Xác định tính đối kháng của các chủng probiotic trong môi trường nuôi cá tra

SỞ NÔNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG THÔN TP HỒ CHÍ MINH TRUNG TÂM CƠNG NGHỆ SINH HỌC BÁO CÁO NGHIỆM THU XÁC ĐỊNH TÍNH ĐỐI KHÁNG CỦA CÁC CHỦNG PROBIOTIC TRONG MÔI TRƯỜNG NUÔI CÁ TRA Mã số: TS03/15-16 Chủ nhiệm đề tài: ThS Lê Lưu Phương Hạnh Cán thực hiện: ThS Lê Lưu Phương Hạnh KS Lê Văn Hậu KS Trần Văn Hương Cố vấn khoa học: TS Nguyễn Quốc Bình TP Hồ Chí Minh, tháng 04 năm 2017 MỤC LỤC MỤC LỤC i DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT iii DANH SÁCH BẢNG .iv DANH SÁCH HÌNH .v DANH SÁCH SƠ ĐỒ, BIỂU ĐỒ vi TÓM TẮT I THÔNG TIN CHUNG VỀ ĐỀ TÀI II ĐẶT VẤN ĐỀ III TỔNG QUAN TÀI LIỆU III Sơ lược bệnh gan thận mủ .6 III.2 Sơ lược vi sinh vật có lợi thủy sản .9 III.2.1 Đặc điểm chế hoạt động .9 III.2.2 Vi khuẩn Bacillus III.3 Các nghiên cứu, ứng dụng vi sinh vật có lợi thủy sản .11 IV VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .16 IV.1 Vật liệu sử dụng nghiên cứu 16 IV.2 Chuẩn bị dịch lên men .17 IV.3 Khảo sát mật độ vi khuẩn E ictaluri Bacillus diện môi trường nước ao nuôi số tỉnh ĐBSCL (Nội dung 2) 17 IV.3.1 Phương pháp thu mẫu nước tách DNA 17 IV.3.2 Phương pháp PCR real-time 18 IV.4 Khảo sát mối tương tác hai chủng vi khuẩn Bacillus với vi khuẩn E.ictaluri môi trường nước ao xử lý in vitro (Nội dung 3) 18 IV.4.1 Khảo sát tương tác chủng vi khuẩn Bacillus E ictaluri môi trường dinh dưỡng BHI lỏng 18 IV.4.2 Khảo sát tương tác chủng vi khuẩn Bacillus E ictaluri nước ao nuôi 19 IV.5 Đánh giá khả kháng bệnh gan thận mủ chủng Bacillus cá tra quy mơ phịng thí nghiệm (Nội dung 4) .20 IV.6 Đánh giá ảnh hưởng vi khuẩn Bacillus lên cá tra bột bổ sung vào mơi trường q trình ương quy mơ phịng thí nghiệm (Nội dung 5) 21 i IV.6.1 Quy trình ương cá bột có bổ sung Bacillus vào môi trường 21 IV.6.2 Kiểm tra khả kháng bệnh gan thận mủ cá Tra nuôi mơi trường có bổ sung Bacillus 22 IV.7 Xử lý thống kê 23 V KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 24 V.1 Khảo sát mật độ vi khuẩn Edwardsiella ictaluri Bacillus có mơi trường nước ao nuôi số tỉnh ĐBSCL 24 V.2 Khảo sát mối tương tác chủng vi khuẩn Bacillus với vi khuẩn E.ictaluri môi trường nước ao xử lý in vitro 28 V.2.1 Khảo sát ảnh hưởng hai chủng vi khuẩn Bacillus lên sinh trưởng E ictaluri môi trường dinh dưỡng BHI lỏng 28 V.5.2 Khảo sát ảnh hưởng hai chủng vi khuẩn Bacillus lên sinh trưởng E ictaluri nước ao nuôi 31 V.3 Đánh giá khả kháng bệnh gan thận mủ chủng Bacillus cá tra quy mơ phịng thí nghiệm 34 V.4 Đánh giá ảnh hưởng vi khuẩn Bacillus lên cá tra bột bổ sung vào môi trường trình ương quy mơ phịng thí nghiệm 37 V.4.1 Quy trình ương cá bột có sử dụng B amyloliquefaciens AGWT13-031 37 V.4.2 Kiểm tra khả kháng bệnh gan thận mủ cá Tra ni mơi trường có bổ sung B amyloliquefaciens AGWT 13-031 .38 VI KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .40 VI.1 Kết luận .40 VI.2 Đề nghị ……………………………………………………………………….40 VII TÀI LIỆU THAM KHẢO .41 ii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT BHI: Brain Heart Infusion TSB: Tryptone Soy Broth TSA: Tryptone Soy Agar ĐBSCL: Đồng sông Cửu Long DLM: dịch lên men PA: phagocytic activity PI: phagocytic index RPS: tỷ lệ sống tương đối (relative percent survival) EIM: môi trường Edwardsiella ictaluri medium CFU: colony forming unit iii DANH SÁCH BẢNG Bảng 4.1 Vật liệu sử dụng nghiên cứu 16 Bảng 4.2 Thí nghiệm khảo sát tương tác vi khuẩn Bacillus E ictaluri môi trường BHI lỏng .19 Bảng 4.3 Thí nghiệm khảo sát tương tác vi khuẩn Bacillus E ictaluri nước ao 20 Bảng 5.1 Danh sách số lượng mẫu nước vị trí thu mẫu 24 Bảng 5.2 Mật độ vi khuẩn E ictaluri Bacillus môi trường nước ao số tỉnh ĐBSCL 24 Bảng 5.3 Sự thay đổi mật độ vi khuẩn E ictaluri VL WT14-020 B amyloliquefaciens AGWT 13-031 đồng nuôi cấy môi trường dinh dưỡng BHI lỏng 29 Bảng 5.4 Sự thay đổi mật độ vi khuẩn E ictaluri VL WT14-020 B subtilis AGWT 13-421 đồng nuôi cấy môi trường dinh dưỡng BHI lỏng 30 Bảng 5.5 Sự thay đổi mật độ vi khuẩn E ictaluri VL WT14-020 B amyloliquefaciens AGWT 13-031 đồng nuôi cấy môi trường nước ao .32 Bảng 5.6 Sự thay đổi mật độ vi khuẩn E ictaluri VL WT14-020 B subtilis AGWT 13-421 đồng nuôi cấy môi trường nước ao 33 iv DANH SÁCH HÌNH Hình 3.1 Hình thái vi khuẩn Edwardsiella ictaluri .7 Hình 3.2 Nội tạng cá tra khỏe mạnh (A) cá tra bị bệnh gan thận mủ (B), (C) Hình 3.3 Khuẩn lạc nhuộm gram B subtilis AGWT 13-0421 (A1, A2) B amyloliquefaciens AGWT 13-031 (B1, B2) .10 Hình 5.1 Kết điện di gel agarose 1,2% sản phẩm real-time PCR cặp mồi Ser vi khuẩn E ictaluri (A) Bsub vi khuẩn Bacillus (B) 27 Hình 5.2 Dấu hiệu bệnh gan thận mủ cá tra tháng tuổi sau công cường độc với chủng E ictaluri VL WT 14-020 .35 Hình 5.3 Hình thái bên cá hương 21 ngày tuổi 38 v DANH SÁCH SƠ ĐỒ ĐỒ THỊ Sơ đồ 4.1 Bố trí thí nghiệm khảo sát khả kháng bệnh gan thận mủ chủng B amyloliquefaciens AGWT 13-031 lên cá tra tháng tuổi quy mơ phịng thí nghiệm .21 Sơ đồ 4.2 Phổ thức ăn dùng thí nghiệm .22 Sơ đồ 4.3 Bố trí thí nghiệm kiểm tra khả kháng bệnh cá tra nuôi mơi trường có bổ sung Bacillus .23 Đồ thị 5.1 So sánh mật độ vi khuẩn Bacillus E ictaluri diện số mẫu nước ao tỉnh ĐBSCL 26 Đồ thị 5.2 Sự thay đổi mật độ vi khuẩn E ictaluri VL WT14-020 (A) B amyloliquefaciens AGWT 13-031(B) đồng nuôi cấy môi trường dinh dưỡng BHI lỏng 29 Đồ thị 5.3 Sự thay đổi mật độ vi khuẩn E ictaluri VL WT14-020 (A) B subtilis AGWT 13-421 (B) đồng nuôi cấy môi trường dinh dưỡng BHI lỏng .31 Đồ thị 5.4 Sự thay đổi mật độ vi khuẩn E ictaluri VL WT14-020 (A) B amyloliquefaciens AGWT 13-031 (B) đồng nuôi cấy môi trường nước ao 32 Đồ thị 5.5 Sự thay đổi mật độ vi khuẩn E ictaluri VL WT14-020 (A) B subtilis AGWT 13-421 (B) đồng nuôi cấy môi trường nước ao 33 Đồ thị 5.6 Tỷ lệ sống cá tra sau 14 ngày công cường độc với chủng E ictaluri VL WT14-020 36 Đồ thị 5.7 So sánh kích thước trọng lượng cá Tra sau 21 ngày nuôi 38 Đồ thị 5.8 Tỷ lệ sống cá tra tháng tuổi nuôi mơi trường có bổ sung Bacillus sau cơng cường độc với chủng E ictaluri VL WT14-020 39 vi TĨM TẮT Động vật thủy sản nói chung cá Tra nói riêng bao bọc xung quanh môi trường nước tác nhân gây bệnh tồn độc lập với vật chủ Do đó, cá Tra có nguy tiếp xúc thường xuyên với vi khuẩn gây bệnh môi trường nước thông qua trình tiêu thụ thức ăn hấp thụ qua da Vì vậy, viêc kiểm sốt q trình sinh trưởng phát triển vi khuẩn gây bệnh để làm giảm loại bỏ hoàn toàn vi khuẩn gây bệnh tồn sẵn nước phương pháp dùng để kháng lại bệnh gan thận mủ cá Tra Vi khuẩn Edwardsiella ictaluri có mặt hầu hết ao nuôi cá Tra Trong 39 mẫu nước thu ngẫu nhiên năm tỉnh Đồng sông Cửu Long (ĐBSCL), xác định 32 mẫu có diện vi khuẩn E ictaluri, với mật độ trung bình 103 tế bào mL-1 26 mẫu có diện vi khuẩn Bacillus với mật độ khoảng 102 tế bào mL-1 Khảo sát ảnh hưởng hai chủng Bacillus amyloliquefaciens AGWT 13-031 Bacillus subtilis AGWT 13-421 lên E ictaluri nồng độ 105 CFU mL-1 môi trường dinh dưỡng BHI lỏng môi trường nước ao in vitro cho thấy hai chủng có khả ức chế q trình sinh trưởng phát triển E ictaluri với nồng độ 105 CFU mL-1 106 CFU mL-1 Khi bổ sung B amyloliquefaciens AG 13-031 nồng độ 106 CFU mL-1 vào dịch công cường độc E ictaluri (1 x 106 CFU mL-1) tỷ lệ sống cá sau 14 ngày thử nghiệm 70,21% , hiệu bảo vệ RPS đạt 68,46% (ở mốc h sau bổ sung) 67,77%, hiệu bảo vệ RPS đạt 62,33% (mốc 10 h sau bổ sung), có khác biệt mặt thống kê so với nghiệm thức đối chứng (p< 0.0001) Bên cạnh đó, sử dụng B amyloliquefaciens AG 13-031 để bổ sung vào mơi trường ni cá bột tỷ lệ tăng trưởng cá nghiệm thức thử nghiệm cao so với nghiệm thức đối chứng Ngoài ra, sức đề kháng cá tăng mạnh với hiệu bảo vệ RPS đạt 86,58% Các kết tạo tiền đề cho nghiên cứu I THÔNG TIN CHUNG VỀ ĐỀ TÀI Tên đề tài: Xác định tính đối kháng chủng “probiotic” mơi trường nuôi cá Tra (Mã số: TS03/15-16) Cơ quan quản lý: Trung tâm Công nghệ sinh học TP.HCM 2347 Quốc lộ 1, khu phố 2, P Trung Mỹ Tây, quận 12, thành phố Hồ Chí Minh Điện thoại: (08) 37153792 Đơn vị chủ trì: Phịng CNSH Thủy sản 2347 Quốc lộ 1, khu phố 2, P Trung Mỹ Tây, quận 12, thành phố Hồ Chí Minh Điện thoại: (08) 38911118 Cơ quan phối hợp chính: khơng có Chủ nhiệm đề tài: ThS Lê Lưu Phương Hạnh Cán bộ/Nhóm thực hiện: ThS Lê Lưu Phương Hạnh KS Lê Văn Hậu KS Trần Văn Hương Cố vấn khoa học: TS Nguyễn Quốc Bình Thời gian thực hiện: năm (Từ 01/2015 đến 12/2016) Kinh phí duyệt: 400.000.000 VNĐ Kinh phí sử dụng: 384.372.722 VNĐ 10 Các nội dung nghiên cứu thực so với đề cương đăng ký Thời gian STT Nội dung Nội dung 1: Đánh Các thử nghiệm xử giá khả bảo vệ lý phương pháp khuẩn cho ăn không thu Bacillus cá kết quả, khó Tra bổ sung vào kiểm soát nên nội dung thức ăn đồng ý thay đổi vi (bắt đầu – kết thúc) Kết thực thành nội dung Đánh giá “Đánh giá ảnh hưởng vi khuẩn Bacillus lên cá Tra bột bổ sung vào môi trường Nội dung STT Thời gian (bắt đầu – kết thúc) Kết thực Đánh giá trình ương quy mơ phịng thí nghiệm” Nội dung 2: Khảo Xác định 32/39 sát mật độ vi mẫu nước thu tỉnh khuẩn E ictaluri ĐBSCL có diện Bacillus có vi khuẩn E ictaluri, môi trường nước ao nuôi 4/2015 - 6/2015 với mật độ trung bình 103 tế bào mL-1, Đạt 26/39 mẫu có diện vi khuẩn Bacillus với mật độ khoảng 102 tế bào mL-1 Nội dung 3: Đánh B amyloliquefaciens giá ảnh hưởng AGWT 13-031 B vi khuẩn Bacillus subtilis AGWT 13-421 lên vi khuẩn E có khả ức chế ictaluri in vitro trình sinh trưởng 7/2015 - 12/2015 phát triển E ictaluri Đạt với nồng độ 105 CFU mL-1 106 CFU mL-1 môi trường BHI lỏng nước ao in vitro Nội dung 4: Thiết Chủng B lập quy trình sử amyloliquefaciens AG dụng 13-031 nồng độ 106 Bacillus vi khuẩn kháng 1/2016 - 12/2016 CFU mL-1 có khả bệnh gan thận mủ làm giảm độc lực vi cá Tra quy khuẩn E ictaluri VL Đạt CFU mL-1 (0 h) xuống 9,07 x 102 CFU mL-1 (10 h) không phát sau 15 h Trong đó, với mật độ B amyloliquefaciens AGWT 13-031 cao (1,78 x 105 CFU mL-1) E ictaluri hồn tồn khơng phát sau h đồng nuôi cấy Ở nghiệm thức đối chứng, E ictaluri VL WT14-020 sinh trưởng phát triển bình thường không nuôi cấy chung với B amyloliquefaciens AGWT 13-031 Bên cạnh đó, mật độ B amyloliquefaciens AGWT 13-031 tất nghiệm thức sinh trưởng tăng dần từ h đến 10 h giảm sau 15 h Kết trước nhóm nghiên cứu cho thấy thời điểm 15 h đường cong tăng trưởng chủng B amyloliquefaciens AGWT 13-031 vào pha suy tàn, mật độ vi khuẩn giảm Chủng B subtilis AGWT 13-421 đưa kết tương tự Tuy nhiên, kết cho thấy khả ức chế E ictaluri chủng AGWT 13-421 yếu so với chủng AG 13-031 Mật độ chủng AGWT 13-421 phải mức 1,16 x 105 CFU mL-1 sau 15 h không phát E ictaluri môi trường nuôi cấy Và chủng AGWT 13-421 mật độ 2,70 x 106 CFU mL-1 E ictaluri không phát sau 10 h đồng nuôi cấy Bảng 5.4 Sự thay đổi mật độ vi khuẩn E ictaluri VL WT14-020 B subtilis AGWT 13-421 đồng nuôi cấy môi trường dinh dưỡng BHI lỏng Nghiệm thức E ictaluri (ĐC1) B 13-421 (ĐC 2) NT1 E ictaluri B 13-421 NT2 E ictaluri B 13-421 0h 2,30 x105 1,52 x105 1,05 x105 1,16 x 105 2,83 x105 2,70 x106 5h 6,03 x105 4,12 x106 8,14 x103 1,84 x106 5,22 x102 3,10 x107 30 10 h 1,20 x107 1,18 x108 3,61 x102 6,10 x106 1,22 x108 15 h 5,03 x107 8,33 x106 3,08 x106 1,50 x107 1,18 108 5,03 107 8,33 106 3,61 102 Đồ thị 5.3 Sự thay đổi mật đổ vi khuẩn E ictaluri VL WT14-020 (A) B amyloliquafaciens AGWT 13-421 (B) đồng nuôi cấy môi trường dinh dưỡng BHI lỏng Ghi chú: E5: E ictaluri VL WT14-020 mật độ x 105 CFU mL-1 B5: B subtilis AGWT 13-421 mật độ x 105 CFU mL-1 B5E5: B subtilis AGWT 13-421 x 105 CFU mL-1+ E ictaluri VL WT14-020 x 105 CFU mL-1 B6E5: B subtilis AGWT 13-421 x 106 CFU mL-1+ E ictaluri VL WT14-020 x 105 CFU mL-1 Kết cho thấy hai chủng B amyloliquefaciens AGWT 13-031 B subtilis AGWT 13-421 có khả ức chế chủng E ictaluri VL WT14-020 đồng nuôi cấy môi trường BHI lỏng Tuy nhiên, hiệu ức chế E ictaluri chủng B amyloliquefaciens AGWT 13-031 cao so với B subtilis AGWT 13-421 V.5.2 Khảo sát ảnh hưởng hai chủng vi khuẩn Bacillus lên sinh trưởng E ictaluri nước ao nuôi Kết khảo sát tương tác hai chủng Bacillus với E ictaluri VL WT14020 đồng nuôi cấy môi trường nước ao qua xử lý trình bày Bảng 5.5 (đối với chủng B amyloliquefaciens AGWT 13-031) Bảng 5.6 (đối với chủng B subtilis AGWT 13-421) Bên cạnh đó, kết đồ thị hóa Đồ thị 5.4 Đồ thị 5.5 Bảng 5.5 5.6 cho thấy mật độ vi khuẩn E ictaluri VL WT14-020 nước ao giảm dần theo thời gian có bổ sung thêm chủng Bacillus Sau 15 h đồng nuôi cấy với B amyloliquefaciens AGWT 13-031 (104 CFU mL1 ), diện chủng E ictaluri VL WT14-020 môi trường nước ao khơng phát Trong đó, với mật độ chủng AGWT 13-031 cao (105 CFU mL- 31 ) sau 10 h chủng E ictaluri VL WT14-020 không phát mẫu nước Ở nghiệm thức đối chứng, mật độ vi khuẩn E ictaluri cịn trì mức 1,43 x 105 sau 15 h không nuôi cấy chung với chủng Bacillus Bảng 5.5 Sự thay đổi mật độ vi khuẩn E ictaluri VL WT14-020 B amyloliquefaciens AGWT 13-031 đồng nuôi cấy môi trường nước ao Nghiệm thức E ictaluri (ĐC1) B 13-031 (ĐC 2) NT1 E ictaluri B 13-031 NT2 E ictaluri B 13-031 0h 1,60 x 105 3,49 x 105 1,74 x 105 1,21 x 104 1,56 x 105 1,43 x 105 5h 2,88 x 105 9,30 x 105 2,30 x 105 1,47 x 105 2,83 x 105 6,08 x 106 Mật độ E ictaluri đồng nuôi cấy với AG 13-031 nước ao 10h 3,22 x 105 3,13 x 106 3,85 x 103 6,32 x 106 1,42 x 107 15h 1,43 x 105 1,45 x 107 2,42 x 106 9,42 x 106 Mật độ AG 13-031 đồng nuôi cấy với E ictaluri nước ao 1.00E+08 1.00E+06 1.00E+06 1.00E+04 1.00E+04 1.00E+02 1.00E+02 1.00E+00 1.00E+00 0h 5h E5 E5+B4 10h 15h 0h E5+B5 5h B5 10h EB4 15h EB5 Đồ thị 5.4 Sự thay đổi mật đổ vi khuẩn E ictaluri VL WT14-020 (A) B amyloliquafaciens AGWT 13-031 (B) đồng nuôi cấy môi trường nước ao Ghi chú: E5: E ictaluri VL WT14-020 mật độ x 105 CFU mL-1 B5: B amyloliquefaciens AGWT 13-031 mật độ x 105 CFU mL-1 B4+E5: B amyloliquefaciens AGWT 13-031 x 104 CFU mL-1+ E ictaluri VL WT14-020 x 105 CFU mL-1 B5+E5: B amyloliquefaciens AGWT 13-031 x 105 CFU mL-1+ E ictaluri VL WT14-020 x 105 CFU mL-1 32 Bảng 5.6 Sự thay đổi mật độ vi khuẩn E ictaluri VL WT14-020 B subtilis AGWT 13-421 đồng nuôi cấy môi trường nước ao Nghiệm thức E ictaluri (ĐC1) B 13-421 (ĐC 2) NT1 E ictaluri B 13-421 NT2 E ictaluri B 13-421 0h 1.60 x 105 1.00 x 105 1.10 x 105 1.50 x 105 4.70 x 105 1.43 x 105 5h 5.30 x 105 7.20 x 105 2.67 x 105 1.20 x 106 2.70 x 105 1.10 x 107 10h 9.40 x 105 5.33 x 107 1.20 x 106 1.60 x 107 1.00 x 104 5.10 x 107 15h 1.10 x 106 1.57 x 106 1.00 x 103 8.30 x 106 2.00 x 107 Tương tự, chủng B subtilis AGWT 13-421 biểu khả ức chế sinh trưởng chủng E ictaluri môi trường nước ao, hiệu ức chế yếu so với chủng B amyloliquefaciens AG 13-031 Sau 15 h đồng nuôi cấy với chủng B subtilis AGWT 13-421 mật độ 105 CFU mL-1, chủng E ictaluri tồn môi trường nước ao mức x 103 CFU mL-1 Trong đó, chủng E ictaluri khơng phát sau 15 h nuôi cấy chung với chủng B subtilis AGWT 13-421 mật độ 106 CFU mL-1 Mật độ E ictaluri đồng nuôi cấy với AG 13-421 nước ao 1.00E+08 Mật độ AG 13-421 đồng nuôi cấy với E ictaluri nước ao 1.00E+08 1.00E+06 1.00E+06 1.00E+04 1.00E+04 1.00E+02 1.00E+02 1.00E+00 1.00E+00 0h E5 5h E5+B5 10h 15h 0h E5+B6 5h B5 10h EB5 15h EB6 Đồ thị 5.5 Sự thay đổi mật đổ vi khuẩn E ictaluri VL WT14-020 (A) B subtilis AGWT 13-421 (B) đồng nuôi cấy môi trường nước ao Ghi chú: E5: E ictaluri VL WT14-020 mật độ x 105 CFU mL-1 B5: B subtilis AGWT 13-421 mật độ x 105 CFU mL-1 B5+E5: subtilis AGWT 13-421 x 105 CFU mL-1+ E ictaluri VL WT14-020 x 105 CFU mL-1 B6+E5: subtilis AGWT 13-421 x 106 CFU mL-1+ E ictaluri VL WT14-020 x 105 CFU mL-1 Vì vậy, đồng ni cấy chủng B amyloliquefaciens AGWT 13-031 B subtilis AGWT 13-421 với E ictaluri VL WT14-020 mơi trường nước ao 33 hai chủng Bacillus ức chế sinh trưởng phát triển E ictaluri Cũng tương tự thí nghiệm dùng mơi trường BHI lỏng, khả ức chế chủng E ictaluri chủng B subtilis AGWT 13-421 yếu so với chủng B amyloliquefaciens AGWT 13-031 Trong đó, tất nghiệm thức đối chứng, chủng Bacillus sinh trưởng phát triển bình thường theo thời gian mơi trường nước ao dù mật độ tăng trưởng thấp so với thí nghiệm dùng môi trường BHI lỏng Các nghiên cứu Bacillus cho thấy, Bacillus vi khuẩn Gram dương, có khả tiết chất kháng khuẩn bacterioxin … để ức chế vi khuẩn khác Ngoài ra, khảo sát cho thấy thời gian hệ Bacillus dao động từ 20-25 phút, E ictaluri khoảng tiếng mơi trường BHI, Bacillus sinh trưởng phát triển nhanh, cạnh tranh chất dinh dưỡng chất sắt môi trường … ức chế vi khuẩn E ictaluri đồng ni cấy Trong thí nghiệm mình, Lalloo (2007) khẳng định chủng Bacillus ức chế tăng trưởng vi khuẩn gây bệnh Aeromonas hydrophila gây bệnh xuất huyết cá đồng nuôi cấy môi trường nước ao nuôi nhân tạo Vậy kết mà nhóm nghiên cứu thu phù hợp với khảo sát lập luận nghiên cứu trước V.3 Đánh giá khả kháng bệnh gan thận mủ chủng Bacillus cá tra quy mơ phịng thí nghiệm Kết từ khảo sát mối tương tác hai chủng vi khuẩn Bacillus với vi khuẩn E.ictaluri môi trường nước ao xử lý in vitro nội dung cho thấy chủng vi khuẩn B amyloliquefaciens AGWT 13-031có khả ức chế trình sinh trưởng phát triển vi khuẩn gây bệnh gan thận mủ E ictaluri tốt hơn, sử dụng để thí nghiệm trực tiếp cá Tra phịng thí nghiệm Sau ngày cơng độc, nhóm cá ngâm với hỗn hợp DLM ủ 10 h bắt đầu chết, kể đối chứng dương Cá xuất dấu hiệu bệnh thân cá bị trơi nhớt, tróc da, nội tạng có đốm trắng xuất huyết (Hình 5.3) Trong đó, nhóm cá ngâm với hỗn DLM h chết chậm Cá nghiệm thức đối chứng dương (0 h) bắt đầu chết từ ngày thứ Đến ngày thứ cá nghiệm thức ngâm với hỗn hợp DLM (10 h) có bổ sung B amyloliquefaciens AGWT 13-031 nồng độ 105 CFU ml-1 bắt đầu chết 34 tăng nồng độ Bacillus lên 106 CFU ml-1 đến ngày thứ cá xuất dấu hiệu bệnh chết Phân tích ANNOVA số liệu cá chết thu sau 14 ngày theo dõi hai nhóm cá thử nghiệm cho thấy tỷ lệ cá chết nghiệm thức công cường độc với hỗn hợp DLM có khác biệt mặt thống kê so với nhóm cá đối chứng âm (p