Xác định hàm lượng vitamin e trong một số loài nấm nuôi cấy bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao

TRƢỜNG ĐẠI HỌC VINH 664 KHOA HÓA HỌC ===  === đồ án tốt nghiệp Đề tài: Xác định hàm l-ợng vitamin E số loài nấm nuôi cấy ph-ơng pháp sắc kí lỏng hiệu cao GV h-ớng dẫn : Ths hoàng văn trung SV thực : HỒNG THỊ LAN Líp : 50K - C«ng nghƯ thùc phÈm M· sè SV : 0952040407 NGHỆ AN - 01/2014 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM TRƢỜNG ĐẠI HỌC VINH ĐỘC LẬP - TỰ DO - HẠNH PHÚC NHIỆM VỤ ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Họ tên sinh viên: Hoàng Thị Lan MSSV: 0952040407 Khóa: 50 Ngành: Cơng Nghệ thực phẩm Tên đề tài: “Xác định hàm lượng vitamin E số lồi nấm ni cấy phương pháp sắc kí lỏng hiệu cao ” Nội dung nghiên cứu, thiết kế tốt nghiệp: …………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………… Họ tên cán hƣớng dẫn: ThS Hoàng Văn Trung Ngày giao nhiệm vụ đồ án: Ngày tháng năm Ngày hoàn thành đồ án: Ngày tháng năm Ngày tháng năm 2014 Chủ nhiệm môn Cán hƣớng dẫn (Ký, ghi rõ họ, tên) (Ký, ghi rõ họ, tên) Sinh viên hoàn thành nộp đồ án tốt nghiệp ngày tháng năm 2014 Ngƣời duyệt (Ký, ghi rõ họ, tên) BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM TRƢỜNG ĐẠI HỌC VINH ĐỘC LẬP - TỰ DO - HẠNH PHÚC BẢN NHẬN XÉT ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Họ tên sinh viên: Hồng Thị Lan MSSV: 0952040407 Khóa: Ngành: Cơng nghệ thực phẩm 50 Cán hướng dẫn: ThS Hoàng Văn Trung Cán duyệt: Nội dung nghiên cứu, thiết kế: ………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………… Nhận xét cán hƣớng dẫn: ………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………… …………………………………………… …………………… Ngày tháng năm 2014 Cán hƣớng dẫn (Ký, ghi rõ họ, tên) BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM TRƢỜNG ĐẠI HỌC VINH ĐỘC LẬP - TỰ DO - HẠNH PHÚC BẢN NHẬN XÉT ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Họ tên sinh viên: Hoàng Thị Lan MSSV: 0952040407 Khóa: Ngành: Cơng nghệ thực phẩm 50 Cán hướng dẫn: ThS Hoàng Văn Trung Cán duyệt: Nội dung nghiên cứu, thiết kế: ………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………… Nhận xét cán duyệt: ………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………… …………………………………………… …………………… Ngày tháng năm 2014 Cán duyệt (Ký, ghi rõ họ, tên) C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an LỜI CẢM ƠN Khóa luận thực phịng thí nghiệm Trung tâm Kiểm định An tồn Thực phẩm Môi trường, Trường Đại học Vinh Với lịng kính trọng biết ơn sâu sắc, tơi xin chân thành cảm ơn đến thầy giáo Th.s Hoàng Văn Trung - Khoa Hóa, Trường Đại học Vinh giao đề tài, tận tình hướng dẫn, tạo điều kiện thuận lợi suốt q trình nghiên cứu hồn thành khóa luận Tơi xin chân thành cảm ơn Ths Chu Thị Thanh Lâm - Khoa Hóa, Trường Đại học Vinh tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ tơi q trình làm thí nghiệm Đề tài hồn thành nhờ hỗ trợ kinh phí từ đề tài Nghị định thư hợp tác Việt Nam - Đài Loan PGS.TS Trần Đình Thắng - khoa Hóa học, Trường Đại Học Vinh Nhân dịp này, xin gửi lời cảm ơn đến quý thầy cô, cán khoa Hố, cán hướng dẫn thí nghiệm phịng chuẩn bị, phịng Hóa thực phẩm, nghiên cứu sinh Trung tâm thí nghiệm - Trường Đại học Vinh tạo điều kiện cho học tập nghiên cứu môi trường học tập khoa học, giúp cho tơi có kiến thức vững vàng trước bước vào đời Cuối xin tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè, động viên, giúp đỡ tơi hồn thành khóa luận Xin trân trọng cảm ơn! Vinh, ngày tháng 01 năm 2014 Sinh viên thực Hoàng Thị Lan i Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an MỤC LỤC rang LỜI CẢM ƠN i DANH MỤC BẢNG, HÌNH VẼ iv DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ CÁI VIẾT TẮT vi LỜI MỞ ĐẦU 1 Lí chọn đề tài .1 Nhiệm vụ nghiên cứu .1 Chƣơng TỔNG QUAN Tổng quan nấm 1.1 Giới thiệu giới nấm 1.2 Phân loại nấm 1.3 Các đặc điểm sinh học nấm .6 1.3.1 Đặc điểm cấu tạo tế bào 1.3.2 Đặc điểm dinh dưỡng 1.4 Tổng quan vitamin nấm 1.5 Công dụng nấm 1.5.1 Giá trị dinh dưỡng nấm 1.5.2 Giá trị dược liệu nấm .11 Tổng quan vitamin 12 2.1 Khái niệm .12 2.2 Vai trò đặc điểm chung 12 2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến vitamin .13 2.4 Phân loại .13 2.5 Vitamin E (Tocoferol) 14 2.5.1 Giới thiệu vitamin E 14 2.5.2 Tính chất .14 2.5.3 Vai trò 15 2.5.4 Nguồn vitamin E 16 ii Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an 2.5.5 Nhu cầu sử dụng vitamin E 19 2.5.6 Rối loạn liên quan đến vitamin E 20 2.5.7 Sự chuyển hóa- biến đổi vitamin E 21 Giới thiệu phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) 23 3.1 Cơ sở lý thuyết 23 3.2 Nguyên tắc trình sắc ký cột 24 3.3 Phân loại sắc ký ứng dụng .25 3.4 Các đại lượng đặc trưng sắc ký đồ 26 3.5 Hệ thống HPLC 29 Chƣơng THỰC NGHIỆM 31 2.1 Thiết bị, dụng cụ 31 2.2 Hóa chất 31 2.3 Thực nghiệm 32 2.3.1 Sơ đồ xử lý chất chuẩn mẫu 32 2.3.2 Cách tiến hành: .33 2.3.3 Điều kiện sắc ký 35 2.4 Khảo sát đánh giá phương pháp 36 2.4.1 Khảo sát giới hạn phát (LOD) giới hạn xác định (LOQ) phương pháp 36 2.4.2 Khảo sát độ lặp .36 Chƣơng KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .37 3.1 Xác định khoảng tuyến tính đường chuẩn Vitamin E .37 3.2 Xác định độ lặp lại phương pháp 40 3.3 Đánh giá hiệu suất thu hồi phương pháp .43 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 49 Kết luận 50 Kiến nghị 50 TÀI LIỆU THAM KHẢO 51 iii Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an DANH MỤC BẢNG, HÌNH VẼ Trang Hình: Hình Mẫu nấm 01 Hình Mẫu nấm 621 Hình Mẫu nấm HKG 401 .3 Hình Mẫu nấm HKG 406 .3 Hình Mẫu nấm lỗ .4 Hình Mẫu nấm TH04 .4 Hình 1.1 Cấu trúc tế bào nấm Hình 1.2 Hệ thống sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) Agilent 1100 29 Hình 1.3 Sơ đồ nguyên lý máy sắc ký lỏng hiệu cao 30 Hình 2.1 Q trình xà phịng hóa mẫu 34 Hình 2.2 Lọc mẫu sau xà phòng 34 Hình 2.3 Chiết với dietyl ete hóa qua giấy lọc 34 Hình 2.4 Lọc dịch qua lớp Na2SO4 khan .35 Hình 2.5 Hệ thống cô quay chân không 35 Hình 3.1 Đường chuẩn biểu thị mối quan hệ diện tích peak thu nồng độ chuẩn vitamin 38 Hình 3.2 Sắc đồ mẫu chuẩn có nồng độ 4ppm 44 Hình 3.3 Sắc đồ mẫu chuẩn có nồng độ 10ppm 45 Hình 3.4 Sắc đồ mẫu chuẩn có nồng độ 20ppm 45 Hình 3.5 Sắc đồ mẫu chuẩn có nồng độ 40ppm 46 Hình 3.6 Sắc đồ mẫu nấm 01 .46 Hình 3.7 Sắc đồ mẫu nấm HKG401 47 Hình 3.9 Sắc đồ mẫu nấm lỗ thêm chuẩn 48 iv Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Bảng: Bảng 1.1 Hàm lượng vitamin chất khoáng Bảng 1.2 Tỉ lệ % so với chất khô Bảng 1.3 Thành phần axit amin (amino axit) Bảng 1.4 Thành phần nguyên tố vi lượng có Nấm ăn 10 Bảng 1.5 Hàm lượng tocopherol số loại dầu thực vật 17 Bảng 1.6 Hàm lượng tocopherol số loại thực phẩm 18 Bảng 1.7 Hàm lượng vitamin E số loại thực phẩm .19 Bảng 1.8 Nhu cầu RRR-alpha-tocopherol (D-alpha-tocopherol) độ tuổi 20 Bảng 1.9 Độ bền tocopherol trình chiên rán nhiệt độ cao 22 Bảng 1.10 Hàm lượng vitamin E số thực phẩm thị trường 23 Bảng 3.1 Diện tích peak vitamin E tương ứng với nồng độ chuẩn 37 Bảng 3.2 Giá trị LOD LOQ .38 Bảng 3.3 Kết phân tích hàm lượng vitamin E nấm .40 Bảng 3.4 Kết trung bình, độ lệch chuẩn, hệ số biến thiên mẫu nấm 41 Bảng 3.5 Kết xác định hiệu suất thu hồi nấm lỗ 43 v Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ CÁI VIẾT TẮT HPLC Sắc ký lỏng hiệu cao IC - HPLC Sắc ký rây phân tử - Sắc ký Gel LLC Sắc ký phân bố - Sắc ký chiết LOD Giới hạn phát LOQ Giới hạn định lượng UV - VIS Ultraviolet - spectrophotometer IU Là đơn vị quốc tế dùng để định lượng vitamin, thuốc số chất sinh học khác VLDLs Lipoprotein tỉ trọng thấp HDLs Lipoprotein tỉ trọng cao LDLs Lipoprotein tỉ trọng thấp DRI Thuật ngữ chung cho tập giá trị tham chiếu sử dụng để lập kế hoạch đánh giá lượng chất dinh dưỡng người khoẻ mạnh DRIs Chế độ phần ăn tham khảo RDA Hàm lượng vitamin E cho phép sử dụng vi Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Hình 3.1 Đường chuẩn biểu thị mối quan hệ diện tích pic thu nồng độ chuẩn vitamin Giá trị LOD LOQ phương pháp qua lần đo nồng độ khác 4ppm, 10ppm, 20ppm, 40ppm ta đươc kết bảng sau : Bảng 3.2 Giá trị LOD LOQ Giá trị Chuẩn vitamin E(ppm) LOD 0,0043 LOQ 0,0143 Trong đó: 3*Sy LOD = m 10*LOD LOQ = m hệ số góc phương trình hồi quy 38 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Độ lệch chuẩn Sy: Σ( Xi – Xtb )2 Sy = n-1 Giá trị trung bình Xtb: ΣXi Xtb = n Qua bảng số liệu ta thấy phương pháp có khoảng giới hạn phát khoảng định lượng nhỏ chứng tỏ thiết bị có độ nhạy cao, phát hàm lượng vitamin E dạng vết có mẫu phân tích Từ giá trị diện tích pic đo ta tính hàm lượng vitamin E (ppm) Sau ta tính hàm lượng Vitamin E (mg/kg) có mẫu nấm theo cơng thức sau: C = (Co/m).Vdm.f Trong : - C hàm lượng Vitamin E có mẫu, tính theo mg/kg - Co: Hàm lượng Vitamin E Có dịch chiết ( Co) thông qua đường chuẩn , mg/l - f: hệ số pha lỗng (nếu có) - m: khối lượng mẫu thử (g) - Vdm: Thể tích bình định mức mẫu (ml) 39 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Bảng 3.3 Kết phân tích hàm lượng vitamin E nấm Diện tích Mẫu C0(ppm) Nấm lỗ 34,89552 1673,65884 23,26368 01 92,49783 4487,16992 61,66522 HKG401 40,73575 1952,86389 21,15716 HKG406 1,80866 46,96786 1,20577 621 57,59263 2778,18799 38,39508 TH04 5,87313 245,96680 3,91542 peak C(ppm) 3.2 Xác định độ lặp lại phƣơng pháp Theo lý thuyết thống kê, đại lượng đặc trưng cho độ lặp lại độ lệch chuẩn SD hệ số biến thiên CV% (RSD) Thực phân tích 15g nấm, tiến hành phân tích lặp lại lần điều kiện Kết phân tích lần lặp lại độ lặp lại phương pháp nêu bảng 3.4 Độ lặp lại phương pháp đánh giá qua độ lệch chuẩn tương đối (RSD) Dựa vào nồng độ tương ứng tính kết trung bình tính độ lệch chuẩn hệ số biến thiên theo công thức đây: 40 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Bảng 3.4 Kết trung bình, độ lệch chuẩn, hệ số biến thiên mẫu nấm Mẫu TT nấm lỗ Mẫu 01 Mẫu Mẫu HKG401 HKG406 Mẫu 621 Mẫu TH04 Nồng độ (ppm) 23,26368 61,66522 21,15716 1,20577 38,39508 3,91542 23,48642 61,42786 21,54311 1,17305 38,17473 3,84406 23,14963 61,97481 21,02407 1,22521 38,58320 3,98735 Xtb 23,29991 61,68929 21,24144 1,20134 38,38433 3,91561 S 0,172 0,274 0,269 0,026 0,204 0,071 CV(%) 0,74 0,44 1,26 2,16 0,53 1,81 - Giá trị trung bình hàm lượng vitamin E mẫu nấm lỗ là: Xtb = n  x = 23,29991 n i 1 n Độ lệch chuẩn: s  ( xi  xtb ) i 1 = 0,172 n 1 Độ lệch chuẩn tương đối: CV(%) = 0,172 S  100 =  100 = 0,74% 23, 29991 xtb - Giá trị trung bình hàm lượng vitamin E mẫu 01 là: Xtb = n  x = 61,68929 n i 1 n Độ lệch chuẩn: s  (x i 1 i  xtb ) n 1 = 0,274 41 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Độ lệch chuẩn tương đối: CV(%) = 0, 274 S  100 =  100 = 0,44% xtb 61, 68929 - Giá trị trung bình hàm lượng vitamin E mẫu HKG401 là: Xtb = n  x = 21,24144 n i 1 n Độ lệch chuẩn: s  ( xi  xtb ) i 1 = 0,269 n 1 Độ lệch chuẩn tương đối: CV(%) = 0, 269 S  100 =  100 = 1,26% 21, 24144 xtb - Giá trị trung bình hàm lượng vitamin E mẫu HKG406 là: Xtb = n  x = 1,20134 n i 1 n Độ lệch chuẩn: s  ( xi  xtb ) i 1 = 0,026 n 1 Độ lệch chuẩn tương đối: CV(%) = 0, 026 S  100 =  100 = 2,16% xtb 1, 20134 - Giá trị trung bình hàm lượng vitamin E mẫu 621 là: Xtb = n  x = 38,38433 n i 1 n Độ lệch chuẩn: s  ( xi  xtb ) i 1 = 0,204 n 1 Độ lệch chuẩn tương đối: CV(%) = 0, 204 S  100 =  100 = 0,53% 38,38433 xtb - Giá trị trung bình hàm lượng vitamin E mẫu TH04 là: Xtb = n  x = 3,91561 n i 1 n Độ lệch chuẩn: s  (x i 1 i  xtb ) n 1 = 0,071 42 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Độ lệch chuẩn tương đối: CV(%) = 0, 071 S  100 =  100 = 1,81% xtb 3,91561 Trong đó: Xi nồng độ vitamin E lần chạy thứ i Xtb nồng độ trung bình n lần chạy n số lần chạy lặp lại Nhận xét: Kết tính tốn cho thấy, phương pháp có lặp lại cao cho độ tốt, đáp ứng yêu cầu định lượng 3.3 Đánh giá hiệu suất thu hồi phƣơng pháp Để đánh giá hiệu suất thu hồi phương pháp tiến hành phân tích mẫu theo quy trình với phương pháp thêm chuẩn Hiệu suất thu hồi xác định theo công thức sau: %H = Trong đó: Csm  Cm C so  100% %H hiệu suất thu hồi Cs+m nồng độ tổng chuẩn thêm vào mẫu thực có đo Cm nồng độ mẫu thực đo Cso nồng độ chuẩn biết trước Hiệu suất thu hồi nấm lỗ: Bảng 3.5 Kết xác định hiệu suất thu hồi nấm lỗ Nồng độ (ppm) TT Cs+m - Cm Cso(ppm) H(%) Cs+m Cm 27,11527 23,26368 3,85159 96,28 27,33971 23,48642 3,85329 96,33 27,00201 23,14963 3,85238 96,31 43 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Từ kết ta có giá trị trung bình H% mẫu nấm lỗ là: n  X  96,30 % n i 1 Htb (%) = n Độ lệch chuẩn: s =  (x i 1 i  xtb ) = 0,026 n 1 Trong đó: xi nồng độ α-tocopherol lần chạy thứ i x nồng độ n lần chạy n số lần chạy lặp lại Độ lệch chuẩn tương đối: CV (%)= s 100  0,027% x Qua kết phân tích cho thấy, phương pháp có độ cao, hiệu suất thu hồi cao Đáp ứng nhu cầu phân tích 3.4 Sắc đồ Hình 3.2 Sắc đồ mẫu chuẩn có nồng độ 4ppm 44 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Hình 3.3 Sắc đồ mẫu chuẩn có nồng độ 10ppm Hình 3.4 Sắc đồ mẫu chuẩn có nồng độ 20ppm 45 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Hình 3.5 Sắc đồ mẫu chuẩn có nồng độ 40ppm Hình 3.6 Sắc đồ mẫu nấm 01 46 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Hình 3.7 Sắc đồ mẫu nấm HKG401 Hình 3.8 Sắc đồ mẫu nấm lỗ không thêm chuẩn 47 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Hình 3.9 Sắc đồ mẫu nấm lỗ thêm chuẩn 48 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Luận văn hoàn thành nhiệm vụ đề ra, tìm hiểu trình bày vấn đề sau: - Đã tổng quan nấm, tổng quan vitamin E tổng quan phương pháp HPLC - Đã kiểm tra, đánh giá phương pháp điều kiện phân tích với q trình thực kết thu - Đã xác định hàm lượng vitamin E mẫu nấm nuôi cấy phương pháp HPLC : + Mẫu nấm lỗ: 23,29991 ppm + Mẫu HKG401: 21,24144 ppm + Mẫu HKG406: 1,20134 ppm + Mẫu 01: 61,68929 ppm + Mẫu 621: 38,38433 ppm + Mẫu TH04: 3,91561 ppm - Đã xác định độ lặp lại vitamin E mẫu nấm lỗ với độ lệch chuẩn tương đối: CV(%) = 0,74 % - Đã xác định độ lặp lại vitamin E mẫu nấm 01 với