Nghiên cứu quy trình xác định hàm lượng acid oxalic trong một số loại mì ăn liền bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

Trang 1

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRUONG DAI HOC SU PHAM THANH PHO HO CHi MINH

KHOA HOA HOC sollics

KHOA LUAN TOT NGHIEP

Dé tai:

NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG

ACID OXALIC TRONG MOT SO LOAI Mi AN LIEN

BANG PHUONG PHAP SAC KY LONG HIEU NANG CAO

Giảng viên hướng dẫn: Th.S Nguyễn Ngọc Hưng

Trang 2

XÁC NHẠN

Tôi xin cam đoan khóa luận tốt nghiệp đã được chỉnh sửa đúng với yêu cầu của Hội

đòng báo vệ khóa luận tốt nghiệp khoa Hóa học năm 2015

Chủ tịch hội đồng

lu, —

—

Trang 3

LỜI CÁM ƠN

Lời đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới giáo viên hướng dẫn của em, thầy Nguyễn Ngọc Hưng Cám ơn thấy đã tạo điều kiện cho em được phát huy tôi đa khả

năng tư duy nghiên cứu của mình Nhờ sự chỉ bảo tận tinh của thây mả em có thẻ giải quyết được các vấn đề khó khăn và kịp thời sửa chữa những sai sót của mình Và hơn nữa, qua đẻ tài nghiên cứu nảy, em đã được học thêm nhiều tri thức mới, giúp cho kiến thức chuyên

môn của em được củng có và hoản thiện hơn

Em cũng xin gửi lời cảm ơn rất nhiều tới các thầy cô khác trong tô bộ môn Phân tích

Cảm ơn các thầy cô đã giúp đỡ, hỗ trợ để em có thể hoàn thành đề tải nghiên cửu này,

Và cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn tới gia đình và các anh, chị, bạn trong khoa Hóa đã truyền đạt kinh nghiệm và luôn ủng hộ, động viên tỉnh thần em trong những lúc khỏ khan

Một lần nữa xin cám ơn tất cả mọi người Kính chúc thầy cô, tất cá bạn bẻ và gia đình thật nhiều sức khỏe, luôn thành công trong công việc vả cuộc sống

Trang 4

ACN BM GC GT HPLC HSD HH LOD LOO m MeOH NP — HPLC RP —- HPLC Speak STT tạ UV Vv VIS WW DANH MUC CHU VIET TAT Acetonitrile Mau mi Reeva 3 Miễn tôm chua cay Nông độ

Mẫu mỉ Gầu Đỏ chay rau nắm

Mau mi Gau Đỏ tôm chua cay

Chiéu cao peak

Trang 5

Bang 2.1 Bang 2.2 Bang 2.3 Bang 2.4 Bang 3.1 Bang 3.2 Bang 3.3 Bang 3.4 Bang 3.5 Bang 3.6 Bang 3.7 Bang 3.8

DANH MUC CAC BANG

Danh mục dung môi tính khiết chuyên đùng cho HPLC - 17

Danh mục các hóa chất khác dùng trong đẻ tài nghiên cứu 17

Danh mục thiết bị máy móc phục vụ đẻ tài nghiên cửu - - 18

Thông tin về các mẫu mì ăn liền khảo sắt 2-52 2S n2 y2, 24 Sự phụ thuộc của thời gian lưu và điện tích peak sắc ký vào thành phân pha

ÔNG t0 S50000102000000/646460600010A4AXAXA40N0A00GG%2 ša 27 Sự phụ thuộc của diện tích peak sắc ký vào nông độ acid oxalic 33

Độ lặp lại vẻ thời gian lưu của hệ thống HPLC với mẫu acid oxalic 35 Độ lặp lại vẻ điện tích peak của hệ thông HPLC với mẫu acid oxalic 35 Ảnh hưởng của nồng độ HCI lên diện tích peak 62 25552 36

Ảnh hưởng của thẻ tích HCI 3M lên diện tích peak x€s446y 37

Ảnh hưởng của thời gian lắc mẫu lên điện tích peak 38 Kết quả phân tích 5 mẫu mi ăn liễn 42

Trang 6

Hinh 1.1 Hinh 1.2 Hình 1.3 Hinh 1.4 Hinh 1.5 Hinh 3.1 Hinh 3.2 Hinh 3.3 Hinh 3.4 Hinh 3.5 Hinh 3.6 Hinh 3.7 Hinh 3.8 Hinh 3.9 Hinh 3.10

DANH MUC CAC HINH ANH

Se OD ad ia TTC sis ss essen tin es ommemeaipew cast poem vuk mmnyb pte yraecavcrreroeomrereers 10 Sơ đỏ thể hiện sự ảnh hưởng của các lực rửa giải s55 252026 H

Quá trình tách sắc ký của các chất - 2-25-2222 csccec22EEacz.cssced II TRÒN ESOS: PAPA NONG TL /202c002/206660202G002/4262612020000000002AA0600 128 13 Giản đô vẻ sự tách hai peak sắc kỷ A vả B Q 0 0S Tre, 15 Sắc ký đồ của acid oxalic khảo sát trong pha động 5 5s: 27 Sắc ký đồ của acid oxalic với nông độ HCI trong dung dịch chuẩn 29

Trang 7

Lẻ Phạm Phương Nam Khỏa luận tốt nghiệp MỤC LỤC N =rsst=äeareasesrềẫtr trrx~x6Gẩ-GG G0900 x296x00s5g0) 3 CHỮ INCI, TRẤN CAN ru eaaeaodeaeeeadkeaeedasenoiereseoaceavestuaoveeii 4 3: (Ác AI Gtx.ctvúcktbxicocttpcdtGtttdaijdtitaaesioiatbaqsusaa 4 |.I.] Cấu tẠO QQ S0 HT 1 SH c S11 ST 15 ng vựng vs cv cec 4 I.1.2 Tính chất vật lý và hóa học 22 6 1 121 9S 1 121152112116 4 ee 4

1.2 Các loại thực phẩm chứa acid oxalicl?Ì s2 s2 2+239SZ 2z £Zvxzvzzzvz 5

1.3 Các phương pháp phân tích acid oxaÌic ào SA 5

1.4 Cơ sở lý thuyết sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)Í”Ì, 22-52522252 7 BASE :GIAIT]NIỀNG tt oioxccitho64666 1t G2006) 6L00á4005Acawasussae 7 UZ: HỆ tông HP: 2222002 eiii002266G0029 205016625002 k26 7 I.4.3 Nguyên tắc của quá trình sắc ký trong cột - 5-2-2 10

EAA, Che Gai liscite GE6 CG issiiccrssisisisssecesscenesssscnscsacsnccopsaassisinasinaassitassnbionss 12

AS Cie Ries Cla HE EB eco concarcconccotissmcncuunnencmienmmanncet 15 CHUONG 2: THUG NOHIBM iississiicsnscicicceriiactniinannaanaensie 17

2.1, Hỏa chất, dung CU .- cccccesccsecssssesssessessvsessessearcseesessensensansnesnessessnseueeareesnenees 17

DRG: Bie IE oodeeoeeiseokokiistiesteostdebidcdGiggj)42632846)ay002X4ss6 17

2.1.2 Dụng cụ, thiết T24 k0 16664643<649656596kGcase266x6s<xesged:422s69446%6kS44sešÍssesS 18

82 “{bytngliiÊN:s:.:::⁄4200)2515120020102i61020133400/20100AA006G0000, 19 2.2.1 Khảo sát điều kiện tối ưu s56 56c 222235225 213122115 10 1511 19 2.2.2 Xây dựng phương pháp định lượng acid oxalic trong mỉ ăn liên 22

2.2.3 Ứng dụng quy trình phân tích vào một số mẫu mì ăn liẻn 23 2.2.4 Phương pháp xử lý và đánh giá kết quả 2-52 22222525 25

