Hoàn thiện quy trình công nghệ sản xuát thuốc mỡ chữa bỏng glodese sh91 từ nguồn dược liệu trong nước

Công ty Cổ Phần Dợc TW Medipharco-Tenamyd Báo cáo tổng kết đề tài: Hoàn thiện quy trình công nghệ sản xt thc mì ch÷a báng Glodese - SH91 tõ ngn dợc liệu nớc Cnđt: Phan Thị Minh Tâm 8448 Hµ néi – 2011 MỞ ĐẦU Hiện nay, Bỏng tai nạn thường gặp đời sống sinh hoạt, lao động sản xuất vui chơi giải trí Tai nạn bỏng đứng hàng thứ hai sau tai nạn giao thông [1], [12], [27] Hàng năm nước ta ước tính có hàng trăm ngàn người bị bỏng, hàng chục ngàn người phải vào điều trị sở Y tế, đặc biệt trẻ em từ 1-6 tuổi bị bỏng chiếm tỷ lệ cao đến 60% Bỏng để lại hậu nặng nề tính mạng, sức khỏe, chức năng, thẩm mỹ cho nạn nhân, để lại gánh nặng tinh thần, kinh tế cho gia đình cho xã hội Cơng tác điều trị chỗ vết bỏng có vị trí quan trọng để loại bỏ mơ hoại tử, làm vết thương, giảm biến chứng nhiễm khuẩn, tạo điều kiện tốt cho tái tạo biểu mô bỏng vết thương bỏng nông, tạo mô hạt chuẩn bị cho việc ghép da bỏng sâu Các thuốc điều trị bỏng phần lớn có nguồn gốc hóa chất– Bao gồm: • Thuốc xịt Panthenol-Spray Đức, hoạt chất : Vitamin B5 (D-Panthenol) • Kem Silverin Mỹ Ấn Độ • Hebermin: Cuba • Sản phẩm tân dược sản xuất công ty Medipharco – Tenamyd số nhà sản xuất nước Xu hướng Thế giới mở rộng phát triển việc sử dụng chất có nguồn gốc tự nhiên - có thảo dược để phịng chữa bệnh Trong có điều trị bỏng Do việc nghiên cứu loại thuốc chữa bỏng có nguồn gốc thực vật từ dược liệu sẳn có nước, giá thành rẻ, có hiệu cao điều trị, thay thuốc nhập ngoại vấn đề khiến cho nhà sản xuất dược phẩm quan tâm tới CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 1.1 Xuất xứ dự án: Phát huy truyền thống y dược học cổ truyền, thập niên qua số đơn vị nước tiến hành nghiên cứu thuốc chữa bỏng từ nguồn dược liệu dựa kinh nghiệm chữa bỏng dân gian gia truyền đưa lại hiệu điều trị khả quan: Các thuốc chữa bỏng có nguồn gốc Chế phẩm sinh học có: • Chế phẩm EBS1, tách chiết, chế biến từ sinh vật biển nguồn phế liệu nhà máy chế biến hải sản xuất Các thuốc chữa bỏng có nguồn gốc Dược liệu nghiên cứu Việt Nam điển hình có: • Thuốc chữa bỏng B76 bệnh viện 103, cao đặc từ vỏ xoan trà • Dầu calino, kem balsino mỡ mecalin: Dầu mù u (ép từ nhân hạt) lại pha loãng với tinh dầu tràm • Thuốc mỡ madecassol chứa 1% cao rau má • Thuốc mỡ Eupolin Viện Bỏng Quốc gia, điều chế từ thảo dược cỏ lào • Dầu mù u Trong dược liệu nghiên cứu chữa bỏng có nhiều cơng trình ngồi nước nghiên cứu từ dược liệu Hoa giẻ Bịn bọt Một số cơng trình nước ngồi nghiên cứu tác dụng Hoa giẻ Bịn bọt [27], [28], [29] Đặc biệt có nhiều cơng trình nước nghiên cứu tác dụng chữa bỏng Hoa giẻ Bịn bọt cơng bố như: • Năm 1995, tác giả Nguyễn Thị Vân Khanh có nghiên cứu thực vật-hóa học số tác dụng sinh học hoa giẻ [17] • Năm 1996, tác giả Nguyễn Thị Vân Khanh CS nghiên cứu tác dụng co mạch ngoại vi cao hoa giẻ động vật [18] • Năm 1998, tác giả Đinh Văn Hân nghiên cứu đánh giá tác dụng điều trị chỗ cao hoa giẻ vết thương bỏng nơng vùng lấy da.[10] • Một cơng trình nghiên cứu thuốc chữa bỏng từ dược liệu hoa giẻ có Đề tài nghiên cứu sinh thuốc chữa bỏng Glodese - SH 91 (Từ Hoa Giẻ Bòn Bọt) tiến sỹ Nhâm Văn Sinh [14] thực Viện Bỏng Quốc Gia 1991 – 2000 đánh giá thử nghiệm lâm sàng hiệu quả: Glodese - SH91 điều trị chỗ vết thương bỏng có tác dụng kháng khuẩn, giảm viêm nề tiết dịch, kích thích tổng hợp Collagen, kích thích tái tạo mơ biểu mơ hố nhanh [10],[14], [17], [18], [22] • Từ kết nghiên cứu trên, với mong muốn tiếp tục kế thừa phát huy nghĩa, tác dụng hiệu đề tài vào thực tiễn, công ty cổ phần Dược TW Medipharco – Tenamyd tiếp cận tiếp tục hợp tác nghiên cứu tìm cơng thức tối ưu để đưa vào sản xuất phục vụ công tác cứu chữa bệnh nhân bỏng với sản phẩm thuốc mỡ Glodese - SH91 Bộ y tế cấp số đăng ký lưu hành SĐK: 1114 – H12- 05 với thời hạn năm để