Phân lập Exopolysaccharid( EPS) sinh tổng hợp từ Lactobacillus Permentum và ứng dụng vào ngành sản xuất thực phẩm

Trường Đại Học Bách Khoa Hà Nội Viện Công Nghệ Sinh Học Công Nghệ Thực Phẩm  Môn học Vi sinh vật thực phẩm Đề tài Phân lập Exopolysaccharid( EPS) sinh tổng hợp từ Lactobacillus Permentum và ứng dụng vào ngành sản xuất thực phẩm Hà Nội, 2020 Lê Thị Cẩm Ly 20174911 Mục lục Phần I Polysaccharide 4 1 Khái niệm về Polysaccharide 4 2 Ứng dụng chung của PS 4 Phần II Tổng quan về Lactobacillus fermentum 6 Phần III Tổng quan về Exopolysaccharide từ vi k.

Trường Đại Học Bách Khoa Hà Nội Viện Công Nghệ Sinh Học & Công Nghệ Thực Phẩm - - Môn học: Vi sinh vật thực phẩm Đề tài: Phân lập Exopolysaccharid( EPS) sinh tổng hợp từ Lactobacillus Permentum ứng dụng vào ngành sản xuất thực phẩm Hà Nội, 2020 Lê Thị Cẩm Ly 20174911 Mục lục Phần I Polysaccharide Khái niệm Polysaccharide Ứng dụng chung PS Phần II Tổng quan Lactobacillus fermentum Phần III Tổng quan Exopolysaccharide từ vi khuẩn Lactic Khái niệm Đặc điểm phân loại đặc tính lý hóa 2.1 Tính chất chức ứng dụng 12 2.2 Tính chất chức 12 2.3 Ứng dụng EPS thực phẩm 15 Phần IV Phân lập EPS từ Lactobacillus fermentum 17 Phương pháp nghiên cứu 17 Tổng quát trình phân lập thu nhận EPS từ số chủng Lb Fermentum 19 Phần V Tiềm EPS tách chiết từ chủng Lb fermentum để ứng dụng vào ngành công nghiệp thực phẩm 21 Khả hòa tan nước 21 Khả giữ nước giữ dầu 21 Chất chống oxi hóa 23 Phần VI Ứng dụng vào sản phẩm thực phẩm phổ biến thị trường 25 Ứng dụng vào sản phẩm sữa 25 Ứng dụng sản phẩm thịt lên men 25 Ứng dụng đồ uống có nguồn gốc từ thực vật 26 Ứng dụng sản xuất bánh mỳ 26 Lê Thị Cẩm Ly 20174911 Mở đầu Trong năm gần đây, khuynh hướng ứng dụng polymer tự nhiên nhiều lĩnh vực tăng lên dẫn đến phát triển nghiên cứu thu nhận Polysaccharide( PS) tổng hợp từ vi khuẩn Các PS tổng hợp ngoại bào tiết môi trường Hiện nay, PS tách chiết có đa dạng cấu trúc tính chất chức Nguồn Exopolysaccharide( EPS) ngày sử dụng rộng rãi công nghệ mỹ phẩm đặc biệt thực phẩm Chúng tác nhân làm đặc, ổn định kết cấu, nhũ hóa, tạo gel, Hơn nữa, gần đây, hoạt tính sinh học khác liên quan đến EPS khả chống oxy hóa, chống ung thư, làm giảm cholesterol, hoạt động probiotic nghiên cứu phổ biến … Hiện LAB coi alf nguồn sản xuất EPS đáp ứng phương diện ứng dụng thực phẩm với tác động liên quan đến việc cải thiện cấu trúc sản phẩm lên men sữa chua, phomat, Bên cạnh đó, nhờ đặc điểm đa dạng cấu trúc an toàn sức khỏe người mà EPS sinh tổng hợp từ vi khuẩn lactic (LAB) quan tâm nhiều so với EPS từ loài khác Mặc dù việc phát triển nghiên cứu thu nhận EPS phát triển đóng góp phần quan trọng công nghiệp y học EPS từ vi khuẩn tồn nhược điểm suất thu nhận thấp Đây lý khiến khả thương mại hóa EPS từ vi khuẩn Lactic ( LAB – Lactic acid bacteria) nói riêng cịn hạn chế Nhiều nghiên cứu kết luận đa dạng cấu trúc lồi vi khuẩn khác liên quan đến nguồn phân lập vi khuẩn, thành phần chất dinh dưỡng trình lên men điều kiện nuôi cấy thu nhận Sự đa dạng tạo nên ảnh hưởng đến hoạt tính sinh học tính chất chức cơng nghệ thực phẩm Bài báo cáo em trình bày đặc tính cấu trúc EPS sinh tổng hợp từ chủng LAB nói chung số chủng Lactobacillus fermentum nói riêng ứng dụng tuyệt vời exopolysaccharide Em xin càm ơn Trần Liên Hà hướng dẫn em môn Vi Sinh Vật thực phẩm để em có kiến thức chung vi sinh để hoàn thành báo cáo Do thời gian nghiên cứu có hạn nguồn tài liệu hạn hẹp nên báo cáo em cịn thiếu sót nhiều chỗ Mong bạn cho em lời khun để hồn thiện báo cáo Lê Thị Cẩm Ly 20174911 Phần I Polysaccharide Khái niệm Polysaccharide Polysaccharide (PS) polyme thiên nhiên thuộc nhóm carbohydrate thường coi polyme sinh học đa với chức biết đến nguồn lượng dự trữ (tinh bột, glycogen); tạo nên cấu trúc vững cho thực vật động vật (cellulose, chitin); chất bảo vệ (exopolysaccharide vi sinh vật),… Hầu hết chức PS quy định cấu trúc Trong chuỗi PS, monosaccharide liên kết với liên kết glycoside - Các PS chứa loại monosaccharide gọi homopolysaccharide homoglycan - Các PS chứa nhiều loại heteropolysaccharide heteroglycan monosaccharide gọi Trong năm gần đây, nhiều loại PS có vai trị quan trọng y học thương mại thu nhận từ trình lên men vi sinh vật Các PS sinh tổng hợp từ lồi vi sinh vật gây bệnh không gây bệnh Trong đó, PS tổng hợp từ lồi vi sinh vật không gây bệnh (GRAS-Generally Recognized As Safe) khai thác chúng có nhiều ứng dụng quan trọng công nghiệp công nghệ sinh học với tính chất độc đáo lạ tạo gel, khả tự phân hủy sinh học, tính bám dính sinh học, Một số PS phổ biến thu nhận từ vi sinh vật kể đến (i) xanthan, gellan, dextran, alternan, curdlan, exopolysaccharide (EPS) vi khuẩn lactic (LAB), levan, alginate (từ vi khuẩn); (ii) pullulan, scleroglucan, schizophyllan lentinan (từ nấm); (iii) BYG (Beer’ yeast glucan) - glucan thương mại từ nấm men bia Ứng dụng chung PS Với nguồn nguyên liệu thu nhận phổ biến, chi phí thu nhận thấp góp phần giúp hợp chất PS có thêm nhiều phạm vi ứng dụng sản xuất thực phẩm, dược phẩm, mỹ phẩm,… ✓ Trong công nghệ thực phẩm: Các PS sử dụng chất phụ gia bổ sung vào trình chế biến thực phẩm với vai trị giúp hồn thiện cấu trúc thực phẩm từ làm tăng giá trị cảm quan cho sản phẩm: tạo gel, làm tăng độ nhớt, từ tạo nên ổn định nhũ tương giúp ngăn chặn tượng tách nước số sản phẩm có chất cấu trúc gel đặc biệt sữa chua [67] ✓ Trong dược phẩm: PS coi vật liệu sinh học phổ biến Chúng đóng góp vai trị quan trọng cho trình phát triển sản phẩm dược phẩm ứng dụng y tế chất kết dính đơn giản phương tiện phân phối thuốc tinh vi [67], [114] ✓ Trong công nghệ sinh học phịng thí nghiệm: Nhờ đặc tính tạo màng film, tạo gel khả gắn ion giúp cho PS sử dụng công cụ vô giá công nghệ sinh học cơng tác nghiên cứu phịng thí nghiệm Chẳng hạn như, việc sử dụng agar tạo cho khuẩn lạc vi khuẩn phát triển; sử dụng PS hịa tan, khơng hịa tan dẫn xuất chúng giúp cố định protein, cố định enzyme tế bào động vật sử dụng dextran pullulan làm chất chuẩn kỹ thuật phân tách phân tử phương pháp Lê Thị Cẩm Ly 20174911 sắc ký sắc ký khối phổ( MS), sắc ký lỏng hiệu cao( HPLC) Nhờ vào tính chất chức công nghệ khả tạo gel, tạo độ nhớt, làm bền nhũ tương khả tự phân giải nên hợp chất PS ngày quan tâm nghiên cứu khai thác nhà khoa học nước giới Một nguồn cung cấp hợp chất PS quan tâm nhiều LAB đặc biệt PS chúng tiết ngồi mơi trường gọi EPS Lê Thị Cẩm Ly 20174911 Phần II Tổng quan Lactobacillus fermentum Lactobacillus fermentum loài vi khuẩn Gram dương thuộc chi Lactobacillus (Lb.), vi khuẩn thường tìm thấy sản phẩm lên men từ động vật thực vật Chúng vi khuẩn ưa ấm, có nhu cầu dinh dưỡng phức tạp, lên men dị hình chặt chẽ, lên men đường glucose (glc), fructose (fruc), maltose, sucrose, lactose Trong trình sinh trưởng phát triển, chúng chịu tác động không nhỏ yếu tố vật lý (pH, nhiệt độ, thời gian, …), yếu tố hóa học (nguồn carbon (C) nguồn nitrogen (N),…) Lb fermentum tạo thành khuẩn lạc màu trắng xám với đường kính khoảng 1µm Hình dạng Lb fermentum Hình dạng khuẩn lạc Lb fermentum Từ lâu, Lb fermentum sử dụng giống khởi đầu cho trình lên men nhiều sản phẩm thực phẩm đồ uống Trong trình lên men cacbonhydrat, ngồi sản phẩm acid lactic, Lb fermentum tạo hợp chất tạo hương (diacetyl/acetoin) đặc biệt PS ngoại bào (EPS) Chúng hợp chất có giá trị thương mại lớn với tính chất hóa lý có lợi khả tạo gel, tạo kết cấu, tạo độ đặc thực phẩm tác động có lợi liên quan đến sức khỏe có tiềm probiotic, làm giảm cholesterol, kích thích miễn dịch, chống ung thư Từ chủng vi khuẩn Lactic FDA ( cục Thực phẩm dược phẩm Hoa Kỳ) công nhận vi khuẩn an toàn cho sức khỏe người, quan tâm EPS nói chung ngày tăng nhằm thay cho PS từ thực vật Lê Thị Cẩm Ly 20174911 Phần III Tổng quan Exopolysaccharide từ vi khuẩn Lactic Khái niệm Trong trình sinh trưởng phát triển, vi khuẩn sinh tổng hợp nhiều loại PS khác Tùy theo vị trí chúng tế bào, PS nội bào ngoại bào Những PS tiết bên màng tế bào gọi PS ngoại bào Chúng tạo thành chất dính bám chặt gọi PS dạng màng bao gắn lỏng lẻo tiết hồn tồn mơi trường chất nhờn gọi EPS … Chúng PS chuỗi dài, phân nhánh với đơn vị lặp lặp lại monosaccharide dẫn xuất chúng Nói ngắn gọn Exopolysaccharide polyme carbohydrat ngoại bào vi sinh vật sản xuất tiết ra, tích tụ bên ngồi tế bào Đặc điểm phân loại đặc tính lý hóa Dựa thành phần monosaccharide chế sinh tổng hợp EPS từ LAB chia thành nhóm là: heteropolysaccharide (HePS) homopolysaccharide (HoPS) - homopolysaccharide (HoPS) Cấu trúc dạng phân nhánh không phân nhánh HoPS HoPS PS cấu tạo từ loại monosaccharide (dạng hexose) D- glc D-fruc Các chi thuộc LAB Lactobacillus, Leuconostoc (Leu.), Streptococcus (S.) biết đến nguồn sinh tổng hợp HoPS Phần ngoại bào Màng plasmid Tế bào chất Chất xúc Tín hiệu Fruc Glc Mơ hình trình sinh tổng hợp glucan fructan Quá trình tổng hợp HoPS xảy bên ngồi tế bào nhờ xúc tác enzyme đặc Lê Thị Cẩm Ly 20174911 hiệu glycosyltransferase (GTF - glucansucrase) fructosyltransferase (FTF fructansucrase) Các enzyme từ nội bào di chuyển bên ngồi tế bào nhờ tín hiệu xuất Sau chúng xúc tác thủy phân sucrose thành glc fruc tạo liên kết glycoside glc fruc với phân tử chất nhận tạo nên chuỗi glucan fructan Đây HoPS ngoại bào (EPS) Do đó, sucrose chất LAB sử dụng để sinh tổng hợp EPS Trong trình này, sucrose thủy phân thành gluc fruc chất Ngoài phản ứng cịn giúp cung cấp lượng cho q trình tổng hợp PS Các HoPS thường khác loại liên kết, mức độ phân nhánh, độ dài chuỗi glycan, khối lượng phân tử cấu tạo chúng Tùy vào thành phần monosaccharide tạo thành mà HoPS phân thành hai nhóm chính: glucan fructan Sơ đồ phân loại đặc điểm cấu tạo HoPS sinh tổng hợp từ LAB - Heteropolysaccharide (HePS) Khác biệt với HoPS, HePS có đa dạng thành phần, tỷ lệ monosaccharide cấu trúc phân tử đơn vị lặp lặp lại đặc điểm cấu tạo khối lượng phân tử polyme Lê Thị Cẩm Ly 20174911 Cấu trúc dạng phân nhánh không phân nhánh HePS Các chủng vi khuẩn ưa ấm (mesophilic) Lb casei, Lb sake, Lb rhamnosus… chủng ưa nhiệt Lb acidophilus, bulgaricus S thermophilus biết đến nguồn tổng hợp nên HePS từ LAB Quá trình sinh tổng hợp HePS xảy tế bào thường trải qua ba giai đoạn: (a) hấp thu chất, (b) chuyển hóa đường trung gian (c)q trình tổng hợp PS Sơ đồ trình sinh tổng hợp HePS tế bào LAB • Sự hấp thụ chất từ môi trường vào tế bào vi khuẩn Đây trình vận chuyển nguồn C, chủ yếu monosaccharide disaccharide, từ bên ngồi mơi trường vào