Áp dụng phương pháp phân tích dna để xác định nguồn gốc của các dược liệu và sản phẩm thuốc từ sâm sâm bố chính và nghệ

ỦY BAN NHÂN DÂN TP.HCM ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH SỞ KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ TT KHOA HỌC CÔNG NGHỆ DƯỢC BÁO CÁO NGHIỆM THU ÁP DỤNG PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH DNA ĐỂ XÁC ĐỊNH NGUỒN GỐC CỦA CÁC DƯỢC LIỆU VÀ SẢN PHẨM THUỐC TỪ SÂM, SÂM BỐ CHÍNH VÀ NGHỆ TRẦN THU HOA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH THÁNG 7/ 2010 ỦY BAN NHÂN DÂN TP.HCM ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ TT KHOA HỌC CÔNG NGHỆ DƯỢC BÁO CÁO NGHIỆM THU ÁP DỤNG PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH DNA ĐỂ XÁC ĐỊNH NGUỒN GỐC CỦA CÁC DƯỢC LIỆU VÀ SẢN PHẨM THUỐC TỪ SÂM, SÂM BỐ CHÍNH VÀ NGHỆ Chủ nhiệm dề tài: TRẦN THU HOA Những người tham gia: GS TS Nguyễn Thị Lang TS Trần Công Luận DS Phạm Ngọc Oanh DS Nguyễn Thị Ánh Ngọc DS Lê Tiến Dũng DS Võ Thụy Lữ Tâm DS Lê Thị Phương Anh ThS Nguyễn Thị Ngọc Tuyết CN Nguyễn Thanh Tố Nhi CN Nguyễn Lê Huyền Thanh THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH THÁNG 7/ 2010 TĨM TẮT NỘI DUNG NGHIÊN CỨU Tên đề tài: ÁP DỤNG PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH DNA ĐỂ XÁC ĐỊNH NGUỒN GỐC CỦA CÁC DƯỢC LIỆU VÀ SẢN PHẨM THUỐC TỪ SÂM, SÂM BỐ CHÍNH VÀ NGHỆ Mở đầu: Các tác dụng dược lý quý giá Sâm (Panax spp), Sâm bố Abelmoschus sagittifolius (Kurz) Merr., Nghệ (Curcuma sp.) từ lâu biết sử dụng quen thuộc, rộng rãi nhiều nước khu vực châu Á Tuỳ theo loài tùy nơi phân bố loài mà dược liệu có thành phần, tỷ lệ hoạt chất khác nhau, dẫn đến khác nhiều tác dụng dược lý, cơng dụng Chính đa dạng nguồn gốc, chủng loài dược liệu thị trường hay tự nhiên nên cần thành lập, triển khai phương pháp kỹ thuật phân tử để giúp việc định danh thuận tiện xác Các kỹ thuật dựa vào DNA cho phép tìm hiểu, quản lý sử dụng đa dạng di truyền trồng họ hàng hoang dại chúng tốt Chúng có ưu điểm không bị ảnh hưởng giai đoạn tăng trưởng điều kiện môi trường thực vật cung cấp phương pháp thực hứa hẹn so với dựa vào kiểu hình Các kỹ thuật gồm có: giải trình tự (sequencing), phức hợp liên kết mơ (MHC, major histocompatibility complex), minisatellite, microsatellite, đa hình chiều dài đoạn cắt giới hạn (RFLP, Restriction fragment length polymorphisms) số kỹ thuật dựa vào PCR đa hình đoạn DNA khuếch đại ngẫu nhiên (RAPD, random amplified polymorphic DNA), đa hình chiều dài đoạn DNA nhân chọn lọc (AFLP, amplified fragment length polymorphisms), hay đa hình trình tự lặp lại đơn giản (ISSR, intersimple sequence repeat polymorphisms) giúp phân tích tinh vi cấu trúc di truyền quần thể kiện khác trình sinh học tiến hóa chúng Trong đề tài nghiên cứu này, chúng tơi áp dụng phương pháp phân tích DNA RAPD MARMS PCR-RFLP cpDNA để định danh phân biệt sâm, nghệ sâm bố Mục tiêu: Xác định nguồn gốc dược liệu sản phẩm thuốc từ sâm Panax, nghệ sâm bố dược liệu làm thuốc quý phong phú chủng loại Phương pháp: Thu thập mẫu dược liệu sản phẩm thuốc Chiết DNA, phân tích RAPD MARMS Kết quả: 1- Năm loài sâm Panax phổ biến (P ginseng, P quinquefolius, P notoginseng, P japonicus P vietnamensis) tiến hành mô tả đặc điểm hình thái, định tính saponin sâm theo phương pháp truyền thống để làm sở cho nhận định Phân tích MARMS mẫu chuẩn 29 mẫu sản phẩm P Ginseng, P quinquefolius P notoginseng Kết đề tài cho thấy thành cơng việc: - Tìm quy trình thích hợp để chiết DNA từ mẫu sâm Panax - Áp dụng MARMS hiệu việc xác định loài sâm Xác định nhãn hiệu loại sâm thị trường, phòng sản phẩm giả mạo Quy trình kiểm định kiểm tra độ đặc hiệu độ lặp lại 2- Chín mẫu sâm bố mơ tả đặc điểm hình thái, xác định hàm lượng chất nhầy mẫu sâm bố Lộc Ninh, phân tích RAPD Kết cho thấy thành cơng việc: - Phân tích tương quan di truyền mẫu sâm bố thu thập từ địa phương khác - Dựng sơ đồ hình thể mối quan hệ di truyền mẫu sâm bố khảo sát 3- Mười mẫu nghệ Curcuma longa ba mẫu nghệ khác (C aromatica Salisb, C xanthorrhiza Roxb, C zedoaria (Berg.) Roscoe) tiến hành mơ tả đặc điểm hình thái, định lượng curcumin (thành phần hóa học tác dụng nghệ), phân tích RAPD MARMS Các kết sau: - Phân tích RAPD: (1) Sàng lọc 18 mồi ngẫu nhiên dùng phân tích đa dạng di truyền nghệ (2) Mối tương quan di truyền mẫu nghệ cao (48% – 82%), khoảng cách di truyền thấp có tương quan khoảng cách địa lý với khoảng cách di truyền - Từ kết phân tích RAPD, sơ đồ mối quan hệ di truyền phân tích sinh lồi thiết lập - Có thể áp dụng MARMS với hai cặp mồi I - CT23F CT177; II - CT23F CT531 khuôn tinh chế sản phẩm PCR với mồi CT23F CT911R để phân biệt vài loài nghệ 4- Tám mẫu ngải (họ Gừng Zingiberaceae) thu hái từ miền Tây Nam Bộ tiến hành mơ tả đặc điểm hình thái, sử dụng để đánh giá khả phân biệt dược liệu nghệ ngải RAPD marker - Kết RAPD với mồi OPE7 phân biệt mẫu nghệ ngải - Mối tương quan di truyền nghệ ngải cao Mẫu ngải vàng chanh có tỉ lệ tương đồng 55% 59% với nghệ C longa thu hái từ Đồng Tháp Cần Thơ mẫu ngải vàng có tỉ lệ tương đồng 80% 70% Phần mở đầu SUMMARY OF RESEARCH CONTENT Project title: APPLICATION OF ANALYSING DNA