CHƯỚNG)! KÉTOUA THẢO LUN eiiieeebiiiiaeossoaoseee 26

Trang 8

Lẻ Phạm Phương Nam Khỏa luận tốt nghiệp

3,I.Ì Cạn cối và G ch vỗHg DIẪN .ceeieeeeeeseies=ee 26 3.1.2 Kháo sát thành phản pha động 5 0 20 210211111212 212 1x 26 3.1.3, Khảo sát ảnh hưởng của HCI -.- 2 522222252222 cEZzrcxvrcrerr 28 3.1.4 Khảo sát tốc độ pha động 50 St 21211211211 1221121021221 c1e 29

3.2 Xây dựng phương pháp định lượng - - - - - S225 5S czec 31

3.2.1 Khao sat LOD và LOQ của thiết bị -222-222 27t 2z c2cxccre 31 3:22 Khảo sâ khoảng tuyỂn thal eisai sts ciccsieciausbai lsatital aceseaacalc 32

3.2.3 Khao sat 46 lap lai cua phép O :cccscssssersernsesensrsevesveaceavensess 34

3.3 Tối ưu hóa quy trình xử lý mẫu mì ăn liễn - 2-5522 525szcccss2 36 3.3.1, Khao sat néng dO HCI carn str dung .ccsecccccesessessesssssseesvessveneneserenes 36 332 Kao Git Gib Cheb FIC cece coeonbieieeecodeoisodosabeesesyee 37 3.3.3 Khao sét thời gian pha ma visiscscccscciccscssssessesassesscasnsscesssssessassaavesvennnee 37

Trang 9

Lễ Phạm Phương Nam Khóa luận tốt nghiệp

MO DAU

Acid oxalic, với công thức phân tir 14 H2C2O., là một acid tương đối mạnh khá quen

thuộc với chúng ta Trong công nghiệp vả cuộc sông, acid oxalie thường được sử dụng để tây trang vai, làm sạch gỗ thỏ, loại bỏ gi sắt, Ngoài ra, acid nảy còn được những người

nuôi ong dùng đê diệt sâu bọ ký sinh trên thân ong),

Ngoai những công dụng vừa được nêu, acid oxalic lại cỏ nhiều tác hại đối với sức khỏe con người Acid oxalie khi tiếp xúc với da và mắt sẽ gây hiện tượng rát, sung tay va dau, nang hon co thé gay viêm mảng giác mạc Bên cạnh đó, nếu bị hắp thụ vào cơ thê, acid

oxalic sẽ gây nhiều ảnh hưởng không tốt đôi với hệ hô hắp, gây nên các triệu chứng như ho

khan, khó thở, sưng phù thanh quản Đặc biệt, acid oxalic làm kết tủa calcium trong máu dưới dạng calcium oxalate, là một trong những nguyên nhân chính gây nên bệnh sói thận Ở liễu cao, acid oxalic (muối oxalate) có khả năng gây ra ngộ độc cấp tính, có thẻ đẫn đến tử vong với hàm lượng 4-5gÍ*l, Vào tháng 12/2013, Hội Y tế công cộng TP HCM đã đưa ra két luan: Hon 20% mau thực pham tuoi, 100% mau mỉ ăn liên chứa acid oxalic, với hàm lượng tử 10 —- 3000 ppm, gây nên sự lo ngại cho một bộ phận lớn người tiêu dùng!!®,

Hiện nay, trên thế giới đã cỏ không ít công trình nghiên cứu vẻ xác định hàm lượng acid oxalic trong các loại thực phẩm Tuy nhiên, ở Việt Nam chưa có nhiều công trình

nghiên cửu vẻ lĩnh vực này Từ yêu câu thực tế đó, chúng tôi thực hiện đẻ tải *Nghiên cứu quy trình xác định hàm lượng acid oxalic trong một số loại mì ăn liên bằng phương pháp

sắc ky long hiéu nang cao”,

Trang 10

Lễ Phạm Phương Nam Khóa luẫn tỏi nghiệp

CHUONG 1 TONG QUAN

1.1 Acid oxalic!!

1.1.1 Cau tao

Tên chung quốc tế: Acid Oxalic _

Công thức phân tử: C:H›zO¿ —

Khoi luong mol: M = 90,035 g/mol 3

1.1.2 Tính chất vật lý và hóa học Ty trong: 1,9 g/cm’

Nhiét d6 phan hay: 189,5°C

Độ tan trong nước: 14,2 g/100 mL nước

Acid oxalic là một chất không mùi, tồn tại dudi dang tinh thé dang mau trang N6 tan tốt trong nước, ethanol, diethyl ether; không tan được trong benzene vả cther dầu hỏa

Acid oxalic lả một acid khá mạnh, nó phân ly 2 nắc theo các cân bằng dưới đây: H:C:O¿: HC:O¿ + H'; pKai = 1,27

HC,0e = C204 + H; pKy2 = 4,27

1.1.3 Độc tính

Acid oxalic là một chất độc Hệ thống GHS đã đánh giá nó ở mức “Nguy hiểm" Khi tiếp xúc với da và mắt, nó gây bỏng, rát, trường hợp nặng hơn có thể bị viêm màng giác mạc hoặc bị mù Khi hấp thụ vào cơ thể người với liều lượng thấp, acid oxalic cé thể gây nhức đầu, nôn mửa, rối loạn tim mạch, làm giảm nhịp tim, hạ huyết áp Ở liều cao, acid

oxalic và muối oxalate có khá năng gây ra ngộ độc cắp tính, có thể dẫn đến tử vong với hàm lượng 4-5g Liều ngộ độc (LDso) của acid oxalic nguyên chất được ước khoảng 378 mg/kg thé trong (khoang 22,68 g/người 60 kg) Sự kết hợp của acid oxalic với calcium tạo ra calcium oxalate, có thé gây kết tủa lắng đọng tạo thành sỏi ở các cơ quan tiết niệu, gan mật, tụy

Trang 11

Lẻ Phạm Phương Nam Khóa luận tốt nghiệp

1.2 Các loại thực phẩm chứa acid oxalic!!?!

Acid oxalic phân bo rong rai trong nhiéu loai lương thực, thực phâm dưới dạng muối oxalate tan trong nước của potassium, sodium va mudi amonium oxalate; hodc dudi dang calcium oxalate ít tan Tùy theo hàm lượng oxalate, người ta chía thực phẩm thành 4 loại:

- Thực phâm chứa acid oxalic với hàm lượng rat cao: các loại cám, hạnh nhân, hạt mè nguyên khô, rau đến, khế, cu cai duéng, rau bina,

- Thye pham chita acid oxalic với hàm lượng cao: hạt điều, đậu phộng, khoai tây chiên

miếng, khoai lang, măng,

- Thực phẩm chứa acid oxalic ở mức trung bình: hạt đẻ, bơ đậu phông, hạt óc chó, cà

rót, khoai tây chiên cọng, sốt cả chua,

- Thực phẩm chứa acid oxalic ở mức thấp: cơm dừa, hạt hướng dương, khoai tây nấu

chin, béng cai xanh, bap, dua chudt,

1.3 Cac phương pháp phân tích acid oxalic

Trước khi các phương pháp hiện đại như sắc ký, điện đi mao quản, phô biến, acid

oxalie trong rau củ thường được xác định bằng phương pháp sau: tách acid oxalic tử thực

vật bằng HCI hoặc NasCO rồi chiết bang ether vả kết tủa dưới đạng muối calcium oxalate,

sau đỏ hòa tan kết tủa bang acid sulfuric loãng để được dung dịch acid oxalic Acid oxalic được định lượng bằng một trong các phương pháp sau đây: chuẩn độ bằng dung dịch KMnO/ chuẩn; hoặc phương pháp tạo màu bằng cách chuyển hóa acid oxalic thành acid

glycolic roi tạo dẫn xuất với 2,7-dihydroxynaphtalene-3,6-disulfonic acid!

Năm 1981, tac gia Bo Libert đã xây đựng quy trinh xác định hàm lượng acid oxalic

trong cây đại hoàng bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC Điều kiện nghiên

cứu: cột pha đảo Cs (kích thước hat: 10 xm); pha động là dung dich chứa 0,5% KH;PO:; và 0,005M tetrabutyl amonium hydrogensulfate, đệm ở pH=2 băng acid H:POs; tốc độ đòng:

2 mL/phút; detector UV-VIS với bước sóng là 220 nmi!Ì,

Năm 1985, để xác định hàm lượng các acid hữu cơ (bao gom acid oxalic) trong khoai

tây, tác giả David H Picha sử dụng phương pháp sắc ký trao déi cation, detector UV-VIS

Trang 12

Lê Phạm Phương Nam Khóa luận tốt nghiệp

đặt ở bước sóng 2 = 214 nm, pha động là dung dịch H;SO‹ 0.0008 N Kết quả thu được hàm lượng acid oxalic khá nhỏ (< 000294)”

Sau đó, năm 1986, tac gia W Jeffrey Hurst và các cộng sự đã phân tích hàm lượng

acid oxalic trong hạt cocoa cũng bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC; sử

dung cot pha dao Cis o 24°C, detector điện hóa được cải đặt ở 1,25V voi AgCl la cuc oxi

hóa pha động là hỗn hợp MeOH : nước theo tỷ lệ 1:1 chứa l mL dung dịch 253% hexadecyltrimethylamonium chloride va 7,5g KH;POx, tốc độ pha động 2 mL/phủt; với

khoảng tuyến tính của acid oxalie từ 0,5 ppm đến 50 ppm!!*),

Năm 1996, Michael Trevakis vả cộng sự đã nghiên cứu quy trình định lượng acid oxalic bằng phương pháp điện di mao quản, lấy phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

làm phương pháp đói chiếu Cá 2 phương pháp đều được sử dụng đề phân tích hàm lượng acid oxalie trong một số loại rau củ như đại hoàng, cà rốt, cú cái đường I

Năm 2002, bằng cách ghép 2 cột loại trừ ion trong hệ thống sắc ký lỏng, tac gia Maria

lesús Nozal cùng với các cộng sự đã xác định hàm lượng acid oxalic trong mật ong, với pha động là dung dịch H:PO: 1%, tốc độ dong | mL/phut, nhiệt độ cột từ 40°C, detector

UV-VIS diode array Kết quả cho thây LOD và LOQ của acid oxalic lân lượt là 0,05 ppm và 0,18 ppm; khoảng tuyến tính rộng, từ 0,2 đến 500 ppmí”],

Violeta Nour và các cộng sự vảo năm 2010 đã nghiên cứu quá trình phân tích các acid hữu cơ có trong nước ép cam bằng phương pháp RP - HPLC Các tác giả đã sử dụng pha động là dung dịch đệm của KH;PO/; và H;:PO: ở pH=2,8 với bước sóng của đetector diode array là 254 nm (đối với acid ascobic) và 214 nm (cho các acid còn lại, bao gồm cả acid oxalic) và tốc độ pha động là 0,7 mL/phút Kết quả cho thấy, thời gian lưu của acid oxalie là 4,122 phút và giới hạn phát hiện của nó là 0,1 mg/LÍ'Ì,

Trước đó, năm 2008, tác gia Miluscia Arnetoli cling cac cộng sự đã định lượng

acid oxalic cùng một số acid hữu cơ khác trong ho thyc vat Silene paradoxa, sử dụng

phương pháp HPLC, cột RP - 18, với pha động là dung dịch đệm pH = 2,Š của

KH:PO; 125 mM và H;PO;, tốc độ 2 mL/phút; detector UV-VIS được đặt ở bước

Trang 13

Lẻ Phạm Phương Nam Khóa luận tốt nghiệp song A = 210 nm; giới hạn phát hiện là 0/0106 mmol/L và sai số là 5,3 % cho acid oxalic!*!, 1.4 Cơ sở lý thuyết sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)#! 1.4.1 Giới thiệu

Sắc kỷ là quả trình tách dựa trên sự phân bố liên tục của các cầu tử chất phân tích lên

hai pha: một pha đứng yên, có khả năng hấp thu chất phân tích gọi lả pha tĩnh, một pha di chuyền qua pha tĩnh gọi lả pha động; do các cấu tử chất phân tích cỏ ái lực khác nhau với pha tĩnh, chúng di chuyên với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là một phương thức của phép sắc kỷ Kỹ thuật phân tích HPLC bao gồm hai nhóm: sắc ký lớp mỏng áp suất cao (HPTLC) và sắc kỷ lỏng

hiéu nang cao (HPLC),

Trong nhóm HPLC, tùy theo bản chất của quá trình sắc ký của pha tĩnh trong cột tách mả người ta chia thành:

- Sắc ký phân bố (PC) của chất tan giữa hai pha không tan (trộn) vào nhau - Sắc ký hấp phụ pha thường (NP-HPLC)

- Sac ky hap phy pha dao (RP-HPLC)

- Sắc ký trao đôi ion (IEX-HPLC) và cặp ion (IP-HPLC) - Sắc ký rây phân tử (FG-HPLC)

1.4.2 Hệ thống HPLC

1.4.2.1 Bình đựng dung môi:

Hệ dung môi giải ly cột được rút ra từ các bình chứa dung môi Bình được làm bằng chất liệu trơ, thường là bằng thủy tỉnh Bình luôn có nắp bảo vệ để không cho bụi rơi vào

trong binh Trong bình có một ông dẫn dung môi từ bình vào hệ thông sắc ký, ở đâu có gắn ống lọc bằng kim loại với mục đích lọc dung môi và cũng để giữ ống luôn ở dưới mặt

thoáng của chất lỏng

Các hệ thống HPLC ngày nay thường có 4 đường dung môi vào đầu bơm cao áp, cho phép chủng ta sử dụng từ 1 đến 4 dung môi trong cùng một lằn rửa giải theo tý lệ mong

Trang 14

muốn Dung môi sử dụng cho HPLC có thẻ là nước, dung dịch đệm (pha trong nước), metanol, acetonitrile hoặc hỗn hợp các loại trên

Lưu ý:

- Tất cả dung môi sử dụng cho HPLC đều phải là dung môi có độ tỉnh khiết cao, đạt tiéu chuan HPLC, không có lẫn bụi bắn Trước khi gắn vào máy HPLC, dung môi phải

được khư không khí và có phì rõ trên nhãn là dung môi dùng cho HPLC hay dung môi tỉnh khiết phân tích

- Tất cả hỏa chất dùng để pha mẫu và pha hệ đệm phải lả hóa chat tinh khiết phân tích, 1.4.2.2 Bộ khử khí:

Mục đích của bộ khử khí nhằm loại trừ các bọt nhỏ cỏn sót lại trong dung môi pha

động Nếu trong quá trình phân tích, dung môi pha động còn sót lại bọt khí thi một số hiện tượng sau đây sẻ xảy ra:

- Tỷ lệ pha động của các đường dung môi lấy không đúng sẽ làm cho thời gian lưu của peak thay đồi

- Trường hợp bọt quả nhiều, bộ khử khí không thé loại trừ hết được thỉ có thé bom sé

không hút được dung môi Khi đó, máy sắc ký sẽ ngừng hoạt động

Trong bắt cứ trường hợp nào nêu trên cũng đều cho kết qua phân tích sai

1.4.2.3 Bơm cao áp:

Mục đích để bơm pha động vào cột tách, thực hiện quá trình sắc ký, rửa giải chất tan ra khỏi cột sắc ký Bơm phải điều chỉnh được áp suất (0 - 400 bar) để tạo ra được những tốc độ nhất định của pha động qua cột tách phù hợp cho quá trình sắc kỷ, phải có tốc độ nằm trong vùng 0.5 - 3 mL/phut

1.4.2.4 Van bơm mẫu:

Đê bơm mẫu phân tích vào cột tách theo những lượng mẫu nhất định không đối trong một quá trình sắc ký Đó là các van 6 chiều có chứa vòng mẫu có thể tích xác định (20, 50 hay 100 L) Van 6 chiều chỉ có một vòng mẫu, nhưng van 10 chiều thi có 3 vòng mẫu

Trang 15

Lẻ Phạm Phương Nam Khóa luận tỏi nghiệp 1.4.2.5 Cột tách:

Cột tách là cột chứa pha tĩnh, trái tim của quá trình tách sắc kỷ Nó là một trong những yêu tô quyết định hiệu quả sự tách sắc ký của một hỗn hợp chất mẫu Cột tách cỏ nhiều

kích cỡ khác nhau, tủy thuộc vào mức độ sắc ký Nói chung, cột tách phân tích thường cỏ kích thước chiều đải từ 10 - 35 cm, đường kính trong thường từ 2 - 5 mm

1.4.2.6 Bộ phận phát hiện chất phân tích:

Đây thường lả các loại detector dựa theo các tính chất của chất phân tích Một số

detector thông dụng như:

- Detector hap thy quang phan tir, ving phé UV-VIS

- Detector nguyén tir phat xa (AES) hay hap thy nguyén tr (AAS) - Detector huynh quang phan tt

- Detector điện hóa (đo dòng, cực phô, độ dẫn, điện lượng)

- Detector chiết suất

- Detector đo độ dẫn nhiệt (FID)

- Detector điode phát quang vả diode mảng

- Deteetor phô khối lugng (GC-MS)

Tùy theo bản chất chất phân tích mả ta sẽ chọn detector phù hợp để đạt được độ nhạy

cao khi định tính cũng như định lượng chúng Trong các loại trên, detector hap thu quang

phân tử vùng phổ UV hay UV-VIS hiện nay được sử dụng phỏ biến nhất vì nó thích hợp cho nhiều loại chất và không quả đắt

I.4.2.7 Bộ phận hiến thị kết quả:

Bộ phận hiển thị kết quả có nhiều loại, nhưng đơn giản và phổ biển nhất là các máy tự ghi (recorder) dé ghi tín hiệu đo dưới dạng các peak của các chất, rồi đến bộ tích phân ké (intergrator), sau đó máy tính và máy in kẻm theo để xử lý kết quả và in kết quả

Đó là 5 bộ phận chính cân thiết tối thiểu phải có của một hệ thống máy HPLC Những

hệ thống may HPLC hoàn chính, hiện đại ngày nay còn có thêm: - Bộ chương trình gradient dung môi (pha động)

- Bộ bơm mẫu tự động vả pha loãng mẫu

Trang 16

- Bộ gia nhiệt và ôn định nhiệt cho cột tách sắc ký

- Máy tính và các chương trình (phần mềm) điều khiên tồn bộ hệ thơng HPL.C và xử lý kết quả tách, in kết quả tach, Column injector Detector Hình 1.1 So dé hé thong HPLC

1.4.3 Nguyên tắc của quá trình sắc ký trong cột

Trong quả trình sắc ký, các phân tử chất tan luôn phân bố qua lại giữa hai pha trong khi pha động luôn chảy qua cột tách với một tốc độ nhất định Mặt khác, do cấu trúc và tính chất của mỗi phân tử chất tan là khác nhau nên tốc độ di chuyển trung bình của mỗi chất tan khác nhau trong quá trình di chuyển từ đầu cột đến cuối cột sắc ký Khi ở trong pha

động, phân tử chất tan dịch chuyển theo tốc độ của pha động; khi ở trong pha tĩnh, phân tử chất tan bị giữ lại Như vậy, sẽ có một thời gian nhất định chất tan bị lưu giữ lại trong cột sắc ký Vì vậy, trong quá trình sắc kỷ, có chất bị lưu giữ lâu trên cột, có chất ít bị lưu giữ

Quyết định hiệu quả của sự tách sắc kỷ ở đây là tổng các mối tương tác:

- Giữa chất phân tích và pha tĩnh (F:)

- Giữa chất phân tích và pha động (F›) - Ciữa pha tĩnh và pha động (F))

Trang 17

Lô Phạm Phương Nam Khóa luận tốt nghiệp chất phân tích F; 7 ` aie F;

Hình 1.2 So dé thé hién su anh hưởng của các lực rửa giải

Tổng 3 tương tác nảy sẽ quyết định chất nào được rửa giải ra khỏi cột trước Đôi với mỗi chất, sự lưu giữ được quy định bởi 3 lực F¡, F›, F› Trong đó, F; và F; giữa vai trò quyết định, còn F: là yếu tổ ảnh hưởng không lớn Ở đây, F: là lực giữ chất phân tích trên

cột, F2 là lực kéo chất phân tích ra khỏi cột của pha động Như vậy, với các chất khác nhau thi F¡ và F› khác nhau Kết quả là các chất khác nhau sẽ đi chuyên trong cột với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau khi ra khỏi cột (như hình dưới)

Hình 1 3 Quả trình tách sắc kỷ của các chất

Trang 18

Lé Pham Phuong Nam Khỏa luận tốt nghiệp

1.4.4 Các đại lượng đặc trưng 1.4.4.1 Thời gian lưu:

Các chất tan trong hỗn hợp mẫu phân tích, khi được nạp vào cột sắc ký, sẽ bị lưu giữ ở trong cột tách (trên pha tĩnh) theo một thời gian nhất định Thời gian lưu là thời gian tính từ lúc bắt đầu bơm mẫu vảo cột cho tới khi peak đạt giá trị cực đại Như vậy, neu 201 tri la thời gian lưu tông cộng của chất tan ¡ thì ta luôn có:

tạ, = (to + tRị ) (1.1)

Trong do:

Nếu to = Ô thì ta sẽ cỏ tạ, = tạ, Trưởng hợp nảy chỉ có khi tạ; rất nhỏ (thường là khi tạ, nhỏ hơn 4 phút)

Giá trị ti cla mét chat trong qua trình sắc ký là phụ thuộc vào nhiều yếu tổ như: - Ban chat sắc ký của pha tĩnh, kích thước hạt, độ xốp, cầu trúc xốp

- Bản chất, thành phân, tốc độ pha động

- Câu tạo và bản chất của phân tử chất tan, các nhóm thể

- Trong một số trường hợp còn phụ thuộc vào cả pH của pha động, nồng độ chất tạo

phức, nếu các yếu tô này có ảnh hưởng đến các cân bằng động trong quá trình sắc ký

Giá trị thời gian lưu t'ạ¡ có ý nghĩa rất lớn trong thực tế của kỹ thuật sắc ký Vì nó cho

ta biết các chất tan (chất phân tích) trong hỗn hợp mẫu được rửa giải ra như thế nào trong

các điều kiện thí nghiệm và một hệ pha đã chọn Đông thời đó cũng là đại lượng để chúng ta phát hiện định tỉnh một chất

Trang 19

Lê Phạm Phương Nam Khóa luận tốt nghiệp (tR)a 0 ' 2 3 a 5 6 ? 8 g Tựưne (es4es) Hình l.4 Thời gian lưu trong HPLC 1.4.4.2 Hệ số phân bố

Quá trình tách sắc ký của các chất là dựa trên cơ sở sự phân bố của chất tan giữa pha

động và pha tĩnh xảy ra liên tục trong quá trình sắc ký Sự phân bố này được đặc trưng bởi

một đại lượng gọi là hệ số phân bố K; của chất ¡ Hệ số này được định nghĩa là tỷ số nông độ của chất tan | trong pha tĩnh vả pha động và nó được tính theo công thức sau:

K =—* (1.2)

Trong đó, C_ và C, là nông độ chất tan I trong pha tĩnh và pha động

Trang 20

Lễ Phạm Phương Nam Khoa luận tốt nghiệp

k,=K,—* (1.4)

1.4.4.4 Hệ số tách ơ

Hệ số tách ứ (hay còn gọi lả thời gian lưu tương đối giữa hai chất A và B) là đại lượng

đánh giá khả năng tách hai chất bằng phương pháp sắc ký Nó phụ thuộc vảo hệ số phân bố

và là tỷ số của hệ số phân bỏ của hai chất sity Se a Nh we BA we He 1.5 “TIẾN & ee ee Điều kiện cần thiết dé hai chat A va B tách khỏi nhau là ơ # 1 1.4.4.S Độ phân giải R

Độ phân giải nói lên mức độ tách các cầu tử khỏi nhau trong một phép sắc kỷ Hai cầu tử A vả B được tách khỏi nhau cảng triệt để khi độ phân giải cảng cao Độ phân giải

được tỉnh theo công thức sau: te ky =i —— W,+W, _ be (1.6)

Nếu R cảng lớn thi hai chat A va B cang tach ra xa nhau, khi này giữa hai peak sẽ có một đoạn đường nên nằm ngang theo trục hoành của biểu đỗ sắc ký Song nếu đoạn đường nên này dai quá thì cũng không cần thiết Vì như thể ta tốn nhiều dung môi (pha động) để rửa giải các chất hơn Do đó giá trị R chỉ vừa đủ đề tách hoản toàn hai chất ra khỏi nhau là tốt Nghĩa là chỉ cần hai peak vừa tách ra khỏi hắn nhau đứt khoát lả được

Trang 21

Lê Phạm Phương Nam Khóa luận tốt nghiệp 1.00 R=1.50 R=0.50 R detector’s response time (a) (b) (c)

Hình 1.5 Gian d6 vé su tach hai peak sac ky A va B (a) Tôi thiểu đề có sự tách

(b) Đủ đề hai chất tách khỏi nhau (c) Hai chất tách xa hẳn nhau

1.4.5 Cac bước tiến hành sắc ký

1.4.5.1 Chuan bị dụng cụ và máy móc

Máy HPLC phải được kiểm chứng theo định kỳ để đảm bảo máy hoạt động tốt, cho kết quả phân tích có độ đúng, độ lặp lại, tuyến tính, tỷ lệ dung môi, tốc độ dòng, năng lượng đèn UV, đúng theo yêu cầu thông số máy đo của nhà sản xuất đặt ra

Đặc biệt, cột sắc ký phải được kiểm tra về số đĩa lý thuyết theo định kỳ hay khi có nghỉ ngờ về khả năng tách và rửa đúng quy định sau mỗi lần chạy sắc ký

Ví dụ: Sắc kỷ pha thường NP-HPLC: rửa bằng methanol, không rửa bằng nước Sắc ký pha đảo RP-HPLC: khi chạy pha động có các loại muối thì phải rửa

bang hôn hợp ACN (hoặc methanol) va nude, ty 1é 50:50 để sạch hết các chất còn đọng lại

trong cột, đồng thời bảo vệ cột không bị mốc khi đề lâu 1.4.5.2 Chuẩn bị dung môi pha động

Các dung môi dùng cho sắc ký là loại tính khiết dành cho HPLC Các hóa chất cần

dùng khác phải là loại tỉnh khiết dùng cho phân tích Pha dung mỗi chính xác theo đúng tỷ

Trang 22

lệ đã nêu, để ôn định dung môi đúng thời gian theo chuyên luận đã yêu câu Lọc dung môi qua mang loc 0,2 - 0.45 um

1.4.5.3 Chuẩn bị mẫu do HPLC

Mẫu thử: xử lý mẫu theo quy trình đúng với các nguyên tắc sau:

- Dung môi hòa tan chất phân tích phải hòa tan trong pha động, trong nhiều trường

hợp, dùng dung môi pha động để hòa tan mẫu

- Phải loại bỏ các chất không tan trong pha động hoặc không rửa giải được bằng cách lọc hoặc chiết

- Phải lọc vả ly tâm, lọc mẫu qua mảng lọc 0,2 - 0,45 pm

- Nông độ mẫu ở mức vừa phải, không vượt quá khả nẵng tách của cột, tránh gây

nghén cot

Mau chuan:

Pha dung dịch chuẩn có thành phần giống như mẫu thứ trong cùng dung môi, riêng

về nòng độ các thành phần giống như mẫu thử là tốt nhất Ngoài ra, có thể dùng nông độ

khác, nhưng phải nằm trong khoảng tuyến tính của từng thành phần 1.4.5.4 Cách vận hành thiết bị

Mỗi máy có cách vận hành khác nhau, tùy thuộc vào hãng sản xuất, phần mềm điều khiển hệ thống HPLC Tuy vậy, cách vận hành phải luôn tuân theo nguyên tắc sau:

- Chạy máy với dung môi pha động để đuổi hết bọt khí có trong hệ thống ống dẫn trước khi cho vào cột

- Đặt đầy đủ các điều kiện sắc ký như: cấu hình máy, tỷ lệ các dung môi pha động,

bước sóng, thành phần mẫu, các thông số của quá trình sắc kỷ yêu cau

Trang 23

Lê Phạm Phương Nam Khóa luận tốt nghiệp 2.1 Hóa chất, dụng cụ 2.1.1 Hóa chất 2.1.1.1 Chất chuẩn: Xuất xứ: Merck KGaA, Đức 2.1.1.2 Dung môi:

Tên chất chuan: Acid oxalic 0,05 mol/L (0,1 N)

CHUONG 2 THUC NGHIEM

Bang 2.1 Danh mục dung môi tỉnh khiết chuyên dùng cho HPLC

Ham | nguyén tran

STT Tên dung môi Nhà sản xuất Ô Tiêu chuẩn TU meee ọ Til | Merck KGaA | Dung cho | Acetonitrile > 99.80% Dirc HPLC Merck KGaA Dung cho 2 Methanol > 99 80% Đức HPLC i 3 Water Merck KGaA | Dung cho > 99.80% Đức HPLC - 2.1.1.3 Hóa chất khác Bảng 2.2 Danh mục các loại hóa chất khác dùng trong đề tải nghiên cứu

STT ( Tên hóa chất | Nhà sản xuất | Tiêu chuẩn | Hàm lượng nguyên trạng (3%)

Trang 24

Lé Pham Phương Nam

2.1.2 Dụng cụ, thiết bị

Khỏa luận tốt nghiệp

Bang 2.3 Danh mục thiết bị máy móc phục vụ đẻ tài nghiên cửu _STT Loại thiết bị Tên thiết bị Hãng sản xuất Mã số Bình đựng dung Pyrex 1000mL Germany 00330341 môi 4 kênh

Bom cao 4p Pump Perkin Elmer Series 200 B6 loai khi cho Vacuum

Perkin Elmer Series 200 dung môi Degasser Thiết bị tiềm Syringe 50 pL Hamilton 80665 mau Thiết bi nạp 6 Injector 20 pL USA mau Agilent ‘ ZORBAX Agilent Cột sắc ký ; USNH039232 Eclipse XDB- Technologies C18

Thiet bj ghi tin

Trang 25

Lẻ Phạm Phương Nam Khỏa luận tot nghiệp Giấy lọc045 | Membrane Filter 4 Whatman, Japan 7141104 yum Sterile

5 May lac KS130 Basic IKA - Germany KS130B

May danh siéu S100H 6 Elma - Germany 101141013 am Elmasonic == Balances and 7 Cân phân tích Prectous Metal Satorius 98648-012-13 Scales ' Lambda 25 Ñ Máy đo quang UV/VIS Perkin Elmer 101N7062504 Spectrometor i Máy lọc nước 9 Water Pro PS LABCONCO 091118524 siéu sach ——— 2.1.2.1 Đụng cụ - Binh định mức: 1000 mL., 500 mL., 250 mL, 50 mL., 2Š mL - Pipet: 1 mL, 2 mL, 5 mL, 10 mL - Bình tam giác: 250 mL - Cốc thủy tính: 50mL, 100 mL, 250 mL - Ống nhỏ giọt, bình tia, cối sứ, chày sứ, giấy lọc thường, giấy lọc 0,45um, giấy parafin 2.2 Thực nghiệm 2.2.1 Khảo sát điều kiện tối ưu 2.2.1.1 Chọn thể tích vòng mẫu