tế bào chất Sau vào tế bào, hầu hết nguồn C chuyển thành glc Quá trình thực lặp lặp lại Tùy thuộc vào loại chất mà đưa đến tế bào thông qua hệ thống vận chuyển thụ động chủ động Các hệ thống tham gia vào trình vận chuyển đường thường phosphoenolypyruvate- phosphotransferase (PEP-PTS) LAB • Sự chuyển hóa loại đường trung gian Q trình chuyển hóa gồm hai giai đoạn: giai đoạn tổng hợp glucose-1phosphate (Glc-1P) giai đoạn hoạt hóa, liên kết loại đường - Sự tổng hợp glucose-1-phosphate: Khi vào tế bào chất, glc trải qua q trình glycolysis phosphoryl hóa Đây chìa khóa trung gian quan trọng gắn kết q trình đồng hóa tổng hợp EPS q trình dị hóa phân giải đường Trước hết, tác dụng hexokinase, glc tạo thành glucose-6-phosphate (Glc-6P) Sau đó, tác dụng Lê Thị Cẩm Ly 20174911 phosphoglucomutase (PGM), Glc-6P chuyển thành Glc-1P - Sự hoạt hóa liên kết loại đường: Glc-1P tiếp tục chuyển hóa thành nucleotide-đường (NDP) Uridine diphosphate glucose (UDP-glc) Thymidine diphosphate glucose (TDP- glc) (Hình 1.8) nhờ xúc tác enzyme tương ứng UDP-glucose pyrophosphorylase (UGP) TDP-glucose pyrophosphorylase (TGP) UDP-glucose TDP-rhamnose TDP-glucose UDP-galactose Cấu tạo UDP- glucose TDP- glucose, v, TDP-rhamnose UDP- glactose Sau đó, loại đường tiếp tục chuyển hóa tạo nên NDP khác bao gồm Uridine diphosphate galactose (UDP-Gal) UDP-Glc chuyển thành tác dụng UDP-Gal-4-epimerase (UGE) TDP Rhamnose (TDP-Rha) chuyển hóa từ TDPGlc tác dụng xúc tác TDP-glc dehydratase Bên cạnh đó, Glc-1P chuyển hóa theo hướng tạo thành Mannose-6P (Man-6P) nhờ xúc tác enzyme phosphomannomutase (PMM) Từ Man-6P tiếp tục hình thành hợp chất Man-1P, GDP-Man Guanosine di phosphate fructose (GDP-Fruc) nhờ xúc tác enzyme tương ứng là, man-1P guanylyltransferase, GDP- mannose pyrophosphorylase (GMP) GDP-mannose dehydratase; từ Glc-1P thông qua bước gian tạo thành fructose-6P (fruc-6P) tác dụng hexokinase Man-6P hình thành từ fruc-6P nhờ xúc tác enzyme phosphomannoisomerase (PMI) cuối GDP-fructose Sự tạo thành NDP (UDP-glc, TDP-Rha, UDP-Gal GDP-Fruc) có vai trị quan trọng q trình tổng hợp EPS Chúng tiền thân đơn vị lặp lại góp phần tạo nên đa dạng cấu trúc PS từ vi khuẩn Bên cạnh đó, Glc-6P cịn đồng phân hóa hướng tới sản phẩm trình đường phân tạo thành pyruvate điều kiện hiếu khí Pyruvate theo chu trình Kreps hình thành ATP (Adenosin Triphosphate) để cung cấp lượng cho trình sinh tổng hợp nucleotide-đường tế bào - Quá trình tổng hợp EPS Lê Thị Cẩm Ly 20174911 Sơ đồ biểu diễn tính chất tăng cường sức khỏe EPS từ LAB - EPS có chức prebiotic probiotic Prebiotic biết đến thành phần dạng sống không tiêu hóa được, có tác dụng kích thích vi khuẩn ruột Chúng thường oligosaccharide chuyển hóa vi khuẩn có lợi cho sức khỏe cải thiện khả miễn dịch để chống lại mầm bệnh EPS hợp chất PS Vì có mặt EPS đường ruột có vai trị prebiotic Bên cạnh tính prebiotic, nhiều chủng vi khuẩn thuộc LAB nghiên cứu công bố tiềm probiotic chúng bao gồm Lb acidophilus, Lb bulgaricus, Lb lactis, - Hoạt động kháng khuẩn LAB tạo nhiều hợp chất chống vi khuẩn bao gồm vi khuẩn, diacetyl, axit hữu cơ, carbon dioxide số chất trọng lượng phân tử thấp khác, chẳng hạn reuterin, reutericyclin peptit kháng nấm Ngoài hợp chất này, EPS LAB tạo có khả thể tác dụng đối kháng vi khuẩn gây bệnh số nhà nghiên cứu ghi nhận - Chống viêm, loét dày tác động làm giảm cholesterol Viêm trình phục hồi mơ bình thường chức để đáp ứng với nhiễm trùng tổn thương mô xảy vật chủ Quá trình viêm kéo dài dẫn đến bệnh viêm nhiễm nghiêm trọng ung thư EPS vi khuẩn probiotic tạo báo cáo có khả kiểm sốt chế gây viêm tế bào miễn dịch Nhiều nhà nghiên cứu thực nhiều nghiên cứu in-vitro dòng tế bào đại thực bào để đánh giá phản ứng miễn dịch bẩm sinh EPS gây EPS tiểu thuyết tinh khiết từ Lactobacillus pentosusLZ-R-17 cho thấy hoạt động kích thích miễn dịch đáng kể cách tăng khả tồn tế bào đại thực bào RAW264.7, tăng cường khả thực bào, cải thiện hoạt hóa đại thực bào thúc đẩy tiết NO, TNF-α, Il-1β, IL-6 IL-10 Lê Thị Cẩm Ly 20174911 Hoạt động chống viêm in- vitro EPS từ LAB LPS kích thích đại thực RAW 264.7 - Hoạt tính chống ung thư( kháng u) Ung thư phát triển bất thường tế bào dẫn đến phá hủy quan khác thể dẫn đến tử vong Hóa trị xạ trị cho bệnh nhân ung thư phá hủy tế bào khối u tế bào bình thường Tiềm chống ung thư EPS liên quan đến cảm ứng apoptosis, biệt hóa tế bào ung thư liên kết chất gây ung thư độc tố gen Các chế có hoạt động chống ung thư EPS gây sau: (1) ngăn ngừa hình thành khối u, (2) cảm ứng trình chết tế bào ung thư, (3) cải thiện khả miễn dịch EPS có tính axit tạo chủng Lactobacillus SB27 cho thấy gia tăng tối đa hoạt hóa capsase-3 gây q trình apoptosis, bắt giữ chu kỳ tế bào G0 / G1 hoạt động chống tăng sinh tế bào - Kích thích miễn dịch Nhiều LAB khác polysaccharid ngoại bào chúng phát để điều chỉnh hệ thống miễn dịch vật chủ cách thúc đẩy gia tăng tế bào lympho T / B (tế bào trung gian hệ miễn dịch tế bào), hoạt động diệt tế bào tự nhiên (NK), khả thực bào tế bào đơn nhân, hoạt động phân bào, tạo cytokine nói chung tăng khả bảo vệ miễn dịch vật chủ chống lại mầm bệnh Như vậy, thông qua số nghiên cứu động vật thử nghiệm in vitro gợi ý tác dụng có lợi đến sức khỏe liên quan đến việc sử dụng thường xuyên EPS sinh tổng hợp từ LAB Những nghiên cứu cho thấy EPS xứng đáng mục tiêu nghiên cứu tiềm ứng dụng nhằm phục vụ sức khỏe người ứng dụng liên quan y tế, mỹ phẩm dược phẩm,… Đồng thời, EPS từ LAB mở hướng cho việc phát triển sản phẩm thực phẩm chức góp phần mở rộng thị trường tiêu thụ thực phẩm với Lê Thị Cẩm Ly 20174911 đặc tính tự nhiên vi khuẩn mang lại 2.3 Ứng dụng EPS thực phẩm Các polyme từ thực vật, động vật thành phần thiếu số loại thực phẩm Từ lâu, chúng sử dụng thành phần giúp hoàn thiện kết cấu cho sản phẩm thực phẩm tạo gel, ổn định, nhũ tương hóa, ngăn ngừa kết tinh So với PS phân lập từ nguồn thực vật (như carrageenan, guar gum, tinh bột biến tính, glucan v.v), PS từ vi sinh vật có lợi với quy trình kiểm sốt tốt, sản xuất với quy mô lớn không gian thời gian tương đối hạn chế, đặc tính hóa học thu ổn định đặc biệt đáp ứng yêu cầu tính an tồn thị trường Việc định hướng sử dụng EPS từ LAB với mục đích làm phụ gia bổ sung vào thực phẩm hay sử dụng trực tiếp LAB có khả sinh tổng hợp EPS làm giống khởi động cho trình sản xuất sản phẩm thực phẩm lên men coi an toàn, thành phẩm thu tự nhiên Bên cạnh đó, EPS có tác động quan trọng đến phát triển sản phẩm thực phẩm (cả thực phẩm lên men khơng lên men), phải kể đến sản phẩm thực phẩm cần tăng cường đặc tính lưu biến, cải thiện kết cấu ổn định khả giữ nước Đây vấn đề cần giải cấu trúc thực phẩm EPS từ LAB giải vấn đề - EPS tác nhân tạo kết cấu Các EPS sử dụng thực phẩm với chức tác nhân làm đặc sinh học tạo nên ổn định hạn chế tượng tách nước thành phẩm thực phẩm lỏng phổ biến sữa chua Khả EPS có nhờ tương tác chúng với protein, ion thành phần khác sản phẩm giúp làm giảm tượng tách nước, tăng tính ổn định cho sản phẩm, từ giúp thực phẩm có tính đồng cao tăng giá trị cảm quan Bên cạnh đó, EPS từ số chủng LAB kết luận góp phần cải thiện kết cấu bột nhào trình chế biến loại bánh sản xuất từ bột mì Chính vậy, nhiều nhà khoa học quan tâm đến việc nghiên cứu số tính chất hóa lý EPS có ảnh hưởng đến yếu tố tạo nên tính chất lưu biến cho sản phẩm thực phẩm - EPS giúp hoàn thiện tính lưu biến sản phẩm lên men Độ đàn hồi độ nhớt hai biến quan trọng tính chất lưu biến thực phẩm Chúng có ảnh hưởng lớn đến tính chất lý hóa sản phẩm thực phẩm đặc biệt sản phẩm lên men Việc sử dụng EPS nhằm cải thiện tính chất lưu biến sản phẩm điều cần thiết Trong chủng vi khuẩn sử dụng làm giống khởi động trình lên men sữa, nhiều chủng LAB đặc biệt loài Lactobacilli biết đến có khả sinh tổng hợp EPS Do đó, dù lượng EPS sinh tổng hợp LAB không cao, nhiên chúng đủ để tạo kết cấu cho sản phẩm sữa lên men mà không cần bổ sung thêm chất ổn định trình sản xuất Tác động hỗ trợ tích cực việc cải thiện kết cấu giảm khả tách nước sản phẩm sữa chua tạo thành EPS sinh tổng hợp từ chủng LAB sử dụng để lên men sữa kết luận EPS từ Lb delbrueckii bulgaricus S Thermophilus; EPS từ L lactis subsp Cremoris; LC330 EPS từ Lb delbrueckii ssp bulgaricus Lê Thị Cẩm Ly 20174911 Bên cạnh đó, nhiều cơng trình nghiên cứu rằng, EPS giải phóng lồi Lactobacilli Lb delbrueckii bulgaricus, Lb helveticus Lb casei có tác dụng thúc đẩy khả giữ nước cải thiện kết cấu tổng thể loại mát khác giai đoạn chín tới giúp cấu trúc sản phẩm tạo thành ổn định Coeuret cộng (2003) kết luận rằng, trình hình thành mát phụ thuộc vào liên hệ chủng Lactobacilli với diện hay vắng mặt EPS sinh tổng hợp Từ công bố cho thấy rằng, sử dụng chủng vi khuẩn có khả sinh tổng hợp EPS cao làm tác nhân vi sinh vật gây lên men chế biến thực phẩm Quá trình thực điều kiện in situ EPS sử dụng theo điều kiện có tác động tác nhân ổn định tự nhiên, có khả làm đặc, tạo độ nhớt cao giảm khả tách nước Công nghệ tạo sản phẩm bảo đảm tính an tồn thực phẩm cao không cần sử dụng chất phụ gia tổng hợp từ bên vào Lê Thị Cẩm Ly 20174911 Phần IV Phân lập EPS từ Lactobacillus fermentum Ở Việt Nam, cơng bố EPS từ LAB nói chung từ chủng Lb fermentum nói riêng cịn hạn chế Đa số nguồn cung cấp PS nghiên cứu Việt Nam chủ yếu từ lồi nấm, loại rong…Các cơng trình nghiên cứu đa phần tập trung vào điều kiện tách chiết, thu nhận, tính chất hóa lý,… Trong báo cáo trình bày rõ phân lập EPS từ nguồn Lactobacillus fermentum khác biệt EPS thu nhận Phương pháp nghiên cứu - Phương pháp nuôi cấy thu nhận sinh khối Các chủng Lb fermentum TC13, TC16, TC21, MC3 từ ống giống gốc cấy ria môi trường MRS agar, ủ tủ ấm 37oC, 24 Khuẩn lạc sau cấy vào mơi trường MRS lỏng, ủ tủ ấm 37oC, 24 Sinh khối thu nhận sau ly tâm 5000 vòng/phút 4oC, phút rửa lại lần dung dịch 1% pepton + 0,85% NaCl tái huyền phù xác định mật độ tế bào phương pháp đo mật độ quang bước sóng 600 nm - Phương pháp thu nhận tách EPS Lê Thị Cẩm Ly 20174911 Sơ đồ thu nhận tách EPS Sau thu sinh khối tế bào chủng Lb fermentum bổ sung vào môi trường cần khảo sát Tiến hành lên men 37oC 24 sau tủa protein acid trichloroacetic 30% (TCA) ) Dịch thu sau ly tâm, kết tủa EPS ethanol lạnh lần (tỷ lệ dịch nổi: ethanol = 1: 2) Hòa tan tủa nước cất 50oC (khoảng ml) EPS dịch thu sau ly tâm kết tủa ethanol lạnh lần (tỷ lệ dịch nổi: ethanol = 1: 2) Kết tủa tiếp tục hòa tan nước cất 50oC Dung dịch xác định hàm lượng EPS phương pháp phenilsulfuric Lê Thị Cẩm Ly 20174911 Tổng quát trình phân lập thu nhận EPS từ số chủng Lb Fermentum Sơ đồ tổng quát nghiên cứu thu nhận EPS từ Lb Fermentum Kết nghiên cứu: LAB nhóm vi khuẩn cơng nhận vi khuẩn an tồn cho thực phẩm, sản phẩm thứ cấp chúng sinh đặc biệt EPS kết luận có nhiều chức khác công nghệ thực phẩm y học Tuy nhiên, nhược điểm chủ yếu EPS tổng hợp từ LAB suất tạo thành thấp khiến khả thương mại hóa EPS từ LAB cịn hạn chế Q trình tổng hợp EPS liên quan đến nhiều yếu tố chủng vi khuẩn sử dụng ban đầu, nguồn phân lập, thành phần môi trường điều kiện nuôi cấy định Do để tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả sinh tổng hợp EPS tót, phải nuôi cấy chủng điều kiện thời gian xác định Dưới kết thu Lê Thị Cẩm Ly 20174911 Khả sinh tổng hợp EPS số chủng vi khuẩn lactic ➔ Kết luận: Trong số chủng vi khuẩn khảo sát, Lb fermentum TC13, Lb fermentum TC16, Lb fermentum TC21 Lb fermentum MC3 chủng có khả sinh tổng hợp EPS vượt trội so với chủng lại Điều kiện thu nhận EPS cao chủng Lb fermentum nghiên cứu Các chủng vi khuẩn Lb fermentu m TC13 TC16 TC21 MC3 Điều kiện thu nhận Mật độ tế bào Thành phần môi nuôi trường pH cấy ban ban đầu Nguồn Nguồn đầu C N (cfu/ml ) 4% glc 0,4% 107 5,5 cao nấm 3% suc 0,8% 106 6,0 cao thịt 4% lac 0,8% 106 6,0 cao thịt 4% glc 0,3% 106 6,0 cao nấm Hiệu suất thu nhận EPS điều kiện khảo sát so với môi trường đối chứng MRS (%) Nhiệt độ nuôi cấy (oC) Thời gian lên men (giờ) 40 48 353,56 35 48 356,95 35 36 414,51 35 48 479,14 Lê Thị Cẩm Ly 20174911 Phần V Tiềm EPS tách chiết từ chủng Lb fermentum để ứng dụng vào ngành công nghiệp thực phẩm Khả hòa tan nước Một tính chất lý hóa quan tâm chủ yếu đặc biệt công nghệ thực phẩm PS khả hịa tan nước Tính chất đóng vai trị quan trọng chế biến khả àm đặc tác nhân ổn định số sản phẩm loại bánh kẹo Với EPS chế phẩm thu sau đông khô, tiến hành nghiên cứu khảo sát đánh giá khả hòa tan nước, kết EPS tách chiết từ chủng Lb fermentum Độ hòa tan (%) EPS- TC13 73,33±3,81 EPS-TC16 75,33±5,17 EPS-TC21 64,00±4,97 EPS-MC3 87,00±2,49 Các EPS thu từ chủng Lb fermentum (TC13, TC16, TC21, MC3) có khả hịa tan nước cao Trong EPS sử dụng nghiên cứu này, EPS có khả hịa tan nước tốt EPS-MC3 đạt khoảng 87% Việc EPS thu từ chủng Lb fermentum hòa tan nước, dễ dàng phân tán đồng dung dịch, tạo điều kiện thuận lợi cho trình biến đổi khả tạo gel, ổn định khối nhũ tương …của thực phẩm, đặc biệt thực phẩm dạng lỏng (phần lớn nước) EPS ví tác nhân kết dính chất nhũ hố, làm tăng độ nhớt cho sản phẩm Khi phân tán khối thực phẩm, EPS có khả ổn định cấu trúc, trạng thái số thực phẩm, hạn chế tượng tách pha – tượng có ý nghĩa quan trọng số sản phẩm sữa, nước trái Khả giữ nước giữ dầu Các tính chất vật lý liên quan đến khả giữ nước giữ dầu EPS coi đặc tính có lợi sản xuất thực phẩm đặc biệt sản xuất sản phẩm sữa lên men, xúc xích, thịt xơng khói,…Các tính chất chức đóng vai trị quan trọng đặc tính sản phẩm thực phẩm suốt trình chế biến đặc tính cuối sản phẩm tạo thành Trong đó, khả giữ nước đóng vai trò quan trọng chất lượng cuối số sản phẩm chứa nhiều nước rau, quả, thịt, cá… Lê Thị Cẩm Ly 20174911 EPS tách chiết từ chủng Lb fermentum Khả giữ nước (%) EPS- TC13 140,55 ± 0,45 EPS-TC16 136,22 ± 0,60 EPS-TC21 120,63 ± 1,99 EPS-MC3 135,70 ± 3,11 Bảng khả giứ nước EPS từ chủng Lb fermentum Kết luận: EPS thu từ chủng Lb fermentum TC13, TC16, TC21, MC3 có khả giữ nước tốt Trong đó, khả giữ nước cao EPS từ EPS- TC13, đạt 140,55% thấp