Hình 3.9 ( ; -5: 2µM /0,3 µM; 0,2µM /0,2 µM ; 0,2µM/0,1 µM; 10 , 0,3µM/0,4 µM; 0,3µM/0,3 µM; 0,3µM/0,2 µM; 0,3µM/0,1 µM; Lectin//P35S: 0,4µM/0,5 µM, 0,4µM/0,4 µM; 0,4µM/0,3 µM; 0,4µM/0,2 µM; 0,4µM/0,1 µM; - -15 -20 -25 0,5µM/0,5 µM, 0,5µM/0,4 µM; 0,5µM/0,3 µM; 0,5µM/0,2 µM; 0,5µM/0,1 µM) -fw/ Tnos-rv Lectin-fw/ Lectin-rv 0, -lectin 0,5µM/0,5µM -fw/ Tnos-rv Lectin-fw/ Lectin-rv Hình 3.10 ( ; -5: Lectin/Tnos: 0,2µM/ 0,5 µM; 0,2µM /0,4 µM; 0,3µM /0,3 µM; 0,2µM /0,2 µM ; 0,2µM/0,1 µM; 0,3µM/0,5 µM, 0,3µM/0,4 µM; 0,3µM/0,3 µM; 0,3µM/0,2 µM; 0,3µM/0,1 µM; 0,4µM/0,4 µM; 0,4µM/0,3 µM; 0,4µM/0,2 µM; 0,4µM/0,1 µM; -15 -20: -25 0,5µM/0,3 µM; 0,5µM/0,2 µM; 0,5µM/0,1 µM.) 3.2.2.3 -fw/ EPSPS-rv Lectin-fw/ Lectin-rv 0,3µM/0,4µM (hình 3.11) 25 -10: -fw/ EPSPS-rv Lectin-fw/ Lectin-rv Hình 3.11 ( ; -5 M /0,2 µM ; 0,2µM/0,1 µM; 0,3µM/0,5 µM, 0,3µM/0,4 µM; 0,3µM/0,3 µM; 0,3µM/0,2 µM; 0,3µM/0,1 µM; 0,4µM/0,4 µM; 0,4µM/0,3 µM; 0,4µM/0,2 µM; 0,4µM/0,1 µM; -10 -15 -20 ectin/EPSPS: 0,5µM/0,5 µM, 0,5µM/0,4 µM; -25: 0,5µM/0,3 µM; 0,5µM/0,2 µM; 0,5µM/0,1 µM.) 3.2.2.4 -fw/ Tnos-rv ZEIN-fw/ ZEIN-rv 2, 0,2µM/0,4µM 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 Hình 3.12 ( Tnos-fw/ Tnos-rv ZEIN-fw/ ZEIN-rv ; -5 0,2µM/0,5 µM; 0,2µM/0,4; 0,2µM/0,3 µM; 0,2µM/0,2 µM; 0,2µM/0,1µM; 0,3µM/0,3 µM; 0,3µM/0,2 µM; 0,3µM/0,1µM; 0,4µM/0,1µM; -10 3µM/0,5 µM; 0,3µM/0,4; -15 -20 0,5µM/0,4; 0,5µM/0,3 µM; 0,5µM/0,2 µM; 0,5µM/0,1µM) -25 3.2.2.5 -fw/ P35S-rv và ZEIN-fw/ ZEIN-rv 0,2µM/0,4µM (hình 3.13) 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 Hình 3.13 ( P35S-fw/ P35S-rv và ZEIN-fw/ ZEIN-rv ; -5: Zein/P35S 0,2µM/0,5 µM; 0,2µM/0,4 µM; 0,2µM/0,3 µM; 0,2µM/0,2 µM; 0,1µM/0,1 µM; µM; 0,3µM/0,4 µM; 0,3µM/0,3 µM; 0,3µM/0,2 µM; 0,3µM/0,1 µM; 0,2µM/0,3 µM; 0,2µM/0,2 µM; 0,2µM/0,1 µM; -10 -15 -20 0,1µM/0,4 µM; 0,1µM/0,3 µM; 0,1µM/0,2 µM; 21-25 0,1µM/0,1 µM) 3.2.2.6 -fw/ Cry-rv ZEIN-fw/ ZEIN-rv Cry0,3µM/0,4µM (hình 3.14) Hình 3.14 Cry-fw/ Cry-rv ZEIN-fw/ ZEIN-rv 26 ( -5: -10 0,2µM/0,5 µM; 0,2µM/0,4; 0,2µM/0,3 µM; 0,2µM/0,2 µM; 0,2µM/0,1µM; 0,3µM/0,3 µM; 0,3µM/0,2 µM; 0,3µM/0,1µM; 0,4µM/0,1µM; Zein/Cry -15 -20 ) -25 3.3 3.2.1 duplex PCR Bt11 1% P35S, TNOS, cry1Ab, Maize) cho duplex PCR ZEIN- for/ZEIN-rev P35S for/P35S rev; ZEIN for/ZEIN rev TNOS for/TNOS rev, ZEIN-for/ZEIN-rev Cry1-for/Cry1- LECT-for/LECT-rev P35S-for/P35S-rev, LECT-for/LECT-rev TNOS-for/TNOS-rev, LECT for/LECT rev EPSPS-for/EPSPS-rev P35S, TNOS, EPSPS, lectin M B B A Hình 3.15 ( - - -lectin; - - - lectin) duplex PCR (hình 3.15 