BAO CÁO KET QUA NGHIEN CUU DE TAI CAP BO
Tén dé tai:
NGHIEN CUU UNG DUNG PHUONG PHAP sAc KÝ LỎNG
HIỆU NĂNG CAO (HPLC) VA BO QUANG PHO UV-VIS DE
ĐỊNH TÍNH VÀ ĐỊNH LƯỢNG CÁC HOẠT CHẤT TRONG MOT SỐ THUỐC CÓ TỪ2 ĐẾN 5 THÀNH PHAN
Chủ nhiệm đề tài:
T.S THAI DUY THIN
Cơ quan chủ tri:
TRUONG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
Cơ quan phối hợp chính:
Trang 2
BAO CAO TONG KET DE TAI NGHIEN CUU
KHOA HOC CAP BO
Cơ quan quản lý đề tài: BỘ Y TẾ
Cơ quan chủ trì đề tài: TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
Tên để tài:
NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG
HIỂU NĂNG CAO (HPLC) VÀ ĐO QUANG PHỔ UV-VIS ĐỂ
ĐỊNH TÍNH VÀ ĐỊNH LƯỢNG CÁC HOẠT CHẤT TRONG
MỘT SỐ THUỐC CÓ TỪ 2 ĐẾN 5 THÀNH PHẦN
Chủ nhiệm đẻ tài: Thái Duy Thìn
Danh sách những người thực hiện chính;
1.PGS-TS Thái Phan Quỳnh Như 2 NCS-DS Trân Việt Hàng
3 ThS Nguyén Tường Vy
4 ThS V6 Nhi Ha
5 ThS Nguyén Tudn Anh,
6 DS CKI Hoàng Văn Đức
Thời gian thực hiện để tài: Từ tháng 1-2003 đến tháng 12 -2005
'Tổng kinh phí được duyệt: 190.000,000đ
Téng kinh phí được cấp: 190.000.000đ
Trang 3MỤC LỤC
Nội dung Trang
Phan A TOM TAT CAC KET QUA NOI BAT CUA DE TÀI | 1 Kết quả nễi bật của đề tài 1 2 Áp dụng vào thực tiễn xã hội 2 3 Đánh giá thực hiện đề tải đối chiếu với để cương nghiên cứu
đã được phê duyệt 2 4 Các ý kiến đề xuất 3
Phan B NOE DUNG BAO CAO CHI TIET 4
1, Đặt vấn đề 4
2 Tông quan đề t 6
2.1 Tình hình nghiên cứu trong và ngồi nước §
2.2 Tổng quan về các phương pháp phân tích 6 3 Đỗi tượng và phương pháp nghiên cứu 18 3.1 Thiết kế nghiên cửu 18 3.2 Chọn mẫu, cỡ mẫu và đối tượng nghiền cứu 18
3.3 Phương pháp nghiên cứu 19
3.4 Phương pháp xử lý số liệu 2 4 Kết quả nghiên cứu 23
4.1 Định tính và định lượng paracetamol, bromhexin hydroclorid, pseudoephedrin hydroclorid, clorpheniramin maleat va cafein bằng
phương pháp ITPLC Cñủ 0ì: PGS-TS Thái Phan Qujnh Nine 2
4.2 Định lượng đồng thời paracetamol (PA) va acid mefenamic
(AM) trong viên nén bao phim Pamesic bằng phương pháp HPLC
Chủ tì: TS Thái Duy Thìn 27
4.3 Nghiên cứu định lượng đồng thời paracetamol (PA) va cafein
(CA) trong thuốc đa thành phần bằng HPL,C Chủ mì: TS, Thái Duy Thìn 31
4,4 Nghiên cứu định lượng đồng thời paracetamol (PA) và ibuptofen
(1B) trong thuốc đa thành phần, Chứ trì: TS Thái Duy Thìn 35 4.5 Định lượng đồng thời paracelamol (PA) va quinin sulfat (QS)
trong viên bao Antigrip F bằng phương pháp HPLC
Chi tri, TS Thai Duy Thin 38
Trang 4
46 Dịnh lượng đồng thời theophylin, ephcdrin hydrochlorid và
phenobarbital trong thuốc hỗn hợp trị hen suyễn bằng phương pháp sắc
ký lỏng hiệu năng cao Chủ trì: PGS-7S Thái Phan Quỳnh Nhớ
4.7 Định lượng đồng thời paracetamol, clorpheniramin maleat va
phenylpropanolamin hydroelorid bằng nhương phap HPLC
Chat tri: TS Thai Duy Thin
4.8 Định lượng đồng thời paracetamol va ibuprofen trang vién nén
bằng phương pháp toàn phổ, Chữ tri: TS Thdi Duy Thin
† 4.9 Định lượng đồng thời paracetamol và quinin sulfat trong viên nén
Antigtip F bằng phương pháp phân tich da edu tir (MCA)
Chủ trì: NCS-DS Trần Việt Hùng
4.10 Tiểu để tài 10, Định lượng đồng thời paracetamol và acid
Trang 5
PHANA TOM TAT CÁC KẾT QUÁ NÓI BẬT CỦA ĐỀ TÀI
1 Kết quả nỗi bật của đề tài
a Đông gúp mới của đề tài
+ Chúng tôi đã khai thác, ứng dụng hai phương pháp phân tích công cụ mạnh, hiện
đại vào việc kiểm nghiệm các thuốc có nhiều hơn một thành phần hoạt chất, đó là
phương pháp HPLC và phương pháp quang phố tử ngoại phân tích đa cấu tử MCA,
sử dụng thuật toán thống kê trong việc đảnh giá các kết quả phân tích
4+ Xây dựng được phương pháp, mô hình qui trình phân tích định tính và định lượng, nói chung đổi với các hoạt chất trong một công thức thuốc phối hợp sử dụng hai
phương pháp trên
Ứng dụng thành công phương pháp, qui trình phân tích đã xây dựng vào việc kiểm nghiệm một số công thức thuốc có từ 2 tới 5 thành phần hoạt chất Đang tiếp tục nghiên cứu, đánh giá trên một số công thức thuốc phối hợp khác, đặc biệt là các
thuốc có nhiều hơn 5 thành phần hoạt chất
b KẾT quả cụ thể
+ Đã xây dựng được 10 qui trình phân tích định tính và định lượng các hoạt chất
trong 7 công thức thuốc phối hợp phố biến trên thị trường, nhiều hơn một công
thức so với dự kiến trong để cương nghiên cứu Trong đó có 7 qui trình sử dụng
phương pháp HPLC và 3 qui trình sử dụng phương pháp quang phổ tử ngoại phân
tích đa cấu tử MCA
+ Đã khảo sát trên 4 công thức thuốc có hai thành phần phối hợp, 2 công thức thuốc có ba thành phần phối hợp và l công thức thuốc có năm thành phần phối hợp
Các nghiên cứu trên đều đã được các chuyên gia về kiểm nghiệm kiểm tra, thẩm
định là có giá trị khoa học và ý nghĩa thực tiễn, đã được công bế trên các tạp chí
chuyên ngành như tạp chỉ kiểm nghiệm thuốc, tạp chí được học và tham gia báo
cáo trong các hội nghị về được nói riêng và hoá học nói chung (xem phần phụ lục)
œ.- VỀ nghiên cửu khoa học
12 công trình khoa học có liên quan đã được công bố Tham gia 3 hội nghị khoa học quốc tế:
Hội nghị được Đông dương HII 5/2003 ở Thái Lan
Hội nghị hoá học A Âu ở Hà Nội 10/2003,
Hội nghị được Đông dương IV 11/2005 ở Thành phó Hồ Chí Minh
nhằm trao đổi thông tin, kiểm chứng và bản luận về phương pháp liên quan tới các
nội dung có trong đề tài của chúng tôi
Trang 6-1-`
+
Déng gúp đào tạo cán bộ cho ngành
ĐỀ tài đã tập hợp và huy động được một số lượng lớn cán bộ trẻ cũa trường Đại
học dược Hà nội, Viện kiểm nghiệm thuốc và một số Trung tâm kiểm nghiệm dia
phương tham gia, góp phần nâng cao trình độ và kinh nghiệm chuyên môn cho các cần bộ
Góp phần đảo tạo được 2 thạo sỹ được học và một được sỹ chuyên khoa cấp 1
Có 12 sinh viên làm công trình tốt nghiệp phục vụ cho nội dung đề tài Một số sinh
viên sau khi tốt nghiệp đã phát huy tốt chuyên môn ở nơi công tác (viện kiểm
nghiệm thuốc, phòng kiểm nghiệm xí nghiệp, trung tâm kiểm nghiệm các tỉnh,
thành)
Hướng dẫn nhiều sinh viên tham gia thực nghiệm khoa học phục vụ cho đề tài có
kết quả, trong đó có 3 nhóm sinh viên tham gia báo cáo tại hội nghị khoa học tuổi
trẻ của trường, 1 sinh viên tham gia báo cáo hội nghị được đông dương
Áp dụng vào thực tiễn sản xuất và đời sống xã hội
Kết quả nghiên cứu của chúng tôi là có tính khả thi và có ý nghĩa thực tiễn, được
viện kiểm nghiệm và một số trung tâm kiểm nghiệm ứng dụng để kiểm tra chất lượng
các thuốc đa thành phần đang lưu hành trên thị trường Một số chương trình được
nghiên cứu là để áp dụng làm tiêu chuẩn cho các cơ sở Một số chương trình đang
được cáo cơ sở tham khảo đẻ xây dựng tiêu chuẩn cho sản phẩm của mình 4 L5 ° Đánh giá thực hiện để tài đối chiếu với đề cương nghiên cứu đã được phê duyệt Tiền độ hoàn thành
Đề tải hoàn thành đúng tiến độ vẻ thời gian đăng ký
Thực hiện các mục tiêu nghiên cứu
Đã hoàn thành đầy đủ theo mục tiêu và các nội dụng nghiên cứu được hội đồng
khoa học của bộ phê đuyệt, còn thực hiện thêm được 1 công thức so với đề cương
Ắ é