theo dõi độ ổn định, thử lâm sàng giai đoạn để đánh giá tính an tồn thuốc Sản phẩm Học viện quân y Viện bỏng quốc gia thử lâm sàng giai đoạn IV (năm 2006) với đề tài “Đánh giá tác dụng điều trị chỗ vết thương bỏng nông thuốc mỡ Glodese - SH91 bào chế từ Bòn Bọt hoa Giẻ ” Hội đồng khoa học công nghệ Viện Bỏng quốc gia đánh giá nghiệm thu theo định số 398/QĐ-VB ngày 06/10/2006 biên nghiệm thu ngày • Đề tài có ý nghĩa thực tiễn hiệu kinh tế xã hội Tuy nhiên kinh phí hạn hẹp nên chưa có điều kiện triển khai sản xuất thử nghiệm dây chuyền công nghệ đạt tiêu chuẩn GMP – WHO theo dõi độ ổn định chất lượng thuốc Để khai thác có hiệu dây chuyền sản xuất thuốc đầu tư theo chuẩn mực GMP WHO đáp ứng yêu cầu khám chữa bệnh, Công ty Medipharco-Tenamyd đề xuất Bộ khoa học công nghệ tham gia nhiệm vụ khoa học công nghệ cấp nhà nước dự án sản xuất thử nghiệm “Hồn thiện quy trình cơng nghệ sản xuất thuốc mỡ chữa bỏng Glodese - SH91 từ nguồn dược liệu nước”, nhằm nâng cao chất lượng sản phẩm thay sản phẩm nhập ngoại tham gia dự trữ chương trình phịng chống thảm họa quốc gia từ dược liệu sẵn có nước Đồng thời mở khả giới thiệu, xuất vào thị trường khu vực giới 1.2 Mục tiêu dự án: a Hồn thiện quy trình công nghệ ổn định sản xuất thuốc mỡ Glodese SH91 quy mô 50 kg/mẻ dây chuyền công nghệ đạt tiêu chuẩn GMPWHO b Nâng cấp tiêu chuẩn chất lượng nguyên liệu, bán thành phẩm thành phẩm c Xác định độ ổn định tăng hạn dùng sản phẩm từ 01 năm lên năm d Sản xuất 150.000 tube 20g Glodese - SH91 & 30.000 hộp 200g 1.3 Tính khả thi dự án: Cơng ty cổ phần Dược TW Medipharco – Tenamyd đơn vị hàng đầu sản xuất loại thuốc cho hệ điều trị Mắt, Da, đầu tư xưởng sản xuất theo chuẩn mực GMP WHO (1 xưởng sản xuất thuốc Kem – Mỡ - nước, xưởng sản thuốc Viên - Cốm - Bột không Betalactam, xưởng sản xuất thuốc Viên - Cốm - Bột chứa kháng sinh nhóm Cephalosporin), Phịng kiểm nghiệm đạt GLP, Kho GSP Đối với xưởng sản xuất Kem – Mỡ - Nước có 50 sản phẩm thuốc Mắt, Da có sản phẩm chữa bỏng (Panthenol, Sulfadiazin bạc, Glodese - SH91), nguyên liệu sản xuất phải nhập ngoại, riêng Glodese - SH91 có nguyên liệu cung cấp nước Vì việc lựa chọn cơng nghệ sản xuất cho thuốc mỡ chữa bỏng Glodese - SH91 khả thi phù hợp với mục tiêu, nội dung dự án Công ty cổ phần Dược Trung ương Medipharco - Tenamyd đơn vị tiến hành nghiên cứu thành công kỹ thuật bào chế chế phẩm “Thuốc mỡ chữa bỏng Glodese - SH 91” chứa cao lỏng dược liệu chiết xuất từ vỏ Hoa Giẻ (Cortex Desmoris) thân Bòn Bọt (Cailis Glochidionis) nguồn thực vật dồi Việt Nam Bộ y tế cấp số đăng ký sản xuất lưu hành Việc sử dụng kết nghiên cứu hoạt chất có nguồn gốc từ dược liệu nước để sản xuất nhiều loại sản phẩm cung ứng cho thị trường phục vụ cho cơng tác phịng khám chữa bệnh phương hướng - phương châm ngành Y tế Vì việc nghiên cứu triển khai sản xuất thử nghiệm “Hồn thiện quy trình cơng nghệ sản xuất thuốc mỡ chữa bỏng Glodese - SH91 từ nguồn dược liệu nước” cho điều trị bỏng quy mô 50 kg / mẻ đề tài cấp Nhà nước cần thiết có đầy đủ tính khả thi để triển khai Dự án sản xuất thử nghiệm 1.4 Lợi ích kinh tế, khả thị trường cạnh tranh sản phẩm Dự án: Như phần mở đầu đề cập, hàng năm nước ta ước tính có hàng trăm ngàn người bị bỏng Bỏng để lại hậu nặng nề tính mạng, sức khỏe, chức năng, thẩm mỹ cho nạn nhân, để lại gánh nặng tinh thần, kinh tế cho gia đình cho xã hội Do Sản phẩm Dự án đưa vào tham gia điều trị cộng đồng sở Y tế đem lại hiệu cao sức khỏe tinh thần người bệnh, giảm gánh nặng kinh tế cho gia đình xã hội [13], [14], [22] Sản phẩm điều trị bỏng Glodese - SH91 sản xuất từ nguồn dược liệu nước dây chuyền công nghệ đại đạt chuẩn GMP WHO giúp chủ động nguồn nguyên liệu đầu vào, tạo công ăn việc làm cho người dân địa phương nơi có nguồn nguyên liệu công nhân Công ty Mặt khác, sản phẩm Glodese - SH91 có ưu điểm vượt trội so với sản phẩm điều trị bỏng thị