Bt11 for/ZEIN rev- duplex ZEIN 102 Maize zein gene revmaize - up Ready Soybean lectin gene 27 256 bp (Hình B) ngơ 100% 3.2.2 nh y k thu n v t li u di truy n c a m c th p nh t có th nh y k thu c g i b ng tên khác gi i h n phát hi n LOD (Limit of detection) Gi i h n n rong h n h p ph n ng kh c n nh y k thu t c a quy trình duplex PCR, DNA m u ngơ chu n c a trình t m c tiêu P35S, TNOS, cry1Ab, Maize phát hi n t i n c p m DNA c a c th hi n b ng 3.7 cho th y m i ZEIN for/ZEIN rev; P35S for/P35S rev, DNA Ngô Bt11 n 0,5% 1% khu c trình t 102bp, ng t c p m i ZEIN for/ZEIN rev; P35S for/P35S rev có gi i h n phát hi n 0,5% , ZEIN for/ZEIN rev TNOS for/TNOS; ZEIN for/ZEIN ngô Bt11 0,5% 1% for/ZEIN rev Cry1 nh y k thu t c a quy trình nh n bi t gen chuy n ngô 0,5% nành GTS c a c p m c th hi n phát hi n t i n DNA b ng 3.2 cho th y c p m i LECT LECT for/LECT rev; EPSPS for/EPSPS ( LECT for/LECT rev; P35S for/P35S rev LECT for/LECT rev; TNOS for/ LECT for/LECT 28 B ng 3.2 K t qu kh o sát nh y duplex PCR c p m i m u ngô chu n Ngô Bt11 (0%) (0,1%) (0,5%) (1%) ZEIN for/ZEIN rev; P35S for/P35S rev (-) (-) (+) (+) ZEIN for/ZEIN rev; TNOS for/TNOS rev (-) (-) (+) (+) (-) (-) (-) (+) ZEIN for/ZEIN rev; Cry1 for/Cry1 rev Chú thích: (- nành GTS c a c p m c th hi n phát hi n t i n DNA b ng 3.3 cho th y c p m i LECT for/LECT rev; P35S for/P35S rev v LECT for/LECT rev; EPSPS for/EPSPS LECT for/LECT rev; P35S for/P35S rev LECT for/LECT rev; LECT for/LECT B ng 3.3 K t qu kh o sát nh y duplex PCR c a c p m i m u nành chu n Roundup Ready (0%) (0,05%) (0,1%) (0,5%) LECT for/LECT rev; P35S for/P35S rev (-) (+) (+) (+) LECT for/LECT rev; TNOS for/TNOS rev (-) (+) (+) (+) LECT for/LECT rev; EPSPS for/EPSPS rev (-) (-) (-) (+) Chú thích: (- 29 Hình 3.16 K t qu i h n phát hi n c a quy trình duplex PCR phát hi n P35S-Zein; Tnos-Zein; Cry-Zein (Gi ng 1, 2, 3: P35S-zein GTS 0%; 0,5%; : P35S-zein GTS 0,05%; : Tnos-zein GTS 0%; Tnos-zein GTS 0,5%; Tnos-zein GTS 0,05%; 25,26,27: EPSPS-zein GTS 0%; P35S-zein GTS : Tnos-zein GTS 0,1%; EPSPS-zein GTS 0,05%; 0,1%; Hình 3.17 K t qu : P35S-zein GTS 0,1%; : : EPSPS-zein GTS : EPSPS-zein GTS 0,5%) i h n phát hi n c a quy trình duplex PCR phát hi n P35S-Lect; Tnos-Lect; EPSPS-Lect (Gi ng 1, 2, 3: P35S-lectin GTS 0%; lectin GTS 0,5%; : P35S-lectin GTS 0,05%; : Tnos-lectin GTS 0%; : Tnos-lectin GTS 0,5%; : P35S-lectin GTS 0,1%; 16,17,18: Tnos-lectin GTS 0,05%; 19,20,21: Tnos-lectin GTS 0,1%; : EPSPS-lectin GTS 0%; 31,32,33: EPSPS-lectin GTS 0,1%; 10,11,12: P35S- EPSPS-lectin GTS 0,05%; : EPSPS-lectin GTS 0,5%) 3.3.3 hình 3.19 ngơ Hình 3.18 K -lectin; EPSPS-lectin; Tnos-lectin ( : P35S-lectin GTS 0,1%; G lectin GTS 0,5%; G : P35S-lectin GTS 0,5%; G : Tnos-lectin GTS 0,1%; G 30 : EPSPS-lectin GTS 0,1%; G Tnos-lectin GTS 0,5%) : EPSPS- Hình 3.19 -zein; Cry-zein; Tnos-zein ( : P35S-zein 0,5%; G G 3.4 : P35S-zein 1%; G : Cry-zein 2%; G : P35S-zein 2%; G : Tnos-zein 0,5%; G : Cry-zein 0,5%; G : Tnos-zein 1%; G : Cry-zein 1%; 8: Tnos-zein 2%) ngô ngô ngô STT 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 S ng/ul) B01 B02 B03 B04 B05 B06 B07 B08 B09 B10 01 02 03 04 05 06 07 08 09 630,7 322,9 197,5 86,6 153,1 434,8 48,6 20,0 109,3 80,6 631,2 1633,8 1360,1 2764,8 100,2 330,7 40,5 704,9 13,4 20,1 31 260/280 1,77 1,92 1,45 1,67 1,3 1,72 1,75 1,13 1,76 1,44 1,72 2,03 1,91 1,9 1,92 1,91 1,16 1,97 1,36 1,61 3.4.2 ng d sàng l c m u s n ph m th ng ct Thí nghi th u nành chuy c ti n hành v i 10 m u ngô 10 m ng c thu th p 3.20 duplexPCR ngô ngô ngô ngô Hình 3.20 : K ( lectin; - 10 lectin; -20 -30 lectin) pháp duplex PCR STT 10 11 12 13 14 15 16 17 18 S B01 B02 B03 B04 B05 B06 B07 B08 B09 B10 01 02 03 04 05 06 07 08 Lectin (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (+) (+) (+) (-) (-) (+) (+) (+) Tnos (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) EPSPS (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) P35S (+) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (-) (-) 32 (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) Cry (-) (-) (-) (-) (+) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) Zein (+) (+) (+) (+) (+) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) 19 20 09 (+) (+) (-) (-) (+) (+) (+) (+) (-) (-) Chú ý: (- 3.4.3 So sánh v i 3.6 (GMO) GA21 Bt11 Bt176 0,1% 0,5% 0,1% 0,5% No Ct No Ct No Ct No Ct 0,1% 0,5% No Ct No Ct tính ,5% Qua ngơ 33 (-) (-) 4.1 gen ngơ 0,2µM/0,4µM 608ºC 45 72 C 120 giây; 0,2µM/0,4µM 58ºC 30 68 C 60 giây; 3µM/0,4µM 60ºC 30 kéo dài 68 C 120 giây gen duplex 0,5µM/0,2µM, 58ºC 30 72 C 120 giây; 0,5µM/0,5µM 60ºC 45 68 C 60 giây; epsps/zein 0,3µM/0,4µM epsps 58ºC 30 68 C 60 giây ngô ngô ngô 4.2 so sánh , 34 [1] 18 [2] , -347 [3] : 30, 6-12 [4] CpTI - Science & Technology Development, 18(3), 76 84 [5] Minh [6] - 159 [7] Barbau-Piednoir, E., Lievens, A., Mbongolo-Mbella, G., Roosens, N., Sneyers, M., Leunda-Casi, A., et al (2010) SYBR_Green qPCR screening methods for feed products Eur Food Res Technol 230, 383 393 doi: 10.1007/s00217-0091170-5 [8] Chaouachi, M., Chupeau, G., Berard, A., McKhann, H., Romaniuk, M., Giancola, S., et al (2008) A high-throughput multiplex method adapted for 35 GMO detection J Agric Food Chem 56, 11596 11606 doi: 10.1021/jf80 1482r [9] Gabriadze, I., Kutateladze, T., Vishnepolsky, B., Karseladze, M., and Datukishvili, N (2014) Application of PCR-based methods for rapid detection of corn ingredients in processed foods Int J Nutr Food Sci 3, 199 202 doi: 10.11648/j.ijnfs.20140303.21 [10] James D., Schmidt AM., Wall E., Green M., Masri S (2003) Reliable detection and identification of genetically modified maize, soybean, and canola by Multiplex PCR analysis Journal of Agricultural and Food Chemistry 51: 5829 5834 [11] James, C (2016) Global status of commercialized biotech/GM crops: 2014 Ithaca, NY, USA: International Service for the Acquisition of Agri-biotech Applications (ISAAA) [12] Kutateladze, T., Gabriadze, I., Vishnepolsky, B., Karseladze, M., and Datukishvili, N (2013) Development of triplex PCR for simultaneous detection of maize, wheat and soybean Food Control 34, 698 702 doi: 10.1016/j.foodcont.2013.06.018 [13] Lipp, M., Brodmann, P., Pietsch, K., Pauwels, J., & Anklam, E (1999) IUPAC collaborative trial study of a method to detect genetically modified soy beans and maize in dried powder Journal of AOAC International, 82, 923-928 [14] Stefanova, P., Angelova, G., Georgieva, T., Gotcheva, V., & Angelov, A (2015) A novel multiplex PCR method for simultaneous detection of genetically modified soybean events Int J Curr Microbiol App Sci, 4(4), 256-268 [15] Oguchi, T., Onishi, M., Mano, J., Akiyama, H., Teshima, R., Futo, S., & Kitta, K (2010) Development of multiplex PCR method for simultaneous detection of four events of genetically modified maize: DAS-59122-7, MIR604, MON863 and MON88017 Journal of the Food Hygienic Society of Japan (Japan) [16] Querci, M., Foti, N., Bogni, B., Kluga, L., Broll, H., and van den Eede, G (2009) Real-time PCR-based ready-to-use multi-target analytical system for GMO detection Food Anal Methods 2, 325 336 doi: 10.1007/s12161-009-9093-0 36 37 PH L C Ph l c Quy trình ly trích DNA 38 Ph l c Danh sách s n ph m th Kí 260/280 B01 630,7 1,77 B02 322,9 1,92 B03 Cám ngô 197,5 1,45 B04 Cám ngô 86,6 1,67 B05 153,1 1,3 B06 434,8 1,72 B07 48,6 1,75 B08 20 1,13 B09 109,3 1,76 B10 80,6 1,44 631,2 1,72 1633,8 2,03 01 xay 02 03 Cám ngô 1360,1 1,91 04 Cám ngô 2764,8 1,9 05 100,2 1,92 06 330,7 1,91 07 40,5 1,16 08 704,9 1,97 13,4 1,36 10 20,1 1,61 09 39