Các chỉ tiêu khoa học đề ra trong đề cương được tôn trọng và thực hiện đầy đủ
Két quit tgo ra so véi dự kiến cũa bân đề cương
Các kết quả thu được hoàn toàn phù hợp với dự kiến Đánh giá việc sử dụng kinh phí
Trang 7A Tóm tắt các kết
Các ý kiến để xuắt
Chúng tôi sẽ tiếp tục nghiên cứu để hoàn chỉnh và mở rộng hơn trong những để tài khác, tiếp tục đánh giá các phương pháp, qui trình và kết quả thu được; ứng đụng
nhiều hơn trong thực tiễn để có cơ sở đề nghị đưa một số chuyên luận thuốc đã thành phẩn vào được điển Việt Nam trong lần xuất bản tới
Tiếp tục nghiên cứu, ứng dụng hai phương pháp đã xây đựng cho nhiều công thức
thuốc đa thành phần khác, đặc biệt là phương pháp quang phổ tử ngoại phân tích đa
cầu tử MCA Tiếp tục mỡ rộng kết quả nghiên cứu cho một số thuốc có nhiều thành phần hoạt chất hơn
RẤt mong được sự quan tâm của Bộ Y tế và các cơ quan để đề tài có thể được áp
Trang 8
PHAN B NOI DUNG BAO CAO CHI TIET KET QUA NGHIEN
cUU DE TAI CAP BO
1, DAT VAN DE
1.1 Tính cấp thiết cần nghiên cứu của để tài
'Trong những năm gẫn đây, ở nước ta, thị trường thuốc đang phát triển nhanh cả về
sản xuất và kinh doanh Các thuốc ngoại được cấp số đăng ký lưu hành ngày càng
nhiều Theo thống kê của cục quản lý Dược Việt Nam, hiện đã có khoảng 6 nghìn mặt hàng thuốc trong nước và khoảng 4 nghìn thuốc ngoại nhập (ước tính có trên 800 hoạt chất) đang lưu hành trên thị trường Việt nam Trong số đó, các thuốc đa thành phần đã
và đang chiếm một tỷ lệ cao
Để phối hợp tác dụng dược lý trong một chế phẩm thuốc và tiện sử dụng cho bệnh
nhân, thuốc đa thành phần thường được phối hợp các hoạt chất trong cùng một nhóm:
thuốc như: các kháng sinh, các vitamin, các thuốc hạ nhiệt giảm đau, thuốc sốt rét,
thuốc chống lao v.v Cũng có thể kết hợp các hoạt chất của 2, 3 nhóm thuốc như
vitamin với thuốc hạ nhiệt, kháng sinh với thuốc chống viêm, thuốc nhỏ mắt hỗn hop,
thuốc đùng ngoài hỗn hợp v.v
Noi chung, trên thế giới, các thuốc có nhiều thành phần đang được sản xuất và sử
dụng ngày càng nhiều Như vậy việc nghiên cứu phương pháp kiểm nghiệm các thuốc
du thành phần là một việc rất cần thiết đối với các nhà sản xuất, các nhà nghiên cứu về
kiểm nghiệm và các cơ quan quản lý chất lượng thuốc
Trọng được điển Việt Nam mới nhất (D.Ð.V.N ID, hẳu như chưa có các chuyên Iuận về thuốc nhiều thành phẩn Vì vậy, việc nghiên cửu để đưa một số tiêu chuẫn cho các thuốc loại này vào dược điển trong các lần xuất bản tới là rất cần thiết
Xuất phát từ yêu cầu thực tế và cấp thiết đó, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu để
“Nghiên cứu ứng dụng phương pháp sắc ký lông hiệu năng cao (HPLO) và đo quang phé UV-Vis dé dink tink va định lượng các hoại chất trong một số thuc có
từ 2 đến 5 thành phẩn” 1.2, Mục tiêu nghiên cứu
% Xây dựng qui trình phân tích một số thuốc đa thành phẩn đã chọn (chưa có tiêu chuân hoặc có tiêu chuẩn nhưng chưa đẩy đủ hoặc có nhược điểm), dựa trên
phương pháp HPLC và phương pháp quang phổ tử ngoại phân tích đa cấu tử IMCA
> Áp dụng các qui trình trên để kiểm nghiệm các thuốc da thành phần có công thức
Trang 9
# Mục tiêu nghiên cứu cụ thể
Trong phạm vi 1 dé tài cấp bộ chúng tôi chọn một số công thức thuốc có từ 2 đến 5
thành phần để nghiên cứu (đã được bộ phê duyệu), đó là các thuốc hỗn hợp sau:
~_ Thuốc có 2 thành phần
+ Paracetamol va cafein, „.# Parag má (BA hắc
+ Paracetamol va ibuprofen Lg Cusp: pats ýC J ( 14s; Fag )
+ Paracetamol va quinin sulfat ( ƒ »~4 Wa, Mea)
- Thuéc cd 3 thanh phan
+ Paracetamol, clorphenirramin maleat va phenylpropanolamin hydroclorid + Theophyllin; ephedrine hydroclorid va Phenobarbital
~_ Thuốc có 5 thành phần
Trang 10
2 TONG QUAN TAI LIEU
2.1, Tinh hình nghiên cứu trong và ngoài nước
Trong những năm qua, ở Việt Nam ta đã có nhiều công trình nghiên cứu ở cấp cơ
sử và cấp bộ về kiểm nghiệm các thuốc đa thành phần như:
~_ Nghiên cứu định lượng đồng thời các vitamin tan trong nước và vitamin tan
trong dầu trong thuốc hỗn hợp multivitamin bằng phương pháp HPLC [10]
-_ Nghiên cứu ứng dụng quang phố UV-VIS, quang phỗ đạo hàm để định lượng,
các thuốc da thanh phan (7; 8]
-_ Nghiên cứu định lượng đồng thời các hoạt chất trong một số thuốc bạ nhiệt giảm đau bằng phương pháp HPLC [6;]
'Tuy nhiên, so với tốc độ phát triển của thị trường thuốc hiện nay thì chưa đủ đáp
ứng, còn rắt nhiều nội dung cần phải được nghiền cứu để ứng dụng trong thực tiễn
Trên thế giới, các chế phẩm thuốc đa thành phần được nghiên cứu rất nhiều, nhưng
phẩn lớn chỉ dừng ở mức tiêu chuẩn cơ sở
“Trong các dược điển lớn và thông dụng như BP, USP, EP, JP, Pháp, Quốc tế [19;
23; 24; 25; 27, 28] chủ yếu ghi các dạng thuốc đơn thành phần
Dược điển Anh (BP1998 và BP2000) có ghỉ một số thuốc đa thành phần như các
chuyên luận thuốc multivitamin, thuốc tiêm lidocain và adrenalin
Riêng được điển Mỹ (USP 23, USP 24, USP 27 ) có số thuốc đa thành phần nhiều
hơn và tập trung vào một số nhóm thuốc phổ biến như: các vitamin, nhóm thuốc hạ
nhiệt giảm đan
Các nước trong khu vực Đông Nam Á đã có những hội nghị về các phương pháp
kiếm nghiệm ngoài được điển Tổ chức Y tế thế giới cũng đã có những chương trình để tỏ chức học tập và trao đổi giữa các nước về vấn đề này,
2.2 Tổng quan về các phương pháp phân tích
2.2.1 Phương phúp sắc ký lăng hiệu năng cao (HPLC}
a Khái niệm Sắc ký lông hiệu năng cao
Tà một phương pháp tách hoá lý dựa vào ái lực khác nhau của các chất khác
nhau với hai pha luôn tiếp xúc và không đồng tan với nhau, một pha động và một
nha tĩnh
Pha động là chất lỏng chảy qua cột với một tốc độ nhất định
Pha tĩnh chứa trong cột là một chất rắn đã được phân chia dưới dạng tiểu phân
hoặc một chất lông phủ lên một chất mang rắn hay một chất mang đã được hiến đổi bằng liên kết hoá học với các nhóm hữu cơ
Quá trình sắc ký xây ra có thể theo các cơ chế: hấp phụ, phân bố, trao đổi ion
Trang 112, Téng quan tài liệu
b Các đại lượng đặc trưng của quá trình sắc ký
* Thời gian lưu và thể tịch lu
Thời gian lưu của một chất là thời gian tính từ lúc tiêm mẫu vào cột đến khi chất
đó ra khỏi cột đạt giá trị nồng độ cực đại và cho pic trên sắc ký đồ
'Nếu gọi tụ là thời gian lưu giữ của một chất:
thi: Pạ = †w - lạ
Trong đó: Œạ là thời gian lưu thực (thời gian lưu hiệu chỉnh)
1u là thời gian chết (thời gian không lưu giữ)
Trong cùng một điều kiện sắc ký đã chọn, thời gian lưu của mỗi chất là hằng định và các chất khác nhau thì thời gian lưu khác nhau tuỳ thuộc vào bản chất, cấu tạo và tính chất của chất đó Vì vậy thời gian lưu là đại lượng định tính các chất
Khi pha động chảy qua cột với một tốc độ không đổi thì thời gian hru có thể thay thé bing thé tích lưu Thể tích lưu là thể tích pha động thu được sau cột trong khoảng
thời gian tương ứng với thời gian lưu
Hình 1 Sắc ký đỗ của hai chất và các thông số đặc trưng,
*% Hêsố phân bố
Trong quá trình sắc ký luôn có sự phân bố của chất tan giữa pha động và pha tĩnh Sự phân bố này được đặc trưng bởi cân bằng phân bố với hệ số phần bố được tính theo
