Phân tích và xác định các đặc điểm hoá học đặc trưng của dược liệu phục vụ công tác tiêu chuẩn hoá

Trang 1

BOY TE

BAO CÁO KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI CẤP BỘ

PHÂN TÍCH VÀ XÁC ĐỊNH CÁC ĐẶC ĐIỂM

HÓA HỌC DAC TRUNG CUA DƯỢC LIỆU

PHỤC VỤ CÔNG TAC TIEU CHUAN HOA

CHU NHIEM BE TAI: DSCKI NGUYEN KIM BiCH CO QUAN CHỦ TRÌ ĐỀ TÀI : VIÊN DƯỢC LIỆU

6265

28/12/2006

Trang 2

PHAN A: TOM TAT CAC KET QUA NOI BAT CUA DE TAI

1 Kết quả nổi bật của đề tài :

Đề tài đã xây dựng được phương pháp và kỹ thuật có tính chất thường

qui để xác định các đặc điểm hoá học đặc trưng của dược liệu phù hợp với đối

tượng chưa xác thành phần hoạt chất, phục vụ có quả cho công tác

tiêu chuẩn hoá vẻ mặt xây dựng phép thử định tính hoá học dược liệu

Các dược liệu chọn làm đối tượng nghiên cứu gồm có 20 dược liệu sau : 1 Ba kích 11 Ơ dược 2 Bỏ cơng anh 12 Sai ho 3 Cau tích 13 Tô mộc 4 Cỏ nhọ nổi 14 Tang bạch bì 3 Dây đau xương 15 Thảo quyết minh 6 Đảng sâm 16 Thổ phục linh 7 Đỗ trọng 17 Tiền hỏ 8 Hà thủ ô 18 Trạch tả 9 Mộc hương 19 Xa tiễn từ

10.Nga truật 20 Xuyên khung

Các mẫu làm đối tượng nghiên cứu đêu biết rõ nguồn gốc thu hái, đã qua kiểm tra và xác định đúng tên khoa học

Phương pháp xác định các đặc điểm hoá học đặc trưng được xây dựng dưới dạng xác định “ vân tay” nhóm chất của dược liệu; được thực hiện bằng phương pháp sắc ký, với kỹ thuật sắc ký lớp mỏng là chù yếu, phù hợp với đối

tượng chưa xác định được thành phần hoạt chất

Kết quả hình ảnh các sắc ký đỏ xác định các đặc điểm đặc trưng dạng “vân tay” hoá học của 20 dược liệu, được trình bày dưới dạng atlas ( hình ảnh ia màu) cùng với các phương pháp xác định, là tài liệu tham khảo bổ ích áp

dụng trong phân tích và xây dựng tiêu chuẩn dược liệu, phục vụ kiểm tra và

đánh giá chất lượng nguyên liệu và sản phẩm thuốc từ dược liệu

Kết quả xác định các đặc điểm vân tay của dược liệu (bằng kỹ thuật SKIM) đã thể hiện được ứng dụng có hiệu quả trong định tính phân biệt chống nhằm lẫn hoặc giả mạo dược liệu, như : phân biệt Cỏ nhọ nỏi với Sài

đất, Dây đau xương với Dây ký ninh ,Ô dược với Ô dược nam, Ô dược với Bễ

sim ( giả mạo), Lức (Sài hổ nam ) với Sài hổ ( Sài hô bắc), Mộc hương với

Nam mộc hương Kết quả đã góp phản minh hoạ cho các đặc điểm ” vân tay” đã xác định là đặc trưng cho dược liệu

Kết quả ứng dụng “vân tay” hoá học đã được xác định trong định tính

dược liệu, có thành phần trong một số chế phẩm thuốc đông dược đang lưu

hành, cho thấy, các đặc điểm vân tay dược liệu, đã được ứng dụng có hiệu quả

để định tính phát hiện sự có mặt của dược liệu đó, trong thành phẩm thuốc

gồm hón hợp đa thành phần dược liệu Kết quả các đặc điểm vân tay của dược liệu đã được xác định là cơ sở và định hướng cho việc khảo sát xây dựng phương pháp định tính dược liệu trong chế phẩm

Trang 3

Các kết quả vân tay hoá học của 20 dược liệu nghiên cứu trong đề tài sẽ góp phần bổ sung tư liệu về định tính trong các chuyên luận dược liệu của

DĐVNHI

Các kết quả xác định vân tay hoá học của dược liệu đã góp phản xây dựng mô hình thiết lập kho dữ liệu vẻ “ dấu vết” hoá học các dược liệu nói chung, áp dụng trong kiểm nghiệm, thẩm định, đánh giá tính đúng của dược

liệu

2 Đánh giá thực hiện đề tài đối chiếu với đề cương nghiên cứu đã được phê duyệt

a Tiến độ : Đề tài thực hiện trong 2 năm, song còn gặp khó khăn trong việc lấy mẫu một số dược liệu và tìm kiếm thành phẩm thuốc đông được phục vụ

cho nghiên cứu và khảo sắt, nên tiến độ bị kéo dài hơn so với qui định b Thực hiện mục tiêu nghiên cứu : Thực hiện đầy dù các mục tiêu đề ra c Các sản phẩm tạo ra so với dự kiến của bản để cương

Tạo ra đẩy đủ các sản phẩm đã dự kiến trong đề cương

Chất lượng sản phẩm đạt yêu cầu

4 Đánh giá việc sử dụng kinh phí + Tổng kinh phí được cấp 150 triệu

Đã quyết toán xong

3 Đề xuất

Với kết quả xác định các đặc điểm hoá học đặc trưng dạng “vân tay” hoá học của 20 dược liệu kể trên, đẻ tài đã bước đầu xây dựng được mô hình về phương pháp phân tích xác định các đặc điểm hoá học đặc trưng của dược

liệu, áp dụng cho đối tượng chưa xác định được thành phần hoạt chất Thời gian tới, chúng tôi xin đề nghị Bộ cho phép mở rộng và tiếp tục nghiên cứu đối với các đối tượng dược liệu khác Trên cơ sở khai thác sâu hơn khả năng

phân tích bằng kỹ thuật SKLM, đặc biệt là kỹ thuật hiện dai ohur TLC Scanner

một kỹ thuật đã được áp dụng có hiệu quả trong phân tích định tính và định

lượng dược liệu nhưng vẫn còn mới mẻ ở VN, góp phần tích cực trong việc

xây dựng phương pháp phân tích phục vụ cho nghiên cứu, tiêu chuẩn hoá, thẩm định và kiểm nghiệm dược liệu

Trang 4

PHAN B: NOI DUNG CHI TIET KET QUA NGHIEN CUU

LDAT VAN DE

Hiện nay nhu cầu sử dụng thuốc có nguồn gốc từ dược liệu, phục vụ phòng và chữa bệnh ở nước ta cũng như các nước trên thế giới

ngày càng gia tăng

'Việt Nam có tiềm năng phát triển dược liệu Nằm trong vùng khí hậu

nhiệt đới gió mùa nóng và ẩm, nước ta có nguồn tài nguyên động thực vật vô cùng phong phú và đa dạng Cộng đồng các dân tộc Việt Nam vốn có nhiều kinh nghiệm trong việc sử dụng các cây thuốc để điều trị ôi bổ khoẻ Với phương châm kế thừa vốn cổ truyền của y học dân tộc, xây dựng một nên y học hiện đại và đại chúng, đến nay nhiều mặt hàng thuốc có nguồn

gốc từ thảo dược đã được sản xuất và lưu hành rộng rãi trên cả nước, phục vụ

chăm sóc sức khoẻ cộng đỏng Tính đến năm 2002 cả nước có 257 cơ sở được cấp giấy phép sản xuất dược liệu và đông dược với tổng số 1617 mặt hàng thuốc có nguồn gốc từ được liệu, chiếm gần 1/3 số mặt hằng thuốc sản xuất trong nước [1] Theo đó nhu cầu cung cấp nguồn nguyên liệu dược liệu phục vụ cho sản xuất và chữa bệnh theo y học cổ truyền ước tính 50.000 tấn/ năm| 1]

Đi đôi với việc sử dụng và lưu hành được liệu và thuốc có nguồn gốc được liệu với số lượng lớa như vậy, vấn đẻ quản lý chất lượng thuốc đặc biệt là quản lý chất lượng dược liệu, để đảm bảo sử dụng thuốc an toàn và hiệu quả, luôn là câu hỏi được đặt ra cho Ngành và còn nhiêu bức xúc cần được tháo gỡ

và giải quyết Tình trạng dược liệu lưu thông trên thị trường không rõ nguồn

gốc, thiếu sự kiểm soát về chất lượng còn phổ biến, do vậy dược liệu đem sử: dụng và sản xuất có chất lượng không ổn định, kém chất lượng và dễ bị nhằm lẫn hoặc bị giả mạo Trước xu thế chuẩn bị hội nhập khu vực và thế giới, trước

nhu cầu cấp bách phải nâng cao chất lượng thuốc được sản xuất trong nước,

một vấn để đặt ra cho ngành dược là phải sử dụng nguồn nguyên liệu dược liệu lầm thuốc với chất lượng ổn định và dược liệu phải được tiêu chuẩn hoá

về nhiều mặt

Van dé tiêu chuẩn hoá dược liệu là nội dung quan trọng trong quản lý chất lượng dược liệu và đã được quan tâm thảo luận nhiều nhất tại diễn đàn hoà hợp thuốc thảo dược gọi tắt là FHH ( Forum for harmonization of herbal

medicines ) của các nước trong khu vực Tây thái bình dương, được tổ chức tại

Tokyo tháng 5 năm 2002 Tại diễn đàn này đã thống nhất qui định tiêu chuẩn hoá dược liệu vẻ các mặt : đúng, tốt và tỉnh khiết [ 1]

Để đảm bảo chất lượng dược liệu đạt yêu cầu về các mặt như đã nêu, các chỉ tiêu kỹ thuật thể hiện trong các tiêu chuẩn dược liệu luôn có xu

hướng đồi hỏi ngày càng chặt chẽ và phải được nâng cao, do vậy các phép thử: được xây dựng để đánh giá cũng đồi hỏi phải được cải tiến, trong số đó gồm

Trang 5

có phép thử định tính hoá học có liên quan đến đánh giá tính đúng, góp phản quan trọng đáng kể trong việc kiểm tra và đánh giá chất lượng dược liệu

Theo báo cáo về “ sự bổ sung và sửa đổi trong DĐTQ 2003” tại dién din FHH tháng 5/2005 [59], các số thống kê vẻ phép thử định tính hoá học trong các chuyên luận dược liệu của DĐTQ 2003 cho biết, các phép thử định tính bằng phương pháp SKLM gồm có 342 trong tổng số 331 phép thử hoá học, chiếm 64% và đã tăng thêm vẻ số lượng so với DĐTQ 2000 là 114 phép thừ, các

phép thử khác như phép thử vật lý và phản ứng hoá học là 172 chiếm 32%, số lượng tăng hơn so với DĐTQ 2000 là 9, phép thử định tính bằng phương pháp SKLCA đã được bỏ sung là 5 Các con số nói trên cho thấy, phép thử định tính băng phương pháp SKLM chiếm tỷ cao và có xu hướng tăng hơn hẳn so với định tính bằng phương pháp khác

Hiện nay, các chỉ tiêu định tính bằng phương pháp hoá học đã được xây dựng và qui định trong các chuyên luận được liệu của DĐVNIIL Theo thống kê, trong số 248 chuyên luận dược liệu có 83 chuyên luận có chỉ tiêu định tính

SKIM chiếm 33,4% ; 77 chuyên luận định tính bằng phản ứng hoá học, chiếm 31% và 88 chuyên luận chưa có chỉ tiêu định tính, chiếm 33,3% Các số đã nêu cho thấy, phương pháp định tính SKLM chiếm tỷ lệ thấp, trong khi đó các phương pháp định tính bằng phản ứng hoá học trong ống nghiệm chiếm tỷ lệ đáng kể và vẫn còn nhiều chuyên luận chưa có phép thử định tính, xác định

đặc trưng về hoá học Hầu hết trường hợp này đều rơi vào các đối tượng dược

liệu chưa xác định được thành phần hoạt chất, thậm chí, kể cả các dược liệu có

thể đã được biết thành phần hoạt chất hoặc thành phần hoá học đặc trưng,

nhưng chưa có điều kiện xác định, do chưa có chất đối chiếu.Trước thựt trạng như đã nêu và trước xu thé chuẩn bị hội nhập, dược liệu có chất lượng phải

đạt tiêu chuẩn của khu vực, việc xây dựng các chỉ tiêu đánh giá chất lượng được liệu liên quan đến định tính xác định đặc trưng hoá học, cần thiết phải được cải tiến và nâng cao cho phi hợp với xu thế chung, góp phần từng bước

nâng cao khả năng kiểm tra và đánh giá chất lượng dược liệu, phục vụ cho công tác quản lý chất lượng dược liệu và chế phẩm thuốc từ dược liệu ngày

một tốt hơn Để đáp ứng một phần yêu cầu đó , đề tài đã được thực hiện với

tiêu để : Phân tích và xác định các đặc điểm hoá học đặc trưng của dược

liệu phục vụ công tác tiêu chuẩn hoá Mục tiêu của đề tài như sau ;

1 Xây dựng được phương pháp, kỹ thuật phân tích một số thành phản

hoá học đặc trưng, coi như là dấu vết hoá học của khoảng 20 dược liệu, trong

danh mục thuốc thiết yếu, chưa xác định được hoạt chất Xác định nhận biết các dược liệu này bằng kỹ thuật so sánh “ đấu vết” trên

2 Sử dụng các “ dấu vết” hoá học trên vào kiểm nghiệm chất lượng

được liệu và một số thành phẩm có chứa dược liệu tương ứng đang lưu hành

trên thị trường

3 Góp phần xây dựng mô hình thiết lập kho dữ liệu vẻ “ dấu vết” hoá học các dược liệu nói chung để áp dụng trong kiểm nghiệm thuốc

Trang 6

I TONG QUAN

2.1 Tổng quan đặc điểm hoá học đặc trưng của dược liệu

Đối với dược liệu, bên cạnh phương pháp nhận dạng bằng kỹ thuật hiển vi, phương pháp phát hiện liên quan đến thành phần hoá học, từ lâu cũng đã

được áp dụng và ngày càng trở nên có hiệu quả trong việc nhận dạng, phân biệt và chống nhầm lẫn dược liệu

Ngày nay, cùng với sự tiến bộ của khoa học, các phương pháp phân tích với kỹ thuật hiện đại, đặc biệt là các kỹ thuật sắc ký đã không ngừng được cải

tiến và áp dụng có hiệu quả trong nghiên cứu, chiết tách và phân tích xác định các thành phần hóa học của cây thuốc Nhờ đó, nhiêu chất mới đặc trưng cho cây thuốc đã được phát hiện, phục vụ nhu cầu nghiên cứu thuốc mới và góp

phần nâng cao tiêu chuẩn hoá chất lượng dược liệu và thuốc thảo mộc Với

mye đích trên, các kỹ thuật sắc ký qhư SKLCA, SKLM, SKLM hiệu năng

cao, SKK, SKK- KP, dién di mao quan đã và đang được áp dụng phổ biến ở các quốc gia như Mỹ, các nước thuộc cộng đồng chung châu Âu và một số

nước châu Á như Trung quốc , Ấn độ Trong đó, xác định vân tay dược liệu bing kỹ thuật SKLM và SKLCA đã được áp dụng để nhận biết, theo dõi và đánh giá chất lượng dược liệu Ví dụ, dựa vào hình ảnh vân tay SKLM của cây thuốc để nhận biết và phân biệt giữa các loài [30]; dựa vào sắc ký đỏ vân tay SKLCA có thể xác định được vùng trồng của Xuyên khung [19], Khương hoạt [28]; đánh giá chất lượng Hoàng liên chân gà (Coptidiz 8bi2ozme) dựa vào đặc điểm vân tay SKLM của protoberberinalcaloid [54]; áp dụng vân tay hoá học xác định sự thay đổi thành phần hoá học của Trạch tả trong quá trình chế biến

[69] Tuy nhiên các kỹ thuật được ấp dụng trong phân tích phục vụ tiêu

chuẩn hoá dược liệu và các chế phẩm thuốc thảo mộc, cần có các yếu tố đáng quan tâm khác, như điều kiện kinh tế, trang thiết bị, khả năng ấp dụng của

mỗi đối tượng được

Trong các chuyên luận dược liệu và chế phẩm thuốc đông dược của

dược điển DĐTQ 2000 gồm có các kỹ thuât sắc ký được áp dụng trong các

phép thử định tính và định lượng như SLKM, SKLCA và SEK Trong đó kỹ thuật SKLM được áp dụng cho định tính chiếm tỷ lệ cao nhất trong số các chỉ tiêu định tính liên quan đến hoá học Cụ thể, theo thống kê vẻ phép thử định tính dược liệu băng phương pháp vật lý và hoá học có 228 phép thử định tính

bằng pp SKLM trong tổng số 403 phép thử, chiếm 56% Trong khi đó, các chỉ tiêu định tính dược liệu bằng phương pháp SKLM gỉ trong DĐVNII chiếm tỷ lệ còn thấp, cản thiết phải được xây dựng và bổ sung.Trước khi đi vào vấn đẻ xây dựng phương pháp phân tích, cần tìm hiểu rõ khái niệm vẻ đặc điểm hoá học đặc trưng của dược liệu và các yêu cầu có liên quan

Khái niệm vẻ đặc điểm hoá học đặc trưng của dược liệu bao hàm đặc trưng của hợp chất thiên nhiên nói chung, không chỉ giới hạn là các thành

Trang 7

của cây có thể được dùng để đảm bảo cho sự nhận biết hoặc đảm bảo chất lượng chế phẩm của cây thuốc đó, không nhất thiết là hoạt chất” [70]

Tổ chức y tế thế giới WHO hướng dẫn đánh giá hiệu lực và an toàn của thuốc có nguồn gốc từ thảo mộc đã qui định chỉ tiêu đánh giá chất lượng dược liệu về mặt hoá học, như sau: “ Phải mô tả các phép thử vật lý và hoá học được tiến hành để xác định các thành phần hoá học của cây và mô tả sắc ký đỏ của phân đoạn hoạt chất hoặc chất đặc trưng Nếu không phải xác định một hỗn hợp các

chất đặc trưng (dấu vân tay) của cây thuốc ” [70] Điều đó có nghĩa là:

* Chỉ tiêu định tính phát hiện thành phần hoá học đặc trưng hay một hén hợp các chất đặc trưng của dược liệu bằng phương pháp sắc ký là một yêu

cầu cần thiết và được thực hiện để đánh giá chất lượng dược liệu đó

* Các đặc điểm hoá học đặc trưng của một dược liệu được thể hiện có

thể là đặc trưng của một hoạt chất, một hợp chất, hoặc là đặc trưng của một

nhóm hoạt chất hay một hỗn hợp các chất của dược liệu đó Một hỗn hợp các

chất đặc trưng cho dược liệu còn gọi là “ dấu vân tay “ của dược liệu đó

* Các qui định đặc trưng hoá học của dược liệu được thực hiện với yêu cầu ở hai mức khác nhau, đồ là : xác định chất đặc trưng và xác định hỗn hợp các chất đặc trưng để nhận biết Trong đó, yêu cầu xác định đặc điểm hoá học dưới dạng “vân tay” của một hỗn hợp các chất chiết được từ dược liệu, là yêu cầu tối thiểu phải được áp dụng cho định tính dược liệu, đặc biệt là đối

tượng khi chưa xác định được thành phần hoạt c hất

Thông thường, các phép thử định tính dược liệu bằng phương pháp sắc ký, trong các chuyên luận dược liệu của các dược điển như DĐTQ 2000, DĐVNHI thể hiện đánh giá định tính dược liệu theo hai cách: Cách thứ nhất, dùng chất chuẩn để đối chiếu và phát hiện Các chất chuẩn này có thể là thành

phần hoạt chất hoặc một chất đại diện đặc trưng của được liệu Ví dụ như rutin trong Hoa hoè, palmatin trong Hoàng đằng, brucin trong Mã tiền Cách

thứ hai, dùng một hỗn hop chất hay nhôm chất được chiết ra từ được liệu làm đối chiếu Trên thực tế các phép thử đánh giá theo cách thứ nhất là ở mức cao hơn, nhưng cồn bị hạn chế do trở ngại phải có chất chuẩn để đối chiếu Một số

chất đặc trưng dùng làm đối chiếu đã được qui định cụ thể trong một số

chuyên luận dược liệu của DĐVNIT để đánh giá, nhưng trên thực tế còn khó kiếm Ví dụ, catalpol trong Địa hoàng, jsminoidia trong Dành dành,

turberostemonin trong Bách bộ Chính vì vậy, các đối tượng dược liệu trên

đã được qui định áp dụng cả hai cách : hoặc dùng chất đối chiếu, hoặc dùng địch chiết của dược liệu đó làm đối chiếu (ấp dụng trong trường hợp không có chất chuẩn) Các trường hợp qui định tương tự như vậy cồn pl ‘a doi voi các dược liệu đã biết thành phản hoạt chất, ví dụ như Bình vôi, Cà độc dược, Đại hoàng Như vậy, có thể nói, xáy đựng phương pháp xác định đặc điềm

đặc trưng của được liệu dưới dạng xác định đặc trưng của một nhóm chất là

cân thiết phục vụ cho tiêu chuẩn boá, áp dụng phổ biến cho các dược liệu, kể

Trang 8

Các trường hợp định tính dùng dịch chiết dược liệu thay thế cho một chất làm đối chiếu như đã nêu ở trên, thể hiện mối tương quan giữa chất đặc

trưng và nhóm chất đặc trưng; các đặc điểm đặc trưng của thành phần chất cũng thể hiện là đặc trưng của nhóm chất, bao gỏm có chất đặc trưng đó Có

thể nói, đánh giá đặc trưng của một nhóm chất đại diện dùng thay thế như đã nêu là cơ sở để đánh giá chất đặc trưng đó Điều này có ý nghĩa trong việc /ờm và xác định đặc trưng của nhầm chất sẽ căn cứ theo hướng tùn hoạt chất

hoặc chất đặc trung đã được biết của được liệu

Mặt khác, khi dùng một nhóm chất chiết từ dược liệu, làm đối chiếu thay thế cho một chất, phương pháp chiết hay còn gọi là xử lý mẫu phải được

tiến hành theo hướng chiết được tối đa chất đặc trưng đã được xác định của

dược liệu đó Ví dụ tetrahydropalmatin là thành phần hoạt chất chính đã được qui định lầm chất đối chiếu trong phép thử định tính Bình vôi; atropin và scopolamin được qui định trong định tính Cà độc dược Do vậy việc xử lý mẫu của các dược liệu nầy đã được thực hiện theo hướng chiết alcaloid, để dịch

chiết thu được có tỉ lệ thành phần hoạt chất như đã nêu đạt tối đa Jasminoidin

là một thành phần đặc trưng của dược liệu Dành dành, thuộc nhóm iridoid glycosid, đã được qui định làm chất đối chiếu trong phép thử định tính, do vậy dịch chiết dược liệu đã được xử lý theo hướng chiết glycosid với dung môi methanol [4] Như vậy, phương pháp chiết hay xử lộ mẫu được liệu là một trong các yếu tố có ảnh bưởng đến kết quả xác định "vân tay “nhóm chất của

một được liệu, cần được quan tâm khảo sát

Đặc điểm hoá học đặc trưng của một chất hoặc của một nhóm chất được

thể hiện về các mặt như sau :

Đặc trưng về màu sắc : Được biểu thị bằng các mầu dưới ánh sáng thường

hoặc màu phát quang dưới UV366am, do bản chất tự nhiên của thành phản chất hoặc do được tạo thành sau phản ứng hoá học với các loại thuốc thử đặc

trưng ( thể hiện trên sắc ký đỏ SKLM)

Tìm đặc điểm đặc trưng này phụ thuộc vào việc khảo sát lựa chọn thuốc thử thích hợp để phát hiện

Đặc trưng về vị trí của vết hoặc của cdc pic tao thành trên sắc ký đô : Được

biểu thị bằng các giá trị Rf ( SKLM) hoặc giá trị thời gian lưu TE (SKLCA, SKK) của vết, các vết hoặc pic, các pic trên sắc ký đỏ

Tìm đặc trưng về vị trí của vết hoặc pic ta phải tiến hành khảo sát hệ dung môi sắc ký ( hay còn gọi là pha động ) thích hợp để tách các thành phần phân tích

rõ rệt trên sắc ký đồ

Đặc trưng về tỷ lệ và mức độ đậm nhạt của các vết hay tỷ lệ mật độ của các

pic trên sắc kỹ để : Được biểu hiện bằng các vết có màu sắc với độ đậm nhạt

khác nhau trên sắc ký đỏ đối với phương pháp SKLM hoặc là các pic có chiều cao hoặc diện tích pic khác nhau, khi thực hiện bằng các phương pháp

SKLCA, SKK .Tỷ lệ mức độ đậm nhạt của các

t hoặc pic cần xác định c ký đỏ, có thể là căn cứ giúp ta đánh giá chất lượng dược liệu không

† định tính mà cả về mặt xác định bán định lượng của được liệu đó

trên

chỉ về

Trang 9

Tỷ lệ này còn phụ thuộc vào phương pháp chiết và xử lý mẫu, do vậy cũng cần

được quan tâm

Bởi vậy, các yếu tố có liên quan và ảnh hưởng đáng kể đến kết quả xác định các đặc điểm đặc trưng của dược liệu bằng phương pháp sắc ký gồm có : Phương pháp xử lý mẫu, hệ dung môi sắc ký (pha động) và phương pháp phát hiện Các yếu tố này cần được quan tâm và khảo sát khi tiến hành xây dựng phương pháp xác định đặc điểm đặc trưng hoá học dưới dạng “vân tay” của được liệu Bên cạnh đó còn có yếu tố ảnh hưởng khác cũng cần được quan tâm như : pha tính được áp dụng của các kỹ thuật sắc ký ( SKLM, SKLCA, SKK) ; dung lượng mẫu áp dụng sắc ký, nhiệt độ

2.2 Các phương pháp xác định các đặc điểm hoá học đặc trưng của

được liệu

Như đã trình bày ở phần Trên, tiến hành xác định đặc điểm hoá học đặc

trưng của một dược liệu, đặc biệ i

hoạt chất, đồng nghĩa với việc xác định đặc điểm đặc Trưng dang vân tay nhóm chất của dược liệu đó Vì thế, việc tìm hiểu khái niệm về các nhóm chất,

sự phân loại và đặc diểm của nhóm chất là cản thiết cho việc khảo sát phương pháp xác định các đặc điểm đặc trưng của nhóm chất đó

2.2.1 Nhóm chất của cây thuốc

Các thành phản hoá học của cây thuốc hay của dược liệu nhìn chung đêu được phân loại thành các nhóm chất, việc phân tích và xác định các thành phần đó đều dựa trên cơ sở xác định nhóm chất của nó Sự phân loại thành nhóm chất theo nhiều cách khác nhau, ví dụ theo nguồn gốc sinh tổng hợp,

theo tính chất hoà tan và theo sự có mặt của nhóm chức quyết định tính chất

của nhóm chất Chẳng hạn, các chất thuộc nhóm phenolic có tính chất ưa nước và có nguồn gốc từ acid shikimic (aromamatic ptecursor shikimic acid), gôm có: phenol- phenolic acid, phenylpropanoid, favonoid,anthocyanin, xanthon-

stilben và các chất mầu quinol Các terpenoid có tính chất thân dầu, sinh tổng hợp từ isopentenyl pyrophosphat, gồm có tỉnh đầu, diterpenoid, triterpenoid , steroid va carotenoid Cac hop chat chứa nitơ có tính kiểm, được phát hiện

băng phản ứng với thuốc thử" niabydưia hoặc đrageodorff [38]

Theo Bai giảng dược liệu [6] [8], đã phân loại các hợp chất trong cây

thành các các nhóm chính như : tỉnh đầu, alcaloid „ anthranoid, coumarin,

flavonoid, tanin, saponin, glycoside tim, céc mono va diterpen glycosid , glycosid cyanogenic, đường , các acid hữu cơ Trong số đó có một số nhóm chất còn được xếp vào nhóm glycosid do công thức của các chất thuộc nhóm này phần lớn ở dạng gắn đường như anthranoid, coumarin, flavonoid, tanin, saponin, glycoside tìm, các mono và diterpen glycosid „ glycosid cyanogenic

Theo H Wagner và S Bladt [30] đã phân loại các thành phần hoạt chất của cây thuốc thành các nhóm chất để phát hiện chúng bằng phương pháp

SKIM gồm có các nhóm chính như sau : alcaloid , anthraglycosid, arbutin,

Trang 10

So dé 2.1: Sơ đỏ tổng quát

phân loại các thành phần nhóm chất trong cây

- Phenol va Phenolic acid - Coumarin ~ Acid hydroxycinnamic -Phenyl propanoid | (Acid phenolcarboxylic ) - Phenylpropen Hợp chất -Lignan Phenolic - Flavonoid cé mau - Ánthocyanin - Flavon va Flavonol

Hop - Xanthon va Stilben

- Flavanoid khác chiếm tỉ lệ nhỏ.: chalcon,

auron, flavanon,dihydrochalcon,isoflavon

tất ~ Chất mầu quinon : benzoquinon.,

aphtaquinon, _ anthraquinon (anthranoid) - Tỉnh đầu ( mono và sesquiferpen ) = Diterpenoid ite Triterpen Terpenoid |-Trierpenoidvà [Steroid | Steroid Saponin nhận Glycosid tim -Carrotenoid

Acid hữu cơ, |ˆ Các acLd có trong cây

Chất bến Tửã - Acid béo va lipid —

hợp chat lien |-Alkaa và các hydrocacboo liên quan BE quan mg Polyacetylea - Hap chat sulphua - Alcaloid -Amio - Amino acid Hợp chất aitd | - Cyanogenic glycosid -Indol ~ Purine, pytimidia, cytokinia = Chlorophyll

Đường - Mono saccharid

Q đấu xuất Oligo saccharid

và dẫn xuất

- Đường alcohol va cyclitol

Trang 11

2.2.1.1 Hop chất phenolic [3][30]138]

a, Coumarin

Coumarin là những dẫn chất benzo- œ pyton có cấu trúc C6 — C3 Cho

đến nay đã có trên 200 chất được biết và đã được phát hiện có trong 27 họ Có thể phân loại coumarin thành các nhóm chính như sau :

-Coumarin đơn giản hay cdn goi la coumarin khong ngưng tụ (non— condensed coumarins) : thường có các nhóm OH hoặc OCH3 được thế ở vị trí

€6, C-7, có khi được thế ở C-5, C-8 Chất điển hình : Umberlliferon

(Angelicae radix) , scopoletia ( Scopoliae radix)

~ Furamo coumarin:

Các chất thuộc nhóm này có thêm một vồng furan được gắn ở vị trí C-ố

và C-7 (psoralen) hoặc ở C-7 và C- 8 (angelicia) Chất điển hình : Imperatorin,

begapten, angelicin ( Angelicae, Imperatoriae radix) - Pytano coumarin:

Có thêm vòng pyran ở vị trí C-6 , C-7 ( xanthyletia ) : ví dụ xanthyletin,

xanthoxyletin Hoặc có vòng pyran ở vị trí C- 7 và C-8 , ví dụ: visnadin,

samadin ( Ammi ma joris fructus}

b Lignan

Lignan được tạo thành bởi sự oxy hoá của một cặp gồm 2 đơn vị p-

hydroxyphenylpropene, thường đuợc nối bởi 1 cầu oxy, thường có ở trong quả, tâm gó và rễ của cây Có trên 30 cấu trúc này đã được phát hiện Chất đại

điện: Pinoresinol, syrylganesinol

Các dẫn xuất của pinoresiaol và syriagaresinol là thành phản hoạt chất

được phát hiện có trong vO thin Dé trong Cortex Eucommiae Tangsenoid I va

sydngin là các lignan có trong rể Đảng sim (Radix Codonopsis pilosulae) #leutheroside E, Eleutheroside B (Syringin) là thành phản chính có trong rể

cila cay Eleutherococcus senticosus MAXIM (Araliaceae)

c Flavonoid

Flavonoid là một nhóm hợp chất lớa thường gặp ở thực vật Phần lớn

các flavonoid có thể xem là các dẫn chất có gốc pheny| của các nhân benzo - + pyron (chromon) benzo dihydro - y pyton , benzo dihydropyran (chroman) và benzo pyrylium Hiện nay có khoảng trên 4000 chất đã được xác định cấu trúc trong đó flavon và flavonol với nhóm thế là OH và /hoặc OCH; chiếm tỉ lệ

lớn Hau hét cac flavonoid la cdc chat phenolic

Sự phân loại các flavonoid dựa vào vị trí của gốc aryl (vòng B) và các mức độ oxy hoá của mạch 3 catbon gồm có : Euflavonoid là các géc flavonoid có gốc aryl ở vị trí C-2, isoflavonoid có gốc aryl ở vị trí C-3 và neoflavonoid có gốc ở vị trí C-4

Ngoài ra còa phân biệt các biflavonoid là những flavonoid dimmer, triflavonoid được cấu tạo bởi 3 monomer flavonoid, flavolignan [a ohitag flavonoid ma phân từ có một phần cấu trúc lignan

Trang 12

trong gôm của các cây họ hoa tán, acid ferulic cũng được phát hiện có trong Xuyên khung

e Anthranoid

Anthranoid nằm trong nhóm lớn thuộc chất mầu quinon là những sắc tố

được tìm thấy chủ yếu trong ngành nấm, địa y, thực vật bậc cao Căn cứ vào số

vòng thơm dính thêm vào nhân quinoa mà người ta sắp xếp thành benzoquinon , naphtaquinon, anthraquinon

Anthranoid ( aathraquinon ) được chia thành 2 nhóm lớn: nhóm phẩm nhuộm và nhóm nhuận tẩy.Trong phạm vì phân tích cây thuốc nhóm nhuận

tẩy được quan tâm nhiều , những chất thuộc nhóm này thường có 2 nhóm OHL

dính ở vị trí 1,8 và ở vị trí 3 thường là nhóm CH; CH,OH, CHO hoặc COOH Người ta hay gặp các dẫn chất có cùng một cấu trúc, chỉ khác nhau ở mức độ oxy hóa C-3 trong cùng một loài Ví dụ trong Đại hoàng, Chút chít, Thảo quyết mình thì có mặt cả 3 chất: Chrysophanol, aloe emodin và rhein Những

dẫn chất anthranoid khi ở trong thực vật có thể tỏa tại dưới dang oxy bod

(anthraquinon) hoặc dạng khử (anthron, anthranol)

Trong cây anthranoid tỏa tại dưới dạng aglycon và dạng gắn đường Dạng gắn đường chủ yếu là O-glycosid, liên kết glycosid thường gặp ở vị trí CL hoặc C-6-OH, dạng C-glycosid chỉ xuất hiện ở nhóm anthron với liên kết C-C thường ở C-10 (barbaloin), hoặc vita C- glycosid vita O — glycosid như aloinosid, cả 2 chất này đều có trong Lô hội

Dẫn chất anthranoid trong cây đôi khi còn gặp dưới dạng dimmer như hipericia: có trong cây Hipericum Perforatwn Ararobinol cé trong cot khi

muởng, senosid A, B, C có trong Phan tả diệp, cassiamin (dianthraquinon )

thường gặp trong chi Cassia

2.2.1.2 Terpenoid [6] [3] [30] [38]

Terpenoid là những chất có cấu tạo từ các isopren C, H, và chúng được phân loại dựa theo số isopren có trong công thức gồm có các thành phần như

sau : Monoterpen 2 đơn vị (C10) , sesquiterpen 3 doo vi (C15), diterpen 4 don

4(C20),ttiterpen 6 đơn vị (C30), carotenoid 8 đơn vị (C40)

Các terpenoid còn được xếp thành nhóm theo tính chất bay hơi như tỉnh dầu

là những mono và sesquiterpen bay hơi (C10 — C15), đến nhóm diterpen bay

hơi kém (C20), cuối cùng là các nhóm không bay hơi

a.Monoterpen va sesquiterpen ( tink ddu )

Một số chất đại diện : Các dẫn xuất của monoterpen như limonen có trong tỉnh đầu vỏ chanh Citrus limonia Osbeck, citronelal, geraniol có trong tinh

dau Sa Citroneile java Menthol cé trong tinh dau Bac ha Mentha arvensisL,

1M piperita L Ciaeol trong tình đầu của cây Tràm Melaleuca leucadendron L Camphor có trong tỉnh đầu cây Long aio Cinnamomum camphora (L), Nees et Eberm (7zizaceae) Các dẫn chất của sesquiterpen như: ÿ.Zingilberen, areurcumemen, B.farnesen cé trong tinh déu Gitng: Zingiber officinale Rose

Trang 13

Các thành phần bay bơi có trong tỉnh dầu, ngoài các thành phản dẫn chat mono va sesquiterpea cé thé có các thành phản bay hơi khác là các dẫn chất nhân thơm chiếm tỷ lệ cao ví dụ như aldehyd cianamic của tỉnh đầu Quế

cinnamomum cassia Nees et BI (Lauraceae) Eugenol cé trong tinh dau cia

Hương abu: Ocimum sametum L boic Ocimum gratissium L (Lamiaceae)

b Mono va diterpenoid glycosid

Trong cay,thiah phin monoterpenoid glycosid duc gip ahiéu ahat là nhóm iridoid, cho đến nay đã được biết đến trên 600 chất Khung cơ bản gồm một vồng xyclopaatan nối với một vòng hydropyra Các itidoid thường gặp trong các họ Šcrophulariaceae như Sioh dia, Huyéa sim, Rubiaceae abut Dành dành, lá lông mơ, Plantaginaceae như Mã đè, và một số họ khác

- Iidoid gầm các nhóm :

* Iridoid c6 aglycon di 10 carbon : Gardosid, scanzhisid trong Dành diab, logania trong lá Kim ngân * Iridoid khong dit 10 carbon : Catalpol trong Sinh địa, aucubin trong lá Mã đề * Các iridoid trên 10 carbon :Fulvoplumierin, plumierid trong vỏ cây đại

* Secoiridoid : Gentiopictim trong Long dim

- Diterpenoid glycosid : gặp giới hạn trong một số loài ví dụ : Darutosid

trong Hy thiêm, neo-andrographolid trong Xuyên tâm liên, sfeviosid có trong Cổ ngọt

Triterpenoid chia thanh 4 nhóm chính: Triterpen (rue triferpen ) ,

steroid, saponin va glycosid tim Các triterpen thường có vị đắng nên còn được xếp vào nhóm chất đắng ví dụ, các limonoid, quassinoid [a các triterpen

có phổ biến trong ho Rutaceae, Meliaceae, Simaroubaceae Cac triterpen tự

nhiên có thể tổn tại dưới dạng tự do hoặc glycosid, ví dụ chandravadana, momordicosid k, | F,, F,, G val la các glycosid triterpenoid có trong quả Mutép diag Momordica charantia L

Sterol trước đây chủ yếu được quan tâm như là những chất hocmon của

động vật (như hocmon nội tiết, ) Trong những năm gần đây, số lượng nhóm chất này được phát hiện trong cây tăng lên nhiều Chất điển hình sitosterol (B sitosterol) stigmasterol và campesterol Những sterol này có thể xuất hiện dưới

đạng tự do hoặc glycosid d.Saponin:

Saponin được phát hiện có trong trên 70 họ Phản lớn các saponin có trong cây thuốc dưới dạng triterpen glycosid và một số dạng steroid saponin Phần gắn đường có thể được nối qua nhóm OH ở vị trí C3-OH

(monodesmosidic saponin) một số ít trường hợp phần đường gắn qua 2 nhóm OH hoặc qua một nhóm OH và một nhóm carboxy| của aglycon

(bisdesmosidic saponin)

Trang 14

một số ít trường hợp kết hợp với đường tạo ra dạng glycoalcaloid như Solanin,

solamacgin, trong cay ca lé xé (Solanwn lacianatwn)

Alcaloid thường được phân loại tuỳ theo cấu trúc của nhân, gồm 3 nhóm chính: alcaloid không có nhân dị vòng, alcaloid có nhân dị vòng và

alcaloid có nhân khác ( nhân sterol và terpen) Alcaloid không có nhân dị

yong abut ephedrin cé trong Ma hoàng, leonuria có trong Ích mẫu Các

alcaloid có các nhân khác như : solanin , solamacgin là các alcaloid có cấu

trúc steroid có trong Cà lá xẻ Solanum lacianatum Ait (Solanaceae) Aconitin

là 1 loại alcaloid có cấu trúc diterpen có trong Ô đầu Ngoài ra, còn có cấu

trúc khác như tuberostemonin có trong Bách bộ

Các alcaloid có nhân dị vòng được phân loại tiếp thành các nhóm có kiểu khung dị vòng khác nhau:

- Dẫn xuất nhân pytrol hoặc pirrolidin

- Dẫn xuất nhân pyridia hoặc piperidin như nicotin trong thuốc lá,

arecolin trong hat cau (semen Arecae)

- Dan xuất tropan: Scopolamin trong Ca độc dược

~ Dẫn xuất của nhân quinolin: quinine, quiaidin trong vỏ Canhkina ~ Dẫn xuất isoquinolin

~ Dẫn xuất cia quinolizidia: spactein trong Sarothamnus scoparius - Dẫn xuất nhân LadoL

- Dẫn xuất nhân imidazol: pilocapin trong ilacarpuz jaboprandi ~ Dẫn xuất nhân purin: cafein, theo phylia, theo bromin

- Dẫn xuất của quinazolin:

- Dẫn xuất của nhân acridin: rutacridon, arborinin trong Ruta

graveolens

- Dẫn xuất của nhân pyrrolizin

Trong số các nhóm dẫn xuất này có 2 nhóm isoquinolia và indol, được sử" dụng nhiều trong điều trị nên được phân loại tiếp thành nhiều phân nhóm

Din xuat isoquinolin gồm 9 phân nhóm : Cấu trúc tetrahydroisoquiaolin, benzylisoquinolin, ptalidisoquinolin, protobetberin, protopin, aporphin, morphinan, benzphenanthridin, emetia.V( dụ : Papaverin (thudc beazylisoquiaolin),nosceapia (thuộc ptalidisoquiaolin), morphin, coddein và thebain (morphinan) là các thành phần có trong nhựa thuốc phiện Đetberia (protoberberin ) có trong Hoàng liên Emetia , cephelia (huộc

emefin) có trong jpeca

Din xuất indol gém 6 phân nhóm: Cấu trúc iadolalkylamin, physostigmin, B carbolia, ergolin, strychnin và các alcaloid nhân ¡adol có cấu trúc phức tạp ở các cây thuộc chỉ Catbaranthus, vi dụ : các alcaloid có cấu

trúc ergolin, có trong cựa loã mạch cấu tric strychnia có trong chỉ Strychnos 2.2.1.4 Acid amin

Các acid amin có phổ biến trong hệ thực vật và động vật nói chung là

thành phần cấu tạo protein, ngoai ra trong hệ thực vật còn có các thành phần

acid amia không thuộc nhóm cấu tạo protein “ non-protein” acid ví dụ :

Trang 15

azetidine2- carboxylic acid là thành phần đặc trưng có trong một số cây thuộc

họ Zifiaceae Một số thành phần acid amin có tác dụng trị sẩn như curcubitin ( amino-3-carboxy-3-pytolidin) cé trong hạt bí ngô, acid kainic có trong tảo Diginea simplex Agatdh, acid quisqualic có trong hạt cây Sử quân từ [8]

Saussureamin A, B,C,D,E là các thành phần aminoacid- sesquiterpen có tác

dụng sinh học đã được phát hiện trong rễ Mộc hương [77] 2.2.1.5 Đường

Đường trong cây được phân loại thành 3 nhóm căn cứ theo kích thước của phân tử gồm có: monosaccharid (ví dụ glucose, fructose), oligosaccharid va polysaccharid Oligosaccharid được tạo thành boi sự ngưng tụ của 2 hay vài đơn vị monosaccharid, ví dụ như suctose.Polysaccharid gồm có nhiều và tạo thành một chuối đài đơn vị moaosaccharid, thành phản này chỉ được tách và

phát hiện dưới dạng sản phẩm thuỷ phân bằng kỹ thuật sắc ký thông thường

như SKLM, sắc ký giấy

2.2.2 Các phương pháp định tính phát hiện

Trong phạm vi của đề tài, chúng tôi xin giới thiệu một số phương pháp và kỹ thuật có liên quan đến xác định các đặc điểm hoá học đặc trưng dạng “vân tay” nhóm chất của dược liệu, gồm có các phương pháp sắc ký như

SKIM, SKLCA, SKK Phương pháp định tính bằng phản ứng hoá học được

giới thiệu để tham khảo

2.2.2.1 Phương pháp định tính bằng phản ứng hoá học

1à phương pháp định tính dựa vào phản ứng hoá học của một số nhóm

chất với thuốc thử tạo thành các sản phẩm kết tủa hoặc có màu đặc trưng, cồn

được gọi là phương pháp định tính trong ống nghiệm Thuốc thử thường được

ấp dụng phát hiện một số nhóm chất của dược liệu, được tóm tất ở bảng 2 1 Phương pháp định tính trong ống nghiệm có tính chất sơ bộ , tính chất

đặc trưng chỉ giới hạn ở một số nhóm chất (như đã trình bày ở bảng 2.1) Phản ứng màu tạo thành để phát hiện nhóm chất đôi khi còn bị hạn chế, khó phát hiện bởi sự ảnh hưởng của các thành phản nhóm chất khác có trong dược liệu Trong phạm vi đề tài, chúng tôi không tiến hành khảo sát xác định đặc điểm

hoá học đặc trưng bằng phương pháp định tính ống nghiệm, phương pháp được nêu chỉ mang tính chất giới thiệu để so sánh

Trang 16

Bang 2.1 : Định tính các nhóm chất hoá học của dược liệu bằng phương pháp đỉnh tính trong ống nghiêm 7 Nhóm chất Phản ứng định tính Phát hiện

Phần ứng cyanidia Sin phẩm có màu hồng Phản ứng với đó FeCl, 5% Sản phẩm mầu xanh tím

1 | Flavonoid Phản ứng với kiểm Sia phim có màu vàng

đậm hoặc vàng cam Phần ứng với TT Mayer Có tủa

2 |Alealoid Phản ứng với TT Dragendorii— | Có màu nâu vàng

Phản ứng với TT Bouchardat Có tủa và màu

Phản ứng mở, đóng vồng lacton | Có tủa trong trong môi

3 | Coumarin trường acid và tan / kiểm

Phản ứng Diazo Có màu đặc trưng

Phản ứng Bortraeger Có mâu đặc trưng 4 | Aathraglycosid Phản ứng với dd gelatin 1% phản ứng với dd phèn sắt amoni 3 | Tania Phản ứng Styasny :

loại tanin pyrogalic

loai tania catechic Có tủa Có tủa và màu Có mầu đặc trưng Có màu đặc trưng

phẫn ứng legal Cổ màu đặc trung 6 | Gtycosidtim [phản ứng Baljet Phản ứng xaathydroL Có mầu đặc trưng Có mầu đặc trưng

: Phân ứng SalEospki Có mầu đặc trưn/

uF | Stssoud Pháo ứng hien Có mầu đặc trưng

§ | Đường khi | Phản ứng với TT Fehling The có màu 9 [ Acid hữu cơ | Phản ứng với dd Na,CO Có bọt khí

10 | Chất béo Hơ trên giấy lọc

Phương pháp sắc ký lớp mồng

Tà phương pháp tách các chất trên hai pha trong đó pha động là chất

lòng gồm các dung môi và pha tính là chất rắn thông thường là silicagel được

tráng trên bản mỏng

Các yếu tố liên quan đến phương pháp : Khi tiến hành phân tích bằng

kỹ thuật sắc ký trên bản mỏng cũng như các kỹ thuật sắc ký cột, có 3 yếu tố

chính liên quan đến phương pháp đó là pha tính, pha động và cách phát hiện Kết quả phân tích phụ thuộc nhiều vào các yếu tố trên Thêm vào đó, còn có các yếu tố ảnh hưởng khác, như phương pháp chuẩn bị mẫu hay còn gọi xử lý

mẫu và lượng chấm mẫu, cần được lựa chọn cho phù hợp với từng đối tượng

Trang 17

phân tích Các yếu tố này sẽ được trình bày kỹ hơa ở phản phương pháp nghiên cứu

nay, có nhiều loại pha tính đã được sử dụng để tách các nhóm chất bởi kỹ thuật này Một số pha tính thông dụng đã được áp dụng định tính các được liệu, có ghỉ trong các dược điển như : Silicagel Œ F254 Merck, silicagel

H, polyamid, cellulose

Bén canh đó, một số loại pha tính khác đã được sản xuất với công nghệ cao, góp phần nâng cao hiệu quả phân tích, như bản mỏng hiệu năng cao HPTLC, Lichrospher Si 60 F254 Một số pha tính dưới dạng bản mỏng pha dio HPTLC plates RP-2, RP-8, RP-18 mở rộng khả năng tách tốt đa số các

thành phần từ rất kếm phân cực như dầu bếo và các chất thơm, đến rất phân

cực như các thành phần có tính acid và bazơ, các cặp ion Bản mỏng HPTLC plates NH, đã được dùng để tích và phát hiện một số chất đường, catecholamin, steroid hormon và các acid của hoa quả, đạt hiệu quả cao

Trên thực tế, sự lựa chọn pha tính cồn phụ thuộc vào mục đích phân tích

và hiệu quả kinh tế Pha tính được áp dụng phổ biến hiện nay là Silicagel Œ #234 Merck bản trắng sẵn, có thể áp dụng phân tích đối với hầu hết các thành phần nhóm chất Pha tính loại này đã được chọn áp dụng cho phân tích dược liệu của đề tài

Pha động:

là các hệ dung môi tách các thành phản chất cản phân tích, việc khảo sit lựa chọn hệ dung môi phù hợp đối với từng đối tượng phân tích là cần thiết để đảm bảo tách và phát hiện rõ các thành phản phân tích trên sắc ký đỏ Việc lua chon hệ dung môi thực hiện theo qui tắc tam giác (riangular diagram) của Egon Stahl [26], tức là giữa 3 yếu tố gỏm có hệ dung môi của pha động, thành phản cần tách và mức độ hoạt hoá của pha tĩnh có mối quan hệ tương ứng với nhau Để tách các thành phần kém phân cực, dùng pha động là dung môi hoặc hệ dung môi kém phân cực là thích hợp, bên cạnh đó pha tính nhự

Silicagel G yêu cầu được hoạt hoá ở mức độ cao, bằng cách sấy ở nhiệt độ 105°C trong 1 giờ trước khi sử dụng Ví dụ, để tách các thành phần kém phân cực của tỉnh dầu , các dung môi và hệ dung môi kém phân cực đã được dùng

như chÍoroform hoặc toluene : ethylacetat (93: 7 ), (95 : 3) và pha tính cần

được hoạt hoá Ngược lại để tách các thành phần phân cực như các glycosid, cần các hệ dung môi có thành phần phân cực và pha tĩnh không đồi hỏi mức độ hoạt hoá cao ,ví dụ như các hệ dung môi đã được áp dụng tách glycosid da nêu ở phụ lục 3 Theo nguyên tắc lựa chọn hệ dung môi thích hợp như đã nêu „ cho thấy, nhiều pha động với thành phản dung môi và tỉ lệ khác nhau có thể được áp dụng để tách các chất cần phân tích Thành phản hệ dung môi có khi có thêm một tỷ lệ nhất định các dung môi có tính acid hoặc kiểm, với mục đích làm tăng hiệu quả tách các chất cần phân tích Chẳng hạn, các hệ dung môi được áp dụng tách các alcaloid thường có thêm thành phẩn kiêm như amoniac hoặc diphenylamin và các hệ dung môi tách các flavonoid thường có

thêm acid, như acid acetic, acid formic ( xem phụ lục 3) Tuy nhiên, có

Trang 18

trường hợp ngoại lệ, chẳng hạn, có thể tách berberin (alcaloid) với hệ dung môi có thành phần acid, hay tách acid glycyrthetic ( saponin) trong rễ Cam thảo (74@uiritiae radix) với bệ dung môi kiêm ( xem phụ lục 3)

Trên thựt tế, đã có nhiều hệ dung môi đã được áp dụng trong phân tích

các thành phần chất và nhóm chất của dược liệu và các chế phẩm Một số hệ dung môi được giới thiệu để tham khảo, đã được áp dụng tách một số thành phần chất và nhóm chất trong được liệu cũng như chế phẩm, với pha tính chỉ: yếu là SilicagelG, như đã được ghỉ ở phụ lục 3

Phương pháp phát biên:

Khác với các kỹ thuật sắc ký cột, một trong số ưu thế nổi bật của kỹ

thuật SKLM là khả năng phát hiện phong phú các thành phản, nhóm chất của được liệu Bên cạnh khả năng phát hiện dựa vào đặc điểm tự nhiên, vốn có

màu hoặc phát quang của thành phần phân tích, sự phát hiện dựa vào các phản

ứng hoá học của các thành phần chất và nhóm chất với các loại thuốc thử khác nhau, tạo ra các sản phẩm dẫn xuất có mầu hoặc có phát quang mầu đặc

trưng, đã góp phần đáng kể trong việc tìm và phát hiện các thành phần đặc trưng cho được liệu và các chế phẩm bởi kỹ thuật này Bên cạnh đó, thuốc thử:

được áp dụng để phát hiện các thành phần chất rất phong, phú Hiện nay đã có

trên 250 thuốc thử các loại [26] [30] [40], trong đó gồm có thuốc thử phát

hiện nhóm chất, ví dụ : thuốc thử Dragendorff dùng để phát hiện alcaloid nói chung ; 4-nitroanilia diazo hoá phát hiện các hợp chất phenolic ; thuốc thử" Ninhydrin phát hiện các acid amin và các amin bậc 1; thuốc thử ơ- naphthol/ acid sulfuric phát hiện đường Thuốc thừ phát hiện nhóm chức như : thuốc thử dinitrophenylhydrazin phát hiện nhóm chức aldehyd và keton; thuốc thử:

Fast blue salt phat hiéa ohém chat phenol Thudc thir phat hiện theo cấu tạo

của công thức như : thuốc thir EP (4- dimethyl aminobenzaldehyd/ acid acetic/ acid phosphoric ) phát hiện terpenoid có cấu trúc khung kiểu azulen

thường cho màu xanh đặc trưng; thuốc thừ Van Urk để phát hiện các dẫn xuất của vòng indoL ( các secale alcaloid ); thuốc thử Tibermann- Burchard phát hiện các triterpen và steroid Hơn nữa, các phản ứng tạo màu cũng thể hiện

khác nhau giữa các chất thuộc cùng một nhóm chất, khi phun cùng một loại

thuốc thử, góp phần tạo nên các đặc điểm đặc trưng cho từng thành phần c hất

trên sắc ký đỏ Chẳng hạn như, các thành phần của tỉnh dầu cho các mầu sắc

khác nhau từ màu xanh- xanh tím- tím — tím đỏ với thuốc thử' vanilin / acid

sulfuric, các thành phần thuộc nhóm flavonoid cho các vết có phát quang khác nhau từ mầu lục — vàng — vàng cam với thuốc thử: NP/ PEG hoặc acid boric/ acid oxalic trên sắc ký đỏ Một số thuốc thử phổ biến đã được áp dụng phát

hiện các thành phần chất và nhóm chất được ghỉ ở phụ lục 4 2.2.2.3 Phương pháp sắc ký lỏng cao áp ( SKLCA)

La phương pháp sắc ký phân bố (pha đảo là chủ yếu), trong đó pha

động là một dung môi hoặc một hỗn hợp dung môi có độ phân cựt thích hợp, cồn pha tính chứa trong cột là chat Long phủ trên một chất mang dạng rắn hay

Trang 19

Pha tink:

Gém céc tiéu phan silica gel mà trên bề mặt của nó được biến đổi bằng liên kết hoá học, mà trong số đồ liên kết kiểu octa decylsilan là phổ biến, được dùng nhiều nhất, ngoài ra, kiểu octylsylan cũng được sử dụng Các nhóm liên kết này làm thay đổi tính chất tách cuả cột còn gọi là cột pha đảo Các loại cột pha đảo được sử dụng phổ biến hiện nay như Lichrospher RP18 [4] [57] Pha

tính trên thực tế thường cố định, chỉ thay đổi cột pha tính trong trường hợp cầu thiết và có yêu cầu riêng biệt

Pha dong:

là các hệ dung môi có độ phân cực thích hợp với đối tượng cần phân tích, việc lựa chọn pha động thích hợp cho mối đối tượng cần phân tích là yếú tố cần thiết phải được tiến hành khảo sát Để góp phản làm tăng hiệu quả tách đối với từng đối tượng phân tích cụ thể, đôi khi thành phản pha động có bỏ sung thêm các dung dịch đệm, tạo môi trường PH thích hợp hoặc/ và tỷ lệ

thành phần pha động được khảo sát, thay đổi theo chương trình gradient thich

hợp

Phái hiện :

Detector UV là phổ biến để phát hiện các chất có khả năng hấp thụ từ ngoại và khả kiến như các thành phần thuộc nhóm hợp chất phenolic,

flavonoid, anthranoid, lig nan, coumarin, alcaloid

Các yếu tố có liên quan khác:

Khác với kỹ thuật sắc ký lớp mỏng có pha tính chỉ đùng một lần, không đồi hỏi việc xử lý mẫu khắt khe, loại sắc ký cột rửa giải này, việc xử lý mẫu

thích hợp trước khi đưa vào cột là một yêu cầu cần thiết phải được quan tâm

khảo sát để vừa đảm bảo phân tích đạt hiệu quả, đỏng thời bảo vệ cột Bên cạnh đó, các yếu tố khác cũng có ảnh hưởng đến kết quả phân tích cản được quan tâm khảo sát cho phù hợp như : lượng mẫu áp dụng cho sắc ký, tốc độ

đồng, kích thước cột

Ưu điểm của kỹ thuật SKLCA là có khả năng tách tốt các thành phin

của nhóm chất với độ phân giải cao Hiện nay kỹ thuật này đã được áp dụng nhiêu trong phân tích dược liệu và chế phẩm, đặc biệt là các đối tượng có thành phản hoạt chất đã biết và cần được xác định Ví dụ , các phép thử định

lượng được áp bằng kỹ thuật SKLCA ghi trong các chuyên luận dược liệu

DĐTQ 2005 gồm có 171 trong tổng số 281 các phép thử định lượng, chiếm 60,8% và chiếm 89% ( 171/ 192 ) trong số các phép thử định lượng bằng các

phương pháp sắc ký [59]

Định tính dưới dạng xác định “ vân tay “nhóm chất của một dược liệu được áp dụng bởi kỹ thuật có khả năng tách tốt này, thông thường căn cứ vào

xác định thành phần hoạt chất hoặc chất đặc trưng của nhóm chất và cần thiết

phải có chất chuẩn dé đối chiếu và xác định Kết quả xác định vân tay bằng kỹ

Trang 20

'Với mục đích áp dụng kỹ thuật phân tích sàng lọc SKLM vào việc khảo sát xác định các thành phản hoá học đặc trưng của các dược liệu đã đăng ký của để tài, chúng tôi xin giới thiệu phương pháp “ phân tích sàng lọc SKLM

được liệu và thuốc có nguồn gốc từ thảo mộc, chưa được biết thành phần hoạt

chất “ đã được nêu lên bởi các tác giả H Wagaet, S Bladt [30] để tham khảo

Phương pháp được trình bày tóm tắt như sau :

Pha tinh : Silicagel G F 254

Hệ dụng môi SKLM được áp dụng cho phân tích sàng lọc gồm có 5 loại hệ dung môi như sau :

- HDM.I : Ethylacetat: methanol : nước ( 100 : :10): Để phân tích các

thành phản phân cực ( glycosid ) như alcaloid, anthraglycosid, atbutin, glycosid tim, flavonoid, phenolcarboxylic acid, saponin,

- HDM22 : Toluen : ethylacetat (93 :7): Dé phao tích các thành phần kém

phân cực ( aglycon), như tỉnh đầu, terpen , coumarin, các chất đắng,

valepotriat, các acid kém phân cực

- HDM.3 : Toluen : ethylacetat : diethylamin ( 70 : 20 : 10) : Phân tích

alcaloid

- HDM.4: ethylacetat : acid acetic : acid formic : nước ( 100: 11: 11: 26):

Phân tích flavonoid

- HDM.5 : chloroform : acid acetic glacial : methanol : nutic(64: 32:

Phân tich saponin Thuốc thủử phát hiện : Thuốc thừ phát hiện các nhóm chất được áp dụng trong phân tích sàng lọc gồm có: ~TTI: Thuốc thử kalihydroxid 10% / ethanol ~TT2: Thuốc thử Kedde ~TT3: Thuốc thử Dragendorff

~TT4: Thuốc thử natural product/ polyethylea glycol ( NP/ PEG)

- TTS: Thusc thir vanilia — acid sulfuric hoặc anisaldehyd — acid sulfuric - TT6: Thusc thir acid hydrochloric- acid acetic

~TT7: Thuốc thử Berlin blue

Phương pháp đánh giá kết quả phân tích được tóm tắt ở bảng 2.2

Mô hình phân tích sàng lọc nêu trên sẽ được tham khảo để áp dụng cho phân tích xác định các đặc điểm hoá học đặc trưng của dược liệu đã đăng ký trong dé tai này Tuy nhiên, việc vận dụng một số hệ dung môi tách và thuốc thử để phát hiện nhóm chất có điều chỉnh cho phù hợp với mục đích tìm “ vân tay ” hoá học của dược liệu Cụ thể ,một số nhóm chất là hoạt chất không phổ

biến, đã có thuốc thử riêng biệt và đặc trưng để phát hiện như glycosid tỉm, arbutin, valepotriat sẽ không đẻ cập đến ở phản phân tích sàng lọc Thêm vào đó, một số nhóm chất phổ biến có thể áp dụng xác định đặc điểm đặc trưng cho dược liệu cần được bổ sung như: acid amin và đường

2:8):

Trang 21

Bang 2.2 : Phương pháp đánh giá kết quả phản tích sàng lọc hoá học dược liêu và thuốc nguồn gốc thảo duoc theo tac gia H Wagner S Bladt He Thuốc TH nhi ¿| Cácđặcđiểm Các nhóm chất

I được phát hiện được phát hiện

SKEM [HE tr de kýđể trên sắc ký đỏ

‘Anthranoid

= Mau 46 / vis > anthraquinon HDMI |TTI |- Màu vàng / vis va UV| > — aathron

366 am

- Phát quang mầu khác|>_ Coumain nhau /UV 36ốnm

HDMI |TT2 |-Màuhỏng đếnđồ/vis |> Giyeosidtim

HDMI |TT7 |-Màuzxanh/vis > Arbuta

Giỉ chú : Ký hiệu vis: Sắc ký đỏ quan sát dưới ánh sáng thường; UV : Quan sát dưới ánh sáng từ agoại, bước sóng 366 am

Phương pháp phân tích sàng lọc SKLM có ý nghĩa trong việc khảo sát xây dựng phép thừ xác định các đặc điểm hoá học đặc trưng của dược liệu

đặc biệt đối với đối tượng chưa xác định thành phần boat chat

Ngoài vấn để nêu trên, phương pháp phân tích sàng lọc được liệu còn có ý aghia trong việc khảo sát nghiên cứu hoá thực vật và các nghiên cứu khác

liên quan đến thành phần hoá học của dược liệu

Trang 22

- Silicagel G F254 Merck, baa tring sin 20 x 20cm

- Dung môi các loại, đạt tiêu chuẩn dung môi dùng cho phân tích của hãng Merck hoặc Prolabo

~ Thuốc thử: Các loại thuốc thử ấp dụng định tính bằng phương pháp

SKIM Danh sách thuốc thử ( xem Phụ lục 4)

3 3 Phương pháp nghiên cứu

Tiến hành phân tích xác định các đặc điểm hoá học đặc trưng của dược liệu dưới dạng “vân tay” hoá học, gồm có các bước được tóm tắt theo sơ đỏ 3 1 Sơ đỏ 3.1 : Sơ đồ nghiên cứu xác định các đặc điểm hoá học đặc frưng của

dược liệu

Dược liệu +

Phan tich sang lọc phát Két qud : Gém các hign cdc thanh phanchua |, | nhóm chất đã được

biết của dược liệu phát hiện pp.SKLM hảo sát tìm đặc điểm a đặc trưng của từng nhóm chất <— — Kỹ thuật khác : HPLC Kỹ thuật SKLM và GC- MS (Khai thác thêm ) - Xử lý mẫu - Khảo sát hệ dung môi tách thích hợp - Phát hiện Tết quả hình ảnh sắc ký đỏ Tết quả hình ảnh sắc ký (Gồm các vết có mầu sắc và Gém tip bgp cdc pic

vitet RE dic teamg của nhóm chất đạc trưng cho dược liệu ) cho dược liệu }

+ Ỷ

ng dụng trong định tính So sánh với kết quả phân biệt nhằm lẫn và phát được xác định bằng pp

hiện được liệu trong chế SKLM

phẩm đông dược

Trang 23

3.3.1 Phân tích sàng lọc hoá học dược liệu bằng phương pháp SKLM

Xác định sơ bộ các thành phần hoá học của được liệu được dưa trên cơ

sở phân tích các thành phần nhóm chất chính của dược liệu như sau : Tỉnh dầu và các thành phản terpenoid kém phân cực khác

Alcaloid Coumarin Anthra noid

Flavonoid va céc acid phenolcarbocylic Saponin và các terpenoid (glycosid )

Amino acid

Đường và oligosaccharid

Phương pháp tiến hành gồm các bước như sau:

a Chuẩn bị mẫu chấm sắc ký +

Với mục đích phân tích sàng lọc, dung môi được chọn là loại có thể chiết được đa số các thành phần nhóm chất cần phân tích của dược liệu, dung

môi thông thường được dùng là methanol Phương pháp chiết được tiến hành nhụt sau:

1 gam ( lá ) đến 2 gam (thân, rẻ hoặc thân rể ) dược liệu đã được tán

nhỏ, được chiết với methanol tỉ lệ 1 g/10 mÍ bằng cách đun hỏi lưu trên cách thuỷ 30 phút, gạn lấy phần dịch chiết và cô trên cách thuỷ đến cạn Hoà cắn thu được trong 2mÍ methanol được dùng làm dung dịch chấm sắc ký

b Pha fĩnh :

Lớp mỏng silicagel Œ F254 Merck bản tráng sẵn, là loại thông dụng đã

được áp dụng để tách hầu hết các thành phần nhóm chất

c Lượng chấm mẫu

Lượng chấm mẫu thông thường là 10 - 15 HÍ, riêng đối với định tính phát hiện alcaloid với thuốc thử dragendorff có khả năng phát hiện thấp, cản lượng chấm lớn hơn, từ 20- 30 HÍ

d Hé dung moi SKLM

Các hệ dung môi được lựa chọa để tách các thành phản nhóm chất, được áp dụng trong phân tích sàng lọc hoá học dược liệu, gồm 5 hệ dung môi,

được sắp xếp theo thứ tự tách các thành phần nhóm chất từ kém phân cực đến phân cực như sau :

- HDM 1: Toluen : ethyl acetat (935 : 3)

- HDM 2: Toluen: ethyl acetate: acetone: acid formic (3: 2:2: 1) -HDM ithylacetat : acid acetic : acid formic : nước (10: 1: 1:2)

-HDM 4: Chloroform: methanol : nước (63 : 33 : 10) - HDM 3: N butanol: acid acetic : nước (4: 1: 5 )

Trong đó :

HDMI: Được áp dụng tách các thành phần kém phân cực như tỉnh dầu,

Trang 24

3.3.2 Phân tích xác định các đặc điểm hoá học đặc trưng của dược liệu

Phân tích xác định các đặc điểm đặc trưng của dược liệu chưa xác định

hoạt chất trên cơ sở xác định các đặc điểm đặc trưng của nhóm chất

Tiến hành khai thác tìm và xác định các đặc điểm đặc trưng dạng “vân tay” nhóm chất của dược liệu gồm có :

~ Khảo sát xác định “vân tay” của các nhóm chất, đã được phát hiện sơ bộ từ kết quả phân tích sàng lọc của dược liệu: Sau khi đã nhận biết một số nhóm chất của dược liệu thông qua kết quả phân tích sàng lọc, bước tiếp theo là tiến hành khảo sát kỹ hơn điều kiện phân tích từng nhóm chất cụ thể đó Tiến hành khảo sát và xây dựng các thông số có liên quan đến xác định đặc điểm đặc trưng của nhóm chất như: cách xử lý mẫu, lượng mẫu, loại pha tĩnh, hệ dung môi sắc ký, cách phát hiện và thuốc thử phát hiện; sao cho thành

phần của nhóm chất được thể hiện trên sắc ký đỏ là đặc trưng cho dược

~ Tiến hành khai thác thêm các đặc điểm đặc trưng của nhóm chất theo

hướng tìm thành phản hoạt chất hoặc chất cụ thể đặc trưng đã được biết có

trong dược liệu khảo sát (nếu có) Theo cách này đã ấp dụng trong một số

trường hợp cụ thể, khi thành phần chất cụ thể cần tìm đó được biết có tính chất

đặc trưng riêng biệt ngoài tính chất chung của nhóm chất, ví dụ , áp dụng xác

định vân tay nhóm chất theo hướng tìm thành phần stilben glycosid trong Ha

thù ô, căn cứ vào các đặc điểm đặc trưng riêng biệt của nó ( có phát quang và cho màu đặc trưng với thuốc thừ acid phosphomolipdic/ acid sulfuric) để xác định; xác định vân tay nhóm chất theo hướng tìm pinoresinol glycosid trong đố trọng, tìm alcaloid bay hơi có trong Xuyên khung Xác định đặc điểm

đặc trưng của nhóm chất theo hướng tìm thành phần hoạt chất hoặc chất cụ thể

này sẽ góp phần bổ sung khả năng tìm và xác định xác điểm đặc trưng nhóm chất của dược liệu đó

3.3.2.1 Phân tích xác định các đặc điểm hoá học đặc trưng của được liệu

bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng ( SKLM)

Tiến hành khảo sát xác định các đặc điểm đặc trưng của nhóm chất có trong dược liệu, gồm có khảo sát các yếu tố liên quan đến xây dựng một phép

thử: định tính “vân tay” nhóm chất như sau :

a Pha fĩnh :

Silicagel Œ E 254 Merck, bản trắng sẵn được hoạt hoá ở nhiệt độ 105 ° € trong 1 giờ trước khi sử dụng

b Xử lý mẫu (chuẩn bị mẫu chấm sắc ký):

Một trong những ưu điểm của kỹ thuật SKLM là loại sắc ký mở có pha

tĩnh là các bản mỏng chỉ dùng một lần do vậy việc xừ lý mẫu không đồi hỏi khắt khe như các loại sắc ký cột khác Dịch chiết được liệu áp dụng cho phân tích bằng phương pháp SKLM thông thường nhất vẫn là dịch chiết methanol

Tuy nhiên trong một số trường hợp cần thiết ta có thể áp dụng dịch chiết với

Trang 25

Căn cứ vào các nhóm chất đã được định hướng xác định “vân tay” của

mỗi được liệu, thu được từ kết quả phân tích sàng lọc nhóm chất như đã nêu ở

trên „ tiến hành lựa chọn cách xử lý mẫu phù hợp với nhóm chất cản xác định của dược liệu đó, trong số các dịch chiết dược liệu như đã nêu dưới đây

—_ Địch chiết methanol:

1 gam là đến 2 gam thân, tể, hoặc thân rễ dược liệu đã được tán nhỏ,được chiết với methanol tỷ lệ 1g/10ml bằng cách đua hỏi lưu trên cách thuỷ khoảng 30 phút, gạn lấy phần dịch chiết và cô trên cách thuỷ đến cạn Hoà cắn thu được trong 2 mÍ methanol, được dùng làm dung dịch chấm sắc ký

— Địch chiết với các dung môi khdc : n.hexan, etherethylic, chloroform hoặc ethylacefat

Cách tiến hành : Dược liệu sau khi đã được chiết với methanol như đã

nêu ở mục dịch chiết methanol, phần cắn sau khi làm bay hơi hết methanol được hoà vào 3ml nước và tiến hành lắc với một trong số các dung môi như đã nêu ở trên, để lắng, gạn lấy phần dịch chiết và cô trên cách thuỷ: đến cạn Hoà cẩn thu được trong 1 đến 2ml methanol, thu được dung dịch chấm sắc ký

* Dich chiét n hxan, ether ethylic va dịch chiết chioreform thường được áp dụng trong phân tích các thành phẩn kém phân cực như tỉnh đầu, terpenoid dạng genin, coumatia và anthraaoid đạng aglycoa ví dụ : Dịch chiết

etherethylic được ấp dụng xác định thành phần anthranoid của dược

kích, dịch chiết n.hexan xác định thành phần kém phân cực của Cỏ nhọ nồi

* Dịch chiết ethylacerat thường được áp dụng trong phân tích các tÍ

phần thuộc nhóm flavonoid, anthranoid, các acid phenolcarboxylic với mục đích làm giảu thêm các thành phần phân tích nói trên và loại bớt các thành

phần tạp phân cực hơn tan được trong methanol gây trở ngại cho triển khai sắc

ký Một số dược liệu có trong để tài đã được tiến hành xử lý mẫu dưới dạng

dịch chiết ethylacetat như : Bỏ công anh, Cầu tích

— Dich chiét phan doan :

Dịch chiết phân đoạn được tiến hành dựa trên nguyên tắc chiết phân bố

lần lượt với các dung có độ phân cực khác nhau từ kém phân cực đến phân cực Cách tiến hành : Dược liệu sau khi chiết với methanol như đã nêu ở mục dịch

chiết methanol, phần cắn sau khi làm bay hơi hét methanol được hoà vào 5ml

nước và tiến hành chiết bằng cách lắc lần lượt với các dung môi từ kém phân

cực(n.hexan, etherethylic, chloroform)đến phân cực( ethylacetat, n.butanol)

Gạn lấy phản các dịch chiết và cô trên cách thuỷ đến cạn Hoà cắn thu được trong methanol làm dung dịch chấm sắc ký

Dịch chiết phân đoạn được ấp dụng trong một số trường hợp với mục:

đích loại tạp ví dụ như dich chiét phan doan chloroform trong định tính đỗ

trọng dùng để loại chất nhựa gây cản trở cho quá trình sắc ký; làm giầu thành phản nhóm chất cần phân tích và định hướng phat thành phần đặc trưng

của được liệu theo tài liệu đã công bố, ví dụ : Dịch chiết phan doan ethylacetat

Trang 26

hoạt chất được nói đến có trong Hà thủ ô; dịch chiết phân đoạn ethylacetat của

Đăng sâm với định hướng định tính lig nan

—_ Địch chiết chlorofbrm trong môi trường kiểm:

Cách tiến hành : 3 gam ( lá) đến 5gam ( tẻ, thân rể) dược liệu được làm

ẩm bằng 2- 3ml dung dịch amoniac 23%, được lắc với 50ml chioroform, thời gian 2-3 giờ Gạn lọc lấy phản dịch chiết và cô trên cách thuỷ đến cạn Hoà cẩn thu được trong lmÍ methanol được dùng làm dung dịch chấm sắc ký,

lượng chấm 20 - 30H

Dịch chiết chloroform trong môi trường kiểm được áp dụng phân tích đa số các thành phần alcaloid Dược liệu được tiến hành chiết theo cách này, ấp dụng định tính alcaloid của Dây đau xương

— Dich chiét methanol- nước +

Được áp dụng trong phân tích các thành phản đường acid amin và các

thành phần phân cực khác

Cách tiến hành : 2 gam ( lá) hoặc 3 gam ( tẻ, thâu tÖ) dược liệu được

đun hồi Lưu trên cách thuỷ với 25ml hốn hợp methanol và nước tỷ lệ 4: 1 Gạn „ lọc lấy phần dịch chiết và cô trên cách thuỷ, đến cạn Hoà cắn thu được trong

2ml bốn hợp dung môi trên và được dùng để chấm sắc ký Lượng chấm 10- 15 ph

— Dich chiét thu duoc bing phương pháp cất kéo hơi nước +

Cách tiến hành theo phương pháp định lượng tỉnh dầu trong dược liệu như đã

ghi trong D DVN III ( phần phụ lục 9.2) Định lượng tỉnh dau trong dược liệu

— Dich chiét thu được từ sân phẩm thuỷ phân :

Trong một số trường hợp tiến hành xác định đặc điểm hoá học đặc

trưng của một nhóm chất dưới dạng sản phẩm thuỷ phân thành genin của nó,

tỏ ra có hiệu quả trong định tính phát hiện dược liệu Phương pháp thuỷ phân các glycosid thường được tiến hành bằng cách đun sôi dung dịch chế phim trong môi trường chứa acid hydrocloric hoặc acid sulfuric 10%, thời gian từ

30 phút cho đến 1 giờ, tuỳ thuộc vào bản chất của từng loại glycosid

Phương pháp đã được áp dụng thuỷ phân anthranoid trong dược liệu Thảo quyết minh với cách tiến hành như sau :

2g dược liệu đã được tán nhỏ, được chiết với methanol theo phương pháp như đã ghỉ ở mục 3.3.1.a Hoà cắn thu được trong 10ml nước và 1ml acid hydrocloric, đua trên cách thuỷ 30 phút, làm lạnh, chiết bằng cách lắc với 20ml ether ethylic, gạn lấy phản dịch ether ethylic và làm bay hơi hết dung mơi Hồ cấn thu được trong 1ml chlorofomm, được dung dịch chấm sắc ký

định tính thành phần anthranoid đạng aglycon c Khảo sát lựa chọn hệ dung môi sắc ký

Tiến hành khảo sát lựa chọn hệ dung môi sắc ký cho phù hợp đối với mỗi nhóm chất đã định hướng xác định đặc trưng của dược liệu

Trang 27

Thực tế, có nhiều loại bệ dung môi được tham khảo áp dụng tách các thành phân của nhóm chất (xem phụ lục 3) Các hệ dung môi chủ yếu đã được áp dụng khảo sát xác định đặc điểm đặc trưng của nhóm chất từ dược liệu, thuộc nội dung của đề tài, đã được tốm tắt ở bảng 3.2

Bang 3.2 Cac hé dung moi SKLM, duoc ap dụng khảo sát xác định các

dac diém hoa hoc đặc trưng dang “vân fay” nhóm chất của dược liệu Tên dược liệu Nhóm chất Hệ dung môi Khao sat 1 Alcaloid | Toluen: ethylacetat (95 : 5) Mộc hương

Chloroform : methanol : ammoniac 23% Tang bạch bì

(73:25 :2,5)

Ethylacetat: acid acetic : acid formic : nước Dây đau xương

(0: 1:1: 1)

2 N.butanol: nước: acid acetic(5 : 5:1) (4:5: 1)

Aminoacid | Propanol : nước : ethylacetat (7: 2:1)

Propanol : ethylacetat : nutic : acid acetic Mộc hương

(4:3:2:

a Ether dau : ethylacetat : acid formic Ba kich

(75 25 35) (75: 25 2,5) (75:25: 1)

Anthranoid | Toluen: ether: acid acetic 10%

„coumarin, | (1:1: 1) lấy pha trên

flavonoid, | Toluen: ethylacetat(95: 5), (9: 1),(4:1)

hợp chat | Toluen: ethyl acetat: aceton: acid formic Hà thủ õ

phenolic (15:2:2:(0:2:2:1)G:2:2:10)

Chloroform : ethanol: acid acetic (95: 5: 1)

(aglycon) | Chloroform : methanol ( 90: 10)

Chloroform: aceton: acid formic(75: 16,5: 8,5)

Trang 28

Nhóm chất He dung moi Tên dược liệu khảo sát

7.Đường _ | Chioroform: methanol: nước (70: 30: 4) Đảng sâm

Eihylacefat: acid acetic : nước (2: 1: 1) Isopropanol: acid acetic : nước (+:1: 1)

N.buftanol : acLd acetic : nước (4:1 :3) Mộc hương

Propanol : ethylacetat : nutic : acid acetic (4:3:2: 4 Benzene : ethylacetat (95 : 5) (90: 10) Terpenoid; | N hexan: ethylacetat Tinh dau | (60:40), (70: 30), (80: 20) Toluen : ethyl acetat Mộc hương, Nga (97:3), (95 : 3), (90: 10) truật Toluen: ethyl acetat: aceton: acid formic Cầu tích (0:2:2:1)

Toluen: ethylacetat: acid formic(90 : 10: D — | Bỏ công anh

3 Chloroform : aceton : acid formic (7,5 : 1,5 : 1) | Cé abo adi

Terpenoid | Chloroform: methanol: nutic Dang sam glycosid | (70: 30: 4), (60: 40 : 5), (65: 35:10) ( Saponia, | Chloroform : methanol : ammoniac 25% (75 : | Cỏ nhọ nổi iridoid ) | 25:5), (70 : 30: 5) Chloroform : methanol : nước : acid acetic | Dé trọng khan (70:30:4: 1) Ethylacetat : acid acetic : acid formic : nước (0:1: 1:2,5) Chloroform : acid acetic khan : methanol : nước (64: 32 :12 : 8)

Ethylacetat : ethanol : nước : ammoniac25 %

Ethylacetat : methanol : nước (80 : 20 : 10)

N.butanol: ethanol : autc : amoniac 25%

(70:20 : 30: 20)

d Phát hiện và thuốc thử phát hiên

Phương pháp phát hiện các đặc điểm đặc trưng của dược liệu theo

hướng tìm các đặc điểm đặc trưng của nhóm chất được tóm tắt ở bảng 3.3

Trang 29

Bảng 3.3 Phương pháp phát hiện các nhóm chất được áp dung trong

đỉnh tinh duoc liéu bang ky thuat SKLM

Tên nhóm chất Thuốc thứ phát hiện Cách phát hiện phát hiện Ket qua

1 Atealoid ~Dragendorifiacid sulfuric |- Quan sát đưới ánh | Màuvàng nâu 10% trong côn hoặc sáng thường đến nâu

natrinitrit 10%

2.Amiaoacid |-Ninhydria = Say 105°C quan sét | Mầu tín đến dưới ánh sáng thường _| tím đồ,

3 Anthraaoid, |= ~ Quan sát/ UV366nm | - Màu vàng

trước khi phuaTT | đếncam - Kali hydtoxyd /cthanol |-Quan sát đưới ánh _ | - Mầu vàng

sáng thường đến đỏ - Acid boric =acid oxalic_ |- 8y105°C, quan sát | -Màu H1 dưới UV 366m

-NP/PEG - Quan sắt dưới UV |-ar

366nm

4 Coumarin - - Quan sat/ UV 366om | -MauO

trước khi phua TT

- Kali hydtoxyd / cthanol_ |- Quan sát/ UV366am | Màu xanh đến vàng - Acid boric —acid oxalic |- say105°C / ~n

UV36ốnm

-NP/PEG - Quan sét (UV366am | - at

~ Tetrazolium blue * - Xanh tím

6-Flavonoid, | - Acid boric —acid oxalic |-Sấy 1035 -MauO

acid quansát /UV366nm

phenolcarboxyli{ - NP / PEG - Quan sét/UV366am | - at

~ Nhôm clorid 10% - at ~ Vâng lục

Trang 30

3.3.2.2 Xác định các đặc điểm hoá học đặc trưng của dược liệu bằng

phương pháp khác

a Phương pháp sắc ký lng cao áp

Tiến hành khảo sát áp dụng kỹ thuật SKLCA trong việc xác định đặc

điểm đặc trưng của 2 đối tượng dược liệu đỗ trọng và xuyên khung gồm các bước như sau :

—_ Đối tượng xác định :

* Tiến hành khảo sát xác định đặc điểm vân tay hoá học của Đố trọng theo hướng xác định thành phản lignan, là một trong số các thành phần hoạt chất chính đã được biết có trong Đố trọng, trong đó thành phản chính là

pinoresinol diglucosid.Thành phản này đã được qui định định lượng bằng phương pháp SKLCA để đánh giá chất lượng dược liệu[57]

* Tiến hành khảo sát xác định đặc điểm vân tay hoá học của Xuyên khung theo hướng xác định thành phản alcaloid bay hơi, là thành phần hoạt chất có trong dược liệu Xuyên khung, trong đó thành phản chính là tetramethyL pyrazin Thành phan này đã được đánh giá định lượng bằng

phương pháp SKLCA [24] [41] [47]

—_ Khảo sát các điều kiện sắc ký

Tiến hành khảo sát các yếu tố liên quan đến phương pháp phân tích sắc ký: xử: lý mẫu, lựa chọn pha tĩnh, khảo sát lựa chọn pha động và phương pháp phát hiện

— Kết quả phân tích

Kết quả xây dựng được một phép thừ xác định định tính và bán định lượng thành phần nhóm chất đã khảo sát, gồm có :

* Phương pháp tiến hành xác định các đặc điểm đặc trưng

* Các hình ảnh sắc ký đỏ định tính và kết quả đo của mối pic ( chiều

cao pic )

* Đánh giá kết quả, so sánh với kết quả phân tích bằng kỹ thuật sắc ký lớp mỏng

b Phương pháp sắc ký khí khối phổ

Tiến hành khảo sát xác định thành phần bay hơi được của dược liệu Ô dược bằng kỹ thuật SKK- KP, gồm các bước như sau :

Trang 31

Nhiệt độ buồng tiêm : 150°C Nhiệt độ detector : 200°C Chương trình nhiệt độ: 60 - 250°C; tốc độ tăng 8°C/phút Thể tích tiêm mẫu: 1HÍ Hệ số tách đồng: 50 —_ Kết quả phân tích:

Xác định tên và tỉ lệ (%) các chất chính trong tổng số 10 chất bay hơi có trong dịch chiết n-hexan của các mẫu Ô dược, đối chiếu với phổ khối chuẩn trong ngân hàng khối phỏ để xác tên chất Xác định thành phần đặc trưng của dược liệu nghiên cứu, làm căn ì cứ xây dựng phép thử định tính phát hiện

dược liệu Ô dược bởi kỹ thuật này

Trang 32

IV KET QUA NGHIEN CUU

4.1 Xác nhận tên khoa học ( tên loài ) của các mẫu dược liệu nghiên cứu

Tiến hành kiểm chứng xác định tên khoa học của các mẫu dược liệu nghiên cứu theo cách như đã ghỉ ở mục 3.1.2

Két qua:

— Các đối tượng dược liệu nghiên cứu ( thu hái) được xác định tên khoa học

phù hợp với tên đã ghỉ trong DĐVNII là 16 trong tổng số 20 dược liệ

—_ Các đối tượng dược liệu có tên khoa học/ tên lồi khơng thống nhất với qui định trong DĐVNII, gồm có :

* Đối tượng dược liệu nghiên cứu có tên khoa học loài, khác với qui định ghỉ trong DĐVNIH, gồm có 2 dược liệu là Đảng sâm và Ô dược, cản được nghiên cứu tiếp Do vậy, các kết quả mô tả đặc điểm hình thái, vi phẫu và bột của các dược liệu này đã được mô tả ở phần phụ lục 7

* Đối tượng dược liệu không trùng tên gọi với tên đã qui định trong

DPVNIII [a : Sài hồ nam ( DMTTY) = Lức DĐVNIT)

* Đối tượng dược liệu có tên khoa học được xác định là 1 loài trong số các loài được qui định trong DĐVNIII, đó là Tiên hỏ

Các đối tượng dược liệu đã nêu, có tên không thống nhất với qui định trong DĐVNITI, cụ thể như đã ghỉ ở bảng 4.1

Bang 4.I: Các đối tượng được liệu nghiên cứu có tên khoa học/ tên lồi khơng thống nhất với qui đỉnh trong DĐVNIH

Tên dược Tên được liêu và loài Tên loài ghỉ trong Tên loài đã

liệu nghiên qui dinh trong danh mục thuốc thiết được

cứu DĐVNHI yếu (NMTTY) xác đỉnh

Dang sim |Codonopsi pilosula Codonopsis javanica | Giống như

(Franch) Maomf (Blume) Hook.f DMTTY

Campanulaceae Campanulaceae

Oduoc Lindera aggregata Lindera myrrha Giống như

( Sims) Kosterm (Lour.) Merr DMTTY Lauraceae Lauraceae

Sài hỗ Nam | Lite: Pluckea Pluchea pieropoda Giống như pteropoda Hemsl Hemsl , Asteraceae DMTTY Asteraceae Sài hỗ : Bupleurum chinense DC Asteraceae (Vi này có ở TỌ)

Tiền ho Từ2 loài: Peucedanwn | Peucedanum Giống như

decursivum Maxim va decursivum Maxim DMITY

P praerupcorum Duan | Apiaceae Apiaceae

Trang 33

4.2 Phan tích sang lọc hoá học, xác định nhóm chất của dược liêu bằng

phương pháp SKLM

Tiến hành phân tích sơ bộ xác định nhóm chất của 20 dược liệu đã đăng ký của đẻ tài, theo phương pháp phân tích sàng lọc dược liệu như đã ghỉ ở mục

3.3.1 gồm có các bước như sau :

Chuẩn bị mẫu chấm sắc ký : Tiến hành theo 3.3 la

Chuẩn bị pha tĩnh : Silicagel G F254 Merck ban tring sin

Hệ dung môi sắc ký Tiến hành theo 3.3.1.4

Phát hiện và thuốc thử phát biện : Tiến hành theo 3.3 Le

Kết quả phân tích sàng lọc và phân loại thành nhóm chất của 20 dược liệu đã khảo sát được tóm tất ở bảng 4.2

Bảng 4.2 Kết quả phân tích sàng lọc dược liệu bằng phương pháp SKLM Tên Nhóm chất được phát hiện dược

Trang 34

* Terpe (1) : terpenoid (tỉnh đầu, terpenoid kém phân cực khác ; Coum(2) : coumarin; Anthr (3): anthranoid; Flavoaoid / Hợp ch Phenolic (4): flavonoid

hoặc hgp chat phenolic ;Terpen glycosid (5): terpenoid glycosid ( saponin,

iridoid ); Alca (6): alcaloid; Acid amin (7); Đường ( 8)

* 45445 444+: Ký hiệu chỉ mức độ đậm nhạt của vết trên sắc ký đỏ; +(

nhạt) ; +t(frung bình) ; +++ (đậm nhất)

* Phenolic : Hợp chất phenolic Thành phản cho dương tính với thuốc thử của hợp chất phenolic nói chung (TT fast blue salt), được áp dụng trong trường hợp khi kết quả xác định flavonoid không tố rệt

* Phát quang : Thành phần có phát quang trước khi phun thuốc thử

Tên nhám chất và số lượng nhôm chất Šã được phát hiện tử được liệu, gầm có

như sau

Ba kích: Anthranoid , đường

Trang 35

Bé cOng anh: Terpenoid, flavonoid, hợp chất phenolic Cầu tích: Terpenoid, hợp chất phenolic

Cé nho adi: Terpenoid glycosid, flavonoid

Day đau xương: Alcaloid, terpenoid, terpenoid glycosid Dang sim : Terpenoid , terpenoid glycosid, đường

Dé trong: Terpenoid glycosid, hgp chat phenolic

Ha thi 6 : Hop chat phenolic

Mộc hương : Terpenoid- alcaloid- đường- amino acid

Nga truật : Terpenoid, hợp chất phenolic

Ô dược : Terpenoid, alkaloid, hợp chất phenolic

Sai ho nam ( Lit) : Terpenoid, flavonoid

To moc: Flavonoid

Tang bach bi: Flavonoid, alcaloid Thảo quyết mình : Anthranoid

Thể phục linh : Flavonoid., terpenoid iên hồ : Coumarin, hợp chat phenolic Trạch tả: Terpenoid , amino acid,đường

Xa tién tir: Terpenoid glycosid , flavonoid

Xuyên khung: Coumarin, alcaloid , bgp chat phenolic

4.3 Phan tích xác định các đặc điểm hoá học đặc frưng của dược liệu

4.3.1 Phân tích xác định các đặc điểm hoá học đặc trưng của dược liệu

bằng phương pháp SKLM

Tiến hành phân tích xác định các đặc điểm hoá học đặc trưng của dược liệu theo hướng khảo sát xác định các đặc điểm đặc trưng của nhóm chất,

gềm có:

— Tiến hành khảo sát xác định “ vân tay” nhóm chất của mỗi dược liệu, gồm có các nhóm chất đã được phát hiện sơ bộ, thu được từ kết quả phân

tích sàng lọc của dược liệu đó Các nhóm chất đã được phát hiện của mỗi dược liệu thu được, như đã ghỉ ở bảng 4.1 là cơ sở định hướng cho việc khảo sát xác định đặc điểm hoá học đặc trưng của dược liệu đó

— Tiến hành xác định “vân tay” nhóm chất theo hướng xác định đặc

điểm đặc trưng của chất cụ thể ( hoạt chất hay c hất đặc trưng) đã được nói đến

có trong dược liệu khảo sát (nếu có), góp phản khai thác thêm đặc điểm đặc

trưng nhóm chất của dược liệu đó

—_ Kết quả khảo sát xác định đặc điểm hoá học đặc trưng của 20 dược

liệu trong nội dung đề tài được trình bày cụ thể như sau :

4.3.1.1 Xác định các đặc điểm hoá học đặc trưng của Ba kích a Mẫu khảo sát

Tiến hành khảo sát trên các mẫu Ba kích gồm có 2 mẫu dược liệu thu

hái, 3 mẫu mua trên thị trường được áp dụng để so sánh

Trang 36

b Khảo sát các điều kiện phân tích

Dựa vào kết quả phân tích sàng lọc theo nhóm chất, tiến hành khảo sát xác định các đặc điểm hoá học đặc trưng của Ba kích theo hướng định tính các thành phần anthranoid, gồm các bước như sau :

Chuẩn bị mẫu chấm sắc ký:

ịch chiết phân đoạn cther ethylic và ethylacetat

3g dược liệu đã tán nhỏ được tiến hành chiết lần lượt với các dung môi ether ethylic, ethylacetat theo cách như đã ghỉ ở mục 3.3.2.1.b.( Dịch chiết phân đoạn) Hoà các cắn thu được trong 2ml methanol được dùng làm dung dịch chấm sắc ký, lượng chấm 10 pl

Dịch chiết phân đoạn ether ethylic được áp dụng định tính anthranoid aglycon Dịch chiết phân đoạn ethylacetat được áp dụng định tính glycosid Hệ dụng môi sắc ký và phát biệ

Tiến hành khảo sát theo hướng tách và phát hiện các thành phản thuộc

nhóm anthranoid Cách tiến hành như đã ghi ở mục 3.3.2 1.c và 3.3.2.1.d Kết

quả đã lựa chọn được các hệ dung môi và cách phát hiện áp dụng cho định tính dược liệu Ba kích như đã ghỉ ở phản c Trong đó : - Hệ dung môi : Hệ 1: được áp dụng tách các thành phần kém phân cực Hệ 2 : được áp dụng tách các thành phần glycosid - Thuốc thử: TT1 và TT2 thông thường được áp dụng phát hiện anthranoid c Kết quả :

Các đặc điểm hoá học đặc trưng của dược liệu Ba kích được thể hiện trên các hình ảnh sắc ký đỏ Hình 4.1.và Hình 4.2 Điều kiện phân tích như sau

Mẫu chấm sắc ký :

nghiên cứu (mẫu thư hái) :C 2.1,C2.2

Trang 37

nghiên cứu (mẫu thụ hái) : C 2.1,C 2.2

Mẫu mua trên thị trường : Š 3.1, S3.2,5 3.3, 53.4

Hệ dưng m

Hình 4.3: A Hệ 2: Toluen: ethylacetat: aceton : acid formic (5 : 2 : 2 :1)

Ethylacetat : toluen : acid formic : nudéc (100 :5 : 10 : 10)

: Toluen: ethylacetat: acid formic( 90 : 10: 1)

Hinh 4.4: A.TT 2: Anisaldehyd — acid sulfuric B.TT 3 : Vanilin — acid phosphoric 4 Đánh giá kết quả và nhân xét

- Hình 4.3: Sắc ký đỏ thể hiện phép thử định tính flavonoid, gồm có các vết cho phát quang màu xanh lục với TT 1 Thành phản tách trên sắc ký đỏ Hình 4.3.A với Hệ 2, có 2 vết chính có giá trị Rf nằm trong khoảng 0,4 — 0,3 thuộc flavonoid dạng aglycon.Thành phản tách trên sắc ký đỏ Hình 4.3.B với

Hệ 3 gồm các vết phát quang ( 4 vết) có giá trị Rf 0,2 — 0,5 thuộc glycosid

Các thành phần aglycon ở hệ này bị dồn lên đỉnh

- Hình 4.4 : Các sắc ký đỏ thể hiện của phép thử định tính terpenoid A Thành phản được tách với Hệ 1 cho các vết có mầu tím xanh với

thuốc thử anisaldehyd (TT2) có 2 vết chính ở khoảng Rf 0,4 va 0,8, cdc miu

mua trên thị trường cũng có vết tương tự nhưng nhạt hơn

Ð Thành phản được tách với Hệ 2 và được phát hiện với TT 3 các vết có vị trí thay đổi so với sắc ký đỏ Hệ 1 của Hình 4.4.A, với hệ này có thêm 1

số vết mới

- Các hình ảnh sắc ký đỏ nêu trên thể hiện đặc trưng cho dược liệu Bỏ công anh Sắc ký đỏ của các mẫu nghiên cứu ( mẫu thu hái) cho các vết có

mật độ đậm hơn so với các mẫu dược liệu mua trên thị trường, trong cùng điều

kiện thí nghiệm

4 Xác định các đặc điểm hoá học đặc trưng của Cầu tích

a Mẫu khảo sát

Tiến hành khảo sát trên 2 mẫu dược liệu thu hái, 3 mẫu mua trên thị

trường Địa chỉ mẫu được ghi ở phụ lục 2

Tiến hành khảo sát xác định các đặc điểm hoá học đặc trưng của dược liệu cẩu tích theo hướng định tính nhóm chất terpenoid, được tiến hành gồm

các bước như sau:

Chuẩn bị mẫu chấắm sắc ký

Dich cl ethylacefat : 2g dược liệu đã được tán nhỏ được tiến hành

Trang 40

4.3.1.4 Xác định các đặc điểm hoá học đặc trưng của Cỏ nhọ nổi

a Mau khảo sát

Tiến hành khảo sát trên 4 mẫu dược liệu thu hái, 3 mẫu mua trên thị

trường Địa chỉ mẫu được ghi ở phụ lục 2

Dựa vào kết quả phân tích sàng lọc theo nhóm chát, tiến hành khảo sát xác định các đặc điểm hoá học đặc trưng của dược liệu Cỏ nhọ nổi theo hướng

định tính các nhóm chất flavonoid va terpenoid, gém các bước như sau :

Chuẩn bị mẫu chấm sắc ký: - Dịch chiết methanol :

1g dược liệu tán nhỏ được chiết với 20ml methanol theo phương pháp ghỉ ở mục 3.3:2.1.b Hoà cấn thu được trong 2ml methanol, dùng làm dung dịch chấm sắc ký, lượng chấm 10 HH

- Dich chiét phan doan chloroform va ethylacetat

1g dược liệu được tiến hành chiết phân đoạn như đã ghỉ ở mục 3.3.2.1.b Hoà các cắn thu được trong Iml methanol diag [am dung dịch chấm sắc ký, lượng chấm 101L

Dịch chiết phân doan chloroform được áp dụng định tính các thành phần kém phân cực (Hình 4.7) Dịch chiết phân đoạn ethylacetat được áp dụng định tính thành phản tetpenoid glycosid ( Hình 4.8)

Hệ dụng môi sắc ký và phát biện:

Tiến hành khảo sát theo hướng tách và phát hiện các thành phản thuộc nhóm flavonoid và terpenoid như đã ghỉ ở mục 3.3.2.1.c và 3.3.2.1.d Kết quả đã lựa chọn được các hệ dung môi và phát hiện áp dụng cho định tính Cỏ nhọ nồi như đã ghi ở phần c Trong đó :

- Hệ dung môi : Hệ 1 được áp dụng tách thành phần kém phân cựt ; Hệ 2 tách các thành phản flavonoid dạng aglycon; Hệ 3 và hệ 4 tách các

thành phần terpenoid

- Phát hiện : TT1 và TT2 được áp dụng phát hiện các thành phản thuộc ohém flavonoid, TT3 phát hiện các thành phần terpenoid

c Kết quả

Kết quả xác định các đặc điểm hoá học đặc trưng của dược liệu Cỏ nhọ nôi được thể hiện trên các hình ảnh sắc ký đỏ ở Hình 4.7, Hình 4.8, Hình 4.9

và Hình 4.10 (tr 54 — 55 ) Điều kiện phân tích như sau :

nghiên cứu (mẫu thu bái) : C2.1, C2.2, C2.3,C2.4

Định dạng
Số trang	100
Dung lượng	15,65 MB