độ lệch chuẩn tương đối: CV(%) = 0,44 % - Đã xác định độ lặp lại vitamin E mẫu nấm HKG401 với độ lệch chuẩn tương đối: CV(%) = 1,26 % - Đã xác định độ lặp lại vitamin E mẫu nấm HKG406 với độ lệch chuẩn tương đối: CV(%) = 2,16 % 49 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an - Đã xác định độ lặp lại vitamin E mẫu nấm 621 với độ lệch chuẩn tương đối: CV(%) = 0,53 % - Đã xác định độ lặp lại vitamin E mẫu nấm TH04 với độ lệch chuẩn tương đối: CV(%) = 1,81 % - Đã xác định hiệu suất thu hồi nấm lỗ 96,3% - Đã xác định giới hạn phát phương pháp LOD = 0,0043 ppm - Đã xác định giới hạn định lượng phương pháp LOQ = 0,0143 ppm Kiến nghị Kết thu luận văn góp phần đánh giá hàm lượng vitamin E thực phẩm Do thời gian không cho phép nên tơi khơng thể tiến hành phân tích hàm lượng vitamin E phương pháp khác nhau, tiến hành phân tích nhiều mẫu Nếu có thêm thời gian, tơi mong muốn xác định hàm lượng vitamin E nhiều đối tượng khác để có nhìn tổng quan vitamin E đối tượng thực phẩm Tôi hy vọng quy trình phân tích áp dụng để phân tích hàm lượng vitamin thực phẩm khác thị trường 50 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt [1] Hồng Kim Anh, Hóa học thực phẩm (2006), Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật [2] Nguyễn Văn Bá, Cao Ngọc Điệp, Nguyễn Văn Thành (2005), Giáo trình nấm học, Trường Đại học Cần Thơ - Viện Nghiên cứu Phát triển Cơng nghệ sinh học [3] Hồng Minh Châu, Từ Vọng Nghi, Từ Văn Mặc, Cơ sở hóa học phân tích, Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật [4] Tô Minh Châu, Vương Thị Việt Hoa, Vũ Thị Lâm An, Lâm Thanh Hiền, Nguyễn Thị Ngọc Diệp, Nguyễn Thúy Hương (1999), Vi sinh vật học đại cương, Đại học Quốc gia TP.HCM - Trường Đại học Nông Lâm TP.HCM [5] Nguyễn Lân Dũng (2002), Công nghệ nuôi trồng nấm - Tập 1,2, Nhà xuất Nông Nghiệp [6] Nguyễn Hữu Đống, Đinh Xuân Linh, Huỳnh Thị Dung (2003), Nuôi trồng sử dụng nấm ăn - nấm dược liệu, Nhà xuất Nghệ An [7] Phạm Luận (1999), Cơ sở lý thuyết phân tích sắc ký lỏng hiệu cao, Đại học Quốc gia Hà Nội [8] Nguyễn Hữu Nhân (2005), Dinh dưỡng học, Nhà xuất Nơng Nghiệp [9] Nguyễn Khắc Nghĩa, Xử lí số liệu thống kê, Đại học Vinh [10] Lê Duy Thắng (1999), Kỹ thuật trồng nấm - Tập 1: Nuôi trồng số nấm ăn thông dụng Việt Nam, Nhà xuất Nơng Nghiệp, TP.HCM [11] Lê Ngọc Tú (2002), Hóa sinh công nghiệp, Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật [12] Đào Hữu Vinh, Nguyễn Xuân Dũng cộng (1985), Các phương pháp sắc ký, Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật [13] Tiêu chuẩn Quốc Gia: 8276 : 2010, Xác định vitamin E sắc ký lỏng hiệu cao - Định lượng α-, β-, γ-, δ-tocopherol, Nhà xuất Hà Nội [14] Viện kiểm nghiệm, Định lượng vitamin, Nhà xuất Y học 51 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn