Chế tạo và thử nghiệm khả năng kháng khuẩn của vật liệu nano bạc trong môi trường nuôi cá nheo mỹ tại việt nam

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA TÀI NGUYÊN VÀ MÔI TRƯỜNG  - KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: “CHẾ TẠO VÀ THỬ NGHIỆM KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN CỦA VẬT LIỆU NANO BẠC TRONG MÔI TRƯỜNG NUÔI CÁ NHEO MỸ TẠI VIỆT NAM” Hà Nội – 2022 HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA TÀI NGUYÊN VÀ MÔI TRƯỜNG  - KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: “ CHẾ TẠO VÀ THỬ NGHIỆM KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN CỦA VẬT LIỆU NANO BẠC TRONG MÔI TRƯỜNG NUÔI CÁ NHEO MỸ TẠI VIỆT NAM ” : ĐỖ ĐỨC AN Người thực Lớp : KHMTA Khóa : 63 Ngành : Khoa học Mơi trường Giáo viên hướng dẫn : ThS Hồ Thị Thúy Hằng Hà Nội – 2022 LỜI CẢM ƠN Trong thời gian học tập, nghiên cứu thực khóa luận tốt nghiệp ngồi cố gắng nỗ lực thân mình, em nhận nhiều giúp đỡ thầy giáo, gia đình bạn bè Nhân dịp em xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành sâu sắc Đề tài khóa luận em thực với giúp đỡ tạo điều kiện Bộ môn Công nghệ Môi trường – Khoa Tài nguyên Môi trường Khoa Thủy sản, Học Viện Nông nghiệp Việt Nam Em xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc tới ThS Hồ Thị Thúy Hằng người ln tận tình bảo, truyền đạt cho em nhiều kiến thức, kỹ làm việc, giúp đỡ em học tập, nghiên cứu theo sát em suốt q trình thực khóa luận này, tận tình giúp đỡ hướng dẫn em suốt q trình làm thí nghiệm Em xin gửi lời cảm ơn tới bạn làm việc phịng thí nghiệm Bộ môn Công nghệ Môi trường, đặc biệt anh/chị, bạn sinh viên nghiên cứu Bộ môn Công nghệ môi Trường giúp đỡ em suốt q trình làm thí nghiệm Cuối em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới bố mẹ mình, tồn thể bạn bè người ln bên em suốt thời gian học tập rèn luyện Học viện Nông nghiệp Việt Nam Hà Nội, ngày … tháng … năm 2022 Người thực Đỗ Đức An i MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC ii DANH MỤC BẢNG iv DANH MỤC HÌNH v DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT vii TÓM TẮT KHÓA LUẬN viii MỞ ĐẦU 1 Tính cấp thiết đề tài Mục tiêu nghiên cứu Chương TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Hiện trạng phát triển nuôi cá Nheo Mỹ Việt Nam vấn đề môi trường - dịch bệnh 1.1.2 Vấn đề môi trường - dịch bệnh nuôi cá Nheo Mỹ 1.2 Tổng quan nano bạc ứng dụng kiểm soát dịch bệnh 12 1.2.1 Tổng quan nano bạc: đặc tính kháng khuẩn phương pháp điều chế 12 1.2.2 Một số nghiên cứu ứng dụng nano bạc nuôi trồng thủy sản 18 Chương ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 2.1 Đối tượng nghiên cứu 24 2.2 Phạm vi nghiên cứu 24 2.3 Nội dung nghiên cứu 24 2.4 Phương pháp nghiên cứu 24 2.4.1 Phương pháp điều chế vật liệu nano bạc 24 2.4.2 Phương pháp xác định hình thái, cấu trúc nano bạc tạo thành 26 2.4.3 Phương pháp xác định khả kháng vi khuẩn gây hại môi trường nuôi cá Nheo Mỹ 26 ii Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 30 3.1 Đặc điểm dung dịch nano bạc tổng hợp 30 3.2 Đặc tính kháng vi khuẩn có hại mơi trường ni cá Nheo Mỹ 32 3.2.1 Đặc tính kháng vi khuẩn E coli Salmonella 33 3.2.2 Khả vi khuẩn Aeromonas veronii gây bệnh cá Nheo Mỹ dung dịch nano bạc tạo thành 38 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 40 Kết luận 40 Kiến nghị 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO 41 PHỤ LỤC 45 iii DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Một số phương pháp hóa học quan trọng để ổn định tổng hợp nano bạc 16 Bảng 3.1 Kiểm tra khả diệt vi khuẩn E coli Salmonella .33 iv DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Cá Nheo mỹ Ictalurus punctatus (Rafinesque, 1818) Hình 1.2 Cá Nheo mỹ giai đoạn cá giống bị bệnh đốm trắng trùng dưa Hình 1.3 Cá bị xuất huyết nhiễm khuẩn Aeromonas veronii Hình 1.4 Cá Nheo mỹ nuôi lồng bị nhiễm nấm 10 Hình 1.5 Một số hình ảnh TEM nano bạc với hình dạng kích thước khác 12 Hình 1.6 Cơ chế diệt khuẩn nano Bạc 13 Hình 1.7 Sự hình thành nano bạc dung dịch 15 Hình 1.8 Số lượng ấn phẩm nghiên cứu ứng dụng nano Bạc nghững năm 2011 – 2021 19 Hình 2.1 Quy trình điều chế dung dịch nano bạc với chất khử NaBH4 25 Hình 3.1 Dung dịch nano bạc tổng hợp 30 Hình 3.2 Phổ UV- Vis mẫu dung dịch nano bạc tổng hợp 31 Hình 3.3 Hình thái cấu trúc hạt nano bạc dung dịch tổng hợp 31 Hình 3.4 Phân bố kích thước hạt dung dịch nano bạc tạo thành 32 Hình 3.5a Hình ảnh mẫu đối chứng khả diệt khuẩn nano bạc với E.Coli 34 Hình 3.5b Hình ảnh mẫu thí nghiệm khả diệt khuẩn nano bạc với E.Coli 34 Hình 3.6a Hình ảnh mẫu đối chứng khả diệt khuẩn nano bạc với Salmonella 35 Hình 3.6a Hình ảnh mẫu thí nghiệm khả diệt khuẩn nano bạc với Salmonella 35 Hình 3.7 Hình ảnh hình thành vòng kháng khuẩn nano bạc với E Coli Salmonella 36 v Hình 3.8 Tỷ lệ diệt khuẩn dung dịch nano nạc tạo thành E.coli 37 Hình 3.9 Tỷ lệ diệt khuẩn dung dịch nano nạc tạo thành Salmonella 37 Hình 3.9 Sự hình thành vịng vơ khuẩn sử dụng nano bạc diệt vi khuẩn Aeromonas veronii 38 vi DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ATSH An toàn sinh học BOD Nhu cầu oxy sinh hóa (Biochemistry Oxygen Demand) BTNMT Bộ Tài ngun Mơi trường COD Nhu cầu oxy hóa học (Chemistry Oxygen Demand) MIC Nồng độ ức chế tối thiểu NTTS Nuôi trồng thủy sản SEM Scanning Electron Microscope TEM Tunnelling Electron Microscope TN Nitơ tổng số (Total Nitrogen) UV-Vis UV-Vis spectroscopy UBND Ủy ban nhân dân VSMT Vệ sinh môi trường vii TÓM TẮT KHÓA LUẬN Nghiên cứu tổng hợp dung dịch nano bạc từ NaBH chitosan, hạt nano bạc có dạng hình cầu, phân bố kích thước khoảng 20 nm, phân tán đồng dung dịch Khảo sát khả diệt khuẩn gây hại môi trường nuôi cá Nheo Mỹ cho thấy, dung dịch nano bạc tổng hợp có khả diệt khuẩn tốt vi khuẩn gây hại môi trường nước E Coli Salmonella với nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) 0,025 µg/mL 7,5 µg/mL Với vi khuẩn gây bệnh điển hình cá Nheo Mỹ Aeromonas veronii, dung dịch nano bạc tổng hợp cho thấy khả vô hiệu hóa phát triển vi khuẩn Kết bước đầu nghiên cứu sở cho nghiên cứu ứng dụng nano bạc kiểm soát dịch bệnh cá Nheo Mỹ thực tế viii thâm canh bền vững qui mơ trang trại Tạp chí Khoa học – Công nghệ Thuỷ sản Số đặc biệt 2009: 152-156 11 Trương Đình Hồi, Kim Văn Vạn, Đào Lê Anh, Nguyễn Thị Huyên, Nguyễn Văn Tuyến, Vũ Đức Mạnh, Nguyễn Thị Hương Giang, Trương Quang Lâm, Nguyễn Thị Lan, 2020 Đặc điểm bệnh lý ứng dụng phương pháp PCR chẩn đoán bệnh Gan Thận mủ cá Nheo mỹ (Ictalurus punctatus) Tạp chí Khoa học Nơng nghiệp Việt Nam 2020, 18(2): 94-104 Tài liệu tiếng Anh Alagumuthu, G and Kirubha, R., 2012 Synthesis and Characterisation of Silver Nanoparticles in Different Medium, Open Journal of Synthesis Theory and Applications 1(2): 13-17 Agnihotri, S., Mukherji, S and Mukherji, S., 2014 Size-controlled silver nanoparticles synthesized over the range 5–100 nm using the same protocol and their antibacterial efficacy, Advances 4(8): 3974-3983 Ameen, F., Srinivasan, P., Selvankumar T et al., 2019 Phytosynthesis of silver nanoparticles using Mangifera indica flower extract as bioreductant and its broadspectrum antibacterial activity Bioorganic Chemistry 88: 102970-102971 Behravan, M., Panahi, A H., Naghizadeh, A., Ziaee, M., Mahdavi R and Mirzapour, A., 2019 Facile green synthesis of silver nanoparticles using Berberis vulgaris leaf and root aqueous extract and its antibacterial activity International Journal of Biological Macromolecules 124:148-154 Chen, D., Qiao, X and Chen, J., 2011 Morphology- controlled synthesis of silver nanostructures via a solvothermal method Journal of Materials Science: Materials in Electronics 22: 1335-1339 Choi, O and Hu, Z., 2008 Size Dependent and Reactive Oxygen Species Related Nanosilver Toxicity to Nitrifying Bacteria Environmental Science & Technology 42(12): 4583-4588 Fievet, F., Ammar-Merah, S., Brayner, R et al., 2018 The polyol process: a unique method for easy access to metal nanoparticles with tailored sizes, shapes and 42 compositions Chemical Society Reviews 47: 5187-5233 Khodashenas, B and Ghorbani, H R., 2019 Synthesis of silver nanoparticles with different shapes 10 Arabian Journal of Chemistry 12(8): 1823-1838 11 Kim, D., Jeong, S and Moon, J., 2006 Synthesis of silver nanoparticles using the polyol process and the influence of precursor injection 12 Nanotechnology 17: 4019-4024 13 Helmlinger, J., Sengstock, C., Groß-Heitfeld C et al., 2016 Silver nanoparticles with different size and shape: equal cytotoxicity, but different antibacterial effects Advances 6: 18490-18501 14 Hoai T D., Trang T T., Van Tuyen N., Giang N T H & Van Van K (2019) Aeromonas veronii caused disease and mortality in channel catfish in Vietnam Aquaculture, 513, 734425 15 Li, W.R., Xie, X B., Shi, Q S., Zeng H Y.,, OU16 Yang Y S and Chen, Y B., 2009 Antibacterial activity and mechanism of silver nanoparticles on Escherichia coli, Appl Microbiol Biotechnol 85: 11151122 17 Meléndrez, M.F., Medina, C., Solis-Pomar, F., Flores, P., Paulraj, M and PérezTijerina, E., 2015 Quality and high yield synthesis of Ag nanowires by microwaveassisted hydrothermal method Nanoscale Research Letters 10: 48-57 18 Pal, S., Tak, Y K and Song, J M., 2007 Does the Antibacterial Activity of Silver Nanoparticles Depend on the Shape of the Nanoparticle? A Study of the Gram-Negative Bacterium Escherichia coli, Applied and Environmental Microbiology 73(6): 1712-1720 19 Qing, Y., Cheng, L., Li R et al., 2018, Potential antibacterial mechanism of silver nanoparticles and the optimization of orthopedic implants by advanced modification technologies, International journal of nanomedicine 13: 3311-3327 20 Raza, M.A., Kanwal, Z., Rauf, A., Sabri, A.N., Riaz, 21 S and Naseem, S., 2016 Size- and Shape- Dependent Antibacterial Studies of Silver Nanoparticles Synthesized by Wet Chemical Routes, Nanomaterials 6(4): 43 74-89 22 Zhao, T., Sun, R., Yua, S et al., 2010 Size- controlled preparation of silver nanoparticles by a modified polyol method, Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects 23 366: 197– 202 44 PHỤ LỤC HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA MÔI TRƯỜNG - - ĐỀ CƯƠNG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP TÊN ĐỀ TÀI: “CHẾ TẠO VÀ THỬ NGHIỆM KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN CỦA VẬT LIỆU NANO BẠC TRONG MÔI TRƯỜNG NUÔI CÁ NHEO MỸ TẠI VIỆT NAM” Người thực : ĐỖ ĐỨC AN Lớp : KHMTA Khóa : 63 Ngành : KHOA HỌC MƠI TRƯỜNG Giáo viên hướng dẫn : ThS HỒ THỊ THÚY HẰNG Hà Nội - 2022 45 ĐỀ CƯƠNG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Họ tên sinh viên: ĐỖ ĐỨC AN Mã sinh viên: 639701 Tel: 0389.868.698 Mail: doducan@gmail.com Chuyên ngành: Khoa học mơi trường Lớp: KHMTA Khố: 63 Giáo viên hướng dẫn: ThS HỒ THỊ THÚY HẰNG Tel: 0985643819 Mail: htthanghp@gmail.com Tên đề tài: “CHẾ TẠO VÀ THỬ NGHIỆM KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN CỦA VẬT LIỆU NANO BẠC TRONG MÔI TRƯỜNG NUÔI CÁ NHEO MỸ TẠI VIỆT NAM” Loại đề tài: Đề tài điều tra Đề tài khoa học thực nghiệm Địa điểm thực hiện: Học viện Nông nghiệp Việt Nam Hà Nội, ngày … tháng … năm……… Sinh viên thực Giảng viên hướng dẫn Xác nhận Bộ môn Đỗ Đức An ThS Hồ Thị Thúy Hằng ThS Nguyễn Ngọc Tú 46 PHẦN MỞ ĐẦU Lý chọn đề tài Ngành nuôi trồng thủy sản ngày phát triển mạnh mẽ tồn cầu, đóng vai trị quan trọng việc cung cấp sản phẩm giàu protein nhu cầu sống người ngày tăng cao Trong nghề ni trồng thủy sản giới Châu Á có nghề ni trồng thủy sản lớn nhất, chiếm 89,1% sản lượng 77,1% giá trị sản phẩm thủy sản nuôi giới năm 2013 Mười nước đứng đầu giới sản lượng nuôi trồng thủy sản năm 2013 theo thứ tự Trung Quốc, Ấn Độ, Indonesia, Việt Nam, Bangladesh, Ai Cập, Myanma, Thái Lan, Braxin Philippin (FAO, 2015) Tại Việt Nam, năm gần nuôi trồng thủy sản xác định ngành kinh tế trọng điểm với kim ngạch xuất cao, cá da trơn lồi ni chủ yếu (Achmad Syafiuddin S., 2017) Đến năm 2017, Bộ Nông nghiệp Phát triển Nông thôn Việt Nam ước tính có khoảng 7000 lồng cá suất xấp xỉ 9700 Tuy nhiên, năm gần đây, mức độ thâm canh hoá ngày cao vấn đề kiểm sốt mơi trường ao ni chưa chặt chẽ với nguồn giống không đảm bảo chất lượng nên dịch bệnh cá Nheo mỹ xảy nhiều diện rộng Các bệnh nguy hiểm cá Nheo Mỹ kể đến Bệnh vi khuẩn Aeromonas Veronii (Nguyễn Thị Dung, 2022) ; bệnh trắng da, bạc má vi khuẩn dạng sợi F.Colummnare ; Bệnh Gan thận mủ Edwardsiella ictaluri (Kim Văn Vạn & 2020) ; bệnh ấu trùng sán nội tạng bệnh nấm Điển hình nhóm vi khuẩn di động Aeromonas spp bao gồm vi khuẩn Aeromonas hydrophila, A sobria A caviae, A veronii Vi khuẩn gây bệnh xuất huyết cá Nheo Mỹ nhiều loài cá nuôi khác Khi dịch bệnh xảy ra, tỷ lệ chết từ 40-60% với cá thương phẩm có khối lượng 1-2 kg (Đồn Thị Nhinh, 2021), chí với cá giống lên đến 100% Việc sử dụng loại vacxin tiêm khó khăn áp dụng với hệ thống nuôi cá Việt Nam, nay, kháng sinh dùng phổ biến để điều trị bệnh nhiễm khuần động vật thuỷ sản Tuy nhiên, phương pháp dần trở nên hiệu sản phẩm thuỷ sản mặt hàng xuất nước ta điều kiện tiên 47 để thị trường tiêu thụ chấp nhận không tồn dư hóa chất, kháng sinh cấm sản phẩm Do đó, việc tìm giải pháp nâng cao suất vật ni an tồn với sức khoẻ người bảo vệ môi trường cấp bách Một xu hướng đánh giá cao ứng dụng chế phẩm công nghệ nano vào nuôi trồng thuỷ sản Việc sử dụng dung dịch nano mang lại ưu điểm vượt trội hạn chế việc sử dụng chế phẩm sinh học, kháng sinh có hại cho mơi trường, tăng hiệu tác động lên tế bào tác nhân gây bệnh dẫn đến giảm dư lượng kháng sinh ĐVTS xử lý ô nhiễm môi trường nước Xuất phát từ thực tiễn trên, em thực đề tài “Chế tạo thử nghiệm khả kháng khuẩn vật liệu nano bạc môi trường nuôi cá Nheo Mỹ Việt Nam” Kết đề tài góp phần bổ sung sở cho việc sử dụng giải pháp kiểm sốt dịch bệnh ni cá Nheo Mỹ vật liệu nano Mục tiêu nghiên cứu - Tổng hợp đánh giá đánh tính vật liệu nano bạc - Khảo sát đặc tính kháng vi khuẩn gây hại môi trường nuôi cá Nheo mỹ vật liệu nano bạc tổng hợp 48 PHẦN NỘI DUNG THỰC HIỆN Chương Tổng quan nghiên cứu 1.2 Hiện trạng phát triển nuôi cá Nheo Mỹ Việt Nam vấn đề môi trường - dịch bệnh 1.1.1 Hiện trạng phát triển nuôi cá Nheo Mỹ Việt Nam 1.1.2 Vấn đề môi trường - dịch bệnh nuôi cá Nheo Mỹ 1.2 Tổng quan nano bạc ứng dụng kiểm soát dịch bệnh 1.2.1 Tổng quan nano bạc: đặc tính kháng khuẩn phương pháp điều chế 1.2.2 Một số nghiên cứu ứng dụng nano bạc nuôi trồng thủy sản 49 Chương Đối tượng, nội dung phương pháp nghiên cứu 2.1 Đối tượng nghiên cứu -Vật liêu nano bạc dạng dung dịch -Vi khuẩn E coli, Salmonella ; vi khuẩn Aeromonas veronii 2.2 Phạm vi nghiên cứu - Phạm vi không gian: Vật liệu nano bạc điều chế xác định đặc tính Phịng thí nghiệm Khoa học Vật liệu, Viện Hàn Lâm Khoa học Việt Nam, Các thí nghiệm khảo sát đặc tính kháng khuẩn thực phịng thí nghiệm Mơi trường Bệnh học thủy sản, Khoa Thủy sản, Học viện Nông nghiệp Việt Nam - Phạm vi thời gian: 2/2022 – 6/2022 2.3 Nội dung nghiên cứu - Điều chế đánh giá đặc tính vật liệu nano bạc tạo thành - Khảo sát hoạt tính kháng vi khuẩn gây hại môi trường nuôi cá Nheo Mỹ vật nano bạc tạo thành 2.4 Phương pháp nghiên cứu 2.4.1 Phương pháp điều chế vật liệu nano bạc Vật liệu nano bạc điều chế phương pháp khử hóa học dung dịch nước với - Tiền chất : AgNO - Chất khử NaBH , - Chất ổn định : Chitosan - Nước cất axit acetic (mơi trường) Dụng cụ thí nghiệm : - Máy khuấy IKA RW 20 digital (IKA - Đức); - Máy ly tâm Universal 32R D- 78523 (Germany); - Tủ sấy chân không Vacucell MMM Madcenter Einrich (Germany); - Cân phân tích Precisa số lẻ, 50 - Và dụng cụ thủy tinh 0,2g Chistosan/50ml dung dịch CH3COOH 10% 0.15 g AgNO3/ 30 ml nước cất Dung dịch Dung dịch Nhỏ từ từ 30 ml dung dịch AgNO3 vào dung dịch chitosan Dung dịch Khuấy 30 phút Dung dịch 5mg NaBH4 20 ml nước cất Khuấy 30 phút Nano Hình 2.1 Quy trình điều chế dung dịch nano bạc với chất khử NaBH4 2.4.2 Phương pháp xác định hình thái, cấu trúc nano bạc tạo thành - Các mẫu thí nghiệm phân tích phương pháp UV-Vis (Jacco V-670, Nhật) bước sóng từ 600 – 300 nm, pha loãng EG với tỷ lệ khác tốc độ quét 100 nm/phút 51 - Đối với phân tích FE-SEM (Hitachi – S4800, Nhật), mẫu nhỏ giọt lưới đồng đường kính mm, sấy chân khơng nhiệt độ phịng tiến hành phân tích điện 100kV 2.4.3 Phương pháp xác định khả kháng vi khuẩn gây hại mơi trường ni cá Nheo Mỹ Thí nghiệm 1: Xác định khả kháng khuẩn nano bạc tạo thành với E coli, Salmonella - Vật liệu : Vi khuẩn E Coli ; Vi khuẩn S  Chủng vi khuẩn E coli, Salmonella  Hợp chất Nano cần kiểm tra  Môi trường Brain heart broth (BHB): môi trường tăng sinh vi khuẩn  Môi trường Nutrient Agar (NA): môi trường cấy đếm số lượng khuẩn lạc  Nước cất vô trùng  Ống Eppendorf 1.5ml, ống Falcon 15ml  Pipet 100µl, 1000 µl, 10ml  Đầu Tuýp 100µl, 1000 µl, 10ml  Đĩa lồng, que cấy láng, đèn Gas, cồn 70°  Găng tay, trang - Chuẩn bị vi khuẩn thí nghiệm : Hút 100µl canh khuẩn gốc E coli, Salmonella + ml Môi trường BHB Votex đều, nuôi cấy Sau nuôi cấy giờ, đem li tâm 5000 rpm/5 phút Bỏ dịch nổi, thu lấy cặn Sau hồn ngun nước cất vơ trùng - Tiến hành thí nghiệm : Bước 1: Chuẩn bị dãy, dãy chuẩn bị ống eppendorft 1,5ml + Ống ký hiệu 100 dãy: Hút vào ống 500µl canh khuẩn vi khuẩn E coli (Salmonella) chuẩn bị mục 1.2, votex + Ống ký hiệu 10-1 đến 10-8 Tiến hành pha loãng ống theo số 10 từ nồng độ 10-1 đến 10-8 nước cất vô trùng Riêng ống 10-8 sau pha loãng xong tiến hành hút bỏ 50µl 52 - Bước 2: + Dãy thí nghiệm Nano: Bổ sung thêm hợp chất Nano bạc theo tỷ lệ 1:1 Để yên nhiệt độ phòng 30 phút, 10 phút lắc nhẹ lần Tiến hành hút 100µl nồng độ pha lỗng 100 đến 10-8 cấy láng nồng độ/1 đĩa NA + Dãy đối chứng: Hút 100µl nồng độ pha lỗng 10-3 đến 10-8 cấy láng nồng độ/1 đĩa NA Nuôi cấy 20-24 giờ/37°C tủ ấm đếm số lượng khuẩn lạc đĩa thạch Xác định số lượng vi khuẩn cách áp dụng công thức sau: ∑C N = V (n1 + 0,1n2 )d Trong đó: N: Tổng số vi khuẩn (CFU/ml) C: Tổng số khuẩn lạc đếm đĩa chọn độ pha loãng liên tiếp V: thể tích mẫu cấy đĩa (ml) n : số đĩa độ pha loãng thứ chọn để đếm số khuẩn lạc n : số đĩa độ pha loãng thứ hai chọn để đếm số khuẩn lạc d : hệ số pha loãng tương ứng với độ pha loãng thứ Thí nghiệm : Xác định hoạt tính kháng khuẩn nano bạc phương pháp khuếch tán qua thạch nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) E coli, Salmonella - Hoạt tính kháng khuẩn nano bạc phương pháp khuếch tán qua thạch xác định thơng qua kích thước vịng kháng khuẩn hình thành : Thí nghiệm tiến hành sau : Bước : Dịch vi khuẩn thử nghiệm (nồng độ 106 cfu/mL) trải môi trường MHA Bước : Trên đĩa thạch EMB (đối với E coli) BPA (đối với Salmonella), hút 100 µL mẫu dung dịch nano bạc nồng độ 10 ppm, 30 ppm, 50 ppm cho vào giếng giếng đối chứng với 100 µL nước cất vơ trùng (4 giếng/đĩa) 53 Bước : Ủ đĩa 37oC, sau 24 (đối với vi khuẩn E coli) 48 (đối với vi khuẩn Salmonella) Bước : Ghi nhận kết vòng kháng khuẩn đĩa - Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) xác định thông qua tỷ lệ kháng khuẩn (%) thực sau : Bổ sung mẫu nano bạc khảo sát vào dịch khuẩn chuẩn bị theo tỷ lệ 9:1 (v/v) thành nồng độ khảo sát tương ứng với nồng độ vi khuẩn đạt 104 cfu/mL Lắc hỗn hợp để yên trọng phút Tiến hành hút 100 µL dịch nghiệm thức trải đĩa môi EMB (đối với E coli) BPA (đối với Salmonella), đối chứng âm với 100 µL dịch khuẩn nồng độ 104 cfu/mL Ủ đĩa 37°C, sau 24 (đối với vi khuẩn E coli) 48 (đối với vi khuẩn Salmonella) đếm khuẩn lạc đĩa nghiệm thức ghi nhận kết Tỷ lệ kháng khuẩn tính theo cơng thức sau: Tỷ lệ kháng khuẩn (%) = (1-N t /N ) x 100% N số khuẩn lạc ban đầu trước thí nghiệm N t đơn vị hình thành khuẩn lạc tức mẫu thời điểm t sau tương tác với vật liệu diệt khuẩn Giới hạn phát phương pháp 10 CFU/ml Thí nghiệm : Khảo sát khả kháng vi khuẩn Aeromonas veronii gây bệnh cá Nheo Mỹ Cách thức tiến hành : Bước : Vi khuẩn gốc phân lập từ cá nhiễm bệnh Aeromonas veronii lưu trữ phịng thí nghiệm mơn Mơi trường bệnh thuỷ sản – Khoa Thuỷ sản Học viện Nông nghiệp Việt Nam Sau ni tăng sinh mơi trường Nutrient Broth (NB) 20-24 nhiệt độ 28 – 300C Bước : Đĩa thạch TSA chuẩn bị trước cấy 100 µl vi khuẩn A.veronii có mật độ 0.26 x 109 cfu/mL, trang cho khô Bước : Đặt lên đĩa khoanh giấy có độ dày 0,5 mm, đường kính 4mm vô trùng cho mặt khoanh giấy áp sát vào mặt môi trường 54 Bước : Nhỏ lượng 10 µl dung dịch nano bạc nồng độ 10 ppm, 20ppm, 30 ppm, 50 ppm /một đĩa giấy cơng thức thí nghiệm Bước : Để đĩa thạch tủ ấm 300C Vịng vơ khuẩn quan sát đo sau 24h Chương Dự kiến kết nghiên cứu 3.1 Đặc điểm dung dịch nano bạc tổng hợp 3.2 Đặc tính kháng vi khuẩn có hại mơi trường ni cá Nheo Mỹ 3.2.1 Đặc tính kháng vi khuẩn E coli Salmonella 3.2.2 Khả vi khuẩn Aeromonas veronii gây bệnh cá Nheo Mỹ dung dịch nano bạc tạo thành 55 PHẦN KẾ HOẠCH NGHIÊN CỨU STT Nội dung công việc Thời gian thực Chuẩn bị thông qua đề cương nghiên cứu Báo cáo đề cương Bố trí thí nghiệm Theo dõi thí nghiệm Xử lý, phân tích số liệu, viết báo cáo Hồn thiện khóa luận 6/2022 Nộp bảo vệ khóa luận 6/2022 56 Từ 1/2022 đến 2/2022 2/2022 3-5/2022 5/2022 5-6/2022