TO DETERMINE ORIGIN OF PHARMACEUTICAL PRODUCTS AND MEDICINES FROM GINSENG, ABELMOSCHUS, AND CURCUMIN Introduction: The valuable pharmaceutical effects of ginseng (Panax spp), ginseng derived medicine, abelmoschus - Abelmoschus sagittifolius (Kurz) Merr., and Curcuma sp have long been known and used broadly in many countries in Asia Depending on species distributions and locations, these medicinal herbs have different ingredients and percentage of active compounds leading to their variances in pharmacological effects and utilities Due to the diversity of origin and species of these medicinal herbs on the market or in nature, scientists need to establish and implement molecular techniques to facilitate their identification more accurately New techniques based on the DNA allow to study, manage and use genetic diversity of plants and their wild relatives better They have an advantage of not being affected by growth phase and environmental conditions of plants and provide promising methods comparing to old techniques based on phenotype These new techniques include: sequencing, Major Histocompatibility Complex (MHC), minisatellite, Restriction Fragment Length Polymorphisms (RFLP) and some new techniques based on PCR, such as Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD), Amplified Fragment Length Polymorphisms (AFLP), or InterSimple Sequence Repeat polymorphisms (ISSR) provide sophisticated analysis of genetic structure of populations and other events in the process of biological evolution In this research, we apply RAPD and MARMS to analyse DNA from Panax, Abelmoschus, and Curcuma Deleted: Objective: Determine the source of medicinal products and drugs Method: Applying the methods of DNA analysis, such as RAPD and MARMS Results: 1- Five popular Panax samples (P ginseng, P quinquefolius, P notoginseng, P japonicus and P vietnamensis) were described morphological characteristics, analysed quantitatively saponin and were used as reference samples Results showed that project was successful in: - Find and establish a suitable process for extracting DNA from samples of Panax ginseng v Phần mở đầu - Apply MARMS effectively in identifying ginseng species Identification properly ginseng products and their labels on the market preventing fraud products The process of verification was test for specificity and reproducibility 2- Nine forms of Abelmoschus were described morphological characteristics, determined the mucus concentration of the dark Albelmoschus Loc Ninh, and analysed RAPD Results showed success in: - Analysis of the genetic correlation among Abelmoschus forms collected from different areas - Generate a tree dendogram shows the genetic relationship among surveyed Abelmoschus forms 3- Ten samples of Curcuma longa and other Curcuma samples (C aromatica Salisb, C xanthorrhiza Roxb, C zedoaria (Berg.) Roscoe) were described morphological characteristics, determined curcumin concentration (the main composition of Turmeric), and analysed by RAPD and MARMS From result of MARMS, a diagram of genetic relationship and phylogenetic analysis were generated In addition, the DNA analysis showed: - RAPD analysis: (1) Selected 18 random primers to analyse genetic diversity of Curcuma samples and (2) genetic correlation among Curcuma samples was quite high (48% - 82%) implying their short genetic distance There is a correlation between geographical distance and genetic distance - Can apply MARMS with two pairs of primers I - CT23F and CT177; II - CT23F and CT531 to the purified PCR product with primers CT23F and CT911R to differentiate several species of Curcuma - - Eight samples, which have local name “ngai” belong Zingiberaceae family, harvested from the Mekong Delta were carried out to describe morphological characteristics, and used to measure the ability to distinguish between Curcuma and “ngai” by RAPD marker - RAPD results with primer OPE7 can distinguish curcuma and ngai forms - Genetic correlations between Curcuma and “ngai” were quite high, from 55% to 80% vi Phần mở đầu Mục lục TÓM TẮT NỘI DUNG NGHIÊN CỨU .i Mục lục vii CÁC CHỮ VIẾT TẮT ix DANH MỤC BẢNG x DANH MỤC HÌNH xi Thông tin chung Chương I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 1.1.1 1.1.2 1.1.3 1.1.4 1.1.4.1 1.1.4.2 1.1.4.3 1.2 1.3 1.3.1 1.3.2 1.3.3 Tổng quan Kỹ thuật RAPD Kỹ thuật ARMS/MARMS PCR-RFLP cpDNA Sơ lược đối tượng nghiên cứu Sâm Sâm bố Nghệ Tình hình nghiên cứu nước Tình hình nghiên cứu nước Phân tích DNA nghiên cứu phân loại chi Panax Phân tích DNA nghiên cứu phân loại chi Dâm bụt (Abelmoschus, Hibiscus) 10 Phân tích DNA nghiên cứu phân loại chi Curcuma 10 Chương II NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 11 2.1 2.1.1 2.1.2 2.1.3 2.1.4 2.2 2.2.1 2.2.2 2.2.3 2.3 2.3.1 2.3.2 2.3.3 2.3.4 2.3.5 2.3.6 2.3.7 2.4 2.4.1 2.4.2 2.4.3 Nội dung 1: Thu thập mẫu dược liệu 11 Các mẫu sâm Panax 11 Các mẫu sâm bố 11 Các mẫu nghệ (Curcuma) 11 Các mẫu dược liệu khác 11 Nội dung 2: Khảo sát định lượng thành phần hóa học tác dụng 11 Curcumin nghệ 11 Saponin sâm 12 Chất nhầy Sâm bố 13 Nội dung 3: Chiết DNA gen mẫu 13 Nguyên tắc 13 Nguyên vật liệu 14 Quy trình chiết DNA 14 Quy trình chiết DNA 15 Quy trình chiết DNA 15 Đo mật độ quang kiểm tra DNA 19 Điện di 19 Nội dung 4: Phân tích RAPD để phân biệt loại sâm bố chính, nghệ số dược liệu khác 21 Nguyên tắc 21 Nguyên vật liệu 21 Tiến hành 23 vii Phần mở đầu 2.5 2.5.1 2.5.2 2.5.3 2.5.3.1 2.5.3.2 2.5.4 2.6 Nội dung 5: Phân tích MARMS mẫu sâm, nghệ khảo sát 23 Nguyên tắc 23 Nguyên vật liệu 23 Tiến hành 25 MARMS gen trnK họ Gừng 25 MARMS sâm Panax 27 Gradient PCR 27 Nội dung 6: Dựng sơ đồ mối quan hệ di truyền phân tích sinh lồi mẫu nghệ sâm bố 27 Chương III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28 3.1 3.1.1 3.1.2 3.1.3 3.1.4 3.2 3.2.1 3.2.2 3.2.3 3.3 3.3.1 3.3.2 3.3.3 3.3.4 3.4 3.4.1 3.4.2 3.4.3 3.5 3.5.1 3.5.1.1 3.5.1.2 3.5.1.3 3.5.1.4 3.5.2 3.6 3.6.1 3.6.2 3.6.3 3.6.4 Nội dung 1: Thu thập mẫu dược liệu 28 Các mẫu sâm Panax 28 Các mẫu sâm bố 31 Các mẫu nghệ (Curcuma) 34 Các mẫu dược liệu khác 35 Nội dung 2: Khảo sát định lượng thành phần hóa học tác dụng 36 Saponin sâm 36 Chất nhầy sâm bố 37 Curcumin nghệ 37 Nội dung 3: Chiết DNA gen mẫu 39 DNA từ sâm 41 DNA từ sâm bố 42 DNA từ nghệ 43 DNA từ số dược liệu họ Gừng khác 44 Nội dung 4: Phân tích RAPD để phân biệt loại sâm bố chính, nghệ số dược liệu khác 45 Kết RAPD phân tích đa hình lồi nghệ 45 Kết RAPD phân tích đa hình mẫu sâm bố 49 Kết RAPD phân tích đa hình số dược liệu họ Gừng khác 53 Nội dung 5: Phân tích MARMS mẫu nghệ, sâm khảo sát 54 MARMS sâm Panax 54 Áp dụng MARMS phân biệt năm loại sâm 55 Độ đặc hiệu phương pháp 57 Độ lặp lại phương pháp 58 Kiểm chứng loại sâm mẫu thị trường 59 Kết MARMS (ARMS) nghệ 62 Nội dung 6: Dựng sơ đồ mối quan hệ di truyền phân tích sinh lồi mẫu nghệ sâm bố 65 Mối quan hệ di truyền phân tích sinh lồi mẫu nghệ 65 Sự đa dạng di truyền loài nghệ 66 Sự đa dạng di truyền mẫu ngải (họ Gừng) 67 Mối quan hệ di truyền phân tích sinh lồi mẫu sâm bố 68 Chương IV KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 71 4.1 Kết luận 71 4.2 Đề nghị 73 Tài liệu tham khảo .74 viii Phần mở đầu CÁC CHỮ VIẾT TẮT VIẾT TẮT THUẬT NGỮ A Absorbent, hấp phụ C-I Chloroform-isoamylalcohol CTAB Cetyltrimethylamonium bromide DNA Desoxyribonucleic acid IAA Isoamyl alcohol M Marker, thang DNA chuẩn MARMS Multiplex Amplification Refractory Mutation System matK maturase K P-C-I Phenol-chloroform-isoamylacohol PCR Polymerase chain reaction, phản ứng chuỗi polymerase PG Panax ginseng PJ Panax japonicus PN Panax notoginseng PQ Panax quinquefolius PV Panax vietnamensis PVP Polyvinylpyrolidon RAPD Random Amplified Polymorphic DNA, đa hình DNA khuếch đại ngẫu nhiên RFLP Restriction fragment length polymorphisms, đa hình độ dài đoạn cắt giới hạn SBC Sâm bố TE Tris-EDTA Trn Translocated tRNA-Lys UV Ultra violet, tia tử ngoại ix Phần mở đầu DANH MỤC BẢNG SỐ TÊN BẢNG SỐ LIỆU TRANG Bảng 2.1 Thành phần gel polyacrylamide 10% 20 Bảng 2.2 Các mồi sử dụng kỹ thuật RAPD 21 Bảng 2.3 Chu trình luân nhiệt cho kỹ thuật RAPD 23 Bảng 2.4 Các loại mồi sử dụng MARMS sâm Panax .23 Bảng 2.5 Thành phần mồi cho loại sâm 24 Bảng 2.6 Các mồi sử dụng MARMS gen trnK họ Gừng chi Curcuma 24 Bảng 2.7 Thành phần phản ứng khuếch đại gen trnK 25 Bảng 2.8 Thành phần phản ứng MARMS nghệ 25 Bảng 2.9 Chu trình luân nhiệt cho phản ứng khuếch đại gen trnK 26 Bảng 2.10 Chu trình luân nhiệt phản ứng MARMS nghệ 26 Bảng 3.1 Nguồn gốc mẫu sản phẩm sâm Panax chuẩn 28 Bảng 3.2 Các mẫu sản phẩm sâm từ thị trường 29 Bảng 3.3 Các mẫu sâm bố .31 Bảng 3.4 Các mẫu nghệ khảo sát nơi thu hái 34 Bảng 3.5 Các mẫu ngải khảo sát .35 Bảng 3.6 Hàm lượng chất nhầy sâm bố .37 Bảng 3.7 Curcumin dược liệu nghệ 38 Bảng 3.8 Sự khác ba quy trình chiết DNA 39 Bảng 3.9 Kết đo mật độ quang mẫu DNA chiết từ sâm Panax 40 Bảng 3.10 Kết đo mật độ quang mẫu DNA chiết từ sâm bố .42 Bảng 3.11 Kết đo mật độ quang mẫu DNA chiết từ nghệ 43 Bảng 3.12 Kết RAPD mẫu nghệ gel agarose 45 Bảng 3.13 Kiểu mẫu băng nghệ vàng, nghệ đen nghệ xà cừ .46 Bảng 3.14 Kết RAPD loại SBC đợt gel agarose .49 Bảng 3.15 Kết RAPD loại SBC đợt gel polyacrylamide 50 Bảng 3.16 Kết RAPD loại SBC đợt gel agarose .52 Bảng 3.17 Sự khác biệt nucleotide đoạn gen trnK loại sâm .54 Bảng 3.18 Sự khác biệt nucleotide đoạn gen matK loại sâm 55 Bảng 3.19 Sự khác biệt nucleotide đoạn gen 18S rRNA .55 Bảng 3.20 Tổng hợp kiểm chứng mẫu Sâm thị trường 60 Bảng 3.21 Tỉ lệ tương đồng loài Curcuma 68 Bảng 3.22 Hệ số tương đồng di truyền mẫu Sâm Bố Chính 70 x Kết thảo luận Như vậy, vật chất di truyền, dòng nghệ miền Tây gần giống với dịng miền Đơng (70 – 72 %), dòng miền Bắc gần giống miền Trung (68 %) Có khác biệt rõ dịng miền Tây, Đơng với miền Bắc miền Trung (tỉ lệ tương đồng 64 %) Riêng mẫu thu hái Bình Dương lại gần giống với mẫu miền Bắc (Vĩnh Phúc), tỉ lệ tương đồng 73 % Điều trước mẫu người dân lấy từ miền Bắc, hay biến đổi vật liệu di truyền trình sinh trưởng, phát triển Hình 3.37 Sơ đồ thể hịện mối tương quan dòng C longa 3.6.2 Sự đa dạng di truyền lồi nghệ Chọn kết phân tích RAPD mẫu C longa so sánh với ba loài nghệ cịn lại, kết thật đáng ngạc nhiên (Hình 3.38) Nghệ ten đồng C aeruginosa nghệ rễ vàng C xanthorrhiza tương đồng 82%, hai loài tương đồng 70% với C longa Vĩnh Phúc (Bảng 3.21) Nghệ đen C zedoaria có mức độ khác biệt cao so với mẫu cịn lại 66 Kết thảo luận Hình 3.38 Sơ đồ thể hịện mối tương quan loài Curcuma nghiên cứu C.l.: Curcuma longa, C.: Curcuma Bảng 3.21 Tỉ lệ tương đồng loài Curcuma E1 E2 E3 E4 E5 E9 E10 E11 E6 E7 E1 1,00 E2 0,82 1,00 E3 0,66 0,61 1,00 E4 0,66 0,57 0,82 1,00 E5 0,66 0,66 0,68 0,68 1,00 E9 0,66 0,66 0,64 0,68 0,73 1,00 E10 0,80 0,61 0,68 0,59 0,64 0,59 1,00 E11 0,79 0,65 0,65 0,60 0,70 0,63 0,95 1,00 E6 0,80 0,70 0,73 0,77 0,77 0,64 0,73 0,74 1,00 E7 0,73 0,64 0,57 0,48 0,66 0,61 0,57 0,51 0,61 1,00 E8 0,80 0,70 0,73 0,73 0,77 0,68 0,64 0,65 0,82 0,61 E8 1,00 3.6.3 Sự đa dạng di truyền mẫu ngải (họ Gừng) Bên cạnh việc phân tích tính đa hình mẫu dược liệu thuộc chi Curcuma, chúng tơi phân tích mẫu ngải (N) thu hái từ miền Tây Nam Bộ để minh hoạ phong phú đa dạng di truyền họ Gừng Zingiberaceae Cây sinh loài loại ngải xây dựng (Hình 3.39) dựa kết phân tích RAPD 13 mồi giống phân tích nghệ Một số nhận xét rút sau: - So với nghệ C longa thu hái từ Đồng Tháp Cần Thơ (hai địa phương lân cận khu vực Đồng Bằng Sông Cửu Long), mẫu ngải vàng chanh có tỉ lệ tương đồng 55% 59%, mẫu ngải vàng có tỉ lệ tương đồng 80% 70%, khả phân biệt chúng dựa vào RAPD cao Thực tế theo kết RAPD với mồi OPE7 ta phân biệt loài dựa vào băng đa hình RAPD với mồi OPE7 mẫu ngải nghệ cho băng đa hình phân biệt - So sánh với kết khảo sát Syamkumar cộng [39] phân tích RAPD với mồi OPE7 30 mẫu nghệ 10 mẫu gừng (PL2) cho thấy mẫu gừng Himachal Maran cho băng giống với nghệ C aromatica (E6) 67 Kết thảo luận Hình 3.39 Sơ đồ mối tương quan nghệ ngải nghiên cứu C.l.: Curcuma longa, C.: Curcuma, N: ngải 3.6.4 Mối quan hệ di truyền phân tích sinh lồi mẫu sâm bố Dựa vào số liệu có, đa dạng di truyền mẫu SBC thu thập vùng khác xác định (Hình 3.40 Bảng 3.22) Sự tương đồng bảy mẫu khảo sát thay đổi từ 53% SBC Lộc Ninh, mẫu xẻ thùy Khoa Dược mẫu hoa đỏ Thanh Hóa, đến 73% hai mẫu SBC lấy Khoa Dược Xét theo mức độ tương đồng 58%, bảy mẫu SBC chia làm nhóm : - Nhóm I gồm Sâm báo hoa vàng, sâm báo hoa đỏ, SBC Phú Yên - Nhóm II gồm mẫu SBC Lộc Ninh mẫu trồng TP HCM (hai mẫu Khoa Dược mẫu Thảo cầm viên) Trong nhóm I, xét mức độ tương đồng 60%, nhóm I chia làm hai nhóm: - Nhóm I.1 gồm mẫu Sâm báo hoa vàng Thanh Hóa SBC Phú Yên hai mẫu có mức độ tương đồng 71% - Nhóm I.2 có mẫu Sâm báo hoa đỏ Thanh Hóa 68 Kết thảo luận Nhóm II chia làm hai nhóm với mức độ tương đồng hai nhóm khoảng 59% - Nhóm II.1 gồm hai nhóm nhỏ với mức độ tương đồng cao (64%): (1) nhóm II.1.1 có mẫu SBC Lộc Ninh, (2) nhóm II.1.2 hai mẫu trồng Khoa dược có độ tương đồng cao 73% - Nhóm II.2 mẫu SH TONG HOP HV I.1 SP I I.2 HD II.1.1 HV SN II.1 SK II.1.2 SD II II.2 0.58 SH 0.61 0.65 0.69 Coefficient 0.73 Hình 3.40 Mối quan hệ di truyền mẫu Sâm Bố Chính Bảng 3.22 Hệ số tương đồng di truyền mẫu Sâm Bố Chính HV HD SP SN SH HV 1,00 HD 0,60 1,00 HDa - 1,00 SP 0,71 0,61 1,00 - 0,44 1,00 0,57 0,53 0,56 1,00 - 0,44 0,6 1,00 0,58 0,58 0,57 0,53 1,00 - 0,56 0,67 0,57 1,00 0,60 0,53 0,60 0,66 0,59 a SP SN SN a SH SH SK a SK SD SG 1,00 69 Kết thảo luận SKa - 0,47 0,63 0,68 0,57 1,00 SD 0,64 0,54 0,61 0,62 0,62 0,73 1,00 0,47 0,68 0,63 0,64 0,75 1,00 - - - - - - - - - 0,54 0,63 0,68 0,62 0,8 0,75 1,00 SD a SG SG a a : Những mẫu phân tích lần 3, -: khơng làm Trong lần phân tích lặp lại, kết tỉ lệ tương đồng tương đối giống lần trước, ngoại trừ HD với mẫu kia, SP với SH (Bảng 3.20) Sự khác biệt kết có lẽ kỹ thuật bảo quản mẫu tiến hành phân tích cần khảo sát để đảm bảo độ lặp lại Nhận xét: Như vậy, nhóm Sâm Bố Chính trồng khu vực miền Trung gồm mẫu Sâm Bố Chính Thanh Hóa Phú n có kiểu gen gần nhóm thứ hai gồm mẫu thu thập khu vực miền Nam cụ thể mẫu Sâm Bố Chính Lộc Ninh, hai mẫu thu thập khoa Dược mẫu Thảo cầm viên TP HCM có kiểu gen gần Điều đặc biệt Sâm báo hoa vàng lại có kiểu gen gần với Sâm Bố Chính Phú n mà khơng phải sâm báo hoa đỏ Sâm Bố Chính Phú Yên có màu hoa đỏ Kết luận nội dung Sơ đồ mối quan hệ di truyền phân tích sinh lồi loại SBC, nghệ số làm thuốc họ Gừng xây dựng 3.7 Nội dung 7: Phân tích PCR-RFLP vùng trnL-F trnS-Q chloroplast số đối tượng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu dự định mẫu Ngải mà theo ý kiến Hội đồng giám định kỳ đề nghị không sâu vào đối tượng chúng tơi khơng thực 70 Kết luận đề nghị Chương IV KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