công thức sau:
Trong dé: Cs, Cụ là nỗng độ của chất phân tích trong pha động và pha tĩnh ở
Trang 12
HE
+ Thừa số dụng lượng
Thừa số dung lượng là đại lượng biểu thì khả năng phân bố của chất tan trong hai
pha cộng với sức chứa của cột, tức là tỷ số giữa lượng chất tan trong pha tĩnh và lượng chất tan trong pha động ở thời điểm cân bằng 9 Ys Bs xy bs Qu Vy Trong đó Qs, Qụ, là lượng chất tan có trong pha tĩnh và pha động Vs, Vy [a thé tích pha tĩnh và pha động Có thể tính k? theo một công thức khác: + Hệ tổ chọn lọc
Hai chit chỉ được tách ra khi chúng có các giá trị k" khác nhau, hệ số chọn lọc cho
°iết hiệu quả tách của hệ thông sắc ký
tap to _ f ng
lu —Íg - Fmm
Ở đây ta quy ước chất B bị lưu giữ mạnh hơn chất A, như vậy ø luôn lớn hơn l, ø
càng lớn đủ khả năng tách của hai chất càng rõ Thường phân tích trong điều kiện + trong khoảng 1,5 đến 2
** SỐ địa lý thuyết va chiều cao đĩa lý thuyết
Hiệu lực cột thường được biểu thị qua bai thông số: Số đĩa lý thuyết (N) hoặc chiều
cao đĩa lý thuyết (H) Cột sắc ký được coi như có N tầng lý thuyết, ở mỗi tầng sự phân
bố chất tan vào hai pha lại đạt đến một trạng thái cân bằng mới Mỗi tầng được giả
định như một lớp pha tĩnh có chiều cao H Đĩa lý thuyết được định nghĩa như là một
khu vực của hệ thống phân tách mà trong đó thiết lập một cân bằng nhiệt động học giữa nồng độ trung bình của chất tan trong pha nh và trong pha động,
Số đĩa lý thuyết N được tính theo các công thức: „Ý ty N=16x () hoặc 5,54x Ge} ua Trngđó W x, ve
Chiều cao của đĩa lý thuyết được tính theo công thức:
rộng pic ở đầy pic
rong pic do 6 ntra chiều cao pic
Hee N
Trong đó L là chiều cao của cột sắc ký
Trang 13
Ông quan
Dé phan giải (Rs)
Độ phân giải là đại lượng biểu thị độ tách của các chất ra khỏi nhau trong một điều kiện sắc ký đã cho Độ phân giải cúa hai pic cạnh nhau được tính theo 1 trong 3 công thức sau: ~ 2x =tu} Wah, 118x (ng —fz„} hoặc a-l Pu¿a + uy a Rs 4 Hệ số dối xứng (1) Cho biết mức độ cân đổi của pic sắc ký, nó được tính theo công thức: pale 24
Trong đó W,: la độ rộng đáy pic đo ở 1⁄20 chiều cao của pic
A : là khoảng cách từ đường vuông góc hạ từ cực đại của pic dén chan
đường cong phía trước, ở tai 1/20 chiéu cao pic
+ Phuong trink Van-Deemter
Phương trình Van-Deemter mô tả ảnh hưởng của tốc độ dòng pha động và các
thông số động học khác đến hiệu lực của cột sắc ký H=A++Cxu w
I : Chiều cao đĩa lý thuyết
u : Tốc độ dòng pha động
A, B,C : Các hệ số thay đổi phụ thuộc vào từng cột sắc ký
Trong đó: _ A: Mô tả ảnh hưởng của sự khuếch tán xoáy (eddy diffusion)
B/u: Mô tả ảnh hưởng của sự khuếch tán dọc của các phân tử chất
tan theo phương dòng chảy của pha động (longitadinal
diffussion)
€: Mô tả ảnh hưởng của sự chuyén khéi (mass transfer)
© Hệ thống HPLC: Hệ thống máy HPLC có các bộ phận chính sau:
Bình chứa dung môi (pha động)
Bơm cao áp: đây pha động qua cột sắc ký
'Bộ phận tiêm mẫu: tiêm vào cột một thể tích mẫu nhất định
Cột tách (pha tĩnh)
Detector
Trang 14
Hình 2 hệ thống HPLC hoàn chỉnh Hình 3 Các thành phần cơ bản của một
máy sắc ký lỏng hiện đại
1 Khay chứa bình dung môi (Solvent eabinet) 2 Bộ đuổi khí chân không (Vacuum degasser) 3 Bơm cao áp (Pomp)
4 Bộ tiêm mẫu tự động (Autosampler)
5 Bộ điều nhiệt cho cột (Colunim compartment),
6 Detector
7 Module diéu khién (Control module)
a Pha tinh + Khái niêm
Pha tĩnh trong HPLC là chất nhồi cột để làm nhiệm vụ tách một hỗn hợp chất phân tích Nó là những chất rắn, xốp, kích thước hạt rắt nhỏ, đường kính cỡ hạt từ 3 ~ 10 ;zn, điện tích bề mặt hạt thường từ 50 - 500 m”/g
+ Phân loai
- Căn cứ theo bản chất chính của quá trình sắc ký trong cột tách, người ta chỉa nó
thành nhiều loại như hắp phụ, phân bố, trao đổi ion và rây phân tử Tương ứng với loại chất nhối như thế người ta có một loại sắc ký riêng trong kỹ thuật
HPLC
-_ Căn cứ theo trạng thái rắn hay lỏng của pha tĩnh, người ta chia nó thành hai
loại, nếu pha tĩnh là chất rắn ta có sắc ký lỏng-rắn (LSC), nếu pha tĩnh là chất
lảng ta có sắc ký lỏng-lỏng (LUC)
-_ Căn cứ theo độ phân cực của pha tĩnh và pha động, có các loại: sắc ký pha thuận (pha tĩnh phân cực còn pha động ít phân cực), sắc ký pha đảo (pha tĩnh ít
phân cực còn pha động thì phân cực), sắc ký pha đảo tạo cặp ion và sắc ký trao
đôi ion
- _ Căn cứ theo cấu trúc xốp của pha tĩnh là các hạt rắn, người ta chia nó thành hai
loại là xốp toàn phần hạt và xốp bề mặt hạt (xếp chỉ lớp vỏ ngoài)
Trang 15
+ Điều kiện đúi với một pha fink
~_ Phải trơ và bền vững với các điều kiện của môi trường sắc ký
~ Có khả năng tách chọn lọc một hỗn hợp chất tan nhất định trong điều kiện sắc
ký nhất định
- Tinh chất bề mặt phải ôn định (đặc biệt là đặc trưng xốp của nó) - _ Cân bằng động học của sự tách phải xây ra nhanh và lặp lại tốt
-_ Cỡ hạt phải tương đối đồng nhất
Pha động Khải niêm
Pha động là dung môi dùng để rửa giải chất tan (chất cần phân tích) ra khỏi cột
tách để thực hiện một quá trình sắc ký, Đây là một yếu tố rất linh động và dễ dàng thay đổi Nó có thể là một dung môi hoặc hỗn hợp nhiều dung môi trộn lẫn với nhau theo những tỷ lệ nhất định Nó cũng có thể là dung địch các muối có chứa các chất đệm, chất tạo phức Nói chung mỗi loại sắc ký sẽ có các hệ dung mỗi rửa giải riêng để có được hiệu quả phân tách tốt nhất,
Quả trình rửa giải
Rửa giải đẳng dòng: pha động không thay đổi trong suốt quả trình ra giải
'Rữa giải gradienf: pha động liên tục thay đối (do tỷ tệ của các thành phần tạo nên
pha động thay đổi) trong suốt quá trình rửa giải Lúc này, độ phân cực của pha động cũng sẽ bị biến đổi và thường là tăng hiệu quả tách
% Gác tẫu tộ chính cần chú ÿ trong lựa chọn pha động
- _ Bản chất của đung môi lựa chọn làm pha động
~ _ Thành phẩn các chất tạo ra pha động - _ Tốc độ đòng pha động
- _ pH của pha động (đặc biệt chú ý ở sắc ký trao đổi ion và sắc ký cặp ion)
** Điều kiên đội với một pha động
-_ Phải trơ đổi với pha tĩnh,
- Hoà tan được chất cần phân tích
- _ Bên vững theo thời gian = C646 tinh khiết cao
- _ Phải nhanh đạt các cân bằng trong quá trình sắc ký
-_ Phù hợp với loại detetor đùng để phát hiện các chất phân tích,
- _ Có tính kinh tế và không quá hiểm
$ Pha động là một trong những yếu tố quyết định hiệu suất tách sắc ký của một hỗn
Trang 16* f * os ing quan tài liệu ~ _ Hiệu lực của cột tách
~_ Độ phân giải các chất trong một pha tĩnh -_ Độ rộng và sự cân đối của pÍc sắc ký
Tắt cả các dung môi đùng trong HPLC (kể cả pha động) đều phải được đuổi khí bằng cách đun nóng, hút chân không, lắc siêu âm Vì không khí hòa tan trong
đung môi sẽ tạo bọt khí trong detector và gây nhiễu tín hiệu
Cách đánh giá pie
Đánh giá điện tích pịc: Diện tích pìc của một chất tương ứng với tỗng lượng chất đó Để tính điện tích pïc, hiện nay người ta thường dùng máy tích phân điện tử gắn với máy vì tính (sai số khoảng 0,5%) hoặc máy tích phân cơ học (sai số khoảng
1,3%) Phương pháp này có thể dùng cho các pic không bị trôi đường nên vả cả pic
