Nghiên cứu chiết xuất và khảo sát hoạt tính miễn dịch của nhóm hoạt chất saponin từ lá đu đủ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI - BÙI THỊ THANH PHƢƠNG NGHIÊN CỨU CHIẾT XUẤT VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH MIỄN DỊCH CỦA NHĨM HOẠT CHẤT SAPONIN TỪ LÁ ĐU ĐỦ LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC PGS.TS ĐỖ THỊ HOA VIÊN Hà Nội - 2014 LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn này, ngồi cố gắng nỗ lực thân, tơi nhận ủng hộ, giúp đỡ tận tình thầy giáo, gia đình bạn bè Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Đỗ Thị Hoa Viên - Viện Công nghệ sinh học & Công nghệ thực phẩm, Trường Đại học Bách khoa Hà Nội tận tình bảo tơi suốt q trình thực luận văn Tơi xin chân thành cảm ơn tới thầy cô giáo thuộc Viện Công nghệ sinh học & Công nghệ thực phẩm – Trường Đại học Bách khoa Hà Nội giảng dạy giúp đỡ tơi suốt q trình học tập thực luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè tạo điều kiện, quan tâm, động viên góp ý cho tơi suốt q trình học tập, nghiên cứu hồn thành luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 29 tháng năm 2014 Học viên Bùi Thị Thanh Phƣơng LỜI CAM ĐOAN Tôi Bùi Thị Thanh Phương xin cam đoan nội dung luận văn với đề tài “Nghiên cứu chiết xuất khảo sát hoạt tính miễn dịch nhóm hoạt chất Saponin từ đu đủ” cơng trình nghiên cứu sáng tạo tơi thực hướng dẫn PGS.TS Đỗ Thị Hoa Viên Các số liệu, kết trình bày luận văn hồn tồn trung thực chưa công bố công trình khoa học khác Hà Nội, ngày 29 tháng năm 2014 Học viên Bùi Thị Thanh Phƣơng Bùi Thị Thanh Phương Công nghệ sinh học MỤC LỤC MỞ ĐẦU PHẦN 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan đu đủ 1.1.1 Các giống đu đủ đƣợc trồng phổ biến Việt Nam tỉnh đồng Bắc Bộ 1.1.2 Thành phần hóa học giá trị dinh dƣỡng, giá trị sử dụng cuống, đu đủ 1.2 Tổng quan nhóm chất saponin 12 1.2.1 Cấu tạo hóa học tính chất hóa, lý saponin 12 1.2.2 Hoạt tính sinh, dƣợc học saponin 20 1.2.3 Các phƣơng pháp chiết xuất 21 1.2.4 Các phƣơng pháp phân tích định tính định lƣợng 23 1.2.5 Phân bố tự nhiên đu đủ 25 1.3 Hoạt tính miễn dịch 25 1.3.1 Cơ sở lý thuyết 26 1.3.2 Các phƣơng pháp miễn dịch thông dụng 27 PHẦN 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 34 2.1 Nguyên liệu 34 2.2 Hóa chất 34 2.3 Thiết bị 34 2.5 Phƣơng pháp nghiên cứu 35 2.5.1 Xử lý nguyên liệu 35 2.5.2 Nghiên cứu lựa chọn dung môi chiết xuất thích hợp 35 2.5.3 Lựa chọn phƣơng pháp chiết xuất 36 2.5.4 Phƣơng pháp loại bỏ hợp chất không phân cực khỏi nguyên liệu ……… ……………………………………………………………………………36 2.5.5 Các bƣớc chiết cao saponin tồn phần thơ nguyên liệu đu đủ khô……………………………………………………………………………… 38 Luận văn Thạc sĩ kỹ thuật 2012-2014 Bùi Thị Thanh Phương Công nghệ sinh học 2.5.6 Lựa chọn điều kiện chiết xuất 36 2.5.7 Phƣơng pháp định tính xác định saponin 40 2.5.8 Phƣơng pháp sắc kí mỏng 40 2.5.9 Phƣơng pháp định lƣợng