  4.1 Kết luận Về vấn đề thu thập mẫu Chúng thu mẫu sâm Panax chuẩn, 29 mẫu sâm Panax thị trường Thu thập 13 mẫu nghệ có mẫu Curcuma longa đại diện cho miền Bắc Trung Nam; mẫu ngải thuộc vùng An Giang để khảo sát Thu thập mẫu Sâm bố từ Thanh hóa trở vào Có thể nói số lượng mẫu đối tượng phổ quát cho vùng miền, tạo điều kiện thuận lợi cho phân tích nguồn gốc dược liệu theo vùng phân bố (nghệ, sâm bố chính) nguồn gốc dược liệu theo tên khoa học loài (sâm) Về vấn đề xác định thành phần hóa học tác dụng đối tượng nghiên cứu Chúng tơi tiến hành xác định định tính saponin sâm; định lượng hàm lượng chất nhầy sâm bố hàm lượng curcumin nghệ, làm sở hóa học cho phân tích xác định nguồn gốc dược liệu phần sau Về vấn đề li trích DNA Các mẫu dược liệu thực vật đa phần mẫu củ, chứa nhiều polysaccharide, polyphenol hợp chất màu, gây khó khăn cho q trình li trích thu nhận DNA tinh khiết Chúng thành cơng việc tìm qui trình li trích thích hợp để thu nhận DNA cho tất mẫu dược liệu Về vấn đề phân tích DNA Đề tài sử dụng hai phương pháp phân tích DNA để xác định nguồn gốc dược liệu RAPD MARM đối tượng Sâm Panax, Chi Curcuma Sâm bố Abelmoschus Cụ thể là: Trên Sâm Panax: - Áp dụng phương pháp MARMS vùng gene trnK để xác định nguồn gốc mẫu sâm chính, làm sở cho việc xác định 29 mẫu sâm thị trường Kết cho thấy việc lựa chọn vùng gen trnK để phân tích phù hợp với tính chất mẫu dược liệu sâm (đã qua chế biến) Quy trình kiểm định kiểm tra độ đặc hiệu độ lặp lại - Có thể sử dụng phương pháp để xác định nguồn gốc dược liệu với mẫu sâm khô, nghiền thành bột chế biến thành phẩm Trên Chi Curcuma Ngải - Áp dụng phương pháp RAPD MARMS để xác định nguồn gốc dược liệu Phân tích RAPD, chúng tơi sàng lọc 18 mồi ngẫu nhiên dùng phân tích đa dạng di truyền nghệ ước lượng mối tương quan di truyền mẫu nghệ có tương quan khoảng cách địa lý với khoảng cách di truyền 71 Kết luận đề nghị - Bên cạnh đó, chúng tơi tiến hành phân tích mội quan hệ di truyền mẫu Ngải Nghệ Kết cho thấy mối liên hệ chúng cao - Phân tích MARMS chọn cặp mồi vùng gen trnK để phân biệt vài lồi nghệ Có thể áp dụng MARMS với hai cặp mồi I - CT23F CT177; II - CT23F CT531 khuôn tinh chế sản phẩm PCR với mồi CT23F CT911R Trên Sâm bố - Chúng tơi áp dụng phương pháp RAPD để đánh giá mức độ đa hình mẫu sâm bố trải dài từ Thanh Hóa trở vào tỉnh miền Nam Việt Nam Kết cho thấy có khác biệt lớn kiểu gen mẫu vùng địa lí khác Tỉ lệ tương đồng mẫu trải vùng rộng từ khoảng 50% đế 80% Tóm lại, kết nghiên cứu đề tài góp phần khẳng định phân tích DNA phương pháp đáng tin cậy dùng để xác định nguồn gốc dược liệu DNA vật liệu di truyền thống cho cá thể, không phụ thuộc vào dạng mẫu, không chịu ảnh hưởng tuổi mẫu, điều kiện sinh lí, yếu tố mơi trường, thu hái, bảo quản, chế biến DNA thu nhận từ lá, thân hay rễ mang thông tin di truyền DNA sau li trích trữ -20°C thời gian dài (từ 3-5 năm), thời gian phân tích khơng bị hạn chế Một lượng nhỏ mẫu đủ để thực phân tích, liện lợi tiến hành phân tích mẫu dược liệu đắt tiền Các phương pháp phân tích DNA mà chúng tơi áp dụng nghiên cứu khơng địi hỏi trang thiết bị phức tạp, cần máy vi li tâm, máy PCR, chạy điện di gel agarose gel polyacrylamide máy đọc gel (có thể dùng hộp đèn UV) Tuy nhiên cịn có số tồn cần phải giải áp dụng phương pháp phân tích DNA Thứ nhất, nguyên liệu thường xử lí nhiệt cách sấy, phơi nắng, nghiền, tẩm hóa chất… trữ lâu dài điều kiện bảo quản khác DNA thường bị gãy Chúng tơi sử dụng phương pháp phân tích vùng gen bị gãy gen ribosome (18S rRNA) lục lạp (trnK)) để làm tăng khả thu đoạn gen dài nguyên vẹn Thứ hai, yếu tố diện làm ức chế phản ứng PCR Các loài thực vật dược liệu thường chứa nhiều hợp chất phenol, acidic polysaccharide chất màu, cần lựa chọn phương pháp li trích DNA thích hợp để hạn chế chất ức chế Chúng tơi sử dụng PVP 2-mercaptoethanol qui trình li trích Thứ ba, nhiễm DNA ngoại lai từ vi khuẩn, nấm trùng q trình bảo quản bị trộn lẫn với dược liệu khác ảnh hưởng đến kết phân tích Chúng sử dụng ARMS (Amplification refractory mutation system) để đảm bảo độ đặc hiệu Như vậy, việc áp dụng phương pháp phù hợp vùng gen thích hợp giải vấn đề tồn 72 Kết luận đề nghị 4.2 Đề nghị - Đối với mẫu nghệ Curcuma longa, đề nghị cần tiến hành khảo sát RAPD số lượng mồi lớn - Các mẫu dược liệu lồi mà chúng tơi thu thập phổ quát số lượng mẫu vùng (một mẫu/vùng) khó đánh giá mức độ dao động kiểu gen tương ứng với vùng; làm sở đánh giá mức độ biến đổi tiến hóa kiểu gen vùng khác nhau, nhận xét liên quan kiểu gen thành phần tác dụng - Xác định nguồn gốc dược liệu vấn đề cần thiết để quản lí dược liệu tương lai Để phát triển xa hơn, cần phải thành lập thư viện tham khảo dược liệu chứa thông tin di truyền, đặc biệt cho lồi có nguy tuyệt chủng lồi có giá trị kinh tế cao và/hoặc với chất làm giả có khả gây độc 73 Tài liệu tham khảo Tài liệu tham khảo Dược điển Việt Nam III, NXB Y Học, 2002 Thái Kỳ Tài (2004), Phân tích mức độ đa dạng di truyền xây dựng phương pháp nhận diện số giống cà chua kỹ thuật RAPD, Trường Đại học Nông Lâm, TP HCM Panax Ahuja, M.R 2001 Recent advances in molecular genetics of forest trees Euphytica 121: 173–195 Cui X.M et al., Authentication of Panax notoginseng by 5S-rRNA spacer domain and random amplified polymorphic DNA (RAPD) analysis Planta Med 2003 Jun;69(6):584-6 Doyle, J.J., Doyle, J.L., 1987 A rapid DNA isolation procedure from small quantities of fresh leaf tissues Phyotochem Bull 19, 11-15 Fushimi H et al, Application of PCR-RFLP and MASA analyses on 18S ribosomal RNA gene sequence for the identification of three Ginseng drugs Biol Pharm Bull 1997 Jul;20(7):765-9 Ha WY et al., Authentication of Panax ginseng and Panax quinquefolius using amplified fragment length polymorphism (AFLP) and directed amplification of minisatellite region DNA (DAMD) J Agric Food Chem 2002 Mar 27;50(7):1871-5 Ha WY et al., Direct amplification of length polymorphism analysis differentiates Panax ginseng from P quinquefolius Planta Med 2001 Aug;67(6):587-9 Hong Jin KIM, Identification of Panax Species in the Herbal Medicine Preparations Using Gradient PCR Method, Biol Pharm Bull 28(4) 671—676 (2005) 10 Jae-Young UM et al., Phylogeny and Biogeography of Panax L (the Ginseng Genus, Araliaceae): Inferences from ITS Sequences of Nuclear Ribosomal DNA, Mol Phylogenet Evol., Vol 6, No 2, October, pp 167–177, 1996 11 Komatsu K et al., Phylogenetic analysis based on 18S rRNA gene and matK gene sequences of Panax vietnamensis and five related species Planta Med 2001 Jul;67(5):461-5 12 Li J.T., J Yang, D.C Chen, X.L Zhang Z.S Tang (2007), "An optimized minipreparation method to obtain high-quality genomic DNA from mature leaves of sunflower", Genet Mol Res 6(4), 1064-1071 13 Lim W et al., Utilization of RAPD markers to assess genetic diversity of wild populations of North American ginseng (Panax quinquefolium) Planta Med 2007 Jan;73(1):71-6 14 Matthew S Holt (1990), "Using the Beckman DU-6 Spectrophotometer" 15 Shaw PC, But PP.Authentication of Panax species and their adulterants by randomprimed polymerase chain reaction Planta Med 1995 Oct;61(5):466-9 16 Shim YH, et al., Molecular differentiation of Panax species by RAPD analysis Arch Pharm Res 2003 Aug;26(8):601-5 74 Tài liệu tham khảo 17 Shim YH, et al., Species identification from Ginseng drugs by multiplex amplification refractory mutation system (MARMS).Planta Med 2004 Feb;70(2):189-92 18 Tanaka H, Fukuda N, Shoyama Y Identification and differentiation of Panax species using ELISA, RAPD and eastern blotting Phytochem Anal 2006 Jan-Feb;17(1):46-55 19 Tochika-Komatsu Y, Asaka I, Ii I A random amplified polymorphic DNA (RAPD) primer to assist the identification of a selected strain, aizu K-111 of Panax ginseng and the sequence amplified Biol Pharm Bull 2001 Oct;24(10):1210-3 20 Um JY, et al., Molecular authentication of Panax ginseng species by RAPD analysis and PCR-RFLP Biol Pharm Bull 2001 Aug;24(8):872-5 21 Wang J et al., Application of sequence characterized amplified region (SCAR) analysis to authenticate Panax species and their adulterants Planta Med 2001 Nov;67(8):781-3 22 Woo-Jun Hwang et al., Molecular Authentication of Panax ginseng Species by RAPD Analysis and PCR-RFLP, Biol Pharm Bull 24(8) 872—875 (2001) 23 Zhu S, Fushimi H, Cai SQ, KomatsuK, (2004), Species identification from Ginseng drugs by multiplex amplification refractory Mutation System, Planta Med, 70 (2): 189-192 24 Zhu S, Fushimi H, Cai SQ, KomatsuK, (2003), Phylogenetic relationship in genus Panax: inferred from chloroplast trnK gene and nuclear 18S rRNA gene sequences Planta Med, 69, 647-653 SBC 25 Jenderek MM et al., Development of Randomly Amplified Polymorphic DNA Marker Chracteristic of Hibiscus rosa-sinensis and H syriacus California agricultural technology institute – Cati (1997) 26 Pfeil B E., Brubaker C L., Craven L A., and Crisp M D Phylogeny of Hibiscus and the Tribe Hibisceae (Malvaceae) Using Chloroplast DNA Sequences of ndhF and the rpl16 Intron Systematic Botany (2002), 27(2): pp 333–350 Nghệ 27 Aparajrut et al.,1999 Molecular Markers in the identification of some early floxering Curcuma (Zingiberaceae) species Ann Bot 84: 29-534 28 B Phunchaisri, Chiara Alisi, Somboon Anuntalabhochai and Pimchai Apavatjrut (1998), Randomly amplified polymorphic DNA (RAPD) in curcuma species 29 Chen et al., 1999 Random amplified polymorphic DNA analysis on C wenuujin and C sichuaensis Zhongguo Zhong Yao Za Zhi 24: 131-133 30 Cao, H., Sasaki, Y., Fushimi, H., Komatsu, K (2001), “Molecular Analysis of Medicinally-Used Chinese and Japanese Curcuma base on 18S rRNA Gene and trnK Gene Sequences”, Biol Pharm Bull., 24(12), 1389-1394 31 Islam A (2004) Genetic diversity of the genus Curcuma in Bangladesh and further biotechnological approaches for in vitro regeneration and long term conservation of C Longa germplasm Thesis for the degree of Doctor of Natural Sciences at University of Hannover 75 Tài liệu tham khảo 32 Joshi K, Chavan P, Warude D and Patwardhan B Molecular markers in herbal drug technology Current Science, Vol 87, No 2, 25 July 2004 33 Palai, S.K., Rout G.R (2007), “Identification and genetic variation among eight varieties of ginger by using random amplified polymorphic DNA markers”, Plant Biotechnology, 24, 417-420 34 Phunchaisri B., et al., Randomly amplified polymorphic DNA (RAPD) in curcuma species (1998) 35 Ongkarn, V., Sirirugsa, P and Suvachittanont W (2004), "Confirmation of relationships among Boesenbergia (Zingiberaceae) and related genera by RAPD", Biochemical Systematics and Ecology, 33, 159-170 36 Scott, T et al., Genetic analysis with random amplified polymorphic DNA markers Plant Physiol (1993) 101: 349-352 37 Sasaki Y, Hirotoshi Fusuhimi et al (2002) Sequence analysis of Chinese and Japanese curcuma drugs on the 18S rRNA