có đường nền bị trôi Phương pháp này chỉ cần điểm đầu và điểm cuối của pic được
nhận ra chính xác và cho kết quả tốt đối với nồng độ trung bình, vừa và cao
Đảnh giá chiêu cao pịc: Khi pc có dạng không đỗi thì chiều cao pic (khoảng cách
giữa đường nền và đỉnh pic) là một đại lượng tỷ lệ với điện tích pic và nó cũng có
thể dùng để đánh giá sắc ký đồ Phương pháp nảy chỉ áp dụng khi các chỉ số k° là
hằng định Với pic có đường nền bị nhiễu hoặc pic hẹp thì việc xác định chiều cao pic sẽ dễ dàng và chính xác hơn việc xác định diện tích pic
Cách tính kết quả
Phương phúp ngoại chuẩn; Là phương pháp đựa trên cơ sở so sánh mẫu chuẩn và
mẫu thử trong cùng điều kiện Kết quả của chất chưa biết được tính toán so với mẫu chuẩn đã biết trước nồng độ hoặc suy ra từ đường chuẩn,
Phương pháp nội chuẩn: Là phương pháp cho thêm vào mẫu chuẩn và mẫu thử
một lượng chất không đổi, mà trong cùng điều kiện sắc ký nó có thời gian lưu gần với thời gian lưu của chất cần phân tích trong mẫu thử Nó được tách hoàn toàn và có nồng độ gần bằng nồng độ của chất phân tích và có cấu trúc hoá học tương tự
Phuong pháp (hêm chuẩn: Chủ yếu được sử dụng trong kỹ thuật HPLC khi có
vẫn đề ảnh hướng của các chất phụ (ví dụ : tá được) Dung dịch mẫu thử được thêm
một lượng xác định chất chuẩn, Các pic thu được của cả hai dung dịch mẫu thử và
mẫu thử thêm chất chuẩn phải được đo trong cùng một điều kiện sắc ký Kết quả được tính toán đựa vào sự chênh lệch nồng độ (lượng chất chuẩn thêm vào) và độ
tăng của diện tích hoặc chiều cao pic
Phương pháp tinh: theo phần trăm diện tích pc: Nồng độ của mẫu thừ được tính
toán dựa trên diện tích pic tính theo tỷ lệ phần trăm diện tích pic chất thử trên tổng
diện tích toàn bộ pic có trong sắc ký đồ Trong HPLC, phương pháp này chỉ đúng
khi có sự đáp ứng của detector trên các chất là như nhau, nến không như nhau khi
đó với mỗi chất cản có hệ số hiệu chính
Trang 17
2.2.2 Phương pháp quang phổ từ ngoại phân tích đa câu tử (MCA)
a Cơ sở lý thuyết
** Nguyên tắc chưng
Cơ sở lý thuyết của phương pháp dựa trên nguyên lý “Độ hập thự quang A của một
hỗn hợp trong dụng dịch tại mội bước sóng ở bắt kỳ bằng tổng độ hấp thụ quang của
mỗi thành phần tại bước sóng đó”
“Trong dung địch, độ hấp thụ quang và nồng độ dung địch có mi liên hệ với nhau
theo định luật Lambert - Beer:
A: độ hấp thụ quang tại bước sóng 2
E: độ hấp thụ riêng tại bước sóng 2 C: nồng độ dung dịch
d; bề đầy cốc đo,
ta có thể viết gọn lại nhự sau: A = K,C (với K =E.đ được gọi là hệ số tý lệ)
Nếu ta giả sử hỗn hợp cần đo cô n thành phẩn thì theo nguyên lý trên ta có:
Tại bước sông thứ nhất: Ai= Ki(C¡ +KqaCŒ+ + Ki,C; @)
Khi độ hấp thụ quang được do tai m bước sóng, ta sẽ thu được hệ gồm œ phương
trình, với niần số về nồng độ ( Cạ) và n m ấn số về hệ số tỷ lệ ( K„„ )
Ai= KuiCi + Ki¿€; + + KiuCa
Az=K¿¡Ci + Ka¿C + + KanCa
A=ECd (1)
G)
Kyi, + Kix, + + Kay
Hệ trên có thể viết gọn lại đưới dạng ma trận đại số tuyến tính như sau;
4 Ki Kụ; Ki
Ay | _ | Kay Kaa Kan GQ
4m} (Ka Kno Ka n
Trong dé: [A] 14 ma tran d6 hap thy quang, duge do trén may
IK] là ma trận hệ số tỷ lệ, được xác định trước bằng cách đo phố
của các dung dịch chuẩn hỗn hop da biết trước nồng độ
[C] là ma trận nằng độ của các thành phần trong hỗn hợp
Để có thể giải được phương trình (4) ta cần phải chuyển ma trận chữ nhật [K]a„
thành ma trận vuông bằng cách nhân với ma trận chuyển vị của K Giả sử m > n, khi đó ta có thể viết phương trinh (4) dưới dạng sau:
Ags KInn-Ena (5)
Nhan ca hai vé cha phuong trinh (3) với ma trận chuyển vi cia K {4 [K Jug ta doe
Trang 18
[Jun Ay = [K Jos ER an Ent 9 (Zh = [Tne Gy
Trong thực tế của bài toán, C là nồng độ chưa biết cần tìm của mẫu thở, vậy ta có
thể viết phương trình trên dưới dạng như sau
Ổ,=[TT'sa.[Z+ 6)
Như vậy, dễ xác định nồng độ chưa biết của mẫu thử, điều quan trọng là ta cần phải
giải được phương trình (6) dựa trên việc xác định ma trận hệ số hấp thu [K]„„ thông
Ap thy 4,,,
qua do
s* Gidi hé Cremer bing phuong phúp Gauss
Một hệ phương trình đại số tuyến tính chỉ tìm được nghiệm, khi số phương trình của hệ lớn hơn hoặc bằng số ấn (nghĩa là ta phải có mè > n) Trong trường hợp tối thiểu
với m = n, khi đó ta sẽ có hệ n phương trình n dn va ma trận [K] là một ma trận vuông
(kích cỡ n x n), đây chính là hệ Cremer quen thuộc trong đại số tuyển tính Đ giải loại
hệ này ta dùng phương pháp Gauss Xét hệ phương trinh Cremer sau: có ma trận hệ số Ha hy 8i XI + 812Ä2 † + 8izXn = by Ag 1X1 + ay 2X2 + + Aggka = by ¬ tai Bây Oe A= a
aIXI T Bang: + † ângXn = Đụ By Oya Ing
Phương pháp Gauss là phương pháp giải bằng cách dùng các biến đổi sơ cấp dé đưa hệ đã cho về hệ tam giác có dạng:
có ma trận hệ số
ay 1X + ay ok, + + „Xa = bị fin bg
anak) + + Agha = be Aa|2 z , : a “ Maren! ogy
AnaXa = Dp
Với giả thiết am, # 0, khi đó việc giải hệ tam giác trên rất đơn giản.Từ phương
trình cuỗi ta sẽ tìm được xạ, thể lên các phương trình tiếp trên tìm được X„ , Xạz và
x ở phương trình đầu tiên
% Phân tích chuẫn, đánh giá chất lượng của phân tích chuẩn bằng cách úp dung tội bình phương lu và các thẳng kê tưởng quan
u (least square method) sẽ làm cho độ đúng trong việc
phân tích chuẩn cao hơn vì nó làm giảm thiểu sự sai khác giữa nồng độ thực (entered concentration) va nồng 46 tinh toan duge (calculated concentration)
Trang 19
Giả thiết số lượng các hỗn hợp chuẩn được sử dụng là p Theo đạng ma trận của hệ
(4) ở trên
Chúng ta đã biết muốn xác định được ma trận hệ số [K] của hỗn hợp gồm n chất thì
ta phải sử dụng tối thiểu n dung địch hỗn hợp chuẩn và đo tại tối thiểu là n bước sóng
(m = n= p) dé có nŸ phương trình xác định một nghiệm duy nhất của hệ gồm n” phần
tử của K
Ví dụ: muốn xác định các hệ số K của hỗn hợp gồm 2 chất, ta phải sử dụng tối
thiểu 2 dung dịch hỗn hợp chuẩn và đo mật độ quang tại tối thiểu 2 bước sóng khi đó ta sẽ có 2 x 2 =4 phương trình xác định các giả trị của hệ số tỷ lệ K„„, cụ thể như sau:
Tại bước sóng 1
dung dịch hỗn hợp chuẩn I: Á; = KịaC¡ + KịzC;
dung dịch hỗn hợp chuẩn2: A;= K;C¿ + KịzC¿
Tại bước sóng 2
dung dịch hỗn hợp chuẩn I: Á; =K;„C¡ + K;zC› dung địch hỗn hợp chuẩn 2: Á¿= Kạ¡C; + K;zC¿
'Trên thực tế, ta có thê giảm sai số trong phân tích chuẩn bằng cách áp dụng nguyên
lý bình phương tối thiểu “sử dụng số lượng các dung dịch hỗn hợp chuẩn nhiều hơn số
cấu tử (p>rj", khi đó hệ trên sẽ trở thành “hệ trên xác định- overdetermined system”
Về nguyên tắc, để giải loại hệ này ta đưa về việc giải hệ Cremer, khi đó mỗi lẫn chúng
ta chỉ cẩn dùng giá trị phân tích của n dung dịch chuẩn trong số p dung dịch sử dụng (p
> n), vậy chúng ta gặp bài toán tổ hợp chập n của p phần tử Theo công thức tính tổ
hợp ta có:
a ph
Oma 0
Kết quả là ta sẽ có C7; trường hợp, nghĩa là ta sẽ có tương ứng C„ hệ Cremer và
thu được C7 nghiệm, mỗi nghiệm gồm nỄ giá trị tương ứng với n° phan tử của hệ số
tỷ lỆK
Ví dụ: vẫn với trường hợp hỗn hợp có 2 chất ở trên, để phân tích chuẩn chúng ta sẽ
dùng 5 chuẩn hỗn hợp, Nếu giả thiết chỉ đo tại hai bước sóng thì s8 06 C3 = 10 trường hợp và sẽ có 10 giá trị ma trận chuẩn hóa K, có nghĩa là ta đã phải giải 10 hệ phương trình, mỗi hệ có 4 phương trình để xác định 4 ấn số là các hệ số tỷ lệ K của 2
chất tại hai bước sóng,
Từ các giá trị K này, tính được ma trận trung binh [K}¿ và sẽ xác định được nồng độ của mỗi thành phần trong dung địch chuẩn hỗn hợp theo công thức:
[C]=[Kls°JAJ (10)
Trang 202 Ting
So sánh các giá trị C này với giá trị nồng độ mà ta pha ban đầu cho mỗi thành phần
trong hỗn hợp ta sẽ tính được sự sai khác giữa nồng độ tính được ở trên và nồng độ
thực của các dung địch chuẩn hỗn hợp San đó, ta có thể dùng các thống kê tương quan
để đánh giá sai số cữing như chất lượng đường chuẩn
4 Phân tích mẫu thử và áp đụng thuật toán bình phương lối thiểu trong phân tích
mẫu thử
Sau khi phân tích chuẩn để xác định ma trận hệ số tỷ lệ [K]ạ và chất lượng của nó đựa vào các thống kê đã nêu, ma trận [K]„ được sử dụng để tính trực tiếp nồng độ
chưa biết của mẫu thử Theo nguyên lý bình phương tối thiểu, khi tăng số bước sóng, phân tích sẽ giám được sai số của phép đo (giảm giá trị tổng bình phương của sự sai khác giữa nồng độ trung bình và nồng độ của từng trường hợp tổ hợp bước sóng), và sai số sẽ càng nhô khi số bước sóng phân tích càng tăng Do đó, để giảm sai số của phép đo, chúng ta sẽ dùng số lượng các bước sóng phân tích lớn hơn số cấu tử trong
hỗn hợp (m > n) bằng cách sử dụng thêm nhiều thông tin hơn của phố
hư vậy, để tỉnh nồng độ chưa biết của mẫu thử, mỗi lần ta chỉ cần sử dụng giá trị
độ hấp thụ quang đo tại n bước sóng trong số m bước sóng phân tích, ta lại gặp bài toán tỗ hợp chập n của m phần tử Vẫn ở ví dụ trên, trong trường hợp dùng 6 bước
séng phan tích cho hỗn hợp gồm có hai chất, chúng ta sẽ giải được C¿ = 15 giá trị
cho néng độ của mỗi thành phần và kết quả sẽ là giá trị trung bình của 15 giá trị ma ta
tính được,
b Phần mềm cho phân tích đa câu tử MCA
"Thực tế, cơ sở lý thuyết của phương pháp phân tích đa cầu từ (MCA) cũng như các
thuật toán để giải quyết nó đã có từ lâu, và đã có thẻ thực hiện được ngay từ khi có
máy quang phố UV-Vis Tuy nhiên, đo hạn chế về độ chính xác của các thiết bị phân
tích, cũng như hạn chế về thiết bị xử lý số liệu dẫn đến kết quả phân tích không chính
xác hoặc có thể đo được chỉnh xác nhưng lại phải khá công phu trong việc tính toán
kết quả
Năm 1989-1990: Hãng Beckman giới thiệu phần mềm phân tích quang phổ MCA trên các máy quang phổ Beckman DU thông thường, Để phân tích MCA trên thế hệ máy này, trước hết chúng ta phải lựa chọn một số bước sóng phân tích thích hợp đối với mỗi thành phần, sau đó tiễn hành phân tích các mẫu chuẩn và mẫu thử, cuối cùng, là xử lý kết quả dựa vào phần mềm trên máy tính điện tử
Các thế hệ máy quang phổ hiện đại sau này như: DU 650i, DU 7000 của hãng Beckman hay HP8452, HP8453 của hãng HP có sự cải tiến rõ rệt cả về phần cứng và phần mềm Về phần cứng, các máy được trang bị bộ vi xử lý tốc độ cao, cấu hình quang học cải tiến, detector chuỗi diot được nếi với bộ truyền và biến đổi dữ liệu tốc
độ cao, cho phép phân tích phổ nhanh hơn, tăng độ nhạy và độ lặp lại cũa bước sóng,
Trang 21
đồng thời thu được toàn bộ dữ liệu phổ trong khoảng bước sóng đã chọn dùng cho
phân tích Sự cải tiễn về giao điện phần mềm, dùng thuật toán chuyển hỏa chuỗi Fourier trong xử lý đữ liệu phố, cũng như là áp đụng các = kê toán học đã làm cho
việc tính toán kết qua trở nên đơn giản hơn với sai số
Hiện nay ở nhiễu cơ sở kiểm nghiệm chưa được trang bị các thế hệ máy quang phổ hiện đại như trên, vì vậy chúng tôi đã thiết lập một phần mềm xử lý kết quả cho phép
áp dụng kỹ thuật MCA để phân tích được một số chế phẩm có từ 2 đến 3 thành phần
hấp thụ quang trên máy quang phổ thông thường Chương trình xử lý này mà thuật giải
của nó dựa trên việc giải quyết hai bài toán chủ yếu, đó là: phương pháp Gauss để khử
hệ phương trình Cramer; tổ hợp để xử lý các kết quả thu được từ nhiều hệ Cramer (hệ
trên xác định-overdetermined) cùng với việc loại bỏ các kết quả quá sai lệch theo
nguyên lý của thuật bình phương tối thiểu (Ieast square method)
Hình 4 Cửa số chương trình phân tích
da cdu tir MCA Hình 5 Thiết lập các thông số chung
Trang 22
xà phương pháp nại
3 ĐỒI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 Thiết kế nghiên cứu
Đề tài được thiết kế theo mô bình nghiên cứu thực nghiệm tại phòng thí
nghiệm
N dung nghiên cứu;
Thử nghiệm tìm kiếm kỹ thuật hoặc giải pháp để loại trừ ảnh hưởng của các
thành phần khác (kế cả tá được), khai thác các ứng dụng của phương pháp sắc
ký lông hiệu năng cao (IPLC) và phương pháp quang phổ LV-Vis hiện đại vào
việc phân tích các thuốc đã chọn
Nghiên cứu xây dựng các phương pháp định tính và định lượng đồng thời nhiều
hoạt chất trên các thiết bị HPLC và quang phổ UV-Vis hiện có
Nghiên cứu phương pháp xử lý mẫu, khảo sát tính tuyến tỉnh, chứng minh bằng thực nghiệm tính đúng, tính chính xác,
Đánh giá ích lợi và Linh kha thi của phương pháp
Ứng dụng các phương pháp đã xây dựng vào việc kiểm nghiệm một số thuốc
đang lưu hành trên thị trường
Dự kiến xây đựng phương pháp định tính và định lượng một số thuốc có chứa từ 2
đến 5 thành phần, cụ thể như sau:
Thuốc có 2 thành phan:
+_ Paracetamol và cafein + Paracetamol va ibuprofen
+ Paraectamol va quinin sulfat + Paracetamol va acid mefenamic
Thuốc có 3 thành phần:
+ Paracetamol, clorphenitramin maleat và phenylpropanotamin hydroclorid + Theophyllin, ephedrin hydroclorid va phenobarbital
Thuốc có 5 thành phần:
+ Paracetamol, cafein, pseudocphedrin hydroelorid, bromhexin hydroclorid va
clorphenirramin malcat
Mỗi chương trình cho muột công thức thuốc sẽ là một tiếu đề tài
3.2 Chọn mẫu, cỡ mẫu và đối tượng nghiên cứu
Chọn mẫu và cỡ mẫu
Chọn các mẫu thuốc điển hinh, có từ hai thành phần trở nện cho các tiểu đề tài
Mỗi liêu đẻ tài chọn tối thiểu lâ 2 mẫu thuốc để nghiên cứu với số lượng đủ để
làm các khảo sát thực nghiệm
Đối trợng nghiên cứu Các mẫu thuốc áp dụng tuỳ theo thị trường cung cấp
Trang 23+18-3 Đội tượng và phương pháp nghiên cứu
3.3 Phương pháp nghiên cứu
3.3.1 Phương pháp sắc Ký lông hiệu năng cao (HPLC) a Chỉ liễu nghiên cứa
Các chỉ tiên nghiên cứu được mô tả ở sơ đồ sau
b Phương pháp xác định các chỉ tiêu nghiên cite ** Lựa chọn điều kiên sắc ký ~_ Thiết bị HPLC Với máy HPLC ta quan tâm nhất tới detector, có thể gặp một số loại detector
sau: detcctor hắp thụ tử ngoại - khả kiến (UV-Vis), detcctor hấp thụ tử ngoại (UV),
detector huynh quang (FLD: fluoreseenee detector), đetector chiết suất vỉ sai,
detector ion hóa ngọn lửa, detector hồng ngoại (TR)
Phễ biến nhất là đetector UV-Vis (190nm - 900nm) như: detector mang diode (DAI: diode amray đetector), đetector đo ở nhiều bước sóng (MWD: mulli
wavelength detector), đetcelor đo ở bước sóng thay đổi (VWD: variable
wavelength detector)
Trong dé detector mang diode lả loại đetector hiện đại có độ nhạy rất cao, đặc
biệt là có khả năng quét phổ và do nhiều bước sóng cùng một lúc, do đó đối với một hỗn hợp gồm nhiều thành phan ta c6 thé chon cho mỗi thành phần một bước sóng phát hiện thich hợp nhất
~ Loai
dùng phân tích (pha tĩnh): cột của hãng nảo, kích thước cột ra sao, các
thông số về loại pha tĩnh, cỡ hạt, độ xốp hạt
- Pha dong:
+ Thanh phan va tỷ lệ các thành phẩn của pha động, pH
dong (isocratic)
éu ia rita gidi ding
+ Thanh phần và chương trình dung môi nếu là rửa giải gradient,
Trang 24
Lau ý: Pha động là một yếu tế rất linh động, ta cớ thể để dàng thay đổi để
thu được kết quả tách tốt nhất bằng cách thay đổi tỷ lệ các thành phần, thay đổi pH Bude song phat h phải thích hợp với mỗi thành phần Tốc độ đòng pha động: khảo sát dễ chọn tốc độ phù hợp nhất Thể tích tiêm: thường lả 20ul, 50p ~ Nhị độ cột phân tích
+* Khảo sát đồ tuyến tính của các thành phẫn cân phân tích
Ta biết rằng, nồng độ của mỗi chất phân tích đều có mối quan hệ tuyến tính
với diện tích hay chiều cao pic sắc ký (trong một khoảng nỗng độ nhất định nào
đó) Nghĩa là trong khoảng nằng độ đó thì diện tích (S) hay chiều cao (h) pic
phụ thuộc vào nồng độ (C) theo một hàm bậc nhất,
§ =a.C + bhoặc
h=a.C +b (a, b là hệ sổ)
Chúng ta cần phải xác định khoảng tuyển tink nay bằng thực nghiệm từ đó
làm cơ sở để pha các dung dịch phân tích có nồng độ nằm trong khoảng tìm
được
Tién hành pha một dung dịch gốc, sau đó pha loãng dung dịch gốc này để
thu được một đãy dưng dịch chuẩn biết trước nổng độ Dem cdc dung dich chuẩn này chạy sắc kỷ để thu được giá trị diện tích hay chiều cao pic, lập phương trình hồi qui, đánh giá độ tuyển tính thông qua hệ $% Chuẩn bị cúc dụng dịch phân tích Trong phương pháp IIPLC, thông thường ta tính kết quả bằng cách so sánh tương quan r
mẫu chuẩn và mẫu thử trong cùng điều kiện Do đó, ta cần chuẩn bị các dung, dịch chuẩn và các dung địch thử cho qưá trình sắc ký
$* Khảo sát tính thích hợp của hệ thông
Yêu cầu ở bước này là phải kiểm tra xem oác điều kiện sắc kỷ ta đã lựa chọn có thích hợp không? Ta thử chạy một mẫu phân tích với điều kiện sắc ký đã
chọn, nếu các píc tách khỏi nhau hoàn toàn, pie nhỏ, gọn là được “> Khảo sút độ chính xác của phương phúp
Độ chính xác thường được xác định thông qua độ lặp lại của phương pháp
(cách thông thường nhất là xác định độ lệch chuẩn tương đối của kết quả phân
tích RSD - theo các được điển hoặc sai số tương đối)
Tiến hành khảo sát độ lặp lại bằng cách định lượng riêng biệt trên nhiều
mẫu giống nhau của chất cần phân tích rồi xử lý kết quả bằng phương nháp thống kê
Trang 2514 pháp
+* Khảo sát độ đúng của phương pháp
Độ đúng được xác định thông qua khả năng thu hồi của kết quả phân tích khi dùng phương pháp thêm chuẩn
Thêm vào mẫu thử một lượng chính xác chất chuẩn đã biết trước hàm lượng sao cho dung địch cuối cùng có nồng độ nằm trong khoảng tuyến tính đã khảo
sát, xác định phần trăm tìm lại
3.3.2 Phương pháp quang phổ phân tích đa cẫu tử (MCA)
a Chỉ tiêu nghiên cứu
Các chỉ tiêu nghiên cứu được mô tã ở sơ đồ sau
È Phương pháp xác định các chỉ tiêu nghiên cứu
+ Khdo sát phố hấp thu UV va lua chon cde bước sông, hoặc giải súng phân
tích
** Xác định khoảng nông độ phân tích s* Chuẩn bị đữy dung dịch chuẩn hỗn hợp
+ Đo độ bắp tịuu quang của các dụng dịch chuẩn bỗn hợp
$% Xây dựng, đúnh giá, tỗi ru đường chuân bằng phần mém trén mdy tinh Phân tích mẫu thử
+ Đảnh giá độ đúng và độ chính xắc của phương pháp
Phan này tương tự như đối với phương pháp HPLC
[Khảo sát phổ hấp thụ UV và lựa chọn các bước sóng, lhoặc giải sóng phần tích
(Chul bị đây dung địch chuẩn hôn hợp
(Đo:độ hảo thụ quang của các dụng địch chuân hỗn hợp
(Xây dựng, đánh giá, tối ưu đường chuẩn bằng phần mềm
lưỡn mmáy tính
[Phân tịch mẫu thử
(Bath gid dg ding va độ chính xác của phương pháp
Trang 26-21-_3 Déi tượng và phương pháp nghiên cứu
3.4 Phương pháp xử lý số liệu
-_ Đánh giá phương pháp phân tích và các kết quả phân tích: sở dung phương pháp
thống kê, sử dụng công cụ hỗ trợ là chương trình Microsoft Excel
Trang 27
( quả nghiên cứa
4 KÉT QUÁ NGHIÊN CỨU
4.1 Định tinh và định lượng paracetamol, bromhexin hydroelorid, pseudoephedrin hydroclorid, clorpheniramin maleat và cafein bằng phương
pháp HPLC
Viên nang hạ nhiệt, giảm đau, chữa ho “Cotussin” do công ty dược phẩm Tiền
Giang nghiên cứu sản xuất có công thức như sau; - Paracetamol (PA) 280 mg - Cafein (CA) 30 mg - Pscudoephedrin hydraciorid (PE) 10 mg - Bromhexin hydroclorid (BH) 8 mg - Clorpheniramin maleat(CM) 4 mg Trong các tài liệu tham khảo, chưa thấy sắn phẩm nào có công thức như trên
Vì vậy để giúp các cơ sở xây dựng tiêu chuẩn cho sản phẩm của mình, chúng tôi
đã nghiên cứu phương pháp định lượng 5 hoạt chất trên trong viên hỗn hợp bằng
phương pháp HPLC với điều kiện sắc ký lỏng pha thuận, detoctor UV và chương trình she ky dng dong A Thực nghiệm A1, Máy móc, dụng môi, hoá chất a Máy móc đụng cụ - _ Máy sắc ký lông hiệu năng cao HP 1100 với deteetor LJV - VIS - Cét Lichrosorb $i 60 (250 x 4 mm; 5 wm)
~ May lée siéu am
- _ Cân phân tích với độ chỉnh xác 0,! mẹ
b Hoá chất dụng môi
~_ Methanol tỉnh khiết sắc ký
- Dung dich đệm Amoni nitrat pH 9,5 (8#4 mỉ nước cho thêm 94 ml Amoniac đậm đặc (25 - 28%) va 21,5 ml acid nitric (69 - 71%), khudy déu, dé ngudi,
Trang 284 Kea ~_ Cột Lichrosorb S¡ 60 (250 x 4mm; 5 pm)
- Detector UV — VIS: 257 nm do PE va CM; PA; 298 nm đo CA và BH, - _ Pha động: Methanol - Dung địch đệm Amoninitrat pII 9,5 (45 : 6) - Téc d6 dong: 1,5 ml/piit do PE va CM 1,0 ml/phút đo CA và BH 1,0 ml/phút đo PA -_ Thế tích tiêm: 20 ml b._ Các đụng dịch tiêm sắc ký:
“> Dung dich thir
- _ Dung dịch thử để định lượng PA: Cân chính xác một lượng bột viên tương ứng với 30mg PA vào bình 50ml, thêm 30ml pha động, lắc khoảng 10 phút, thêm
pha động đến vạch, lắc dễu, lọc qua giấy lọc thường Hút 2ml dung dịch trên
cho vao bình định mức 20ml, thêm pha động tới vạch, lắc đều, sau đó lọc qua
mảng lọc 0,45Im
- Dung địch thử để định lượng CA, PE, BH và CM: Trộn đều và nghién min
lượng bột viên lấy từ 20 nang Cân chính xác một lượng bột viên tương ứng với
2 viên, thêm 30 m pha động, lắc khoảng 10 phút Dùng 30 ml nước để chuyển hỗn hợp này vào bình gạn Thêm I0ml NaOH IN, lắc kỹ rồi chiết bằng
Cloroform 3 [an x 30ml, Gộp dịch chiết, bốc hơi trên cách thuỷ đến hết
Cloroform Hoà lan cắn trong 20ml dung dịch HCI 0,1N rồi thêm methanol vừa
đủ 200ml, lắc đều Lọc qua giấy lọc thường, sau đó lọc qua mảng lọc 0,45 um
> Dung dich chuẩn
- Dung dich chuẩn để định lượng PA: Pha chất chuẩn PA trong dung môi pha
động để thu được dung dịch PA có nồng độ chỉnh xác khoảng 30Iig/ml
- Dung dịch chuẩn để định lượng CA, PE, CM và BH:
+ Cân chính xác khoảng 40mg CM, hoà tan trong pha động vừa đủ 25ml
(dung dịch CM)
+ Cân chính xác khoảng 40mg BH, hoà tan trong pha động vừa đủ 25ml (dung dịch BH)
+_ Cân chính xác khoảng 560mg PA, 6Ômg CÁ, 20mg PE, cho vào một cốc có mỏ, thêm chính xác 5ml dung dịch CM, 10ml dung dịch BH, 15ml pha
động, khuấy cho tan hết rồi xử lý tiếp như mẫu thử, từ đoạn “ dùng 30ml nước để chuyển hết hỗn hợp này vào bình gạn ”
Tính kết quả: Dựa vào diện tích hoặc chiều cao của pic chuẩn và thử tương ứng,
Trang 29
L KẾ quả nghiên c B Kết quả và biện luận
'Với chương trình sắc ký đã nêu, sắc ký đỗ đã tách các chất CA và BH; PE va CM như hình 1,1 và hình 1.2 VND Aa eg 5 fe THANE IOS ị mal: RT Walang § i THN : 3 ae pm ậ s6 i : 5 = sĩ s6 “ © i do ‘ 30 Ps : a i ¬ 2 é _ ae Hình 1.L Sắc ký đồ của CA và BH Hinh1.2 Sic ky đỗ của PE và CM BH: 4,5 phút CA: 6,3 phút PE ;4,6 phút CM; 5,8 phút
BU Khảo sát khoảng tuyến tính
Chúng tôi đã khảo sát sự phụ thuộ
tích pie trên 5 dung địch chuẩn của PA, hỗn hợp CA và BH; P1: và CM với các nẵng
độ khác nhau Kết quả được giới thiệu ở bảng 1.1
Các kết quả trên cho thấy, trong khoảng nồng độ đã khảo sát, có sự tương quan tuyến tỉnh giữa giá trị điện tích pic và nồng độ (r = 0,9985 - 0.9999) Nồng độ dung
dịch chuẩn và dụng địch thử của chúng tôi nằm trong khoảng tuyến tính đã khảo sát tuyến tính giữa nồng độ các hoạt chả Bảng 1.1 Kết quả khảo sát độ tuyến tính Ị TT TT TT | Thành phân | Phương trình hổi quy Hộ aes Kho oe cee [CA "99x + 20/8 0.5999 80 - 400 LCM 124K «27,24 0.9998 20-120 | PE 3” 711 53987 60-300, BH 530K - 9.88 09999 25-125 [PA 7,6x+ 118,82 | _ 0,985 20-120 |
B.2, Khả năng chiết hỗt hoại chat
Trong phương pháp xử lý mẫu, giai đoạn chiết các hoạt chất cẩn đo và loại bỏ
Paracctamol đã được khảo sát khả năng chiết hết bằng cách: sau khi chiết 3x40m]
€loroform thì chiết thêm 1 lần 40ml Cloroform nữa Lớp Clorofom chiết fin 4 nay
Trang 30~25-_£ Kết quà
được bốc hơi trên cách thuỷ đến khơ, hồ tan cắn trong 5ml dung dịch HCI 0,1N thêm
Methanol vừa đủ 20ml, rồi đo HPLC theo chương trình trên Kết quả thử trên 3 bình
đều không xuất hiện pic trên sắc ký đồ Như vậy, hoạt chất đã được chiết hết ở 3 lần
đầu Khả năng chiết được đảm bảo, B.3 Độ lặp lại, sai số và độ đúng
Các thừ nghiệm này được thực hiện trên mẫu viên Cotussin của công ty Dược
phẩm Tiền Giang, SKS: 071199 Kết quả được giới thiệu trong bảng 1.2
Bảng 1.2 Kết quả khảo sát độ lặp lại và độ đúng trên mẫu COTUSSIN 3 liêu trồng kê Thanh phan Đã Hội HÔNG PA | CA | CM | PE | BH Giá trị trung bình X (mg / viên ) 2784 | 2905 | 438 | 921 | 726 Độ lệch chuân $ 063 ] 048 | 0/08 | 017 | 015
Độ lệch chuẩn tương đối 023 | 13! | 183 | !85 | 207
Tỷ lệ tìm lại được ( % ) (n = 3, lượng chuẩn
điềm vào 209 mỗi chit) 990 | 991 | 985 | 990 | 984
Kết quả khảo sát cho thấy độ lệch chuẩn tương đổi tuỷ theo từng trường hợp từ
0,23 - 2,07% và tỷ lệ tìm lại được hoạt chất từ 98,4 - 99,1%
Trang 314, Kết quả nghiên cứu
4.2 Định lượng đẳng thời Paracetamol (PA) và Acid mefenamic (AM) trong viên
nén bao phim Pamesic bing phương pháp HPLC
'Viên bao Pamesic do công ty vật tr y tế Tiền Giang nghiên cứu sản xuất có thành
phần như sau:
Paracetamol (PA) 500mg Acid mefenamic (AM) 250mg
Trong các được điển hiện hành [19; 23; 27; 29 ] chưa có chuyên luận vẻ hai
thành phần này Hai chất trên có độ tan như nhau (đều dễ tan trong kiềm) nên rất khó
chiết tách Vì vậy chúng tôi đã nghiên cứu phương pháp định tỉnh và định lượng đồng thời cá 2 thành phẩn trên trong hễn hợp thuốc với mục đích củng cơ sở xây dựng tiêu
chuẩn cho sản phẩm mới
A Thực nghiệm
4.1 Thiết bị, hoá chắc
-_ Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao HP 1100 véi detector UV-Vis
- Cot Lichtosorb RP18 (250x4 mm; 10um)
- B6 loc dung môi và lọc mẫu với đường kính lỗ mảng lọc 0,45 pm
- Chất chuẩn paracctamol vả acid mefenamie do Viện Kiểm nghiệm - Bộ Y tế
cung cấp
~ Acetonitril, tetrahydrofuran loai ding cho HPLC
- Acid phosphoric tinh khiét phan tich
4.2 Phương pháp nghiên cửu
a Điều kiện sắc ký
- _ Cột Lichrosorb RP18 (250x4 mm; 10m) ~_ Deleetor UV đặt ở bước sóng 279 nm
~_ Pha động: Acetonitril — nước - tetrahydrofuran (3 : 8 :9) diều chỉnh đến pH
2,2 bang acid phosphoric
ốc dé déng 1 ml/phat
~ Thể tích tiêm 20,1
b Chuẩn bị dung dich
- _ Dung dịch chuẩn: Cân chính xác khoảng 0,1 g chất chuẩn PA và khoảng 0,05
ø chất chuẩn AM, hoà tan bằng 5 ml THT, sau đó pha loãng bằng dung môi pha động để được dung dịch chuẩn có nồng độ của PA khoảng 80 pg/ml và
của AM khoảng 40 pg/ml
- Dung dich thir: Cân 20 viên, tính khối lượng trung bình viên, nghiền thành bột
mịn và trộn đều Cân chính xác một lượng bột viên tương ứng với khối lượng
Trang 32
4 Ket quế nghiên cứu
của khoảng 50 mg AM, hoà tan bằng 5 ml THE, pha lỗng bằng dung mơi pha
động để được dung dịch thử có nồng độ của PA khoảng 80 pg/ml va cia AM
khoảng 40 ng/ml lắc đều Lọc qua màng lọc 0.45um
B Kết quả
.B.1 Khảo sảt tùth thích hợp của hệ thông sắc ký
Với điều kiện sắc ký đã chọn như trên, sắc ký đồ thu được ở hình 2.1 cho thấy
PA và AM được phân tách hoàn toan,
TT VWDIZE, Wavetzngim=z7ø ni (TPUXNFIDSƠE] AU ‘160 4 8
140
+20 4 |
Hình 2.1 Sắc ký đồ thu được của dung địch hỗn hợp PA và AM
B.2 Khảo sát khoảng tuyễn tỉnh
Chúng tôi tiến hành khảo sát độ tuyến tính giữa nỗng độ các chất cần định lượng
át chuẩn PA và AM Chuẩn bị một đãy dung
địch hỗn hợp chuẩn trong pha động có nồng độ của PA biến thiên trong khoảng 20 —
200 jig/ml vA cia AM biến thiên trong khoảng 10 — 100 jig/ml, kết quả khảo sát độ
tuyến tính được trình bảy ở bảng sau:
Trang 33-28-4 Kết quá nghiên cứu,
Paracetamol ‘Acid mephenamie 4500 4000 5000 3500 4000 3000 2500 3000 2000 1500 2000 1000 1000 300 Ø0 50 100 150 200 230 0 số 100 150
lêu diễn sự phụ thuộc tuyến Hình 2.3 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến
và diện tích píc tương ứng của PA tỉnh nồng độ và diện tích píc tương ứng của AM
Nhận xét: Trong khoảng nồng độ đã khảo sát có sự tương quan tuyến tính giữa diện tích pic và nẵng độ với hệ số tương quan rat gan 1 (r = 0,9996 - 0,9999) Ching
tôi chọn nằng độ dung địch thứ và chuẩn để định lượng nằm trong khoáng tuyến tỉnh
đã khảo sát (PA khoảng 80 ng/ml và AM khoang 40 pg/ml)
B.3 Khảo sắt độ lặp tại của phương pháp
Độ lặp lại của phương pháp được tiễn hành trên hai mẫu thử viên nén bao phim
Pamesic Kết quả khảo sát độ lặp lại được trình bảy ở bảng sau:
Trang 34Bảng 2.2b Kết quả khảo sát độ lặp lại trên mẫu viên nén bao phim Pamesic Mẫu 2 SKS : 021202 PA 2M STT Fn Tượng (mguvien) | Số Tiệu thông kế | Hàm lượng (nghiên) | Số hậu thông Kế 1 [29821 255,02 2 (495.07 in = F956 25231 [in 2 Ä =25088 4 5 [488,13 Hara s RSD%= 1 36% LE 252,55 Solve RSD% = 0,58% 6 | 301,71 253,08
Nhận xét: Kết quả trên cho thấy phương pháp có độ lặp lại cao với độ lệch chuẩn
tượng đối khoảng từ 0,49 — 1,36%
B.4 Khảo sắt độ đúng
Trang 35
4.3 Định lượng đồng thời paracetarnol (PA) và cafein (CA) trong thuốc đa thành phần bằng phương pháp HPLC
Thuốc đa thành phần bao gồm paracetamol va cafein 1a một dạng phối hợp thông
dung, vi dụ viên Pasepan của CTDF Ila Tay hay vién Sedapa clita XNDFTW 2 { 2
Để định tính và định lượng các hoạt chất trong hỗn hợp thuốc trên thường áp
đụng theo tiêu chấn cơ sở (chiết tách rồi đo quang) [2, I6] Phương pháp nảy có nhược điểm là phải qua bước chiết tách khá phức tạp, dễ mắc sai số, tốn nhiều thời gian, dung,
môi và hóa chất
Chúng tôi đã nghiên cứu một chương trình IIPLC đơn giản vả tách tốt hơn chương trình đã đề cập trong các tài liệu tham khảo |29| để dịnh tính và định lượng, đồng thời 2 thành phần trên A Thực nghiệm 4,1 Hoá chất, thiết bị Máy sắc ký lòng hiệu năng cao HP 1100 véi detector UV Cột T.iehrosocb RP18 (250x4 mm; 10m)
Bộ lọc dung môi và lọc mẫu với đường kinh lỗ màng lọc 0,45 tim
Chất chuẩn paracetamol và cafein do Viện Kiểm nghiệm cung
Methanol loại dùng cho HPLC,
Ethanol tuyệt đối (PA), acid phosphoric (PA)
Dung môi A : Ethanol - nước (1:1) 4.2 Phương pháp nghiên cứu a Diéu kiện sắc ký Cột Lichrosorb RP18 (250x4 mm; 10um) Detector UV đặt ở bước séng 273 nm Pha động: Dung dich acid phosphoric 0,75% trong hỗn hợp dung môi methanol - nước (35:65) Tốc độ đồng 1 ml/phúi Thể tích tiêm 20nI ð Chuẩn bị dụng dịch
Dung địch chuẩn: Chuẩn bị một dụng dịch hỗn hợp chuẩn trong dung môi A
có nồng độ của PA khoảng 600 ng/ml và của CA khodng 20 pg/ml
Dung dịch thử: Cân 20 viên, tính khối lượng trung bình viên, nghiền thành bột mịn và trộn đều Cân chỉnh xác một lượng bột viên tương ứng với khối lượng
của khoảng 60 mạ PA, hoà tan và thêm dung môi A đến vừa dủ 100 ml, lọc
qua giấy lọc thường(bỏ khoảng 20 mỉ dịch lọc đầu), Sau đó lọc qua mảng lọc
0,45um
-31-
Trang 36
quả nghiên cứu
B Két quả
Với điều kiện sắc ký đã chọn như trên, chúng tôi thu được sắc ký đồ cho thấy PA
và CA được phân tách hoàn toàn như hình 3 — { | | | - |
Hình 3.1 Sắc ký đỗ thu được của dung dịch hỗn hợp PA và CA
B.1 Kết quả khảo sát độ tuyến tính
Chúng tôi tiến hành khảo sát độ tuyến tính giữa nồng độ các chất cần dịnh lượng,
với diện tích pie tương ứng trên các chất chuẩn PA và CA Chuẩn bị một day dung
dịch hỗn hợp chuẩn trong dung môi A có nồng độ của PA biến thiên rong khoảng 150 - 750 pg/ml va cia CA biến thiên trong khoảng 10 - 50 pg/ml, két qua khảo sát độ
tuyến tính được trình bày ở bảng sau:
Bằng 3.1 Kết quả khảo sát độ tuyến tính PA CA SUT Nồng độ(ugml) | Digntich pic {Nong dd (ugiml) | Diện tích pic | 1 150 2370 10 470 2 300 4701 20 98 1 3 450 7094 30 1432 # 600 9412 4ô 1901 “| is Emxmww.r= $0 2330
[Rhoing “wong 4) 155 5 759 tuyến tính đã khảo sát 10> 50
Phương trình hồi quy | Y = 15,2x + 154,9 Y=46,4x + 29,3
He s6 trong quan r= 0,995 r= 0,9996
Trang 37
4 Kết quá nghiên cứu Paracetamol ¡ Cafein 2500 2000 F 1500
Himh 3.2 4 thj bidu dién su phy thugc tuyén Hình 3.3 Đồ thị biểu điển sự phụ thuộc tuyến
tính nồng độ và điện tích pie tương ứng của PA _ tính nỗng độ và diện tích pie tương ứng của CÁ
Ð.2, Kết quả khảo sát độ lặp lại
Trang 384 Kế quả nghiên cứu
Kết quả khảo sát độ lặp lại ở trên cho thấy sai số tương đối từ 0,54 đến 1,07%, với sai số này cho phép áp dụng được phương pháp trên
Bia Kết quả khảo sát độ đúng
Khảo sát độ đúng trên hai mẫu SEDAPA ở trên bằng phương pháp thêm chuẩn,
kết quả được trình bày ở bảng 3.4 và 3.5
tảng 3.4 Kết quả khảo sát độ đúng trên mẫu SEDAPA, Maw / SKS : 350900 PA CA
STT | Lượng thêm | Lượng dim] 5 Mi Lượng them Lượng ti Tim kí
vao(mg) | thấy (mg) vào (mg) thấy (mg) T 29 20,2 1010 0.30 0305 101,7 2 20 19,6 98.1 030 [0.293 98 3 30 30,1 1803 0.60 0,600 1000 j + 30 394 3” 0.60 0,582 97,0 5 40 40,1 100,2 0,90 0,896 99,5 6 40 391 977 090 0,884 98,2 1B | 992% 98,9% Bang 3.5 Két qua khao sát độ đúng trên mẫu SEDAPA, Mdu 2 SKS : 361000 TPA CA \
srr [7 thấm vào | some dm | % dm lại _ | Lượng thêm | Lượng tìm % tìm lại -
Trang 39
4.4 Nghiên cứu định lượng đồng thời paracetamol (FA) và ibuprofen (IB) trong
thuốc đa thành phần bằng phương pháp HPLC
Một trong những dạng thông dụng trên thị trường hiện nay lả hỗn hợp paracetamol va ibuprofen (vi du: viên nén Alaxan của xí nghiệp United Pharma Việt
nam [11], viên nén Pi-Antalvic [5] của công ty Dược vật tư y tế Trà Vinh, viên nén
MK protamol của công ty cổ phần Dược phẩm Mê Kông ) Dược điển Việt Nam cũng
như các được điển khác hiện nay đều chưa có chuyên luận cho dạng bảo chế nảy Mục
tiêu của chúng tôi là nghiên cứu một số phương pháp định lượng paracetamol và
ibuprofen có trong thành phần một đạng thuốc với mục dich 1am phong phú thêm và đánh giá các phương pháp cho các cơ sở lựa chọn áp dụng Đồng thời mong được góp phần xây dựng các tiêu chuẩn chất lượng của ngành cũng như của Quốc gia cho các dạng thuốc có thành phân tương tự
A Thực nghiệm
A.!, Thiết bị, hoá chất
-_ Máy sắc ký lòng hiệu năng cao MERCK-HITACHI 655A-12 với đetector UV- Vis 655A-22
-_ Cột Liehrosorb RP18 (250x4 mm; 10um)
- _ Bộ lọc dung môi và lọc mẫu với đường kính lỗ màng lọc 0,45 um
~ _ Chất chuẩn paracetamol và ibuprofen do viện kiểm nghiệm cung cấp
- Diethyl ether, ethanol 96, natri sulfat khan, dung địch NaOH 0,1N va 0,01N
A.2 Phương pháp nghiên cứu
a Điễu kiện sắc ký
Cột Lichrosorb RP18 (250x4 mm; 10um)
Detector UV dat 6 bude séng 224 nm
Pha động: Acetonilril - acid phosphoric 0,1% (60:40)
Tốc độ dòng 1 ml/phút Thể tích tiêm 2001 b Chuẩn bị dụng địch
- Dung dich chuẩn : Chuẩn bị một dưng dịch hỗn hợp chuẩn trong pha động có
nông độ của PA khoảng 65 ug/ml và của IB khoảng 40 yg/ml
-_ Dung địch thử; Cân 20 viên, tính khối lượng trung bình viên, nghiền thành bột
mịn và trộn đều Cân chính xác một lượng bột viên tương ứng với khối lượng
của khoảng 32,5 mg PA, hoà tan và thêm pha động đến vừa đủ 50 ml, lọc (bỏ khoảng 20 mĩ dịch lọc đầu) Hút chính xác 2.0 ml dịch lọc trên cho vào bình
định mức 20,0 ml, thêm pha động đến vừa đủ, lắc đều Lọc qua màng lọc
0.45pm
Trang 40
B Két qua
Với điều kiện sắc ký đã chọn như trên, chúng tôi thu dược sắc ký đỗ cho thầy PA
và TB được phân tách hoàn toản
Hình 4.1 Sắc ký đồ thu được của dung địch hỗn hợp PA và IB
B.1 Khão sát khoảng tuyến tính
Chúng tôi tiến hành khảo sát độ tuyến tính giữa nồng độ các chất cần định lượng
với điện tích pic tương ứng trên các chất chuẩn PA và IB Chuẩn bị một đấy dung dịch
hỗn hợp chuẩn trong pha động có nồng độ của PA biến thiên trong khoảng 26 - 130 kg/ml và của IB biến thiên trong khoảng 16 - 80 ng/ml, kết quả khảo sát độ tuyến tính được trình bày ở bảng sau:
Bảng 4.1 Kết quả khảo sát độ tuyến tính PA 1B Na Nông độ (ugm]) | Diện tích pic | Nông độ (ug/ml) | Diện tich pic 1 26 1970 16 958 “| 2 52 3628 32 1521 3 78 3475 48 2148 al 4 184 7168 4 ” zm 3 130 3922 80 3356 Khoảng dng độ tuyển tỉnh đã khảo |26 -> 130 16 > 80 sat † Phương trình hôi quy | Y =67,1x + 199,4 Y=374x +3430 [Hés6 trong quan [R= 09999 R=0,9997 ee 2s | = = = % Paracetamol † Tbuprofen
Hình 4.2, Đề thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến Hinh 4.3, Đỗ thị biểu điễn sự phụ thuộc tuyến
tính nồng độ và diện tích píc tương ứng cia PA tính nồng độ vả diện tích pic tương ứng của IB