saponin (phƣơng pháp cân khối lƣợng không đổi) ……………………………………………………………………………… 40 2.5.10 Phƣơng pháp thử nghiệm hoạt tính miễn dịch 41 PHẦN 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 43 3.1 Lựa chọn dung mơi chiết xuất thích hợp 43 3.2 Lựa chọn phƣơng pháp chiết xuất hợp chất saponin từ đu đủ 43 3.3 Kết khảo sát điều kiện chiết xuất 43 3.3.1 Tỷ lệ nguyên liệu/dung môi 43 3.3.2 Thời gian chiết xuất 45 3.3.3 Nhiệt độ chiết xuất 46 3.4 Kết định tính saponin 47 3.4.1 Thí nghiệm tạo bọt 47 3.4.2 Phản ứng tạo màu 50 3.4.3 Kết định tính phƣơng pháp sắc kí mỏng 51 3.5 Kết định lƣợng saponin 53 3.6 Kết thử nghiệm hoạt tính miễn dịch 56 PHẦN 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 58 TÀI LIỆU THAM KHẢO 60 Tài liệu tiếng việt 60 Tài liệu tiếng anh 60 Tài liệu internet 62 Luận văn Thạc sĩ kỹ thuật 2012-2014 Bùi Thị Thanh Phương Công nghệ sinh học DANH MỤC HÌNH Hình 1: Cây đu đủ Hình 2: Khung Olean 14 Hình 3: Khung ursan 15 Hình 4: Khung lupan 15 Hình 5: Khung hopan 16 Hình 6: Khung Dammaran 16 Hình 7: Khung Lanostan 17 Hình 8: Khung Cucurbitan 17 Hình 9: Đường chuẩn dùng định lượng protein đặc hiệu khuyếch tán đơn, kỹ thuật Mancini 29 Hình 10: Quy trình tách tế bào lymphơ khỏi máu tồn phần 32 Hình 1: Thí nghiệm tạo bọt xác định có mặt saponin đu đủ 48 Hình 2: Thí nghiệm tạo bọt xác định loại saponin đu đủ 49 Hình 3: Phản ứng tạo màu saponin toàn phần 51 Hình 4: Bản sắc kí mỏng saponin phân đoạn chất chiết 52 Hình 5: Hàm lượng cao saponin striterpenoid phân đoạn chất chiết 54 Hình 6: Quy trình tách chiết saponin tồn phần quy mơ phịng thí nghiệm 55 Luận văn Thạc sĩ kỹ thuật 2012-2014 Bùi Thị Thanh Phương Công nghệ sinh học DANH MỤC BẢNG Bảng Kết ảnh hưởng tỷ lệ nguyên liệu/dung môi đến trình chiết xuất 44 Bảng Kết ảnh hưởng thời gian trình chiết xuất 45 Bảng 3 Kết ảnh hưởng nhiệt độ đến trình chiết xuất 46 Bảng Kết thí nghiệm tạo bọt cao saponin đu đủ 49 Bảng Khả kích thích lymphơ tổng số cao saponin 56 Luận văn Thạc sĩ kỹ thuật 2012-2014 Bùi Thị Thanh Phương Công nghệ sinh học MỞ ĐẦU Cây đu đủ (có tên khoa học Carica papaya L.) loại phổ biến Việt Nam; từ miền Nam đến miền Bắc, từ vùng đồng đến miền núi, đâu trồng đu đủ Đã từ lâu đủ đủ biết đến loại giá trị dinh dưỡng cao mà cịn có tác dụng bảo vệ sức khỏe tốt Trong số thuốc dân gian nước ta đu đủ sử dụng để chữa số bệnh ho, tiếng, nước sắc đu đủ dùng gột vết máu vải, rửa vết thương… Thời gian gần đây, số thuốc sử dụng nước chiết từ đu đủ để hỗ trợ điều trị ung thư nhiều người áp dụng Bài thuốc dân gian sử dụng hiệu ông Stan Sheldon vùng Gold Cost, Queensland – Úc từ năm 1962 đến năm 1978 phổ biến tạp chí Gold Cost Buletin (Harald W Tietze, 1997) Tại Việt Nam, số người sử dụng dịch chiết đu đủ để điều trị số bệnh ung thư có trường hợp khỏi bệnh kéo dài thời gian sống Bên cạnh có trường hợp sử dụng thuốc lại không cho kết khả quan Ngày nay, khoa học công nghệ ngày phát triển số nước tiên tiến giới như: Nhật Bản, Mỹ, Úc… có nhiều nghiên cứu, thí nghiệm có cơng bố kết hoạt tính chống ung thư từ nước chiết đu đủ kết thực phịng thí nghiệm mà chưa có quy trình thử nghiệm người Chính thế, việc sử dụng nước chiết từ đu đủ việc hỗ trợ điều trị ung thư thể người cịn câu hỏi mà chưa có câu trả lời Việc khai thác hoạt chất có nguồn gốc thiên nhiên để tạo chế phẩm có tác dụng hỗ trợ điều trị ung thư ngày quan tâm Việt Nam nhiều nước giới Trên sở nghiên cứu nước nước cho thấy đu đủ có chứa nhiều vitamin, acid, hợp chất alkaloid, flavonoid, saponin… Tác dụng sinh học saponin người nhận biết ứng dụng từ lâu qua trình sử dụng thảo dược kháng sinh, chống Luận văn Thạc sĩ kỹ thuật 2012-2014 Bùi Thị Thanh Phương Cơng nghệ sinh học nấm, phịng điều trị bệnh cao cholesterol máu, diệt côn trùng, ứng dụng đời sống… Những nghiên cứu xác định saponin có tác dụng ức chế phịng số bệnh ung thư, tăng cường khả miễn dịch… Để góp phần làm sáng tỏ tác dụng hỗ trợ điều trị ung thư đu đủ, chọn nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu, chiết xuất khảo sát hoạt tính miễn dịch nhóm hoạt chất saponin từ đu đủ” Đề tài thực với mục đích nội dung sau: Mục đích đề tài: Đưa phương pháp chiết xuất, điều kiện chiết xuất, tối ưu hóa yếu tố ảnh hưởng đến q trình chiết từ đưa điều kiện chiết xuất thích hợp khảo sát hoạt tính miễn dịch nhóm hoạt chất saponin từ đu đủ Nội dung đề tài: - Lựa chọn phương pháp chiết xuất, xác định điều kiện chiết xuất tối ưu hóa yếu tố ảnh hưởng đến trình chiết xuất hợp chất saponin đu đủ - Phân tích định tính, định lượng saponin đu đủ - Thử nghiệm hoạt tính miễn dịch hợp chất saponin chiết xuất từ đu đủ Luận văn Thạc sĩ kỹ thuật 2012-2014 Bùi Thị Thanh Phương Công nghệ sinh học PHẦN 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan đu đủ: 1.1.1 Các giống đu đủ đƣợc trồng phổ biến Việt Nam tỉnh đồng Bắc Bộ: Cây đu đủ có nguồn gốc từ vùng nhiệt đới châu Mỹ, sau phổ biến khắp nơi Tại Việt Nam, đu đủ trồng nhiều tỉnh đồng Hà Tây, Hà Nam, Hưng Yên, Tun Quang, Vĩnh Phúc, Bình Dương, Tiền Giang, Sơng Bé tỉnh Tây Nguyên, dọc theo sông, loại đất phù sa, dốc tụ, phù sa cổ nhiều loại đất khác Diện tích trồng đu đủ nước ước khoảng 10000 – 17000 với sản lượng khoảng 200–350 ngàn Hiện nước ta sâu bệnh, úng nước điều kiện thời tiết không thuận lợi cho việc hoa kết trái nên suất đu đủ trung bình khoảng 20 tấn/ha Hình 1: Cây đu đủ Luận văn Thạc sĩ kỹ thuật 2012-2014 Bùi Thị Thanh Phương Cơng nghệ sinh học nhau, có saponin triterpenoid Nếu ống pH=13 có cột bọt cao nhiều so với ống pH=1, có saponin steroid - Tiến hành thí nghiệm sau: + Lấy ống nghiệm cỡ nhau, cho vào ống nghiệm vài mg cao saponinbutanol dược liệu chiết + Cho vào ống thứ 5ml dung dịch NaOH 0,1N (pH=13), cho vào ống thứ hai 5ml dung dịch HCl 0,1N (pH=1) lắc mạnh ống nghiệm theo chiều dài ống khoảng 30 giây Kết thí nghiệm thể hình 3.1, 3.2 bảng 3.4 Hình 1: Thí nghiệm tạo bọt xác định có mặt saponin đu đủ Luận văn Thạc sĩ kỹ thuật 48 2012-2014 Bùi Thị Thanh Phương Công nghệ sinh học Hình 2: Thí nghiệm tạo bọt xác định loại saponin đu đủ Bảng Kết thí nghiệm tạo bọt cao saponin đu đủ Thời gian Kết tạo bọt (phút) nước Kết tạo bọt môi trường: HCl 0,1N NaOH 0,1N phút + + + 15 phút + + + 30 phút - + + Dấu (+): phản ứng có xảy Trong mơi trường nước ngun liệu tán nhỏ đu đủ tạo bọt cao khoảng 1cm bền khoảng 15 phút Như xác định đu đủ tán nhỏ có chứa saponin Luận văn Thạc sĩ kỹ thuật 49 2012-2014 Bùi Thị Thanh Phương Công nghệ sinh học Trong môi trường axit môi trường kiềm cột bọt ống nghiệm cao bọt có độ bền khoảng 30 phút Vậy xác định saponin nguyên liệu đu đủ thuộc nhóm triterpenoid 3.4.2 Phản ứng tạo màu: Người ta cịn xác định saponin thuộc nhóm triterpenoid hay nhóm steroid phản ứng cổ điển áp dụng nhiều phản ứng Lieberman Buchard hay gọi phản ứng tạo màu Theo lý thuyết saponin triterpenoid phản ứng cho màu nâu đỏ, cịn saponin steroid phản ứng cho màu xanh Tiến hành phản ứng: cao saponin toàn phần thu đu đủ hòa tan cồn 96o Các ống nghiệm sạch, cho vào ống nghiệm 1ml dung dịch saponin tồn phần, sau thêm vào ống 1ml ahydrid acetic, 1ml chloroform giọt H2SO4 đặc Lắc ống nghiệm cho phản ứng xảy Luận văn Thạc sĩ kỹ thuật 50 2012-2014 Bùi Thị Thanh Phương Cơng nghệ sinh học Hình 3: Phản ứng tạo màu saponin toàn phần Kết thí nghiệm tạo màu: sau phản ứng xảy cho dung dịch có màu nâu đỏ có tượng tỏa nhiệt mạnh Như ta xác định saponin chiết đu đủ saponin triterpenoid 3.4.3 Kết định tính phƣơng pháp sắc kí mỏng: - Bản mỏng Silicagel 60F254 - Mẫu saponin tồn phần hịa tan cồn 40o - Tiến hành chấm sắc kí với hệ dung mơi là: Cloroform: methanol: nƣớc cất = 65: 35: Bản sắc kí sau chạy cách mép khoảng 1cm lấy để khơ khơng khí Tiếp đến sử dụng thuốc thử vanilin 2% H2SO4 đặc làm dung dịch để phun xịt Luận văn Thạc sĩ kỹ thuật 51 2012-2014 Bùi Thị Thanh Phương Công nghệ sinh học mỏng, sau nung nhiệt độ 90-95oC 15-30 phút lấy quan sát kết vệt màu cam Kết chạy sắc kí mỏng thu thể hình M1: mẫu cao saponin n-butanol M3: mẫu cao saponin tồn phần thơ Hình 4: Bản sắc kí mỏng saponin phân đoạn chất chiết Từ hình 3.4 ta thấy mẫu M1, M3 xuất vệt màu cam, mẫu cao saponin tồn phần thơ vệt rõ Có thể hiểu mẫu cao saponin tồn phần thơ mẫu cao tinh cuối Cịn mẫu M1 cịn lẫn nhiều tạp chất nên vệt màu cam xuất mờ nhạt Kết chứng tỏ đu đủ có chứa saponin triterpenoid Luận văn Thạc sĩ kỹ thuật 52 2012-2014 Bùi Thị Thanh Phương Công nghệ sinh học  Dựa vào thí nghiệm tạo bọt, phản ứng tạo màu phương pháp sắc kí mỏng, khẳng định nguyên liệu đu đủ khơ có chứa saponin saponin saponin thuộc nhóm triterpenoid 3.5 Kết định lƣợng saponin: Thực theo quy trình chiết saponin tồn phần, ta thu kết sau: - 200g nguyên liệu - Sau chiết với methanol thu 19,3 g cao saponin methanol (tương đương với hàm lượng % theo trọng lượng nguyên liệu thô H1=9,6%) - Sau chiết với n-butanol thu 3,49 g cao saponin butanol (tương đương với hàm lượng % theo trọng lượng nguyên liệu thô 1,75%) - Sau chiết với chloroform thu 1,91 g cao saponin toàn phần (tương đương với hàm lượng % theo trọng lượng nguyên liệu thô 0,96%) - Sau sấy đông khô = 1,90 g bột chiết saponin (tương đương với hàm lượng % theo trọng lượng nguyên liệu thô 0,95%) ( Tất mẫu sấy đến khối lượng không đổi) Luận văn Thạc sĩ kỹ thuật 53 2012-2014 Bùi Thị Thanh Phương Công nghệ sinh học Kết thể hình 3.5: Hàm lượng cao thô phân đoạn chất chiết (%) 12 10 Hàm lượng cao thô phân đoạn chất chiết (%) 9.6 H1 1.75 0.95 H2 H3 Hình 5: Hàm lƣợng cao thô phân đoạn chất chiết Từ biểu đồ hình 3.5 cho thấy từ 200g nguyên liệu ban đầu kết trình chiết cao saponin tồn phần dung mơi methanol thu lượng cao chiết methanol có chứa saponin triterpenoid 19,3g (tương đương với hàm lượng % theo trọng lượng nguyên liệu khô H1=9,6%) Sau tinh n-butanol chloroform lượng cao chiết thu là 3,49g (tương đương với hàm lượng % theo trọng lượng nguyên liệu khô H2=1,75%) 1,91g (tương đương với hàm lượng % theo trọng lượng nguyên liệu khô 0,96%) Như lượng tạp chất giảm 4,35% chiết với n-butanol giảm 0,79% tinh với chloroform Sau sấy đơng khơ, bột saponin tồn phần thu 1,9g Vậy hàm lượng % theo trọng lượng nguyên liệu khơ q trình chiết cao saponin tồn phần từ nguyên liệu đu đủ tán nhỏ 0,95% (H3) Từ q trình nghiên cứu chúng tơi đưa quy trình tách chiết Saponin triterpenoid quy mơ phịng thí nghiệm sau: Luận văn Thạc sĩ kỹ thuật 54 2012-2014 Bùi Thị Thanh Phương Tán nhỏ Công nghệ sinh học Lá đu đủ tươi Sấy Bột đu đủ Dichloromethan Bã chiết Methanol Dịch chiết methanol (cô chân không) n-butanol lần Dịch chiết n-butanol (cô chân không) Làm chloroform lần Dịch chloroform (cô chân không) Sấy đông khô Saponin triterpenoid dạng bột Hình 6: Quy trình tách chiết saponin tồn phần quy mơ phịng thí nghiệm Luận văn Thạc sĩ kỹ thuật 55 2012-2014 Bùi Thị Thanh Phương Công nghệ sinh học 3.6 Kết thử nghiệm hoạt tính miễn dịch: Tiến hành thí nghiệm lặp lại lần để đảm bảo tính xác, xác định khả kích thích lymphơ tổng số hai mẫu cao saponin-butanol cao saponin sau tinh chloroform (cao saponin toàn phần) ta thu kết thể bảng sau: Nồng độ (µg/ml) SI M1, M2 ConA M1 M2 ConA 100 0.910 0.907 1.24 20 0.966 1.087 1.01 0,2 1.017 1.025 1.01 0.8 0,04 0.942 0.988 1.03 Không xác Không xác định định SD50 M2: Cao saponin toàn phần M1: Cao saponin butanol Bảng Khả kích thích lymphơ tổng số cao saponin Kết cho thấy mẫu M2 có khả kích thích phát triển tế bào lymphô tốt so với mẫu M1 Ở nồng độ 20 µg/ml µg/ml, M2 có khả kích thích tê bào lymphơ phát triển với giá trị SI 1.087 1.025 Mẫu đối chứng ConA hoạt động ổn định thí nghiệm Như vậy: Mẫu M1 cho thấy khả kích thích phát triển tế bào lymphơ nồng độ µg/ml Luận văn Thạc sĩ kỹ thuật 56 2012-2014 Bùi Thị Thanh Phương Công nghệ sinh học Mẫu M2 cho thấy khả kích thích phát triển tế bào lymphơ nồng độ 20 µg/ml  Từ kết ta thấy Saponin triterpenoid đu đủ có khả kích thích miễn dịch Luận văn Thạc sĩ kỹ thuật 57 2012-2014 Bùi Thị Thanh Phương Công nghệ sinh học PHẦN 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN: Từ kết nghiên cứu,có thể rút kết luận sau: Đã khảo sát lựa chọn điều kiện chiết xuất saponin từ đu đủ khơ phương pháp tối ưu hóa cổ điển sau: - Tỷ lệ nguyên liệu/dung môi: 1/7 (g/ml) - Thời gian chiết: 36 - Nhiệt độ chiết: 40 oC Phân tích định tính thí nghiệm tạo bọt, phản ứng màu, sắc kí mỏng đặc trưng khẳng định có mặt saponin triterpenoid đu đủ khơ Phân tích định lượng bột chiết saponin toàn phần so với trọng lượng đu đủ khô ban đầu 0,95% Bước đầu đề xuất quy trình sản xuất Saponin triterpen dạng bột từ đu đủ quy mơ phịng thí nghiệm Saponin triterpen đu đủ có khả kích thích lymphơ tổng số nồng độ 20 µg/ml Luận văn Thạc sĩ kỹ thuật 58 2012-2014 Bùi Thị Thanh Phương Công nghệ sinh học KIẾN NGHỊ: Trong đu đủ chứa hợp chất tự nhiên alcaloid, flavonoid, saponin có tiềm lớn việc hỗ trợ để điều trị bệnh có bệnh ung thư Tuy nhiên điều kiện thời gian nghiên cứu có hạn nên đề tài dừng lại việc nghiên cứu hợp chất saponin đu đủ Trong thời gian tới cần tiếp tục nghiên cứu hồn thiện cơng việc sau: - Khảo sát với lượng mẫu lớn để có kết tốt - Nghiên cứu sản xuất saponin triterpene dạng bột - Nghiên cứu số hoạt tính sinh học saponin triterpenoid (như hoạt tính kháng khuẩn, hoạt tính chống oxy hóa, gây độc tế bào, ) - Thử nghiệm phương pháp chiết xuất khác Luận văn Thạc sĩ kỹ thuật 59 2012-2014 Bùi Thị Thanh Phương Công nghệ sinh học TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt: Nguyễn Bin- Các Quá trình thiết bị cơng nghệ hóa chất thực phẩm– NXB Khoa học kỹ thuật Lê Văn Hưng (2004), Góp phần nghiên cứu tách chiết chất saponin triterpenoid từ rau má, Viện CNSH-CNTP Đại học Bách Khoa, Hà Nội Phạm Thanh Kỳ (1998), Bài giảng dược liệu tập 2, Trường đại học Dược Hà Nội Đỗ Tất Lợi – Những thuốc vị thuốc Việt Nam- NXB Y Học 2004 Phạm Kim Mẫn, Nghiên cứu Saponin cà Sapogenin số thuốc Việt Nam, Viện dược liệu, 1992 Nguyễn Kim Phi Phụng – Phương pháp cô lập hợp chất hữu – NXB ĐH Quốc Gia TP Hồ Chí Minh Trần Thế Tục, TS Đoàn Thế Lư – Cây đu đủ kỹ thuật trồng – NXB Lao Động Xã Hội Ngô Văn Thu (2011), Bài giảng dược liệu tập 1, Trường đại học Dược Hà Nội Bộ môn dược liệu (2004), Bài giảng dược liệu tập 1, Trường ĐH Dược, Hà Nội 10 Nhà xuất y học(1997), Miễn dịch học, Trường đại học Y Hà Nội Tài liệu tiếng Anh: 11 Aurasorn Saraphanchotiwitthaya, Kornkanok Ingkaninan and Pattana Sripalakit (2007), Immunomodulating activity of thai rejuvenating plants, Naresuan University Journal 15 (3), 149 – 157 12 ARNE Bøyum (1974) Separation of Blood Leucocytes, Granulocytes and Lymphôcytes, Tissue Antigens 4(3): 269-274 13 British pharmacopoeia, monographs, Herbal drugs and herbal drug preparations 3, (2009) 3389-3390 Luận văn Thạc sĩ kỹ thuật 60 2012-2014 Bùi Thị Thanh Phương Công nghệ sinh học 14 D A Scudiero, R H Shoemaker, K D Paull, A Monks, S Tierney, T H Nofziger, M J Currens, D Seniff, M R Boyd (1988): Evaluation of a soluble Tetrazolium/Formazan assay for cell growth and drug sensivity in culture using human and other tumor cell lines; Cancer Research No.48, [4827-4833] 15 Elsevier science (1998), Phytochemistry, Great Britain 16 Journal of Medicinal Plants Studies (2013), Prospects of Ethnobotanical Uses of Pawpaw (Carica Papaya) 17 Kurt Hostetmann (1995), Saponin, London 18 Lippincott Williams & Wilkins (2002), Foye’s Principles of medicinal chemistry, USA 19 M C Alley, D A scudiero, A Monks, M L Hursey, M J Czerwinski, D L Fine, B J Abbott, J G Mayo, R H Shoemaker, M R Boyd (1988): Feasibility of drug screening with panels of human tumor cell lines using a microculture tetrazolium assay Cancer Research No 48, [589-601] 20 Mosmann, T (1983) Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays J Immunol Meth 65, 55– 63 21 Ngozi Awa Imaga*, George O Gbenle, Veronica I Okochi, Sunday Adenekan, Tomi Duro-Emmanuel, Bola Oyeniyi, Patience N Dokai, Mojisola Oyenuga, Alero Otumara and Felix C Ekeh - Phytochemical and antioxidant nutrient constituents of Carica papaya and Parquetina nigrescens extracts- Scientific Research and Essays Vol 5(16), pp 2201-2205, 18 August, 2010 22 Yamasky.K (1996), Saponin used in food and Agriculture, Plenum Press, New York 23 Wieslaw Oleszek, Ireneusz Kapusta (2007), and Anna Stochmal, 20 TLC of Triterpenes (Including Saponins), Hajnos/Thin Layer Chromatography in Phytochemistry 46772_C020 Page Proof page 519 Luận văn Thạc sĩ kỹ thuật 61 2012-2014 Bùi Thị Thanh Phương Công nghệ sinh học Tài liệu Internet: 24 http://agriviet.com/threads/ky-thuat-trong-cay-du-du.180039/ 25 Glycosides.htm 26 Saponin – Wikipediating Vit.htm 27 http://duoclieu.net/Dlieuhoc/glycosidch2.html 28 Combined application of saponin and chimeric toxins drastically enhances the targeted cytotoxicity on tumor cells.htm 29 http://miendich.com.vn/ 30 Đại cương môn miễn dịch học 31 Nhập môn miễn dịch học phân tử - Nguyễn Phước Long Luận văn Thạc sĩ kỹ thuật 62 2012-2014 ... trình chiết từ đưa điều kiện chiết xuất thích hợp khảo sát hoạt tính miễn dịch nhóm hoạt chất saponin từ đu đủ Nội dung đề tài: - Lựa chọn phương pháp chiết xuất, xác định điều kiện chiết xuất. .. tố ảnh hưởng đến trình chiết xuất hợp chất saponin đu đủ - Phân tích định tính, định lượng saponin đu đủ - Thử nghiệm hoạt tính miễn dịch hợp chất saponin chiết xuất từ đu đủ Luận văn Thạc sĩ kỹ... ? ?Nghiên cứu, chiết xuất khảo sát hoạt tính miễn dịch nhóm hoạt chất saponin từ đu đủ? ?? Đề tài thực với mục đích nội dung sau: Mục đích đề tài: Đưa phương pháp chiết xuất, điều kiện chiết xuất, tối