trường nên có tính cạnh tranh cao: ¾ Trong điều trị bỏng, sản phẩm Glodese - SH91 có tác dụng giảm đau, giảm tiết dịch phù nề, kháng khuẩn, kích thích q trình tái tạo biểu mơ hóa điều trị bỏng ¾ Giá so với sản phẩm khác: bảng 1.1 Bảng 1 Bảng so sánh giá sản phẩm Glodese - SH91 so với sản phẩm trị bỏng khác STT Tên sản phẩm Glodese - SH91 20g Giá bán (Có VAT) 13.500 So sánh Khối lượng SP tăng lần/ Ấn độ, giá rẻ 10% Glodese - SH91 200g 94.000 Khối lượng SP tăng lần/Pháp, giá tương đương rẻ Silverin 10g - Ấn độ 15.000 Biafine 93g - Pháp 62.000 Dự án sản xuất thử nghiệm “Hoàn thiện quy trình cơng nghệ sản xuất thuốc mỡ chữa bỏng Glodese - SH91 từ nguồn dược liệu nước” hoàn tồn có sở thực triển khai Cơng ty cổ phần dược TW Medipharco Tenamyd đem lại hiệu mặt kinh tế - xã hội: + Cung cấp thêm sản phẩm có tác dụng điều trị bỏng từ nguồn dược liệu nước + Thay phần nguyên liệu tổng hợp phải nhập thay nhóm sản phẩm nhập với giá cao, góp phần bình ổn giá thuốc + Tham gia dự trữ thuốc quốc gia cho phịng chống thảm họa, góp phần bảo vệ an ninh quốc phòng + Phát huy hiệu dây chuyền công nghệ đầu tư đạt tiêu chuẩn GMP WHO + Tạo công ăn việc làm, thu nhập cho người lao động + Mở rộng khả sản xuất nhượng quyền xuất 1.5 Năng lực thực Dự án: a Năng lực Khoa học công nghệ: - Cơng ty CPDTW Medipharco-Tenamyd có 300 lao động lành nghề, 120 lao động có trình độ đại học - Có hội đồng khoa học công nghệ tham gia Đề tài Dự án SXTN cấp Bộ y tế cấp Tỉnh TT Huế hàng trăm đề tài NCKHCN cấp sở đưa vào áp dụng sản xuất thuốc chữa bệnh - Có mối quan hệ hợp tác tịan diện với sở nghiên cứu, đào tạo, điều trị Trường Đại học Y-Dược, Viện - Bệnh viện Trung ương nước tổ chức nước - Là Doanh nghiệp hàng đầu ngành dược Việt nam chuyên sản xuất loại thuốc Kem-Mỡ ngồi da – Trong có thuốc chữa bỏng b Về lực cán tham gia dự án: - Có DSDH có kinh nghiệm thực tế bào chế cơng nghiệp dược 25 năm - Có 01 thạc sỹ hố có kinh nghiệm 28 năm xây dựng tiêu chuẩn phương pháp kiểm nhiệm thuốc - Có 02 GS& PGS.TS dược học có kinh nghiệm lĩnh vực nghiên cứu dược liệu chiết xuất dược liệu Việt Nam - Có 01 GS.TS 30 năm hoạt động ngành Bỏng Việt Nam c Cơ sở vật chất kĩ thuật: - Có dây chuyền sản xuất thuốc Kem - Mỡ da đạt tiêu chuẩn GMP-WHO - Có phịng kiểm tra chất lượng đạt tiêu chuẩn GLP kho bảo quản thuốc đạt tiêu chuẩn GSP - Có dây chuyền máy móc thiết bị với cơng nghệ sản xuất đại d Cơ sở màng lưới kinh doanh phân phối sản phẩm: - Có Chi nhánh Hà Nội, Hồ Chí Minh - Có Chi nhánh dược phẩm tỉnh Thừa Thiên Huế - Có Đại lí phân phối thuốc cho doanh nghiệp tất 61 tỉnh thành phố - Có đối tác nhập thị trường Nga, châu Phi, Myanma… e Khả tài đủ đáp ứng triển khai dự án: - Vốn điều lệ công ty: 20 tỷ đồng VN - Vốn huy động đóng góp người lao động Doanh nghiệp: Trung bình 20 tỷ đồng VN - Vốn vay Ngân hàng thương mại Vietcombank: Trung bình 110-120 tỷ đồng VN 1.6 Khả ứng dụng, chuyển giao, nhân rộng kết Dự án: Kết Dự án triển khai sản xuất nhà máy Công ty phục vụ cho nhu cầu chữa bệnh thị trường Việt Nam, đồng thời mở khả xuất sản phẩm nước 1.7 Những vấn đề dự án cần giải quyết: Kết nghiên cứu đề tài cấp sở nghiệm thu đánh giá để xây dựng hồ sơ đăng kí thuốc đạt mức độ nghiên cứu cơng thức, quy trình cơng nghệ, tiêu chuẩn chất lượng quy mô nghiên cứu sản xuất nhỏ phịng thí nghiệm, chưa khảo sát thông số kĩ thuật tối ưu để ổn định - Hàm lượng HG1 tính theo Hesperidin dược liệu khô kiệt không 0,25 % (kl/kl) PHƯƠNG PHÁP THỬ 2.1 Mô tả: Thử cảm quan, đối chiếu với ảnh mẫu, dược liệu phải đạt yêu cầu nêu 2.2 Bột : Nghiền dược liệu thành bột mịn, soi kính hiển vi với độ phóng đại thích hợp, phải thấy đặc điểm nêu 2.3 Định tính 2.3.1 Định tính tanin: Lấy g bột dược liệu, đun sôi với 20 ml nước cất 15 phút, để nguội, lọc Lấy dịch lọc (dung dịch A) làm phản ứng sau: + Phản ứng với chì acetat 30%: Lấy ml dung dịch A cho vào ống