gene and the aplication refractory mutation system analysis for their authentication Biol.Pharm.Bull 25(12)1593-1599 38 Stanford, S.A.M., Harden, R and Parks, C.R (2000), “Phylogeny and biogeography of Juglans (Juglandaceae) base on matK and ITS sequence data”, American Journal of Botany, 87(6), 872-882 39 Syamkumar S., Bosco Lowarence and B Sasikumar Isolation and Amplification of DNA From Rhizomes of Turmeric and Ginger Plant Molecular Biology Reporter 21: 171a-171e, June 2003 40 Taberlet, P., Gielly, L., Pautou, G and Bouvet, J., 1991, Universal primers for amplification of three non-coding regions of chloroplast DNA, Plant Molecular Biology 17: 1105-1109 41 Williams J G K et al., DNA polymorphisms amplified by arbitrary primer are useful as genetic markers Nucleic acids research, Vol 18 (22), 6531-3535 (1990) 42 Yan-Bo Zhang et al., Molecular Authentication of Chinese Herbal Materials, Journal of Food and Drug Analysis, Vol 15, No 1, 2007, 1-9 43 Yeh, F.C., Yang, R-C., Boyle, Timothy, B.J., Ye, Z-H., and Mao, Judy X 1997 POPGENE, the user-friendly shareware for population genetic analysis Molecular Biology and Biotechnology Centre, University of Alberta, Canada 44 Yip, P.Y., Chau, C.F., Mak, C.Y and Kwan, H.S (2007) Review DNA methods for identification of Chinese medicinal materials Chinese Medicine, 2:9, 1-19 76 Phụ lục BÁO CÁO TÓM TẮT VÀ KIẾN NGHỊ Tên đề tài ÁP DỤNG PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH DNA ĐỂ XÁC ĐỊNH NGUỒN GỐC CỦA CÁC DƯỢC LIỆU VÀ SẢN PHẨM THUỐC TỪ SÂM, SÂM BỐ CHÍNH VÀ NGHỆ Mục tiêu: Xác định nguồn gốc dược liệu sản phẩm thuốc từ sâm Panax, nghệ sâm bố dược liệu làm thuốc quý phong phú chủng loại Kết quả: - Thu mẫu sâm Panax chuẩn, 29 mẫu sâm Panax thị trường; 13 mẫu nghệ có mẫu Curcuma longa đại diện cho miền Bắc, Trung Nam, mẫu ngải họ Gừng thuộc vùng An Giang; mẫu Sâm bố từ Thanh Hóa trở vào - Định tính saponin điển hình sâm Panax chuẩn; định lượng hàm lượng chất nhầy sâm bố hàm lượng curcumin nghệ, làm sở hóa học cho phân tích xác định nguồn gốc dược liệu phần sau - Tìm qui trình li trích thích hợp để thu nhận DNA cho tất mẫu dược liệu Nghiền dược liệu với nitơ lỏng thành bột mịn Lấy khoảng 100 mg mẫu vào tuýp ml, thêm vào 0,6 ml dung dịch đệm chiết (0,35 M glucose; 0,1 M Tris-HCl; 5mM EDTA; 2% PVP-40 (polyvinyl pyrrolidone 40); 1% 2-mercaptoethanol), lắc liên tục đá khoảng phút, ly tâm 10.000 vòng/phút nhiệt độ phòng 10 phút, lấy tủa Tủa ủ tiếp với 0,6 ml dung dịch nuclei lysis buffer (1,4 M NaCl; 0,1 M Tris-HCl pH 8,0; 20 mM EDTA; 2% PVP-40; 1% 2-mercaptoethanol) ủ 65 °C /10 phút trước µl RNase 65 °C Thêm đồng lượng chloroform-isoamylalcohol (24:1), lắc mạnh phút, để yên nhiệt độ phòng phút, ly tâm 10.000 vòng/phút 10 phút nhiệt độ phòng, lấy dịch Thêm 0,6 thể tích isopropanol, ủ -20 oC giờ, ly tâm 10.000 vòng/10 phút/RT, lấy tủa Rửa tủa cồn 70%, để khơ cồn Hịa tan cắn 450 µl TE0,1, thêm 450 µl phenol-chloroform-isoamylalcohol (25:24:1), sau ly tâm 10.000 vòng/phút nhiệt độ phòng 10 phút Thêm lần thể tích cồn tuyệt đối, đảo nhẹ, ủ -20 oC giờ, ly tâm 10.000 vòng/phút nhiệt độ phòng 30 phút Rửa cắn cồn 70%, để khơ cồn Hịa tan cắn đệm TE0,1, bảo quản -20 oC đến dùng Sản phẩm chiết DNA kiểm tra đo quang ba bước sóng 230 nm, 260 nm, 280 nm điện di gel agarose 0,8% - Phân tích DNA Sâm Panax Áp dụng phương pháp MARMS vùng gene trnK để xác định nguồn gốc mẫu sâm chính, làm sở cho việc xác định 29 mẫu sâm thị trường Kết cho thấy việc lựa chọn vùng gen trnK để phân tích phù hợp với tính chất mẫu dược liệu sâm (dược liệu qua chế biến) Quy trình kiểm định kiểm tra độ đặc hiệu độ lặp lại.Có thể sử dụng phương 77 Phụ lục pháp để xác định nguồn gốc dược liệu với mẫu sâm khô, nghiền thành bột chế biến thành phẩm - Phân tích DNA chi Curcuma Ngải Áp dụng RAPD, chúng tơi sàng lọc 18 mồi ngẫu nhiên dùng phân tích đa dạng di truyền nghệ ước lượng mối tương quan di truyền mẫu nghệ có tương quan khoảng cách địa lý với khoảng cách di truyền mối quan hệ di truyền mẫu Ngải Nghệ cao Áp dụng MARMS chọn cặp mồi vùng gen trnK để phân biệt vài lồi nghệ Có thể áp dụng MARMS với hai cặp mồi I - CT23F CT177; II - CT23F CT531 khuôn tinh chế sản phẩm PCR với mồi CT23F CT911R - Phân tích DNA mẫu Sâm bố trải dài từ Thanh Hóa trở vào tỉnh miền Nam Việt Nam cho thấy có khác biệt lớn kiểu gen mẫu vùng địa lí khác Tỉ lệ tương đồng mẫu trải vùng rộng từ khoảng 50% đế 80% Xác định số RAPD-marker để nhận diện mẫu Sâm bố vùng khác Kiến nghị - Xác định nguồn gốc dược liệu vấn đề cần thiết để quản lí dược liệu thuốc làm dược liệu tương lai Để phát triển xa việc phân tích DNA phục vụ kiểm định dược liệu, cần phải thành lập thư viện tham khảo chứa thông tin di truyền dược liệu, đặc biệt cho lồi có nguy tuyệt chủng lồi có giá trị kinh tế cao và/hoặc với chất làm giả có khả gây độc - Cần tiến hành khảo sát RAPD số lượng mồi lớn mẫu nghệ Curcuma longa, để chọn lọc mồi cho điện di đồ phân biệt chúng rõ ràng xác - Cần thu thập mẫu dược liệu Các mẫu dược liệu lồi mà chúng tơi khảo sát phổ qt số lượng mẫu vùng (một mẫu/vùng) khó đánh giá mức độ dao động kiểu gen tương ứng với vùng, làm sở đánh giá mức độ biến đổi tiến hóa kiểu gen vùng khác nhau, nhận xét liên quan kiểu gen thành phần tác dụng 78 Phụ lục TĨM TẮT ÁP DỤNG PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH DNA ĐỂ XÁC ĐỊNH NGUỒN GỐC CỦA CÁC DƯỢC LIỆU VÀ SẢN PHẨM THUỐC TỪ SÂM, SÂM BỐ CHÍNH VÀ NGHỆ Mở đầu: Phân tích DNA phương pháp đáng tin cậy để xác định nguồn gốc dược liệu Mục tiêu: Nhận định nguồn gốc dược liệu sản phẩm thuốc từ sâm Panax, nghệ Curcuma sâm bố dược liệu làm thuốc quý phong phú chủng loại Phương pháp: quy trình chiết DNA tồn phần; kỹ thuật RAPD MARMS gen matK gen diệp lục trnK đoạn gen 18S rRNA; điện di gel agarose polyacrylamide để phân tích sản phẩm Lập ma trận nhị phân từ kết RAPD, dựng sơ đồ hình dựa số SM xếp nhóm mẫu theo phương pháp UPGMA (phần mềm NTSYS-pc 2.1) Kết quả: Chọn quy trình chiết DNA toàn phần cho tất mẫu dược liệu (và sản phẩm) sử dụng PVP 2-mercaptoethanol Chứng minh phương pháp MARMS vùng gene trnK phù hợp để kiểm định mẫu sâm Panax Sàng lọc 18 mồi ngẫu nhiên để thực RAPD chi Curcuma Ngải họ Gừng, kết luận có tương quan khoảng cách địa lý với khoảng cách di truyền Mối quan hệ di truyền mẫu Ngải Nghệ cao MARMS vùng gene trnK 18S rRNA phù hợp để kiểm định nghệ đến mức lồi RAPD mẫu Sâm bố trải dài từ Thanh Hóa trở vào tỉnh miền Nam Việt Nam cho thấy có khác biệt lớn kiểu gen mẫu vùng địa lí khác Kết luận: Phương pháp PCR đa thành phần MARMS thực hiệu việc xác định lồi sâm, tính khả thi lợi ích kinh tế phương pháp rõ ràng MARMS phối hợp với RAPD áp dụng để kiểm định mẫu nghệ Curcuma sâm bố Abstract DNA METHOD TO DETERMINE ORIGIN OF GINSENG, ABELMOSCHUS, AND CURCUMA IN THE HERBAL MEDICINAL MATERIALS AND DRUGS Background: DNA analysis is a reliable method for authentication of crude medicinal materials and drugs from plants Objective: Determine origin of materials from Panax, Abelmoschus and Curcuma Verify ginseng species in commercial products labeled American ginseng, Korean ginseng, and Chinese ginseng on Ho Chi Minh city market Method: protocol for DNA isolation; RAPD and MARMS of matK gene of chloroplast trnK gene and 18S rRNA gene regions, then gel electrophoresis for DNA analysis; dendrogram obtained by UPGMA based on SM coefficient, using SAHN clustering indicated genetic distance among different geographical populations Result: Choose a suitable protocol using PVP and 2-mercaptoethanol for DNA extraction Demonstrate MARMS assay is a reliable authentication of Panax species of commercial products of Ginseng drugs RAPD with selected 18 random primers on Curcuma and “ngai” belong Zingiberaceae family samples, conclude there is a correlation between geographical distance and genetic distance, as well as genetic correlation among Curcuma samples is quite high RAPD to assess Abelmoschus varieties from Vietnam shows the genetic relationship among natural Abelmoschus sagittifolius ((Kurz) Merr.) in Viet Nam may undergo geographic distance and some RAPD markers could use for assigning genotypes Abbreviation: RAPD: random amplified polymorphic DNA, MARMS: multiplex amplification refractory mutation system, UPGMA: unweighted pair group method 79 Phụ lục Phân tích dự báo khả áp dụng Kết nghiên cứu đề tài góp phần khẳng định phân tích DNA phương pháp đáng tin cậy dùng để xác định nguồn gốc dược liệu DNA vật liệu di truyền thống cho cá thể, không phụ thuộc vào dạng mẫu, không chịu ảnh hưởng tuổi mẫu, điều kiện sinh lí, yếu tố mơi trường, thu hái, bảo quản, chế biến DNA thu nhận từ lá, thân hay rễ mang thông tin di truyền DNA sau li trích trữ -20°C thời gian dài (từ 3-5 năm), thời gian phân tích khơng bị hạn chế Một lượng nhỏ mẫu đủ để thực phân tích, liện lợi tiến hành phân tích mẫu dược liệu đắt tiền Các phương pháp phân tích DNA mà chúng tơi áp dụng nghiên cứu khơng địi hỏi trang thiết bị phức tạp, cần máy vi li tâm, máy PCR, chạy điện di gel agarose gel polyacrylamide máy đọc gel (có thể dùng hộp đèn UV) Tuy nhiên cịn có số tồn cần phải giải áp dụng phương pháp phân tích DNA Thứ nhất, ngun liệu thường xử lí nhiệt cách sấy, phơi nắng, nghiền, tẩm hóa chất… trữ lâu dài điều kiện bảo quản khác DNA thường bị gãy Chúng tơi sử dụng phương pháp phân tích vùng gen bị gãy gen ribosome (18S rRNA) lục lạp (trnK)) để làm tăng khả thu đoạn gen dài nguyên vẹn Thứ hai, yếu tố diện làm ức chế phản ứng PCR Các loài thực vật dược liệu thường chứa nhiều hợp chất phenol, acidic polysaccharide chất màu, cần lựa chọn phương pháp li trích DNA thích hợp để hạn chế chất ức chế Chúng sử dụng PVP 2-mercaptoethanol qui trình li trích Thứ ba, nhiễm DNA ngoại lai từ vi khuẩn, nấm côn trùng trình bảo quản bị trộn lẫn với dược liệu khác ảnh hưởng đến kết phân tích Chúng sử dụng ARMS (Amplification refractory mutation system) để đảm bảo độ đặc hiệu Như vậy, việc áp dụng phương pháp phù hợp vùng gen thích hợp giải vấn đề tồn Để phát triển xa việc phân tích DNA phục vụ kiểm định dược liệu, cần phải thành lập thư viện tham khảo chứa thông tin di truyền dược liệu, đặc biệt cho loài có nguy tuyệt chủng lồi có giá trị kinh tế cao và/hoặc với chất làm giả có khả gây độc 80