Trang 26

Nếu vòng mẫu quá dải, lượng mẫu bơm vảo cột quá lớn thì hiện tượng giãn peak xảy ra

cảng lớn gây ra sự chen lắn peak trong quá trình tách

Lượng mẫu được xác định bằng thê tích vòng chứa mẫu mà ta lựa chọn Với thẻ tích mẫu nhỏ hơn thể tích mẫu tới han Vp thi khi bơm mẫu vảo cột tách chiều cao hay diện tích của peak sẽ tăng tuyến tính Đền giới hạn V„ä„ = Vạ mà tiếp tục tăng thê tích mẫu thì chiều

cao peak sắc ký cũng không tăng nữa vả lúc đó peak sắc ký sẽ tù, giãn chân vả không sắc nét, Vì vậy việc lựa chọn thẻ tích vòng mẫu cũng rất quan trọng

Nếu độ nhạy đủ để phân tích, thường dùng vòng mẫu có thê tích cảng nhỏ cảng tốt đẻ tạo nên peak có độ sắc nét cao, tránh giãn peak Trong phân tích HPLC người ta thường

sử dụng các vòng mẫu 10, 20, 30, 50 và 100 4L, trong đó vòng mẫu 20 8L thường hay được

sử dụng nhất Trong đẻ tài nghiên cửu này đề phản tích hảm lượng acid oxalic chúng tôi

lựa chọn van bơm mẫu 6 chiều và thẻ tích vòng mẫu là 20 ụL

2.2.1.2 Chọn cột

Acid oxalic la mét chat hitu co phân cực, vì vậy chúng ta có nhiều lựa chọn cho loại cột phân tích Dựa theo một số tải liệu tham khảo, cùng với điều kiện có sẵn của phòng thí nghiệm, chúng tôi quyết định chọn loại cột pha đảo RP - HPLC Hiện nay trên thị trường

có nhiều hãng sản xuất cột pha đảo C và C¡s, Hiện nay, phòng thí nghiệm chúng tôi _ được trang bị cột ZORBAX Eclipse XDB-C 18 của hãng Agilent Vì vậy, chúng tôi sử dụng

cột ZORBAX Eclipse XDB-C18, với kích thước hạt 5 um; kích thước cột 250 x 4,6 mm cho phép định lượng nảy

2.2.1.3 Khảo sát thành phần pha động

Tỷ lệ thành phần dung môi tạo ra pha động có ảnh hưởng lớn đến quá trình rửa giải các chất mẫu ra khỏi cột Trong phân tích HPLC, khái niệm lực rửa giải là đặc trưng cho quá trình sắc ký Khi tỷ lệ thành phân pha động thay đổi thì lực rửa giải của dung môi pha

động thay đôi, nghĩa là làm thay đổi thời gian lưu của các chất phân tích qua đó làm thay đôi hệ số lưu của chất phân tích đó

Trang 27

2.2.1.4 Khao sat anh hưởng của HCI

Trong thye pham, acid oxalic co thé ton tại 6 ca dang phan tir (acid oxalic) hoặc dang mudi oxalate Vi vay, dé dam bao chiét hoan toan luong acid oxalic trong mau thuc pham

phân tích, ta phải sử dung mot acid manh nhu HCI, H2SOx, Trong đẻ tài nghiên cửu này,

chúng tôi chọn sử dụng acid chlorhydric, vì vậy việc khảo sát ảnh hướng của HC] lén peak sac ky la mot điều tất yếu

Nông độ của HCI có ánh hưởng trực tiếp đến pH của dung dịch mẫu, quyết định dạng tôn tại chỉnh của acid oxalic (H»C204, HC20¢ hay COs") Nong độ HCI quá nhỏ sẽ dẫn đến các dạng của acid oxalic sẽ tổn tại song song, có thể gây hiện tượng tách peak, dẫn đến sai số lớn Mặt khác, nẻu nông độ HCI quá lớn, dẫn đến pH quá nhỏ, ngoài khả năng chịu

đựng cột sẽ làm hỏng cột, gây sai số phân tích Để khảo sát ảnh hưởng của HC], ta tiền hành

chạy sắc ký với các điều kiện sau:

Cot tach: RP — 5 ym, 250x4,6 mm

Pha động: pha động đã khảo sat trong muc 2.2.1.3 Thời gian: 0 - Š phút

Tóc độ dòng: 0,7 mL (phút Detector: UV-VIS, A = 220 nm

Thé tich vong mau: 20 pL

Nông độ HCI khảo sát lần lượt là: 0 M, 0,1 M, 0,5M, 1M 2.2.1.5 Khảo sát tốc độ pha động

Tốc độ pha động là một trong những yếu tố có ảnh hưởng lớn lên quá trình sắc ky vi

nó ảnh hưởng lên quá trình thiết lặp cân bằng giữa pha tĩnh và pha động của chất tan Tốc độ dòng quá nhỏ sẽ gây hiện tượng giãn pcak, tốn nhiều thời gian rửa giải và dung môi,

Tuy nhiên, nếu tốc độ dòng quá lớn sẽ làm cho các chất trong hỗn hợp khơng tách khỏi

nhau hồn toàn, gây ra hiện tượng chồng chéo peak lên nhau Vì vậy, cần phải khảo sát đẻ

tìm ra tốc độ dòng phủ hợp với hệ phân tích

Trang 28

Đề khảo sát ảnh hưởng của tốc độ pha động, tiền hành khảo sat sự thay đôi chiều cao

pic sắc ký theo bước sóng của đetector với điều kiện chạy sắc ký: -Cot tách: RP - Šum, 250 x 4,6 mm -Thể tích vòng mẫu: 20uiL -Nông độ chất phân tích: 36 ppm -Tốc độ đòng: 0.5 mL/phút; 0,6 mL/phút: 0,7 mL/phút; 0,8 mL/phút: 0,9 mL/phút; 1 mL/phut

-Detector: UV-VIS, budc song 220 nm -Pha động: pha động đã khảo sat 6 2.2.1.3,

Tổng kết các điều kiện đã khảo sát suy ra điều kiện tối ưu để phân tích hàm lượng

acid oxalic

2.2.2 Xây dựng phương pháp định lượng acid oxalic trong mì ăn liền

2.2.2.1 Xác định LOD và LOQ

Trong một quy trình phân tích bắt kỳ, giới han phat hién (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) là 2 thông số quan trọng

Giới hạn phát hiện là giá trị nồng độ của chất phân tích mà hệ thống phân tích còn cho tin hiệu phân tích có nghĩa so với tín hiệu mẫu trắng hay tín hiệu của đường nên

Giới hạn định lượng được xem như nông độ thấp nhất của chất phân tích mả hệ thống

phân tích định lượng được với tín hiệu phân tích có nghĩa định lượng so với tín hiệu mẫu

trắng hay tín hiệu nên Thông thường, LOQ được tính như sau:

Đẻ xác định LOD và LOQ của thiết bị, ta tiến hành pha loãng từ 5 - 7 lần mẫu chuẩn chứa acid oxalic nông độ 0.9 ppm và chuẩn bị một mẫu trắng, sau đó tiêm vào thiết bị HPLC va ghi lai kết quả Sắc ký đồ nào thể hiện chiêu cao peak gấp 3 lần đường nẻn thi nông độ mẫu chuẩn đó chính là giới hạn phát hiện LOD của thiết bị

Giới hạn định lượng được suy ra từ công thức: LOQ = 10/3 LOD (2.1)

Trang 29

2.2.2.2 Xác định khoảng tuyến tính

Khoảng tuyển tính là một thông số quan trọng của quy trình phản tích Một chất chỉ

có thé định lượng tốt theo phương pháp đường chuẩn hay thêm chuẩn khi nông độ của chất phân tích năm trong khoảng tuyến tinh,

Đề khảo sát khoảng tuyến tính giữa nồng độ của acid oxalic vả điện tích peak sắc ký, ta lần lượt pha các dung dịch chuẩn có nồng độ tăng dân trong dung môi pha động Sau đó

tiêm vào hệ thông HPLC với điều kiện tối ưu đã được khảo sắt ở mục 2.2.1, ghi giả trị diện

tích peak va ding phần mềm Microsoft Excel 2003 xảy dựng phương trình hỏi quy mỗi quan hệ giữa nông độ C va dién tich peak Speas