nghiệm, thêm vài giọt dung dịch chì acetat 30% (TT), xuất tủa vàng + Phản ứng với sắt (III) clorid 3% : Lấy ml dung dịch A cho vào ống nghiệm, thêm vài giọt dung dịch sắt (III) clorid 3% (TT), có tủa màu xanh đen 2.3.2 Định tính flavonoid: + Phản ứng cyanidin: Cho ml dịch lọc vào ống nghiệm, thêm bột magnesi kim loại (TT), thêm vài giọt acid hydrocloric đặc (TT), đun cách thủy phút, dung dịch chuyển từ màu vàng sang màu hồng + Phản ứng kiềm: Cho ml dung dịch A vào ống nghiệm, thêm vài giọt dung dịch natri hydroxyd 10% (TT), có màu vàng đậm 2.3.3 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) Trong phần định lượng HG1, sắc ký đồ dung dịch thử phải cho pic có thời gian lưu tương đối khoảng 1,08 so với pic chuẩn nội Hesperidin có phổ UV lấy thời gian lưu tương ứng có hình dạng sau: 2.4 Mất khối lượng làm khô : Thử theo DĐVN IV, phụ lục 9.6 ( 1g; 1050C; h) 2.5 Tạp chất: Thử theo DĐVN IV, phụ lục 12.11 2.6 Tro toàn phần: Thử theo DĐVN IV, phụ lục 9.8, phương pháp 2.7 Tro không tan acid: Thử theo DĐVN IV, phụ lục 9.7 2.8 Định lượng 2.8.1 Định lượng phenol tanin toàn phần: Thử theo DĐVN IV, phụ lục 12.6, phương pháp 2.8.1.1.Thuốc thử: Theo DĐVN IV, phụ lục 12.6, phương pháp - Thuốc thử phosphomolybdotungstic: Hòa tan 100 g natri tungstat 25 g natri molybdat 700 ml nước cất, thêm 100 ml acid hydrocloric 50 ml acid phosphoric, đun hồi lưu hỗn hợp 10 Thêm 150 g lithium sulfat, 50 ml nước cất 0,2 ml dung dịch brom, đun sôi để loại bỏ brom thừa (khoảng 15 phút) Để nguội, thêm nước cất vừa đủ 1000 ml, lắc đều, lọc Dung dịch thuốc thử phải có màu vàng Nếu thuốc thử có màu xanh lục nhẹ khơng sử dụng phục hồi lại cách thêm 0,2 ml dung dịch brom đun sôi Chú ý loại bỏ brom dư cách đun sôi thuốc thử Bảo quản thuốc thử - 80C - Dung dịch natri carbonat 29%: Hòa tan 29 g natri carbonat vừa đủ 100 ml nước cất 2.8.1.2 Tiến hành: Tiến hành thử nghiệm điều kiện tránh ánh sáng - Chuẩn bị dung dịch chuẩn: Cân xác khoảng 50 mg acid galic chuẩn vào bình định mức 100 ml màu nâu, thêm nước để hịa tan thêm vừa đủ đến vạch Hút xác 5,0 ml dung dịch cho vào bình định mức 50 ml màu nâu, thêm nước vừa đủ đến vạch, lắc (dung dịch có nồng độ acid galic khoảng 0,05 mg/ml- dung dịch A) - Xây dựng đường chuẩn: Hút xác 1,0 ml; 2,0 ml; 3,0 ml; 4,0 ml; 5,0 ml dung dịch A vào bình định mức 25 ml riêng biệt màu nâu Thêm vào bình ml thuốc thử phosphomolybdotungstic (TT), sau thêm 11 ml, 10 ml, ml, ml, ml nước vào bình tương ứng, thêm dung dịch natri carbonat 29% (TT) đến vạch, lắc Đo độ hấp thụ dung dịch thu bước sóng 760 nm Chuẩn bị song song mẫu trắng Xây dựng đường chuẩn với độ hấp thụ trục tung nồng độ dung dịch trục hoành - Chuẩn bị dung dịch thử: Cân xác lượng bột dược liệu tương đương với khoảng 1,0 g dược liệu khơ cho bình định mức 100 ml, thêm 60 ml nước cất, lắc siêu âm 60 - 700C giờ, để nguội, thêm nước đến vạch, lắc đều, lọc Lọc bỏ 20 ml dịch lọc đầu Hút xác 10,0 ml dịch lọc sau pha loãng với nước vừa đủ 50, ml + Xác định hàm lượng phenol tồn phần: Hút xác 2,0 ml dung dịch thử vào bình định mức 25 ml màu nâu, thêm ml thuốc thử phosphomolybdotungstic (TT), thêm 10 ml nước cất, thêm dung dịch natri carbonat 29% (TT) đến vạch, lắc Đo độ hấp thụ dung dịch thu bước sóng 760 nm Tính hàm lượng phenol tồn phần theo acid galic dung dịch thử dựa đường chuẩn xây dựng + Xác định hàm lượng polyphenol không liên kết với casein: Hút xác 25,0 ml dung dịch thử cho vào bình nón nút mài 100 ml có 0,6 g casein, đậy kín Đặt bình cách thủy nhiệt độ 300C giờ, lắc đều, để nguội, lọc Loại bỏ khoảng 10 ml dịch lọc Hút xác 2,0 ml dịch lọc sau cho vào bình định mức 25 ml màu nâu, thêm ml thuốc thử phosphomolybdotungstic (TT),thêm 10 ml nước cất, thêm dung dịch natri carbonat 29% (TT) đến vạch, lắc Đo độ hấp thụ dung dịch thu bước sóng 760 nm Tính hàm lượng polyphenol không liên kết với casein theo acid galic