Thông tin tài liệu
Tóm tắt Đặt vấn đề Phát định lượng HIV1RNA nhu cầu cần thiết để chẩn đoán phát sớm nhiễm HIV giai đoạn cửa sổ hay trẻ sơ sinh nhũ nhi để theo dõi hiệu điều trị bệnh nhân HIV/AIDS điều trị đặc hiệu Nhu cầu giải xét nghiệm dựa kỹ thuật sinh học phân tử PCR bDNA chấp nhận IVD có thị trường Tuy nhiên giá thành xét nghiệm cao, khó đưa vào áp dụng phịng thí nghiệm lâm sàng quốc gia thu nhập thấp Việt Nam Mục tiêu Có mục tiêu chính: (1) Xây dựng qui trình xét nghiệm phát định lượng HIV1RNA dựa kỹ thuật RT real-time PCR, đặt tên HIV1 RT-TQPCR, sử dụng mồi taqman probe đặc hiệu vùng gene gag gene HIV1; (2) Đánh giá qui trình xét nghiệm thơng qua đánh giá giới hạn phát hiện, khoảng định lượng, độ xác qua độ lặp lại, độ bền lưu trữ, độ nhạy cảm độ lặp lại độ tương đồng thử mẫu thật so sánh với HIV1 Amplicor làm chuẩn vàng Vật liệu phương pháp Qui trình xét nghiệm “HIV1 RT-TQPCR” xây với mồi SK462 SK431 đặc hiệu gene gag công bố taqman probe thiết kế từ biến đổi probe SK101 công bố Các chứng dương HIV1RNA mẫu chuẩn định lượng RNA phiên mã từ plasmid pGEM-T Easy chèn sản phẩm PCR đích nhân từ gene gag sử dụng mồi SK462 SK431 Chứng nội sử dụng chung mồi phiên mã từ plasmid pGEM-T Easy chèn sản phẩm PCR khuếch đai từ sợi Oligo có trình tự hai đầu bắt cặp bổ sung với trình tự hai mồi SK462 SK431 trình tự probe khác biệt Bộ tách chiết RNA sử dụng NKRNAPREP Nam Khoa tổng hợp cDNA sử dụng NKcDNA synthesis Nam Khoa Giới hạn phát hiện, khoảng định lượng, độ lặp lại liên phản ứng phản ứng thực dãy pha loãng chứng dương HIV1RNA Độ đặc hiệu đánh giá mẫu huyết người bị nhiễm HBV, HCV, CMV S aureus xác định PCR hay nuôi cấy Khả chống ức chế thử chất có khả ức chế PCR hemoglobin, lamivudine, BSA, DNA bạch cầu người Độ bền lưu trữ thử mẫu nhiễm HIV1RNA theo dõi 12 tháng với thử nghiệm tháng lần Thử nghiệm mẫu thật thực có so sánh với thử nghiệm sử dụng xét nghiệm Amplicor Kết bàn luận Đã hồn thiện qui trình thử nghiệm HIV1 RT-TQPCR phát định lượng HIV1RNA kỹ thuật real-time PCR sử dụng mồi taqmanprobe đặc hiệu gene gag HIV1 genome Qui trình xét nghiệm có cung cấp chứng [+] chuẩn định lượng dạng RNA mà đánh giá độ nhạy xét nghiệm cho đường chuẩn thật từ mẫu chuẩn RNA Qui trình xét nghiệm cung cấp chứng nội dạng RNA sử dụng chung mồi với trình tự đích dùng taqman probe để phát có trình tự màu huỳnh quang khác biệt taqman probe đích nhờ mà đánh giá nguy mẫu bị ức chế kết phát đích âm tính Các kết đánh giá cho thấy qui trình xét nghiệm có giới hạn định lượng thấp nhất, gọi độ nhạy, 60 copies HIV1RNA 1ml huyết tương; khoảng định lượng 102-108 copies/ml; độ ổn định phản ứng liên phản ứng cao mẫu có giá trị định lượng từ 100copies/ml trở lên; độ bền lưu trữ 12 tháng; không bị chéo với tác nhân vi sinh khác; có khả chống ức chế; so sánh với xét nghiệm FDA công nhận IVD HIV1 Amplicor thử mẫu thật cho kết lương tương đương lấy kết xét nghiệm từ xét nghiệm Amplicor làm chuẩn vàng độ nhạy độ đặc hiệu qui trình xét nghiệm đạt 100% Kết luận Dựa vào kết nghiên cứu xây dựng hồn thiện qui trình phát định lượng HIV1 huyết tương người kỹ thuật real-time PCR với thành phần cần thiết cho xét nghiệm real-time PCR tách chiết RNA sử dụng NKRNAPREP Nam Khoa tổng hợp cDNA sử dụng NKcDNA synthesis Nam Khoa, khuếch đại định lượng, chứng chuẩn định lượng Đồng thời từ việc đánh giá qui trình xét nghiệm HIV1 RT-TQPCR phát định lượng HIV1RNA thu thông số sau: (1) độ nhạy 100% (2) độ đặc hiệu: 100% (3) ngưỡng phát hiện: 60 copies/ml huyết tương (4) khoảng định lượng 102-108 copies/ml (5) độ bền lưu trữ 12 tháng (6) có khả chống ức chế Tuy nhiên để đăng ký chấp nhận IVD cần phải có thêm kinh phí để thử trung tâm đạt chuẩn ISO 15189 làm xét nghiệm phát định lượng HIV1RNA chẩn đoán i Abstract Background Detection and quantification of HIV1RNA is the necessary requirement from the clinical to detect HIV infection during the window phase or to confirm the HIV infection in the baby, as well as to follow up the efficacy of the specific treatment These requirements could be solved by the using of the IVD approved kits using PCR or bDNA technologies However the price of these commercialized kits are very expensive, it could not be easily applied at the clinical laboratory in the existing conditions of the low-income countries like Vietnam Main aims There are two main aims: (1) Prepare the molecular biology kit named HIV1 RT-TQPCR kit, to detect and quantify of the HIV1RNA based on the RT real-time PCR technology using the primers and taqman probe specific the gag gene on the HIV1 genome; (2) Evaluate the process via the limit of detection, the range of quantification, the accuracy, the specificity, the elimination of the inhibitors, and the stability of the kits as well as the sensitivity-specificity and the similarity when testing on the real samples using HIV1 Amplicors as gold standards Materials and methods The “HIV1 RT-TQPCR” was prepared using the published SK462 and SK431 specific to gag gene, and the taqman probe was designed from the modification of the published probe SK102 The positive control HIV1RNA and the standards for quantification was prepared from the transcription of the plasmid pGEM-T Easy inserted with the PCR product amplified from the gag gene using primers SK462 and SK431 The internal control RNA using the same primers of the target was also prepared from the transcription of the plasmid pGEM-T Easy inserted with the PCR product amplified from the two constructed oligo with SK462 and SK431 sequence at the 5’end and the middle sequence complementary with the internal control probe The RNA extraction kit is the NK RNAPREP of Nam Khoa and the cDNA synthesis kit is the NKcDNA synthesis kit of Nam Khoa The limit of detection, the range of quantification, the in testing and the trans-testing reproductibility were tested on the serial dilution of HIV1RNA The risk of the cross reaction were tested on the sera taken from HCV, HBV, CMV infection patients confirmed by PCR, and the sera taken from the S aureus septicemia patient The elimination of the inhibitors were tested of the hemoglobin, BSA, leukocyte DNA and the lamuvidine The stability of the kit was tested during 12 months with interval months on the plasma samples pooled HIVRNA.The clinical trial was done on real plasma sample collected fron HIV infected and non infected patients and the results were analyzed versus the results get from HIV1 amplicor Results and discussions The process named HIV1 RT-TQPCR to detect and quantify of the HIV1RNA based on the RT real-time PCR technology using the primers and taqman probe specific the gag gene on the HIV1 genome was prepared Since the process supplied the control [+] and the standards under the RNA, the users could analyzed the real sensitivity of the testing and the test kit as well as the real quantification graph coming from the RNA not the cDNA The internal control was also supplied under the RNA using the sample primers of the target but the detection probe was difference by the sequence and the fluorophore and this design can help to user monitor the inhibitors in the sample with HIV1RNA detection negative The evaluation results demonstrated that the limit of detection of the process is 60 copies/ml;, the range of the quantification was 102-108 copies/ml; the reproductivity was high with the quantification from 100 copies/ml; the stability of the kit was at least 12 months; no cross reaction with HBV, HCV, CMV, and S.aureus; the inhibitors was eliminated by testing with the kit; and the process gave the same results as the FDA approved for IVD kit, HIV1 Amplicor, when testing on the real samples HIV [+] and HIV [-] with sensitivity and specificity 100% if the Amplicor was considered as gold standards Conclusion Based on the results of the research we have complete the process with the necessary ingredients for a real-time PCR tests as the RNA extraction kit and the cDNA synthesis kit, amplification, positive control and internal control At the time of the evaluation of HIV1 RT-TQPCR tests, we obtained the following parameters: (1) sensitivity: 100% (2) specificity: 100% (3) threshold detection: 60 copies/ml plasma (4) the amount is about 102108 copies/ml (5) durability in storage for at least 12 months (6) is resistant to inhibition However, in order to be approved as the IVD kit,the more funding will be needed to try the kit in the laboratories ISO 15189 certified for testing of HIV1RNA detection and quantification for clinical apliucations ii STT MỤC LỤC PHẦN MỞ ĐẦU PHẦN ĐẶT VẤN ĐỀ PHẦN TỔNG QUAN Tình hình nhiễm HIV giớ Việt Nam 1.1 Tình hình nhiễm HIV giới 1.2 Tình hình nhiễm HIV Việt Nam MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA HIV 2.1 Trang 3 3 4 2.2 2.3 2.3.1 2.3.2 2.4 Một số đặc điểm sinh học HIV Các type di truyền HIV Cấu trúc HIV Hình thể cấu tạo virus Cấu trúc gene HIV Sức đề kháng virus HIV TIẾN TRÌNH TỪ LÚC NHIỄM HIV TỚI AIDS 3.1 Nồng độ HIV-1 tự kháng nguyên p24 huyết tương 3.2 Sự xuất kháng thể kháng HIV-1 huyết bệnh nhân nhiễm HIV/AIDS 3.3 Lượng tế bào miễn dịch T CD4 3.4 Các xét nghiệm sử dụng để phát theo dõi nhiễmHIV/AIDS PHƯƠNG PHÁP REALTIME – PCR Khái niệm real-time PCR Real-time PCR ứng dụng định lượng tác nhân vi sinh vật mẫu thử 4.1 4.2 6 7 9 14 CHỨNG DƯƠNG, ÂM VÀ CHỨNG NỘI TẠI 5.1 Chứng dương 5.2 Chứng âm 5.3 Chứng nội PHƯƠNG PHÁP TẠO DỊNG 6.1 Mục đích tạo dòng 6.2 Các bước phương pháp tạo dòng PHẦN NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NỘI DUNG NGHIÊN CỨU CÁC PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM ĐƯỢC SỬ DỤNG 15 2.1 20 Tách chiết RNA với thuốc thử “NKRNAPREP” Nam Khoa iii 15 16 16 17 17 17 19 19 20 2.1.1 2.1.2 2.2 2.2.1 2.2.2 2.3 2.3.1 2.3.2 2.4 2.4.1 2.4.2 2.5 2.5.1 2.5.2 2.6 2.6.1 2.6.2 2.7 2.7.1 2.7.2 Nguyên tắc Phương pháp Tổng hợp cDNA từ tách chiết RNA với thuốc thử “NKcDNA synthesis” Nam Khoa Nguyên tắc Phương pháp Tinh sản phẩm PCR với thuốc thử “Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System” Promega Nguyên tắc Phương pháp Tạo vi khuẩn E coli khả biến Nguyên tắc Phương pháp Tạo dòng với hệ thống “pGEM®-T Easy” Promega Nguyên tắc Phương pháp Tách chiết plasmid với thuốc thử “Wizard® Plus SV Minipreps DNA Purification system” Promega Nguyên tắc Phương pháp Phiên mã DNA thành RNA Nguyên tắc Phương pháp 20 20 20 20 21 21 21 21 22 22 22 23 23 23 25 25 25 26 26 27 PHƯƠNG PHÁP XÂY DỰNG QUI TRÌNH XÉT NGHIỆM REAL-TIME PCR PHÁT HIỆN VÀ ĐỊNH LƯỢNG HIV1 28 3.1 Mồi Taqman probe 28 3.1.1 Mồi 28 3.1.2 Taqman probe 28 3.2 Thiết kế thành phần qui trình thử nghiệm real-time PCR phát định lượng HIV1RNA 28 3.3 Phương pháp pha chế HIV1-TQPCR master mix 29 3.4 Phương pháp pha chế chứng chuẩn 30 3.4.1 Chế tạo chứng dương HIV1RNA-C[+] chuẩn định lượng HIV1-RNA 30 3.4.2 Chế tạo chứng nội HIV1RNA-IC Mẫu huyết tương người bình thường 31 3.4.3 PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ QUI TRÌNH XÉT NGHIỆM HIV1 RT-TQPCR iv 33 33 TRONG PHỊNG THÍ NGHIỆM 4.1 Các tiêu phải đánh giá 33 4.2 4.2.1 4.2.2 Phương pháp đánh giá Giới hạn phát giới hạn định lượng Độ lặp lại phản ứng 34 34 34 4.2.3 Độ lặp lại liên phản ứng 35 4.2.4 Độ đặc hiệu 35 4.2.5 Khả chống ức chế 36 4.2.6 Độ ổn định điều kiện bảo quản 36 PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ QUI TRÌNH XÉT NGHIỆM HIV1 RT-TQPCR THỰC HIỆN TRÊN MẪU THẬT 37 5.1 Đối tượng sử dụng để đánh giá 37 5.2 Phương pháp đánh giá PHẦN KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 37 39 KẾT QUẢ PHA CHẾ CÁC THÀNH PHẦN CỦA QUI TRÌNH THỬ NGHIỆM REAL-TIME PCR PHÁT HIỆN VÀ ĐỊNH LƯỢNG HIV1RNA 39 1.1 Kết đánh giá khả sử dụng mồi probe đặc hiệu gene gag HIV1 qua kết pha chế HIV1-TQPCR master mix 39 1.2 Kết chế tạo chứng dương HIV1RNA-C[+] Kết chế tạo chứng nội HIV1RNA-C[+] Kết chứng minh chứng nội HIV1RNA-C[+] pha nồng độ 100 copies/10µl khơng cạnh tranh hệ thống đích 39 KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ QUI TRÌNH THỬ NGHIỆM HIV1 RT-TQPCR TRONG PHỊNG THÍ NGHIỆM Kết đánh giá giới hạn phát giới hạn định lượng Kết đánh giá độ lặp lại phản ứng Kết đánh giá độ lặp lại liên phản ứng Kết đánh giá độ đặc hiệu Kết đánh giá khả chống ức chế Kết đánh giá độ ổn định bảo quản KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ QUI TRÌNH XÉT NGHIỆM HIV1 RT-TQPCR THỰC HIỆN TRÊN MẪU THẬT QUI TRÌNH XÉT NGHIỆM HIV1RNA RT-TQPCR VỚI CÁC THÀNH PHẦN VÀ HƯỚNG DẪN SỬ DỤNG 41 1.3 1.4 2.1 2.2 2.3 2.4 2.5 2.6 v 40 40 41 41 42 44 44 45 46 47 4.1 4.2 4.3 4.4 Tên qui trình thử nghiệm thành phần Lưu trữ Phạm vi áp dụng Nguyên tắc hoạt động qui trình thử nghiệm 47 48 48 48 4.5 Trang bị cần thiết 49 4.6 Phương pháp 50 4.6.1 Mẫu thử 4.6.2 Phương pháp PHẦN TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC KẾT LUẬN vi 50 50 54 55 57 DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT VIẾT TẮT THUẬT NGỮ TIẾNG VIẾT AIDS ARV bp CDC Ct cDNA DNA dATP dTTP dCTP dGTP dNTP ELISA HIV-1 IC OD PCR Realtime PCR RNA RT-PCR UNIADS Taq SIV WHO CV SOC IPTG X- gal Acquired Immuno Deficiency Virus Anti-retrovirus Base pair Centers for Diseases & Prevention Threshold Cycle complementary deoxyribonucleic acid Deoxyribonucleic acid 2’-deoxyadenosine 5’- triphosphate 2’-deoxythymidine 5’- triphosphate 2’-deoxycytidine 5’- triphosphate 2’deoxyguanosine 5’- triphosphate 2’-deoxynuclosid 5’- triphosphat Enzyme – Linked Immunosorbent Assay Human Immunodeficiency Virus type Internal Control Optical Density Polymerase chain reaction Realtime Polymerase chain reaction ribonucleic acide reverse transcriptase- polymerase chain reaction Joint Unitied Nations Programme on HIV/AIDS Thermus aquaticus Simian Immunodeficiency Virus World Heath Organization Coeficient of variation Super Optimal Catabolite Repression Broth isopropyl-β-D-thiogalactoside 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D- galactoside vii DANH SÁCH BẢNG Số TÊN BẢNG SỐ LIỆU Trang Thể tích thành phần lấy từ nồng độ hay hàm lượng gốc để pha HIV1-TQPCR mastermix cho 10 mix – 50 mix hay 100 mix 29 Giá trị định lượng HIV1RNA dãy pha loãng giá trị CV 42 Giá trị định lượng HIV1RNA dãy pha loãng thực ngày liên tiếp giá trị CV Giá trị định lượng HIV1RNA cặp mẫu co khơng có thêm chất ức chế Giá trị định lượng HIV1RNA mẫu 103 107 thực lần cách tháng giá trị CV Giá trị định lượng HIV1RNA 44 mẫu HIV1-RNA dương tính định lượng với kit Amplicor giá trị CV so với HIV1 RTqPCR viii 44 45 46 47 DANH SÁCH HÌNH Số 10 11 12 13 14 15 16 17 TÊN HÌNH ẢNH HIV mơ tả từ máy tính Hình chi tiết virus HIV Hình ảnh cấu trúc virus HIV Vị trí gene gene HIV Cơ chế hoạt động SYBR I (1) Khi chưa có sản phẩm khuếch đại ống thứ nghiệm khơng phát hùynh quang nhận ánh sáng kích thích, (2) Nhưng có diện sản phẩm khuếch đại SYBR I chèn vào tập trung phân tử DNA , làm cho ống phản ứng bị phát huỳnh quang nhân ánh sáng kích thích Tóm tắt chế hoạt động Taqman probe real-time PCR Tóm tắt chế họat động Beacon probe real-time PCR Tóm tắt chế hoạt động probe lai real-time PCR Biển đồ đường biểu diễn khuếch đại ghi nhận cường độ huỳnh quang phát từ ống phản ứng nhận ánh sánh kích thích chu kỳ nhiệt Biểu đồ khuếch đại vẽ lên đường biểu diễn khuếch đại mẫu thử mẫu chuẩn Biển đồ chuẩn vẽ lên đường biểu diễn chuẩn mối quan hệ số lượng DNA đích có mẫu chuẩn chu kỳ ngưỡng tương ứng Trong biểu đồ này, E2-E4-E7 ống phản ứng chứa mẫu chuẩn B4 ống phản ứng chứa mẫu thử Nguyên tắc tổng hợp cDNA từ RNA Bản đồ gene plasmid pGEM-T Easy với vị trí chèn DNA bên gene lacZ Plasmid pGEM-T Easy chèn trình tự DNA enzyme cắt giới hạn NdeI cắt đầu SP6 NdeI sử dụng enzyme cắt điểm đầu SP6 không cắt đoạn DNA chèn vào pGEM-T Easy Nhờ men T7 RNA polymerase mà DNA chèn vào plasmid pGEM-T Esay sau duỗi thẳng phiên mã thành chứng nội RNA Biểu đồ khuếch đại pha lỗng “HIV1DNA đích” cho vào HIV1TQPCR mix Kết cho thấy đường khuếch đại có Ct cách khoảng 3-4 chu kỳ Sơ cho phép kết luận HIV1-TQPCR mix hoạt động mà không cần phải thiết kế lại primers taqman probe (A) Hình bên trái kết điện di chip cho thấy lane sản phẩm PCR đích HIV1 kích thước 140bps khuếch đại từ gene gag HIV1 genome trích từ huyết người nhiễm HIV có HIV1RNA [+], lane sản phẩm chứng dương HIV1RNA-C[+] kích thước 240 bases phiên mã từ ix Trang 7 10 11 12 12 13 14 20 23 27 28 39 40 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 plasmid pGEM-T Eseay chèn sản phẩm PCR (B) Hình bên phải kết điện di chip sản phẩm HIV1DNA-IC kích thước 200bps (lane 1) sản phẩm HIV1RNA-IC kích thước 300bps (lane 2) phiên mã từ plasmid pGEM-T Eseay chèn sản phẩm PCR (A) Biểu đồ khuếch đại dãy pha lỗng HIVRNA-C[+] có (màu đỏ) khơng có (màu xanh) cho thêm 10µl chứa 100 copies chứng nội HIV1RNA-IC trước tách chiết RNA để tổng hợp cDNA chạy real-time PCR Kết cho thấy hai dãy pha lỗng nồng độ cuối cho tín hiệu khuếch đại, chứng tỏ chứng nội HIV1RNA-IC nồng độ 100 copies cho vào thể tích mẫu tách chiết khơng cạnh tranh với đích (B) Biểu đồ khuếch đại chứng nội HIV1RNA-IC mẫu HIV1RNA-C[+] có cho 10µl chứng nội vào mẫu, kết chứng minh chứng nội thật khuếch đại cho vào HIV1-TQPCR mix Biểu đồ khuếch đại biểu đồ chuẩn dãy pha lỗng HIVRNA-C[+] có hàm lượng copies đến 1010 copies 150µl huyết tương Biểu đồ khuếch đại biểu đồ chuẩn dãy pha lỗng HIVRNA-C[+] có hàm lượng copies đến 108 copies 150µl huyết tương Biểu đồ khuếch đại biểu đồ chuẩn dãy pha lỗng HIVRNA-C[+] có hàm lượng copies đến 108 copies 150µl huyết tương làm xét nghiệm ngày Biểu đồ khuếch đại biểu đồ chuẩn dãy pha lỗng HIVRNA-C[+] có hàm lượng copies đến 108 copies 150µl huyết tương làm xét nghiệm ngày Biểu đồ khuếch đại biểu đồ chuẩn dãy pha lỗng HIVRNA-C[+] có hàm lượng copies đến 108 copies 150µl huyết tương làm xét nghiệm ngày Biểu đồ khuếch đại biểu đồ chuẩn mẫu huyết tương dương tính HBV, HCV, CMV S aureus cho thấy khơng có tín hiêu khuếch đại dương tính cho HIV1RNA mà có tín hiệu khuếch đại dương tính cho chứng nội (HIV1RNA-IC) chứng tỏ mẫu thất âm tính HIV1RNA Các chuẩn định lượng cho đường khuếch đại màu đỏ Biểu đồ khuếch đại biểu đồ chuẩn cặp mẫu huyết tương có pha lỗng HIVRNA-C[+] cặp có mẫu thêm chất ức chế (đường màu đen) mẫu không thêm chất ức chế (đường màu xanh lá) Kết biểu đồ khuếch đại biểu đồ chuẩn xét nghiệm phát HIV1RNA mẫu 103 107 copies HIV1RNA có 150µl, thực sau pha Kết biểu đồ khuếch đại biểu đồ chuẩn xét nghiệm phát HIV1RNA mẫu 103 107 copies HIV1RNA có 150µl, thực x 41 41 42 43 43 43 44 45 45 45 Hình 25: Biểu đồ khuếch đại biểu đồ chuẩn cặp mẫu huyết tương có pha lỗng HIVRNA-C[+] cặp có mẫu thêm chất ức chế (đường màu đen) mẫu không thêm chất ức chế (đường màu xanh lá) Bảng 4: Giá trị định lượng HIV1RNA cặp mẫu có khơng có thêm chất ức chế Chất ức chế Hemoglobin BSA Lamivudine DNA bạch cầu người0 Có thêm chất ức chế Không thêm chất ức chế 1,642 22 1,227 36 1,672 29 1,249 42 CV 0.9052505 13.72549 0.8885299 7.6923077 Kết chất ức chế không ảnh hưởng lên kết định lượng thông qua giá trị định lượng HIV1RNA mẫu có thêm chất ức chế mẫu khơng thêm chất ức chế khơng khác biệt Chỉ có mẫu có thêm BSA mẫu khơng thêm BSA cho giá trị định lượng có CV = 13.7 (cao 10%), nhiên số định lượng 100 nên độ lặp lại chứng minh phần tương đối thấp 2.6 Kết đánh giá độ ổn định bảo quản Hình 26: Kết biểu đồ khuếch đại biểu đồ chuẩn xét nghiệm phát HIV1RNA mẫu 103 107 copies HIV1RNA có 150µl, thực sau pha Hình 27: Kết biểu đồ khuếch đại biểu đồ chuẩn xét nghiệm phát HIV1RNA mẫu 103 107 copies HIV1RNA có 150µl, thực sau tháng bảo quản 45 Hình 28: Kết biểu đồ khuếch đại biểu đồ chuẩn xét nghiệm phát HIV1RNA mẫu 103 107 copies HIV1RNA có 150µl, thực sau tháng bảo quản Hình 29: Kết biểu đồ khuếch đại biểu đồ chuẩn xét nghiệm phát HIV1RNA mẫu 103 107 copies HIV1RNA có 150µl, thực sau 12 tháng bảo quản Độ ổn định đánh giá qua xét nghiệm phát định lượng HIV1RNA loạt mẫu huyết tương có pha HIV1RNA-C[+] nồng độ 103 107 150µl bảo quản nhiệt độ -80oC đem làm xét nghiệm với thử nghiệm mà thành phần bảo quản điều kiện thời điểm sau bắt đầu pha, tháng sau 12 tháng Kết đường biểu diễn khuếch đại đường biểu diễn chuẩn đợt xét nghiệm trình bày hình 26, 27, 28 29 Số lượng copies đợt CV trình bày bảng Bảng 5: Giá trị định lượng HIV1RNA mẫu 103 107 thực lần cách tháng giá trị CV Đợt Đợt Đợt Đợt CV 833 12,270,173 898 15,168,135 880 12,377,530 861 14,321,509 2.7863362 9.2174617 Kêt cho thấy giá trị định lượng mẫu 103 107 không thay đổi thử nghiệm qui trình xét nghiệm có thành phần bảo quản điều kiện bảo quản Kết cho phép kết luận qui trình xét nghiệm bền 12 tháng bảo quản điều kiện ghi thành phần KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ QUI TRÌNH XÉT NGHIỆM HIV1 RT-TQPCR THỰC HIỆN TRÊN MẪU THẬT 46 Bảng 6: Giá trị định lượng HIV1RNA 44 mẫu HIV1-RNA dương tính định lượng với kit Amplicor giá trị CV so với HIV1 RT-qPCR STT RT-qPCR Amplicor CV 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 84,170.5 960.8 107,834.2 392.1 213.2 15,720.5 48.5 138,482.0 1.0 64.7 755.3 102.5 229.2 5.4 10.0 1,245.5 13,930.0 75.7 2.7 114.4 10,382.2 480.7 79,989.3 826.4 112,312.0 387.6 237.6 14,999.0 65.0 145,234.0 13.0 54.2 802.4 114.3 250.3 8.6 15.2 1,350.2 14,756.3 89.2 12.1 132.8 12,324.3 412.5 2.5470304 7.5196382 2.0340076 0.5747005 5.4199262 2.348671 14.537445 2.3798491 85.714286 8.8233163 3.0208542 5.4623942 4.3969107 22.857143 20.634921 4.0330569 2.8804691 8.196949 63.894872 7.4230715 8.5529163 7.6355541 STT RT-qPCR Amplicor CV 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 7,124.6 2.5 312.3 8.2 7.0 89.3 657.6 14,517.7 98.5 920.0 110,216.2 385.0 145,035.0 1,452.4 18.0 1,234.5 135.4 290.4 9.3 4.8 103.1 326.7 7,240.5 23.1 298.5 10.1 12.0 78.5 599.6 14,325.1 89.7 1,005.0 121,111.0 401.2 148,620.5 1,398.6 27.3 1,198.9 118.5 308.7 11.7 12.0 98.2 356.2 0.8068165 80.461668 2.259332 10.343237 26.315789 6.4362336 4.6134267 0.6676495 4.6785155 4.4155844 4.7096926 2.0605444 1.2209885 1.8870572 20.529801 1.4629736 6.6561638 3.0545819 11.428571 42.857143 2.4341778 4.3198126 20 mẫu huyết tương thử ELISA [-] kháng thể đặc hiệu HIV1, thử Amplicor HIV RT-qPCR âm tính với HIV1RNA 50 mẫu huyết tương thử ELISA [+] kháng thể đặc hiệu HIV1, thử Amplicor HIV1 RT-qPCR có 44 mẫu cho giá trị định lượng HIV1RNA, mẫu cho kết HIV1RNA [-] Bảng trình bày giá trị định lượng HIV1RNA 44 mẫu HIV1-RNA dương tính định lượng với kit Amplicor với HIV1 RT-qPCR với giá trị CV hai kết Phân tích bảng thấy từ giá trị định lượng ≥50 copies/ml trở lên, kết Amplicor HIV1 RT-qPCR khơng khác biệt với CV
Ngày đăng: 05/10/2023, 20:08
Xem thêm:
