Phân tích xác định thành phần và nhóm hoạt chất của một số dược liệu bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng kết hợp đo mật độ quang hấp thụ tlc densitometry scanning phục vụ công tác chuẩn hoá dược liệu bộ y tế

Tính ham lượng % Trang 19 X% : Hàm lượng % atractylenolide III trong được liệu khô tuyệt đối m : Lượng mẫu thử đo được Hg kết quả trung bình cúa 2-3 lần nhắc lại 9: Lượng mẫu thử chấm

Trang 1

BOY TE

ca

FERNS TAY

PHAN YÍSH XẤt? GINH YHÀNH PHÂN VÀ NHÓM EmAY ERAT

CA MỘT SỐ DƯỢC LIEU: BĂNG PHƯƠNG ĐIIÁP: 842 HÝ LỚP Home KEY HỢP ĐÓ MÁT ĐỘ QUA<4G HẬP THỰ (TLC, DENSITCMETWY/ OANH, ?TỤ

Trang 2

BỘ Y TẾ

SAN PHAM KHOA HOC CUA DE TAL

TÊN ĐỂ TÀI

PHẪN TÍCH XÁC ĐỊNH THÀNH PHẢN VÀ NHÓM HOẠT CHÁT CỦA MỘT SỐ DƯỢC LIỆU BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỚP MÓNG

KET HOP DO MAT DO QUANG HAP THU (TLC, DENSITOMETRY/ SCANNING)

PHUC VU CONG TAC TIEU CHUAN HOA DUGQC LIEU

Hà Nội 2009

GOI =A

Trang 3

¬

SAN PHAM KHOA HOC CUA DE TAI

TEN DE MUC Trang

1 Các mẫu được liệu nghiên cứu 1 2 Quy trình phân tích và bộ dữ liệu chuẩn về phần tích của các dược liệu 12

Trang 4

SAN PHAM KHOA HOC CUA DE TÀI

Trang 5

TĐược liệu bạch truật

Rhizoma Atractyloidis macrocephalae

Trang 8

Diệp hạ châu đắng

Trang 9

Được liệu địa cắt bì

Trang 10

Được liệu kim ngân hoa

Flos Lenicerae

Kim ngan bow

Kim ngân bon] ae

Trang 11

Được liện mã đề

Trang 12

Dược liệu ngũ vị tử

Trang 13

Được liện râu mèo

Trang 14

Được liệu thiên môn đông

Radix Asparagi

Trang 15

SAN PHAM KHOA HOC CUA DE TAI

2 QUI TRINH PHAN TICH VA BQ DU LIEU CHUAN VE PHAN

TÍCH CỦA 10 ĐÓI TƯỢNG DƯỢC LIỆU NGHIÊN CỨU KỸ THUẬT TLC-TLC SCANNING

Trang 16

BACH TRUAT (Rhizoma Atractylodis macrocephalae)

1 Nguồn gốc: Than ré phoi kh6 cia cdy bach trudt Atractylodes macrocephala Koidz., ho Cc (Asteraceae)

2 Thu hai, xir ly mẫu: Thu hái vào tháng 10 — 12, dao lấy thân rễ, bỏ rễ con, có

thể thái thành lát mỏng, sấy nhẹ (nhiệt độ < 60°C) đến khô

3 Mô tả: Thân rễ to (quen gọi là củ) có hình dang thay đổi, hình chủy có nhiều mấu phình ra, phía trên thót nhỏ, hoặc từng khúc mập, nạc, đài 5-10cm, đường kinh 2-5em, Mặt ngoài màu nâu nhạt hoặc xám, có nhiều mau, có vân hình hoa cúc, có

nhiễu nếp nhăn dọc Chất cứng, khó bẻ gẫy, mặt cắt không bằng, có màu vàng đến

nâu nhạt, mùi thơm nhẹ

4 Đặc điểm vi học:

* Đặc điểm bột dược liệu

Bột màu nâu vàng, mùi thơm, vị hơi mặn Soi đưới kính hiển vi thấy: Mô mềm gồm

các tế bảo thành mỏng, có thể mang các tế bào mô cứng Tế bảo mô cứng thành

Tinh thé calci oxalat hinh kim, kích thước khoảng 0,02-0,025 mm riêng lẻ hay tập trung thành đám Mảnh mạch điểm, mạch vạch Rải

dày, thấy rõ các ống trao đ

rác có sợi thành đây

5 Định tính:

Định tính terpenoid

Chuẩn bị mẫu

- Mẫu thử: 0,5g dược liệu đã xay nhỏ, chiết với 5 mi methanol, siêu âm 30

phút, gạn, lọc, địch lọc thu được dùng để chấm sắc ký Lượng chấm 10-12 pl

-_ Mẫu đối chiếu: Atractylenolide II 0,2mg/ml methanol, lượng chấm 5 II

Lớp mỏng: TLC Siliea gel 60 F254 Merek, hoạt hóa ở 105°C trong 1 giờ trước khi

sử dụng

Hệ dụng môi sắc ký:

- HDM 1:n.Hexan: ethylacetat (2:1) > Hinh 4.1(A,B) - HDM 2: Ether dau: ethylacetat (50:1) > Hinh 4.1(C)

Phat hi

- TT 1: DMAB - acid sulphuric, Vis / UV366nm > Hinh 4.1(A, B) TY 2: Vanillin - acid sulphuric , Vis —> Hình 4.L.C

Kết quả: Hình 4.1.( A, B, C)

Trang 17

45 At1 23 45

45 Sal 234 5

Hình 4.1: Sắc ký đỗ định tính thành phan nhóm hoạt chất trong

dược liệu bạch trudt (Rhizoma Atractylodis macrocephalae)

Ký hiệu: Atractylenolide III (At); Saccharose (Sa); Cac mẫu được liệu

bạch truật nghiên cứu (vết 1- 5),

SKĐ định tính terpenoid (Hình A/VIS, Hình B/UV366, Hình C/ VIS); SKĐ định tính polysaccharid (Hinh D/ VIS)

Trang 18

Định tính polpsaccharid

Chuẩn bị mẫu:

-_ Mẫu thử: 0,5g dược liệu đã xay nhỏ, chiết với 10 mÌ hỗn hợp methanol, nước

(ỷ lệ 4: 1), siêu âm 30 phút, gạn, lọc, dịch lọc thu được dùng để chấm sắc ký

Luong cl Sul

Mẫu đối chiếu: Saccharose 0,2mg/ml methanol, lượng chấm Sul

Lop mang: TLC silica ge] 60 F254 Merck

Hé dung moi séc ky: n.Propanol : ethylacetal : acid acetic : nude (4:3:1:2) Phát hiện: TT a-Naphthol Kết quả: Hình 4.1.D 6 Định lượng Phương pháp Chuẩn bị mẫu với 20m] metbanol x 2 lần,

ân Gạn, gộp dịch chiết vào cốc có mó, làm bay hơi dung môi

- Mau thử: Cân 1.0 g dược liệu đã xay nhỏ ch

siêu âm 30 phút mỗi l

trên cách thuỷ đến c cạn Hoà cin thu duge trong | ml methanol và 9ml nước, cho vào bình lắng ga với 20mlx 3 lần chloroform Giạn, gộp phần chloroform vio

cốc có mỏ, bốc hơi thành cắn Hòa căn thu được vừa đủ 10ml methanol, lắc đều

Loc qua giấy lọc, bô Iml dich loc dau, lay 1-2ml dich loc tiép theo dé cham sắc ký, ~ Méu déi chiéu: Dung dich atractylenolide III 0,2mg/ml trong methanol

Lớp mỏng: TIPTLC Silica gel 60 F 254 Merek, kích thước 20 x 10 em, hoạt hóa ở

105°C trong 1 giờ trước khi sử dụng

Chấm mẫu: Cham thang chuẩn: 2p, 4H] x 2, 6g), 8kl và 100]; Mẫu thử: 4- 12p

(chấm nhắc lại mẫu thử 2 - 3 lần) Chấm cách mép kính 15mm (chiều X), 8 mm (chiều Y), chiều rộng vết (mm), khoảng cách giữa các vết (10mm)

Hệ dụng môi sắc lj: n.Hexan : cthylacelat (2 : 1), để bình sắc ký bão hoà dung

môi 20 phút

Phát hiện: Bo TLC scanning, hap thy , 2 220 nm

Céch tién hank: Kinh sau khi da trién khai voi hé dung môi néu trén, cao 85mm, lay

ra, để bay hơi hết dung môi trong hết, thời gian 30 phút Tiến hanh do TLC

scanning trén máy CAMAG.TLC SCANNER3, bước sóng À 220 nm, tốc độ quét

20mmwgiây, chế độ đo remission Chương trình được thực hiện dưới sự điều khiển của phần mềm wintcats Đọc kết quả đo trên máy Tính ham lượng %

Trang 19

X% : Hàm lượng % atractylenolide III trong được liệu khô tuyệt đối

m : Lượng mẫu thử đo được (Hg) (kết quả trung bình cúa 2-3 lần nhắc lại)

9: Lượng mẫu thử chấm trên máy (l) V; Thể tích dịch chiết mẫu thử (ml) P: Khối lượng dược liệu đem cân (g) 8: Độ ẩm của được liệu Kết quả định lượng: Kết quả định lượng atraetylenolide II trong được liệu bạch truật được ghỉ ở Bảng 4.1 và Hình 4.2 Bảng 4.1 Kết quả định lượng atractylenolide JII trong dược liệu bạch truật i To mm Ham lượng (%6) —

EE dem DENY ĐIỂM đữacBienolfk HI/ĐDL Ghicha

Trang 20

Atractylenolide HI D8 thi xác định khoảng tuyến tính Hình 4.2 Sắc ký đồ TUC scanning và đồ thị xác định KTT

Định lượng afractylenolide III trong được liệu bạch truật

(Rhizoma Atractylodis macrocephalae)

Trang 21

CHI TU (Fructus Gardeniae)

1.Nguỗn gốc: Quả chín phơi hay sấy khô của cây dành dành Gardenia jasminoides

Ellis., ho ca phé (Rubiaceae)

2 Thu hái, xử lý mẫu: Thu hoạch vào tháng 9-11, hái lấy quả chín chuyển máu

vàng đỏ, ngắt bỏ cuống quả và loại tạp, đỗ đến khi hạt hơi phông lên, lấy ra phơi

hoặc sấy khô

3 Mô tả: Quả hình thoi hoặc hình trứng dài, dài 2-4,5cm đường kính 1-2em, mảu

vàng cam đến đỏ nâu, có khi xám nâu đến đr xám, hơi bong, có 5-8 đường gờ chạy

dọc quả, giữa hai gờ là rãnh rõ rệt Đỉnh quả lõm có 5-8 lá đài tồn tại, thường bị gẫy

cụt Gốc quả hẹp, còn có vết cuồng quả Vỏ quả mỏng, giòn, hơi bong, Vỏ quả giữa màu vàng đục, day hơn Võ qua trong mau vàng ngà, bong, rất mỏng, có 2-3 vách ngăn giả Hạt nhỏ, màu vàng cam nâu đỏ hoặc nâu den nhạt, mặt vỏ hạt có rất

nhiêu hạt mịn Mùi nhẹ Vị hơi chua và đắng 4 Đặc điểm vi học:

Đặc điểm bột được liệu: Bột màu vàng nẫu hay nâu đỏ soi đưới kính hiển vi

thấy: Sợi riêng lẻ hay tập hợp thành bó Mảnh vỏ quả cấu tạo từ những tế bào thành day, khoang tế bào rộng Hoặc hẹp Bề mặt tế bào (loại khoang rộng) thường có những lỗ nhỏ Mô mềm vỏ quả, mảnh nội nhũ chứa các chất dự trữ,

5 Định tính:

Định tinh iridoid

Chuẩn bị mẫu:

-_ Mẫu thử:1g được liệu đã được tán nhỏ, chiết với 10ml methanol, siêu âm 20

phút, gạn lọc lấy phản dịch chiết, thu được dung dịch thử để định tính

- Mẫu đối chiếu: Geniposide 0,25 mg/ml methanol, gardenoside 0,25 mg/ml methanol, Lớp mỏng: TLC silica gel 60 F254 Merck, hoat héa & 105°C trong 1 gid trude khi sử dụng Lượng chấm mẫu: 12pl dung địch mẫu thử; ópl mỗi dung dịch mẫu đối chiếu geniposide và gardenoside Hệ dụng môi sắc ký: n.Butanol: acid acetc : nước (7:2:1 ) Phái hiện:

- Quan sét/ UV 254 > Hinh 4.3.A

- Anisaldehyde- acid sulphuric (TT) > Hinh 4.3.B

Két qua: Hinh 4.3 (A, B)

Trang 22

- 05

Ge Ga 1 2 3 GeGa1 2 3 Ch 1 12 3

Hình 4.3.Sắc ký đồ định tính thành phần nhóm hoạt chất dược liệu chỉ tử

(Fructus Gardeniae)

Ky higu: Geniposide (Ge), Gardenoside (Ga); Acid chlorogenic (Ch); Cae miu

dược liệu chí từ nghiên cứu (I,2,3)

SKĐ định tính iridoid (Hình, A/ UV254 , Hình B/ VIS), SKD định tính dẫn

xuất acid caffeic (Hình C/ UV366); SKĐ định tính sắc tổ crocin (Hình.D/VIS)

Dinh tính dẫn xuất acid caffeic

Chuẩn bị mẫu:

-_ Mẫu thử :1g dược liệu đã được tán nhỏ, chiết với 10ml methanol, siêu âm 20

phút, gạn lọc lầy phần dịch chiết, thu được dung địch thử để chấm sắc ký

- Mau déi chiéu: Acid chlorogenic acid 0,05 mg/ml methanol

Lớp méng: TLC silica gel 60 F254 Merck, hoat héa & 105°C trong 1 giờ trước khí sit dung

Lượng chấm mdu: 8ul dung dich mau thi; 12ul dung dich mdu déi chiéu acid

chlorogenic

Hệ dung môi sắc ký: Ethylaeetat : acid acetic : acid formic : nước (19 : 1 : 1: 2 ) Phát hiện: Natural products- PEG 4000 ( TT)

Kết quả: Hình 4.3.C

Dinh tính số

Chuẩn bị mẫu:

~ Mẫu thử :1g được liệu đã được tán nhỏ, chiét véi 10ml methanol, siêu âm 20

phút, gạn lọc lấy phần dịch chiết, thu được dung dịch thử để định tính

Tớp mỏng: TLC siliea gel 60 F254 Merek, hoạt hóa ở 105°C trong 1 giờ trước khi

sử dụng

Lượng chấm mẫu: 6ul dung dịch mẫu thử,

Hệ dưng môi sắc Ip: Ethylacetat: isopropanol: nước ( 6,5 : 2,5 : ]) Phát hiện: Quan sáU ánh sáng thường,

Trang 23

Kết quả: Hình 4.3.D

6.Định lượng:

Phương pháp

Chuẩn bị mẫu:

-_ Mẫu thử; Cân I,0 g được liệu đã xay nhỏ, chiết với 25 ml methanol (x 3 lần), siêu âm 30 phút mỗi lần Gạn và gộp phần dịch chiết và thêm methano] vừa

đủ 100ml, Pha loãng tiếp với mcthanol để thu được dung dịch có tỷ lệ lg dược liệu

trong 500ml dung môi Lọc qua giấy lọc, bỏ 2ml dịch lọc đầu, lầy 2 — 3 mJ dịch lọc

tiếp theo để chấm sắc ký

- _ Mẫu đôi chiến: Dung địch geniposide 0,20 mg/ml trong methanol

Lớp mỏng: HPTLC Silica gel 60 F254 Merck kích thước kính 20 x 10 em, hoạt hóa ở 105C trong 1 giờ trước khi sử dụng

Chấm mẫu: Chấm thang chudn: 2ul dul x 2, 6ul , 8a) va 12); Mau thir: 4- 10pl (cham nhắc lại mẫu thử 2 -3 lần) Chấm cách mép kính 15 mm (chiều X), 8 mm (chiêu Y), chiều rộng vết (mm), khoảng cách giữa các vết (10mm)

Hệ dụng môi sắc lý: Ethylacetal: isopropanol: nude { 6,5 : 2,5: 1) để bình sắc ký

bão hoà dung môi 30 phút

Phái hiện: Đo TLC scanning, hap thy, 4 235nm

Cách tiễn hành: Kính sau khi đã triển khai với hệ dung môi nêu trên, cao 85mm, lấy

ra, để bay hơi hết dung môi trong hết, thời gian 30 phút Tiến hành đo TLC

scanning trên máy CAMAG.TLC SCANNER3, bước sóng À 235 nm, tốc độ quét

20mm/giay, chế độ do remission Chuong trình được thực biện dưới sự điều khiển của phân mềm wintcats Đọc kết quả đo trên máy Tính bàm lượng % geniposide co

trong được liệu được tính theo công thức sau :

m.V.100.100 X%=

v.1000 P (100-B }

Trong đó :

X% : Hàm lượng % geniposide trong được liệu khô tuyệt đôi

m: Lượng mẫu thử đo được (wg) (kết quả trung bình của 2-3 lần nhắc lại)

+: Lượng mẫu thử cham trén may (1) V: Thể tích dịch chiết mẫu thử (mi) P: Khối lượng được liệu đem cân (g)

Trang 24

Bang 4.2 Két qua dinh long geniposide trong duge ligu chi ter

TT | Kptiguman = | PA geniposide brome ai ot

Trang 25

Geniposide Boe Được liệu chỉ từ cn

Hình 4.4 Sắc ký đồ TLC scanning va đồ thị xác định khoảng tuyến tính

Định lượng geniposide trong được liệu chị tử (Fructus Gardeniae)

Trang 26

Na | 2 34 Nal 23 4 Nal 234

Hình 4.5 Sắc ký đỗ định tính thành phần nhóm hoạt chất được liệu cốt toái bổ

(Rhizoma Drynariae)

Ký hiệu: Naringin (Na): Các mẫu cốt toái bổ nghiên cứu (vết 1- 4)

SKĐ định tính flavonoid và hợp chất phenolie (Hình A/UV366, Hình, B/VIS và Hình G¡ VI§)

6 Định lượng:

Phương pháp

Chuẩn bị mẫu:

- Mẫu thử: 1ø dược liệu đã được xay nhỏ, chiết với 15ml hỗn hợp methano] và

nước( 4:1 ), siêu âm 20 phút, làm nhắc lại như vậy 3 lần Gộp dịch chiết, thêm dung môi vừa đủ 50 ml, lọc qua giấy lọc, bỏ 1-2 ml địch lọc đầu, lầy 2-3ml địch tiếp theo để chấm sắc ký

~_ Mẫu đối chiếu: Dung dich naringin 0,1mg/ml trong methanol

Lop mỏng: HPTLC Siliea gel 60 F254, Merek, kích thước kính 20 x 10 cm, hoạt

hóa ở 105°C trong 1 giờ trước khi sử dụng

Chấm mẫu: Chim thang chuẩn: 0,341, 0,601 x 2, 0,90), 1,/2nÏ và 1,5Hl; Mẫu thử: 8-

14pl (chấm nhắc lại mẫu thử 2 -3 lần) Chấm cách mép kính 15 mm (chiều X), 8

am (chiều Y), chiều rộng vết (§mm), khoảng cách giữa các vết (10mm)

Hệ dụng môi sắc ký: Toluen: ethylacctat: acid formic: nước (1:12:2,5:3) Phát hiện: Đo TUC-scanning, huỳnh quang , 3 366nm va kinh loc K 400

Cách tiến hành: Kính sau khi triển khai sắc ký, lấy ra để khô 30 phút, nhúng dung,

dịch nhôm chlorid 2% trong ethanol, để khô 30 phút, nhúng tiếp dung dịch PEG 400 10% trong ethanol, để khô tiếp 30 phút Tiến hành do TLC scanning trén máy

Trang 27

CAMAG.TLC SCANNER3, huỳnh quang, bước sóng À 366 nm, kinh loc K 400, tốc độ quét 20mm/giây, chế độ do remission Chương trình được thực hiện dưới sự

diều khiển của phần mềm wintcats Đọc kết quá đo trên máy Tính hàm lượng %

naringin có trong được liệu cốt toái bỏ được tính theo công thức sau:

m.V.100.100 X%=

v.1000 P (100-B) Trong đó :

X% : Hàm lượng % naringin trong được liệu khô tuyệt đối

Trang 29

DiEP HA CHAU BANG (Herba phyllanthi amari)

1 Nguồn gốc: Toàn cây đã phơi hay sấy khô của cây diệp hạ châu Phyllanthus

amarus Lscham, Et Thonn,, ho thầu dau Euphorbiaceae

2, Thu hái và xử lý mẫu: Thu hải toàn cây vào mùa hẻ, hoặc mùa thu, rửa sạch

thái ngắn, để khô (có hút âm) ở nhiệt độ phòng 25 - 28" C

3, Mô tả: Cây thảo cao từ 30- 80 cm, thân tròn màu xanh lụe nhạt, nhẫn I.á mọc so

le, xếp thành hai dây trông như lá kép hình lông chim Phiến lá hình bầu dục hẹp,

cuống lá ngắn, mép lá nhẫn 4 Đặc điểm vi học:

* Dặc điểm vi phẫu: Mặt cất thân tròn Từ ngoài vào trong có lớp biểu bì cấu tạo từ một hàng tế bào nhỏ xếp đều đặn Mô mềm gồm các tế bảo lớn tròn hoặc đa giác Bo soi cellulose & than non va lignan hoa nhiều ở thân già Vòng gỗ mỏng cấu tạo

từ các mạch gỗ gồm 5-7 tế bào Mô mềm ruột gồm các tế bào to tròn, đa giác thành

mỏng

* Đặc điểm bột được li

manh pl

các bó sợi kèm mảnh mạch, mảnh biểu bì lá mang lỗ khí, bó sợi Những mảnh mach

: Bột màu xám, vị đắng nhẹ Soi dưới kính hiển vi thấy

n lá mang biểu bì và mô giậu Những mảnh vỏ hạt, mảnh biểu bì thân,

soi dưới kính hiển vi có độ phóng đại lớn có thể thấy bề mặt vỏ hạt mang các chẩm nhỏ 5 Định tính: Dinh tinh lignan Chuẩn bị mẫu: -_ Mẫu thử: 0.5g dược liệu đã được tán nhỏ chiết với 10ml methanol, siêu âm 30 phút, gạn lọc lấy phản địch chiết để chấm sắc ký

-_ Mẫu đối chiếu: Dung dịch phyllanthin 0,05mg/ml trong methanol

Lớp mỏng: TUC silica gel 60 E254 Merck, hoạt hóa lớp móng ở 105'C trong 1 giờ trước khi sử dụng

Lượng chấm: 5 ¡l mẫu đối chiếu và 10H mẫu thử

Hệ dụng môi sắc ký: n.Hexan: ethylacetat (2:1),

Trang 30

Lop méng: TLC silica gel 60 F254 Merek, Hoat héa lép mỏng ở 105°C trong | gid

trước khi sử dụng,

Luong cham

pl mau đổi chiếu và 10p! mẫu thử, Hệ dụng môi sắc lý: Toluen : ethylacctat (95 :5),

Phát hiện:: DragendofF

Kết quả: Hình 4.7.B

Dinh tinh hyp chải phenolic Chuẩn bị mẫu:

Mẫu thử: 0,5 dược liệu đã được tán nhỏ, chiết với 10ml methanol 80%, siêu

âm 30 phút, sạn lọc lấy phần dịch chiết để chấm sắc ký ~ Mẫu đối chiếu: Rutin 0,5mg/ml methanol

Lop méng: TLC silica gel 60 F254 Merck

Lượng chấm: 5 tì mẫu déi chiéu va 10u] mẫu thử

Hệ dụng môi sắc ký: HDM 3: Ethylacetat: acid acetic : acid formie : nước (10:1:1:2) Phát hiện: Fast blue salt

Kết quả: Hình 4.7.C

Định tính flavonoid

Chuẩn bị mẫu:

-_ Mẫu thử: 0,5g được liệu đã được tán nhỏ, chiết với 10ml methanol 80%, siêu

âm 30 phút, gạn lọc lấy phần địch chiết để chấm sắc ký

- Mau déi chiéu: Rutin 0,5mg/ml methanol

Lop méng: TLC silica gel 60 F254 Merck

Lượng chấm: 5 pl mau đối chiếu va 10pl mau thử

Trang 31

Ru1 234567 Ru1234567

c D1 De

Hình 4.7, Sắc ky đồ định tính thành phần nhóm hoạt chất được liệu

diệp hạ châu dang (Herba Phyllanthi amari)

Ký hiệu: Rutin (RO; Phyllanthin (P); Cac mẫu diệp hạ châu đắng nghiên

cứu (vết 1-5)

SKD định tính nhóm lignan (Hinh A/ VIS), aicaloid (Hinh B/VIS), hop chất phenonic (Hinh C/VIS), flavonoid (Hinh D/UV366)

SKD TLC scanning hợp chất phenonic/ digp ha chau ding , 2 520nm

(Hin, C1); SKD TLC scanning rutin va diép ha chau dang , huynh quang À 460nm / K 549 (Hình DI và D2)

Trang 32

6 Định lượng: Phương pháp

Chuẩn bị mẫu:

Mẫu thử: Cân 0,5 g dược liệu đã xay nhỏ, chiết với 20ml methanol (x 2 lần),

siêu âm 30 phút mỗi lần Gạn, gộp dịch chiết, thêm dung môi vđ 50ml, lọc, bỏ Im!

dịch đầu, lấy 2-3ml dung dịch tiếp theo để chấm sắc ký

- _ Mẫu đối chiếu: Dung địch phyllanthin 0.05mg/ml trong mcthanol

Lớp móng: TLC plate silica gel 60 F254 Merek, kích thước kính 20 x 10 em, hoạt hóa lớp mỏng & 105°C trong 1 giờ trước khi sử dụng,

Chấm mẫu: Cham thang chuan: 2ul , 4ul x 2, 8yl, 12yl va 16,0; Mẫu thử: 4- 6p, chấm 2-3 lần nhắc lại Chấm cách mép kính 15 mm (chiéu X), 8 mm (chiéu Y), chiều rộng vết (8mm), khoảng cách giữa các vết (10mm)

Hệ dụng môi sắc ký: nHexan : ethylacetat (2: 1) để bình sắc ký bão hoà dung mỗi 20 phút Phát hiện: TLC scanning, hấp thụ , A 610am Tạo dẫn xuất hoá với dung dịch acid sulphuric 10% trong ethanol, do

Cách tiển hành: Kính sau khí đã triển khai sắc kỹ đến 85mm được lấy ra, làm khô

30 phút, nhúng thuốc thử acid sulphuric 10% trong ethanol, để khô 30 phút, sấy ở

105°C trong 20 phút Tiển hành đo TUC scanning trên máy CAMAG.TLC

SCANNER3, bước sóng ^ 610 nm, tốc độ quét 20mm/giây, chế độ do remission

Chương trình được thực hiện dưới sự điều khiển của phần mềm wintcats Đọc kết

quả đo trên máy Tính hàm lượng % phyllanthin và % lignan tổng số (theo

phyllanthin) có trong dược liệu được tính theo công thức sau:

m.V.100.100 XW= _—_—

9.1000 P (100 - B)

Trong đó : -

X% : Ham lượng % hoạt chất trong được liệu khô tuyệt đối

mm: Lượng mẫu thử đo được (ug) (kết quả trung bình của 2-3 lần nhắc lại)

: Lượng mẫu thử chấm trên máy (,11)

V: Thể tích dịch chiết mẫu thử (ml)

P; Khối lượng dược liệu đem cân (g) B: Độ ấm của dược liệu

Két qua:

Trang 34

Đồ thị xác định khoảng tuyến tính Hình 4.8 Sắc ký đồ TLC seanning và đồ thị xác định KTT

Định lượng phyllanthin trong được liện diệp hạ châu đắng (Herba Phyllanthi amari)

Trang 35

DIA COT BI (Cortex Lycii)

1 Nguồn gốc: Vỏ rễ phơi hay sấy khô của cây câu ky Lycium chinense Mill., họ cà (Solanaceae)

2 Thu hái va xử lý mẫu: Thu hoạch vào đầu xuân và cuối thu, đảo lấy rễ, rửa sạch, bóc lẫy vỏ, phơi hoặc sấy khô

3 Mô tả: Dược liệu cuộn tròn hình ống nhỏ hoặc hình máng Mặt ngoài màu vàng

xám đến vang nâu, sii si, với những đường vân nứt đọc, không đều, đễ bóc; mặt

trong mẫu vàng nhạt đến vàng xám, tương đối nhẫn có vân dọc nhỏ Chất nhẹ và

giòn, đễ bẻ gẫy, mặt gẫy không phẳng, lớp ngoài màu vàng nâu, lớp trong mâu trắng xám Mùi nhẹ, vị hơi ngọt sau đẳng

4 Đặc điểm vi học:

* Đặc điểm vi phẫu: Mặt cắt ngang dược liệu là dải hình cung Dưới kinh hiển vi nhìn từ ngoai vao trong thay: Lop ban gdm 6-7 hàng tế bào xếp lộn xộn Mô mềm

vỏ là những tế bào thành mỏng hình đa giác xếp lộn xôn Bó libe cấp hai chiếm

khoảng 2/3 vi phẫu có hình bó tháp Tia ruột gồm 2-3 hàng tế bào Các tế bảo chứa

đầy tỉnh thể calci oxalat dạng cát TẦng phát sinh libe-gỗ gồm 2-3 hàng tế bào đều

đặn

* Đặc điểm bột dược liệu: Bột vỏ rễ địa cốt bì màu vàng nâu, mùi nhẹ, vị đặc biệt

Soi dưới kinh hiển vi thấy: Mảnh bản, mảnh mô mềm Rất nhiều hạt tỉnh bột hình tròn tập trung thành từng khối trong các mảnh mô mềm hay đứng riêng lẻ, đường,

kính hạt tỉnh bột 0,01-0,02mm Tỉnh thể calci oxalat dạng cát khó nhìn dưới kính

hiển vi thường, để nhìn hơn dưới kính hiển vĩ phân cực

5 Định tính:

Dinh tink coumarin

Chuẩn bị mẫu:

- Mẫu thử: 2g dược liệu đã cắt nhỏ, chiết với 10ml methanol, siêu âm 30 phút,

gan, lọc lấy phản dịch chiết, dùng để chấm sắc ký Lượng chấm 8-16 pl

Miu déi chiéu: Dung dich scopoletin 0,04mg/ml trong methanol Lugng chấm

6ml

Lép méng: TLC silica gel 60 F254 Merck, hoat hóa bản mỏng ở 105°C trong | gio

trước khi sử dụng

Hệ dung môi sắc lý: Ethylacetat : methanol : nước (10: 1:1)

Phái hiện: - Quan sát UV 366nm —> Hình 4.9.A

- Dung dich KOH/ethanol, UV 366nm — Hinh 4.9.B

Két qua: Hinh 4.9 (A, 8)

Trang 36

103 Bel 23456 Si 12345 Hình 4.9 Sắc ký đồ định tính thành phần nhóm hoạt chất dược liệu địa cốt bì (Cortex Lycii)

Scopoletin (Se); Betain (Be); B sitosterol (Si); Các mẫu dược liệu địa cốt

bì thu hái (vết 1- 5); Hương gia bì (vết 6)

SKĐ định tính coumarin (Hình A/UV366, Hình B/UV366); SKĐ định tinh

alcaloid (Hinh.C/VIS); SKB dinh tinh terpcnoid (Hinh D/ VIS); SKB TLC

scanning / scopoletin va DL dia cét bì, huỳnh quang À 366nm /K 540(Hình Alvà

Trang 37

Dinh tinh atcaloid

Chuẩn bị mẫu:

- Mẫu thứ: 2g dược liệu đã được cất nhỏ, chiết với 30ml hỗn hợp methanol và

nước (4:1), siêu âm 30 phút, tiếp tục đun hỗi lưu trên cách thủy 30 phút Dễ nguội,

gan lay phan dich chiét, lam bay hoi dụng môi đến cạn Hòa cắn thu được trong 5m]

methanol cé chira 0,5% acid hydrochloric, lọc qua giấy lọc, bô Iml địch lọc đầu, lấy 3ml địch tiếp theo dùng dé chấm sắc ký Lượng châm 10 ul

Mẫu đối chiếu: Dung dich betain 4 mg/ml trong methanol I.ugng cham Spl

Lớp mỏng: TLC silica gel 60 F254 Merek, bản nhựa

Hệ dụng môi sắc lý: n.Butanol ; acid hydrochlorid : nước (8:2: 1) Phát hiện: Dragendo†f có acid hydrochlorid Kết quả: Hình 4.9.C Định tính terpenoid Chuẩn bị mẫu:

- Mẫu thử: 2g được liệu đã cắt nhỏ, chiết với 10ml methanol, siéu 4m 30 phiit,

gan, lọc lây phần dịch chiết, dùng để chấm sắc ký Lượng chấm 8-16 ul Mẫu đối chiều: Dung địch sitosterol 0,Lmg/ mÍ Lượng chấm 5/1

Lop mong: TLC silica gel 60 F254 Merck, hoat héa ban mong ¢ 105°C trong 1 giờ Hệ đụng môi sắc ký: n.Hexan ; cthylacetat ( 2:1)

Phái hiện: Liebermann- Burchard (TT), quan sát / VIS

Kết quả : Hình 4.9,

6 Định lượng: Phương pháp Chuẩn bị mẫu

-_ Mẫu thử: Cân I g dược liệu đã được xay nhỏ, thêm 20 ml methanol, siév am

30 phút, tiếp tục chiết nóng trên cách thủy ở 66°C trong 30 phút x 2 lần Gộp địch

chiết, cô trên cách thuỷ đến cạn Hòa cắn thu dược trong vừa đủ 5ml methanol, lọc bỏ 1ml địch lọc đầu, lấy 2ml dịch lọc tiếp theo để chấm sắc ký

- Mẫu đối chiếu: Dung dịch B sitosterol 0,1 mg/ml trong methanol

Lép méng: HPTLC Silica gel 60 F254 Merck, kích thước kính 20 x 10 cm, hoạt hóa

bản mỏng ở 105°C trong 1 giờ trước khi sử dung

Chấm mẫu: Châm thang chuẩn: 2u], 44] x 2, 6ml, 8pl, và 1Oul; mau thử 4 6ml (chấm nhắc lại mẫu thử 2 - 3 lần) Châm cách mép kính 15 mm (chiều X), 8 mm (chiều Y), chiều rộng vết (8mm), khoảng cách giữa các vết (10mm)

Hệ dụng môi xắc ký: n.Hexan : ethylacetat (2: 1), để bão hoà dung môi sắc ký 20

phút

"Phái hiện: Đo TLC scanning, h4p thụ, ÀA 570nm

Cách tiến hành: Kính sau khi đã triển khai với hệ dung môi nêu trên, cao 85mm, lấy ra, để bay hơi hết dung mdi trong hốt, thời gian 30 phút Nhúng với thuốc thử acid

Trang 38

sulphuric 10%/ ethanol (V/V), để khô, sấy ở 105°C trong 10 phút Tiến hành đọ

TLC scanning trén may CAMAG.TLC SCANNER3, bước sóng À 570 nm, tốc độ quét 20mmgjây, chế độ do remission, thời gian đo trong khoảng 15- 30 phút sau

khi sấy kính Chương trình được thực hiện dưới sự điều khiển của phần mềm

wirtcats Đọc kết quả đo trên máy Tính hàm lượng % sitosterol có trong dược

liệu được tính theo công thức sau:

m.V.100.100 X%=

9.1000 P(100- B)

Trong đó :

X% : Ham lượng % hoạt chất trong được liệu khô tuyệt dối

m: Lượng mẫu thử do được (ug) (kết quả trung bình của 2-3 lần nhắc lại)

0: Lượng mẫu thử chấm trên máy (ul)

V: Thể tích dịch chiết mẫu thử (ml)

P: Khối lượng được liệu đem cân (g)

Trang 40

KIM NGAN HOA (Flos Lonicerae)

1, Nguén gốc: Nụ hoa có lẫn một số hoa phơi hay sấy khô của cây kim ngân

Lonicera japonica Thunb., ho kim ngân Caprifoliaceae

2 Thu hái và xử lý mẫu: Hải nụ hoa có lẫn ít hoa đã nở, loại bỏ tạp chất, Làm khô ở nhiệt độ phòng (có máy hút Am)

3 Mô tả: Nụ hoa hình ống hơi cong queo, dai 1-Scm, dau to, dudng kính khoảng

0,2-0,5cm Mặt ngoài màu vàng đến nâu, phủ đầy lông ngắn Phía dưới ống tràng có

5 lá đài nhỏ, màu lục, 5 nhị và 1 vời nhuy Mùi thơm nhẹ, vị hơi đẳng, Hoa đã nở dài từ 2-5cm, tràng chia thảnh hai môi cuộn ngược lại Môi trên xẻ thành 4 thuỳ, môi đưới nguyên Nhị và vòi nhuy thường thò ra ngoài tràng hoa

4 Đặc điểm vi học:

Đặc điểm bột được liệu: Bột màu vàng nhạt, có mùi thơm nhẹ, vị hơi đẳng Soi kính

Những mảnh cảnh hoa mang tỉnh thê calxi oxalat hình cầu gai Manh

Ja bắc mang lông che chở Lông che chở đơn bao thanh day, nhin Léng tiét, Manh mạch dạng xoắn Tỉnh thé calxi oxalat hình cầu gai Hạt phấn tròn, kích thước khoảng 0,07-0,08mm $ Định tính: Dinh tinh din xuat acid caffeic Chuẩn bị mẫu:

- Mẫu thử: 9,5 g được liệu cắt nhỏ, chiết siêu âm với 10 ml methanol, thi gian

30 phút, dịch chiết thu được dùng để chấm sắc ký Lượng chấm 2 ~4 u - Mẫu đối chiếu; Acid cafTeic 0,5 mg/ml methanol, lượng chấm 4pl

Lớp mong: TLC silica gel 60 F254 Merck, hoat hoa kinh & 105°C trong 1 giờ trước

khi sử dụng

Hệ dung môi sắc ký: HDM 1: Ethylacetat : acid [omic : nước (8:1 :1) Phát hiện:

Quan sát /UV 366nm —> Hình 4.])(A)

NP/PEG (LŨ) quan sáư UV366nm-> Hình 4.11(B)

Kết quả : Hình 4.11 A.B)

Định tính terpenoid Chuẩn bị mẫu:

~ Mẫu thử: 0,5 g được liệu cắt nhỏ, chiết siêu âm với 10 ml methanol, thời gian

30 phút, dịch chiết thu được dùng để chấm sắc ký Lugng cham 2—4 ul

Mẫu đối chiếu: B sitosterol 0,5mg/ ml methanol, lượng chấm 4 yl

Lép méng: TLC silica gel 60 F254 Merck, hoạt hóa bản mông ở 105C trong 1 gid

trước khi sử dụng

Hệ đụng môi sắc lgý: n.Hexan : ethylacetat (2 : 1 }