2.2.2.3 Khảo sát độ lặp lại của phép đo

Một phương pháp phân tích tốt, ngoài yêu cầu vẻ độ đúng của phương pháp, người ta còn chú ý đến độ lặp lại của phương pháp Độ lặp lại của hệ thống sắc ký được khảo sát bang cach tiêm lặp 7 lằn cùng một mẫu chuẩn acid oxalie (có nông độ nằm trong khoảng

tuyến tính) vào hệ thống sắc ký với điều kiện tối ưu đã được khảo sát ở mục 2.2.1 Kết quả được đánh giá thông qua độ lệch chuẩn (SĐ), độ lệch chuẩn tương đối (RSD) của điện tích peak sic ky Speak va thoi gian lưu tạ

2.2.3 Ứng dụng quy trình phân tích vào một số mẫu mì ăn liền 2.2.3.1 Xử lý mẫu

Mẫu mì ăn liên được tiến hành khảo sát theo quy trình sau:

- Nghiên mịn mẫu mi ăn liền bằng chén sứ, trộn đều, sau đó cân chính xác 0,500 g mẫu vả ghi lại kết quả cân

- Cho 0,5 (g) vào bình tam giác có chứa 10mL dung dịch HCI 3M Lắc trong 20 phút Lọc tách phần cặn không tan vả phần dung dịch

- Rửa phân cặn không tan bằng 10mL nước siêu sạch, thu cả 2 phân dịch lọc Dung

địch thu được có máu nâu nhạt

- Loc phan dich lọc thu được bằng mảng lọc 0.45 um, thu lẫy phân địch lọc màu vàng

nhạt sau cùng

Trang 30

Lê Phạm Phương Nam Khóa luận tốt nghiệp - Cho toan bộ phan địch lọc thu được vào bình định mức 50 mL, định mức băng nước siêu sạch

- Hat 5 mL dung dich mẫu vừa pha loãng cho vào bình định mức 25 mL., định mức

bằng nước siêu sạch

- Tiến hành tiêm lặp 3 lần các dung dịch mẫu sau khi pha loãng vào hệ thông HPLC

và ghi lại kết quả Dựa vào phương trỉnh hỏi quy tỉnh nông độ của chất phân tích

2.2.3.2 Phân tích định lượng mẫu mì ăn liền

Hiện nay trên thị trường có rat nhiều loại mỉ ăn lién, va hau hết các loại mì ăn liền đều

cỏ chứa acid oxalie trong thành phản Trong đẻ tài nghiên cửu này, chúng tôi tiền hành khảo

sát ham lugng acid oxalic trong 5 mau mi 4n lién nhu trong bang 2 4 sau đây:

Bang 2.4 Thông tin vẻ các mẫu mì ăn liên khảo sát

STT | Tên mẫu | Nhãn hiệu mỉ ăn lién Nhà sản xuất HSD

| | HH HảoHảotômchuacay VINA ACECOOK 20/8/2015

Công ty cô phân thực

2 GT Gấu Đỏ tôm chua cay ` phả 13/8/2015

pham A Chau

Công ty cô phân thực

3 GC | Gấu Đỏ chay rau nấm phẩm Á Châu : x vã 7/10/2015

Reeva 3 Miễn tôm Công ty cô phân

4 BM 6/11/2015

chua cay UNIBEN lu lÍ gam i Thai Preserved Food

5 ww Mi chay Wai Wai 15/9/2015

Factory (Thai Lan)

Ap dụng quy trình xử lý mẫu ở mục 2.2.3.1, lầy phân dung dịch lọc cuỗi cùng, cho

vào bình định mức S0mL, định mức đến vạch bằng nước siêu sạch Hút chính xác Š mL

dung địch mẫu vừa pha, cho vào bình định mức 25mL., định mức đến vạch bằng nước siêu

sạch

Tiển hành tiêm lặp 3 lần các mẫu HH, GT, GC, BM và WW vào hệ thống HPLC va

ghi lại kết quả Dựa vào phương trình hỏi quy tính nông độ của chất phân tích

Trang 31

2.2.4 Phương pháp xử lý và đánh giá kết quả

Theo lý thuyết sắc kỷ lỏng, trong một điều kiện sắc kỷ đã chọn, thời gian lưu của chất là đại lượng đẻ định tính (phát hiện) Còn chiều cao và điện tích peak sắc ký cỏ liên quan chặt chẽ đến nòng độ của chất Trong một vùng nông độ nhất định và không lớn, chúng ta

có mỗi quan hệ tuyến tính như sau:

H; = kị C; = f(C) (2.2) S,=k: €, = g(C) (2.3) Trong đó:

H, va S; lan lượt là chiêu cao và điện tích peak sắc kỷ của cầu tử ¡

C, là nông độ của cầu tứ ¡ với thời gian lưu tại

ki, k› là các hãng số thực nghiệm phụ thuộc vào các điều kiện sắc ký cũng

như bản chất pha tĩnh

Dựa vào (2.2) và (2.3), ta có thẻ xác định nông độ chất phân tích theo phương pháp đường chuẩn hoặc thêm chuẩn

Trang 32

Lẻ Phạm Phương Nam Khéa luận tốt nghiệp

CHUONG 3 KẾT QUÁ - THẢO LUẬN 3.1 Khảo sát điều kiện tối ưu

3.1.1 Chọn cột và thể tích vòng mẫu

Dựa vảo các tài liệu tham khảo trong mục l.3 vả trang thiết bị cho phép của phòng thí nghiệm, ta chọn cot va thẻ tích vòng mẫu như sau:

Cột sắc ký pha đảo RP - 18; 250 x 4,6 mm, kích thước hạt 5 ym

Thé tich vong mau: injector 20 pL 3.1.2 Khảo sát thành phần pha động

Đề khảo sát thành phản pha động, ta tiến hành chạy chương trình sắc ký với điều kiện

như dưới đây:

- Cột tách: RP - Š xm, 250x4,6 mm

- Thể tích vòng mẫu: 20 pL

- Nông độ chất phân tich: 36 ppm

- Tốc độ đòng: 0,7 mL/phút

- Detector: UV-VIS, bude song 220nm - Thời gian khảo sát: 0 - Š phút

- Pha động khảo sát: lần lượt khảo sát pha động với các thành phần như sau: e ACN; 100%

e ACN: dung dich dém pH=2,7 KH2POs ImM — H3PO4 = 95% : 5%

Dung dich chuan acid oxalic 36 ppm duge sit đụng để khảo sát ảnh hưởng của thành phần pha động lên thời gian lưu, điện tích peak vả chiều cao peak Kết quả được thẻ hiện

trong hình 3.1 và báng 3.l như sau:

Trang 33

Lẻ Phạm Phương Nam Khóa luận tốt nghiệp ; ) ’ 1 “| + : | ; li - | | |" | dị ; | "3 HW A3 “1m wore: - ke represen: (1) (2)

~ was Hinh 3.1 Sắc kỷ đô của acid oxalic khảo sát

Trang 34

Từ kết quả thu được trong hình 3.1 và bảng 3.1, taco thê rút ra các kết luận sau:

- Trong cả 3 loại pha động, acid oxalic không thê chuyển hoản toàn vẻ một đạng cầu tử Nó tôn tại ở chủ yêu 2 đạng là H;C:Ox và HC2Oz Vì vậy, để khảo sát sự phụ thuộc của của điện tích peak sắc ký vào nông độ, ta phải lấy tông diện tích của cả 2 peak

- Với tỷ lệ 100% ACN, peak sắc nét hơn, cân đổi hơn, bê rộng đáy peak nhỏ hơn so

với kết quả của 2 loại pha động còn lại

Từ những kết luận trên, chúng tôi lựa chọn tỷ lệ pha động là 100% ACN đẻ tiền hành

phan tich ham lugng acid oxalic 3.1.3 Khảo sát ảnh hưởng cia HCI

Tiên hành khảo sát ảnh hưởng của nồng độ HCI lên thời gian lưu và điện tích peak sắc ký theo các điều kiện dưới đây: Cột tách: RP - 5 um, 250x4,6 mm Pha động: 100% ACN Thời gian: 0 — 5 phút Tốc độ dòng: 0,7 mL/phút Detector: UV-VIS, A = 220 nm

Trang 35

Lê Phạm Phương Nam Khỏa luận tỏi nghiệp *> *- @ @ 41 f1 vs ‘ Bast (c) (d) Hình 3 2 Sắc ký đồ của acid oxalic với nông độ HCI trong dung dịch chuẩn (a) IM (b) 0.SM (C) ().2M (d) OM

Dựa vảo kết quá thu được trong hình 3.2, ta thay, ở mọi nông độ HCI khảo sát đều có hiện tugng peak bị tách và kéo đuôi Khi nông do HCI la 1M thì hiện tượng tách peak va kéo đuôi là ít nhất, nhưng hình đạng peak lại không cân đối vả không nhọn Mặt khác, khi

nông độ HCI giảm từ 0,5M đến 0M, hình dạng peak chính sắc nét vả cân đối hơn; nông độ acid trong khoảng này không gây anh hưởng lớn đến mức độ tách peak và kéo đuôi Tuy nhiên, để hạn chế việc cột bị hỏng do pH của dung dịch mẫu chuẩn quá thấp, chúng tôi tiễn hành khảo sát các điều kiện còn lại trên nên mẫu không chứa HCI

—3.1.4 Khảo sát tốc độ pha động

Trang 36

Lé Pham Phương Nam Khỏa luận tốt nghiệp | ! ! 9 ! ! ÂLslne fs — TMHM=NNG ——— An

Hình 3 3 Sắc ký dé cia acid oxalic vai toc dé pha dong lân lượt là: (a) 0,5 mL/phut (b) 0,6 mL/phut (c) 0,7 mL/phut (d) 0.8 mL/phit (e) 0.9 mL/phut (f) 1 mL/phut

Trang 37

Lé Pham Phương Nam Khóa luận tốt nghiệp

Từ kết quả thu được trong hình 3 8 ta thấy, ở mọi tốc độ dòng khảo sát, hiện tượng peak bị tách và kéo đuôi vẫn tôn tại, Mặt khác, có thể thấy được, khi thay đổi tốc độ pha động tử 0,5 đến 0,9 mL./phút, hình đạng peak chinh đẹp, cản đối vả sắc nét Khi tốc độ dòng

tăng lên I mL/phút, hiện tượng bắt đối xứng trên peak chính rõ rằng hơn trong các trường hợp còn lại Vì những lý đo trên, đồng thời đề tránh hao tồn dung môi và thời gian phân

tích khi tốc độ pha động quá lớn hoặc quá nhỏ ta chọn tốc độ dòng là 0,7 mL/phút để tiễn

hảnh định lượng acid oxalic

Như vậy tử các kết quả thu được vả điều kiện có sẵn của phòng thí nghiệm điều kiện

tôi ưu cho quy trình được đẻ xuất như sau:

Cột tách: RP - 18; 250 x 4,6 mm, kích thước hạt Š um Detector UV-VIS dat o budc song A = 220 nm

Pha dong: Acetonitrile 100%

Tốc độ dòng: 0,7 mL/phút

Thời gian phân tích: 0 - 5 phút

3.2 Xây dựng phương pháp định lượng

3.2.1 Khảo sát LOD và LOQ của thiết bị

Trong một quy trình phân tích bắt kỳ, giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng

(LOQ) là hai thông số quan trọng

Để xác định LOD và LOQ của thiết bị, ta tiễn hành như sau: chuẩn bị một mẫu trắng làm nên, pha loãng liên tiếp 5 - 9 lần dung dich chuan acid oxalic 0,9 ppm Sau đó tiêm vào thiết bị HPLC, đến khi nào chiều cao peak bằng 3 lằn chiều cao đường nên thì lấy đó là LOD

Trang 38

Lé Pham Phong Nam Khóa luận tỏ: nghiệp

(a) (b)

Hình 3.4 Sắc kỷ đô của acid oxalic nông độ 0,108 ppm (a) và mẫu trắng (b)

Kết quả: khi nông độ acid oxalic lả 0,108 ppm thì chiều cao peak bằng 3 lần đường nên Do đỏ:

LOID của acid oxalic là 0,108 ppm

LOQ cua acid oxalic = 10/3 LOD = 0,36 ppm 3.2.2 Khảo sát khoảng tuyến tính

Khoảng nông độ tuyến tính là một thông số quan trọng của quy trình phân tích Một chất chỉ có thé định lượng tốt theo phương pháp đường chuẩn hay thêm chuẩn khi nồng độ _ của chất phân tích năm trong khoảng tuyến tính

Khoảng tuyến tính của acid oxalic được khảo sát bằng cách pha một dãy dung dịch

chuẩn acid oxalic có nông độ tang dan nhu sau: 0,45 ppm; 0,9 ppm; 1,8 ppm; 4,5 ppm; 9 ppm; 18 ppm; 27 ppm; 36 ppm; 45 ppm; 54 ppm; 90 ppm Tién hanh pha day dung dich

chuẩn như sau:

- Pha loãng dung dịch acid oxalic gốc 4500 ppm thành 100 mL dung địch acid oxalic

có nàng độ 450 ppm: hút chính xác 10 mL dung dịch gốc cho vảo bình định mức 100 mL, định mức đến vạch bằng nước siêu sạch

- Pha đãy dung dịch chuẩn tử dung dịch 450 ppm ở trên: hút chính xác Vụ mL dung dich acid oxalic 450 ppm cho vảo bình định mức V mL vả định mức bang nước siêu sạch

Trang 39

Sau đó, lần lượt tiêm các dung dịch mẫu chuẩn vào hệ thông HPLC với điều kiện tối ưu thu được ở mục 2.2.1, ghi lại giá trị đo và dùng phần mềm Microsoft Excel 2003 xây dựng đường chuẩn và phương trình hôi quy

Trang 40

Lê Phạm Phương Nam Khóa luận tốt nghiệp Đường hồi quy của acid oxalic prak y = Ñ4544x + 95| 157 R!:=0998Ị 0 5 10 15 20 2 3 35 4 45 SỐ 55 6O 65 70 7S 80 8S 90 95 100 Nong dé (ppm)

Hinh 3.5 Dé thi biéu dién su phụ thuộc cua dién tich peak vao nong dé acid oxalic Tử các số liệu thực nghiệm, ta thu được kết quả sau:

Khoảng tuyến tính của acid oxalic là 0,45 — 90 ppm Phương trình hồi quy: y = 84544x + 95] 157

Hệ số tương quan: r = 0,999

Nhận xét: qua các kết quả phân tích và thống kê ta thấy, tỷ lệ diện tích peak sắc ký và

nông độ acid oxalic phụ thuộc tuyến tính với nhau một cách chặt chẽ với hệ số tương quan cao, r = 0,999, Khoảng nông độ tuyến tính rộng, từ 0,45 - 90 ppm Do đó, ta có thể sử dụng các phương pháp đường chuẩn hoặc thêm chuẩn để định lượng acid oxalic trong mẫu thật

ở khoảng tuyến tính đã khảo sát

3.2.3 Khao sat độ lặp lại của phép đo

Một phương pháp phân tích tốt, ngoài yêu câu về độ đúng của phương pháp, người ta còn chú ý đến độ lặp của phương pháp Độ lặp lại của hệ thông sắc ký được khảo sát bằng cách tiềm lặp lại 7 lẫn cùng một mẫu chuẩn acid oxalic nồng độ 4,5 ppm vào hệ thống HPLC với điều kiện tối ưu ở mục 2.2.1 Kết quả được đánh giá thông qua độ lệch chuẩn

(SD), độ lệch chuẩn tương đối (RSD) của điện tích peak sắc ký Speas va thời gian lưu tạ

Định dạng
Số trang	63
Dung lượng	2,96 MB