dung dịch thử dựa đường chuẩn xây dựng Hàm lượng tanin tính theo acid galic dung dịch thử tính theo cơng thức Tanin tồn phần = (lượng phenol tồn phần) - ( lượng polyphenol khơng liên kết với casein) Hàm lượng phần trăm phenol toàn phần (P%) dược liệu khơ kiệt tính theo cơng thức: P (%) = Mph 25 50 100 100 × 100 = C1 × × × × × 1000 10 1000 M M Hàm lượng phần trăm tanin toàn phần (T%) dược liệu khơ kiệt tính theo công thức: T (%) = Mt 25 50 100 100 × 100 = (C1 − C ) × × × × × 1000 10 1000 M M Trong đó: - Mph lượng phenol tồn phần có mẫu đem thử (g) - Mt lượng tanin tồn phần có mẫu đem thử (g) - C1 nồng độ phenol tồn phần tính theo acid galic dựa đường chuẩn (µg/ml) - C2 nồng độ polyphenol khơng liên kết với casein tính theo acid galic dựa đường chuẩn (µg/ml) - M khối lượng mẫu thử trừ ẩm (g) 2.8.2.Định lượng HG1: Phương pháp HPLC (DĐVN IV, phụ lục 5.3) 2.8.2.1.Điều kiện sắc ký: - Cột RP18 (250 x 4,6mm, 5µm) - Detector: Diode array với bước sóng thị 228nm - Tốc độ dòng: 0,8 ml/phút - Pha động: Acetonitril – acid phosphoric 0,1% Gradient với chương trình sau: Thời gian Acetonitril (%, tt/tt) (Phút) Acid phosphoric 0,1% Kiểu rửa (%, tt/tt) giải 0-15 20 80 Đẳng dòng 15-35 20Ỉ50 80Ỉ50 Gradient 35-50 50 50 Đẳng dịng 50-51 50Ỉ20 50Ỉ80 Gradient 51-55 20 80 Đẳng dịng - Dung dịch chuẩn nội: Pha dung dịch chuẩn Hesperidin methanol có nồng độ xác khoảng 100 µg/ml - Dung dịch thử: Cân xác khoảng 2,0 g bột dược liệu hoa giẻ, thêm 50 ml nước, đun sôi (bổ sung nước trình đun), để nguội, lọc lấy dịch lọc, dùng 15 ml nước nóng để rửa bã Gộp dịch lọc dịch rửa, cô đến gần cạn Thêm vào cắn 40 ml methanol 90%, siêu âm 30 phút để hòa tan chuyển vào bình định mức 50 ml, dùng 10 ml methanol 90% để tráng rửa cắn vào bình định mức, thêm methanol đến vừa đủ, lắc đều, lọc Pha loãng gấp hai dịch lọc dung dịch chuẩn nội, lọc qua màng lọc 0,45µm dung dịch tiêm sắc ký 2.8.2.2.Tiến hành: Tiêm riêng biệt 20µl dung dịch thử 10µl dung dịch chuẩn nội vào hệ thống sắc ký, tiến hành sắc ký theo điều kiện mô tả, ghi sắc ký đồ Xác định diện tích pic pic chuẩn nội Hesperidin pic HG1 pic có thời gian lưu tương đối so với pic chuẩn nội Hesperidin khoảng 1,08 Hàm lượng % (kl/kl) HG1 tính theo hesperidin dược liệu khơ tính theo cơng thức: X (%) = S HG1 100 C CN 100 × × × S CN 1000 mc Trong : - SHG1 diện tích pic HG1 dung dịch thử - SCN diện tích pic chuẩn nội Hesperidin dung dịch thử - CCN : nồng độ dung dịch chuẩn nội Hesperidin tính theo µg/ml - mC : Khối lượng mẫu thử đem định lương trừ độ ẩm (mg) CHÊ BIẾN, BẢO QUẢN - Thu hái lấy quanh năm, loại bỏ tạp chất, rửa sạch, phơi sấy khơ - Bảo quản nơi khơ ráo, thống mát, tránh mốc, sâu , mọt Huế, ngày 26 tháng 04 năm 2010 Trưởng phòng KTCL Nguyễn Văn Thể TỔNG GIÁM ÐỐC TIÊU CHUẨN CƠ SỞ MEDIPHARCO THUỐC MỠ CHỮA BỎNG GLODESE - SH 91 TC: 054 - A- 0791 - 10 Có hiệu lực từ ngày ký YÊU CẦU KỸ THUẬT 1.1 Công thức điều chế cho 100 g thành phẩm : Cao khô Glodese - SH 91 Tám phẩy sáu gram 8,6g (Tương đương với 50,0 g thân-cành-lá hoa giẻ 50,0 g thân bòn bọt) Tá dược Vừa đủ 100g (Vaselin, lanolin, sáp ong vàng, glycerol monostearat, propylen glycol, nipagin, nipasol, nước cất) 1.2 Nguyên liệu: Cao khô Glodese - SH 91 Đạt tiêu chuẩn sở Lanolin (Lanolinum anhydricum) Đạt tiêu chuẩn DĐVN IV Vaselin (Vaselinum album) Đạt tiêu chuẩn DĐVN IV Sáp ong vàng ( Cera flava) Đạt tiêu chuẩn DĐVN IV Glycerol monostearat Đạt tiêu chuẩn DĐVN IV Propylen glycol Đạt tiêu chuẩn BP 2007 Nipagin Đạt tiêu chuẩn DĐVN IV Nipasol Đạt tiêu chuẩn DĐVN IV Nước cất Đạt tiêu chuẩn DĐVN IV 1.3 Chất lượng thành phẩm: 1.3.1 Hình thức, thể chất: Thuốc mỡ màu nâu sẫm, đồng nhất, mùi thơm nhẹ, thể chất mềm thích hợp, dễ bắt dính lên da bơi, khơng chảy lỏng nhiệt độ 37 0C 1.3.2 Độ mịn: Thuốc phải mịn, hạt gợn 1.3.3 Độ đồng nhất: Đạt yêu cầu độ đồng theo DĐVN IV, phụ lục 1.12 1.3.4 Khối lượng đơn vị đóng gói: Tuýp 20g ± 10% (18,0- 22,0g) Tuýp 50g ± 8% (46g- 54g) Hộp 200g ± 5% (190g- 210g) 1.3.5 Định tính: Chế phẩm phải thể phép thử định tính thân-cành-lá hoa giẻ thân bòn bọt 1.3.6 Định lượng: Chế phẩm phải chứa: - Khơng 0,6% (kl/kl) phenol tồn phần - Khơng 0,2% (kl/kl) tanin tồn phần - Khơng 0,13 % (kl/kl) lượng HG1 tính theo Hesperidin 1.3.7 Độ nhiễm khuẩn: Đạt yêu cầu mức 1, phụ lục 13.6, DĐVN IV 1.3.8 Kích ứng da: Khơng kích ứng 1.3.9 pH: Từ 4,5 đến 6,0 1.3.10 Độ dàn mỏng: Từ 1200 đến 5000 mm2 PHƯƠNG PHÁP THỬ 2.1 Hình thức: Lấy ống thuốc mỡ, bóp nhẹ, thuốc phải tạo thành sợi dài liên tục, không bị đứt đoạn bọt khí to chứa ống thuốc phải màu từ đầu đến cuối Để ống thuốc mở tủ ấm tủ sấy 370C thời gian giờ, lấy dốc ngược, thuốc khơng chảy lỏng 2.2 Độ mịn: Bóp lấy khoảng 1g thuốc mỡ đặt lên mặt kính phẳng, dùng đầu ngón tay miết cho thuốc dàn thành lớp mỏng Thuốc phải trơn tay, mịn đều, không gây cảm giác gợn cộm 2.3 Độ đồng nhất: Thử theo DĐVN IV - Phụ lục 1.12 2.4 Khối lượng đơn vị đóng gói: Thử theo DĐVN IV - Phụ lục 11.3, phương pháp 2.5 Định tính: 2.5.1 Định tính Thân-cành hoa giẻ 2.5.1.1 Phương pháp sắc ký lớp mỏng (DĐVN IV, phụ lục 5.4) + Thuốc thử dụng cụ: - Bản mỏng Silicagel 60F254, hoạt hoá 100 0C 30 phút - Ethanol tuyệt đối (TT) - Dung mơi triển khai sắc kí: Cloroform - ethyl acetat - acid formic ( : : 1) - Đèn tử ngoại, bước sóng 254 nm 366nm + Cách thử: - Dung dịch đối chiếu: Lấy 2,5 g thân-cành lá-cây hoa giẻ cắt nhỏ, thêm 100ml nước, đun sôi nhẹ giờ, để nguội, lọc Cơ dịch lọc cịn khoảng 25 ml chuyển vào bình gạn, lắc với hỗn hợp cloroform - ethyl acetat - acid formic (5 : : 1) lần x 20ml Gạn gộp dịch chiết hỗn hợp (lớp dưới), cách thuỷ đến cạn Hồ cắn 1ml ethanol tuyệt đối dung dịch chấm sắc ký - Dung dịch mẫu thử: Lấy 5,5g chế phẩm, thêm 20ml nước, đun sôi nhẹ 15 phút, vừa đun vừa khuấy, làm nguội nhanh, gạn lấy lớp nước Tiến hành chiết lần Gộp dịch chiết nước, chuyển vào bình gạn, lắc với hỗn hợp cloroform - ethyl acetat acid formic ( : :1) lần x 20ml Gạn gộp dịch chiết hỗn hợp (lớp dưới), cô cách thuỷ đến cạn Hoà cắn 1ml ethanol tuyệt đối dung dịch chấm sắc ký Chấm riêng biệt lên mỏng 20µl dung dịch đối chiếu dung dịch thử điểm A B Triển khai sắc ký theo DĐVN IV, phụ lục 5.4 Sau triển khai khoảng 12 - 13 cm, lấy mỏng ra, để khơ nhiệt độ phịng, soi mỏng đèn tử ngoại, bước sóng 254 nm 366nm Kết : Dung dịch thử phải có vết màu, Rf với vết dung dịch đối chiếu 2.5.1.2 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) Trong phần định lượng hoa giẻ, sắc ký đồ dung dịch thử phải cho pic (tạm gọi HG1) có thời gian lưu tương đối khoảng 1,08 so với pic chuẩn nội Hesperidin có phổ UV lấy thời gian lưu tương ứng có hình dạng sau: 2.5.2 Định tính thân bịn bọt 2.5.2.1 Thuốc thử dụng cụ: - Bản mỏng Silicagel 60F254, hoạt hoá 100 0C 30 phút - Ethanol, methanol, n-butanol (TT) - Dung môi triển khai sắc kí: Cloroform - methanol ( :1) - Thuốc thử phát hiện: Dung dịch vanilin 1% acid sulfuric đặc 2.5.2.2 Cách thử: - Dung dịch đối chiếu: Lấy 2,5 g bột thân bòn bọt, thêm 100 ml nước cất, đun sôi nhẹ 30 phút, để nguội, lọc Chuyển dịch lọc vào bỡnh gạn, thờm 30 ml n-butanol bóo hũa nước, lắc kỹ Sau tỏch lớp, gạn lấy lớp butanol, cô cách thủy đến cạn Hoà cắn 1ml ethanol tuyệt đối dung dịch chấm sắc ký - Dung dịch mẫu thử: Lấy 5,5g chế phẩm, thêm 50 ml nước cất, đun sôi nhẹ phút, làm lạnh, lọc Lắc dịch lọc với 30 ml n-butanol bão hòa nước Gạn lấy dịch chiết butanol, cách thủy đến cạn Hồ cắn 1ml ethanol tuyệt đối dung dịch chấm sắc ký Chấm riêng biệt lên mỏng 20µl dung dịch đối chiếu dung dịch thử điểm A B Triển khai sắc ký theo DĐVN IV, phụ lục 5.4 Sau triển khai khoảng 12 - 13 cm, lấy mỏng ra, để khô nhiệt độ phòng, phun dung dịch vanilin 1% acid sulfuric đặc, sấy 1000 rõ vết Kết quả: Dung dịch thử phải có vết màu, Rf với vết dung dịch đối chiếu 2.6.Định lượng 2.6.1 Định lượng phenol tanin toàn phần: Thử theo DĐVN IV, phụ lục 12.6, phương pháp 2.6.1.1.Thuốc thử: Theo DĐVN IV, phụ lục 12.6, phương pháp - Thuốc thử phosphomolybdotungstic: Hòa tan 100 g natri tungstat 25 g natri molybdat 700 ml nước cất, thêm 100 ml acid hydrocloric 50 ml acid phosphoric, đun hồi lưu hỗn hợp 10 Thêm 150 g lithium sulfat, 50 ml nước cất 0,2 ml dung dịch brom, đun sôi để loại bỏ brom thừa (khoảng 15 phút) Để nguội, thêm nước cất vừa đủ 1000 ml, lắc đều, lọc Dung dịch thuốc thử phải có màu vàng Nếu thuốc thử có màu xanh lục nhẹ khơng sử dụng phục hồi lại cách thêm 0,2 ml dung dịch brom đun sôi Chú ý loại bỏ brom dư cách đun sôi thuốc thử Bảo quản thuốc thử - 80C - Dung dịch natri carbonat 29 %: Hòa tan 29 g natri carbonat nước vừa đủ 100 ml 2.6.1.2.Tiến hành: Tiến hành thử nghiệm điều kiện tránh ánh sáng - Chuẩn bị dung dịch chuẩn: Cân xác khoảng 50 mg acid galic chuẩn vào bình định mức 100 ml màu nâu, thêm nước để hòa tan thêm vừa đủ đến vạch Hút xác 5,0 ml dung dịch cho vào bình định mức 50 ml màu nâu, thêm nước vừa đủ đến vạch, lắc (dung dịch có nồng độ acid galic khoảng 0,05 mg/ml- dung dịch A) - Xây dựng đường chuẩn: Hút xác 1,0 ml; 2,0 ml; 3,0 ml; 4,0 ml; 5,0 ml dung dịch A vào bình định mức 25 ml riêng biệt màu nâu Thêm vào bình ml thuốc thử phosphomolybdotungstic (TT), sau thêm 11 ml, 10 ml, ml, ml, ml nước vào bình tương ứng, thêm dung dịch natri carbonat 29% (TT) đến vạch, lắc Đo độ hấp thụ dung dịch thu bước sóng 760 nm Chuẩn bị song song mẫu trắng Xây dựng đường chuẩn với độ hấp thụ trục tung nồng độ dung dịch trục hoành - Chuẩn bị dung dịch thử: Cân xác khoảng 4,5 g chế phẩm cho vào cốc thủy tinh có mỏ 100 ml, đun cách thủy cho khối mỡ chảy lỏng, thêm 50 ml nước, khuấy đều, làm lạnh nước đá, lọc dịch chiết vào bình định mức 200 ml Tiến hành chiết thêm lần nữa, lần với 40 ml nước Gộp dịch chiết nước vào bình định mức, thêm nước đến vạch, lắc đều, lọc Bỏ khoảng 10 ml dịch lọc đầu Hút xác 10,0 ml dịch lọc sau cho vào bình định mức 50 ml, thêm vừa đủ đến vạch, lắc + Xác định hàm lượng phenol tồn phần: Hút xác 2,0 ml dung dịch thử vào bình định mức 25 ml màu nâu, thêm ml thuốc thử phosphomolybdotungstic (TT),thêm 10 ml nước cất, thêm dung dịch natri carbonat 29% (TT) đến vạch, lắc Đo độ hấp thụ dung dịch thu bước sóng 760 nm Tính hàm lượng phenol toàn phần theo acid galic dung dịch thử dựa đường chuẩn xây dựng + Xác định hàm lượng polyphenol không liên kết với casein: Hút xác 25,0 ml dung dịch thử cho vào bình nón nút mài 100 ml có 0,6 g casein, đậy kín Đặt bình cách thủy nhiệt độ 300C giờ, lắc đều, để nguội, lọc Loại bỏ khoảng 10 ml dịch lọc Hút xác 2,0 ml dịch lọc sau cho vào bình định mức 25 ml màu nâu, thêm ml thuốc thử phosphomolybdotungstic (TT),thêm 10 ml nước cất,thêm dung dịch natri carbonat 29% (TT) đến vạch, lắc Đo độ hấp thụ dung dịch thu bước sóng 760 nm Tính hàm lượng polyphenol khơng liên kết với casein theo acid galic dung dịch thử dựa đường chuẩn xây dựng Hàm lượng tanin tính theo acid galic dung dịch thử tính theo cơng thức Tanin toàn phần = (lượng phenol toàn phần) - ( lượng polyphenol không liên kết với casein) Hàm lượng phần trăm phenol tồn phần (P%) có chế phẩm tính theo cơng thức: P (%) = Mph 25 50 200 100 × 100 = C1 × × × × M 10 1000 M Hàm lượng phần trăm tanin tồn phần (T%) có chế phẩm tính theo công thức: T (%) = Mt 25 50 200 100 × 100 = (C1 − C ) × × × × M 10 1000 M Trong đó: - Mph : lượng phenol tồn phần có mẫu đem thử (g) - Mt: lượng tanin toàn phần có mẫu đem thử (g) - C1 nồng độ phenol tồn phần tính theo acid galic dựa đường chuẩn (mg/ml) - C2 nồng độ polyphenol khơng liên kết với casein tính theo acid galic dựa đường chuẩn (mg/ml) - M khối lượng mẫu thử (g) 2.6.2 Định lượng HG1 tính theo hesperidin chế phẩm : Phương pháp HPLC (DĐVN IV, phụ lục 5.3) 2.6.2.1 Điều kiện sắc ký: Cột RP18 (250 x 4,6mm, 5µm) Detector: Diode array với bước sóng thị 228nm Tốc độ dòng: 0,8 ml/phút Pha động: Acetonitril – acid phosphoric 0,1% Gradient với chương trình sau: Thời gian Acetonitril (%, tt/tt) Acid phosphoric 0,1% Kiểu rửa giải (Phút) (%, tt/tt) Đẳng dòng 80 20 0-15 Gradient 80Ỉ50 20Ỉ50 15-35 Đẳng dịng 50 50 35-50 Gradient 50Ỉ80 50Ỉ20 50-51 Đẳng dịng 80 20 51-55 - Dung dịch chuẩn nội: Pha dung dịch chuẩn Hesperidin methanol có nồng độ xác khoảng 100 µg/ml - Dung dịch thử: Cân xác khoảng 4,0 g chế phẩm vào bình nón 100 ml, thêm xác 50 ml methanol 90%, cân xác định khối lượng bình Đun nóng bình nón cách thủy 30 phút sau lắc siêu âm 20 phút, để nguội, bổ sung methanol 90% đến vừa đủ lượng cân trước, lắc đều, lọc Pha loãng gấp hai dịch lọc dung dịch chuẩn nội, lọc qua màng lọc 0,45µm dung dịch tiêm sắc ký 2.6.2.2 Tiến hành: Tiêm riêng biệt 20µl dung dịch thử 10µl dung dịch chuẩn nội vào hệ thống sắc ký, tiến hành sắc ký theo điều kiện mô tả, ghi sắc ký đồ Xác định diện tích pic pic chuẩn nội Hesperidin pic HG1 pic có thời gian lưu tương đối so với pic chuẩn nội Hesperidin khoảng 1,08 Hàm lượng % (kl/kl) HG1 tính theo Hesperidin trong chế phẩm tính theo cơng thức: X (%) = S HG1 C 100 100 × × × S Hes 1000 mc Trong : SHG1, SHes: Diện tích pic HG1 pic chuẩn nội Hesperidin sắc ký đồ mẫu thử C : nồng độ dung dịch chuẩn nội tính theo µg/ml mC : Khối lượng mẫu thử đem định lương (mg) 2.7 Độ nhiễm khuẩn: Thử theo DĐVN IV, phụ lục 13.6 ( thử giới hạn nhiễm khuẩn) 2.8 Kích ứng da: Thử theo tiêu chuẩn ISO 10993-10 - Tiến hành: Dùng 0,5 g mẫu dàn lên miếng gạc kích thước 2,5 x 2,5 cm đắp trực tiếp lên da thỏ, cố định để yên Sau thời gian trên, tháo gạc ra, làm vùng da thỏ, đánh giá kết sau 24 giờ, 48 72 - Đánh giá kết quả: Trên thỏ, điểm phản ứng tính tổng số điểm mức độ ban đỏ phù nề chia cho số lần quan sát Điểm kích ứng mẫu thử lấy trung bình điểm phản ứng thỏ thử sử dụng điểm thời gian quan sát 24 giờ, 48 72 Khả gây kích ứng da thỏ mẫu thử phân loại sau: Bảng Mức độ phản ứng da thỏ Số tt Phản ứng da thỏ Thang điểm Ban đỏ và tạo vẩy Khơng có ban đỏ Ban đỏ nhẹ (có thể phân biệt) Ban đỏ nhìn thấy rõ Ban đỏ từ mức trung bình đến nặng Ban đỏ nặng (màu đỏ thẫm) đến tạo thành vẩy để ngăn ngừa tiến triển ban đỏ Khơng có phù nề Phù nề nhẹ (có thể phân biệt) Phù nề nhẹ (xác định gờ khu vực bị phù nề) Phù nề trung bình (gờ cao khoảng mm) Phù nề nặng (gờ cao mm lan xung quanh) Phù nề Tổng số điểm kích ứng tối đa Đối chiếu điểm kích ứng với mức độ qui định bảng để xác định khả gây kích ứng da thỏ mẫu thử Bảng Phân loại phản ứng da thỏ Loại phản ứng Điểm trung bình Khơng kích ứng Kích ứng khơng đáng kể > - 0,5 Kích ứng nhẹ > 0,5 - 2,0 Kích ứng vừa phải > 2,0 - 5,0 Kích ứng nghiêm trọng > 5,0 - 8,0 2.9 pH: Cân 10,0 g chế phẩm, thêm 10 ml nước cất, đun nóng cách thủy, khuấy tiên tục 10 phút, để nguội, lọc Xác định pH dịch lọc theo DĐVN IV, phụ lục 6.2 2.10 Độ dàn mỏng: Dùng kính có kích thước 200 mm x 200 mm, phía kính có dán giấy chia ô tới mm, tờ giấy có kẻ trục X Y vng góc với nhau, điểm giao vng góc phải nằm tờ giấy dán vào kính phải nằm kính Đặt kính lên mặt phẳng cân Dùng bơm tiêm nhựa (bỏ đầu kim) lấy g chế phẩm bơm lên phần kính nằm chỗ giao hai trục X Y, mẫu phải tạo thành hình nón Đặt nhẹ nhàng xác kính khác (có kích thước 200 mm x 200 mm có khối lượng 200 g ) lên kính chứa mẫu Sau phút, đo đường kính (mm) hình trịn tạo Ghi lại đường kính theo trục X Y Tính giá trị độ dàn mỏng theo cơng thức: E= π ∗ d 1∗ d Trong đó: E : độ dàn mỏng (mm2) π: 3,1416 d1 : Đường kính, trục X (mm) d2: Đường kính, trục Y (mm) 3.ĐĨNG GĨI-GHI NHÃN – BẢO QUẢN -Thuốc đóng tuýp nhựa kín 20 gam 50 gam hộp nhựa 200 gam -Nhãn qui chế -Bảo quản nơi khơ thống, nhiệt độ 25 0C -Hạn dùng 36 tháng, kể từ ngày sản xuất Trưởng Bộ phận KTCL Ds Nguyễn Văn Thể Huế, ngày 26 tháng 04 năm 2010 TỔNG GIÁM ĐỐC