so với EPS lại EPS- TC21 đạt 120,63% Khả giữ nước EPS có được coi đặc tính quan trọng thực phẩm tươi, góp phần trì độ tươi sản phẩm trì tính chất vốn có sản phẩm độ đàn hồi, tăng giá trị cảm quan giúp trì sản phẩm thời gian từ đáp ứng yêu cầu thiết yếu người tiêu dùng Khi khả giữ nước EPS thấp tương ứng khả giữ dầu chúng lại tăng lên cao Khả giữ dầu tương ứng EPS từ chủng Lb Fermentum TC13, TC16, TC21, MC3 590,78%; 594,57%; 608,3% 599,97% EPS tách chiết từ chủng Lb fermentum Khả giữ dầu (%) EPS- TC13 590,78 ± 1,94 EPS-TC16 594,57 ± 1,42 EPS-TC21 608,30 ± 0,45 EPS-MC3 599,97 ± 1,14 Khả hòa tan khả giữ nước EPS có ảnh hưởng lớn việc tạo gel dung dịch Khả giữ hịa tan tốt làm cho khối nhũ tương có độ nhớt, độ sánh cao hơn, kết cấu khối nhũ tương đồng hơn, khó bị phá vỡ, từ hạn chế tượng tách pha Đồng thời khả tạo gel tốt hơn, cấu trúc khối gel bền chặt Pradip cộng (2013) nghiên cứu thuộc tính lưu biến EPS sinh tổng hợp từ Lb fermentum V10 môi trường sữa lên men có hàm lượng chất béo thấp Kết cho thấy khả tách whey thấp, sản phẩm có độ nhớt cao, độ kết dính, thuộc tính cảm quan tốt Với khả giữ nước EPS, chủng lên men khởi đầu có khả sản xuất EPS sử dụng để cung cấp tác nhân ổn định tự nhiên có sẵn Ngồi ra, EPS hoạt động chất làm đặc tự nhiên, tạo cho sản phẩm có độ nhớt cao giảm khả tách nước mang lại cho sản phẩm cải tiến chất lượng mà không sử dụng chất phụ gia Lê Thị Cẩm Ly 20174911 Khả giữ nước giữ dầu tốt chủng vi khuẩn lactic giúp chúng ứng dụng sản phẩm thực phẩm; đặc biệt sản phẩm lên men từ sữa, kem, qua góp phần hồn thiện cấu trúc sản phẩm Chẳng hạn như, sản phẩm loại sốt có chứa chất béo, khả giữ dầu PS có mặt sản phẩm hạn chế tách pha, giúp hệ nhũ tương sản phẩm bền Với tính chất có lợi vậy, tương lai EPS sản xuất từ chủng Lb fermentum hồn tồn thay số loại phụ gia tổng hợp sản xuất thực phẩm mà giữ tính chất, đặc điểm sản phẩm đồng thời đảm bảo an toàn cho sức khỏe Từ kết khảo sát số tính chất có tiềm ứng dụng công nghệ thực phẩm EPS tổng hợp từ chủng Lb fermentum (TC13, TC16, TC21, MC3) bao gồm khả hòa tan nước, khả giữ nước, giữ dầu nhận thấy rằng, EPS thu từ q trình ni cấy chủng Lb fermentum (TC13, TC16, TC21, MC3) thể tính chất tốt Đây tính chất quan trọng việc thể tính chất lưu biến khả ổn định trạng thái sản phẩm Do đó, EPS sinh từ chủng ứng dụng công nghệ chế biến sản phẩm sữa chua, sản phẩm chế biến từ thịt (xúc xích, thịt nguội, …), loại bánh kẹo giúp trì tốt chất lượng sản phẩm có hàm lượng nước cao rau quả, thịt, cá, … Chất chống oxi hóa Chất béo nói chung thực phẩm chứa chất béo thường bị biến đổi theo chiều hướng khơng có lợi chế biến nhiệt bảo quản thời gian dài Các trình biến đổi xảy chủ yếu phản ứng oxy hóa phân hủy sản phẩm oxy hóa từ dẫn đến giá trị dinh dưỡng cảm quan sản phẩm bị giảm Các chất chống oxy hóa coi phụ gia quan trọng trình chế biến thực phẩm Chúng có tác dụng hạn chế phát triển q trình oxy hóa sản phẩm chứa nhiều chất béo thịt, sản phẩm từ sữa, sản phẩm chiên Hoạt động chống oxy hóa loại phụ gia phụ thuộc vào nhiều yếu tố hàm lượng lipid, nồng độ chất chống oxy hóa, nhiệt độ, oxy, có mặt chất chống oxy hóa thành phần khác thực phẩm nước protein Sử dụng DPPH gốc tự ổn định có khả nhận điện tử hydrogen để trở thành phân tử không ổn định nhằm khảo sát khả chống oxy hóa EPS thu nhận Acid ascorbic sử dụng chất chuẩn đối chứng Lê Thị Cẩm Ly 20174911 Nồng độ (mg/mL) Hoạt lực chống oxy hóa (%) EPSTC13 EPSTC16 1,0 - - 1,5 - - 29,14 ± 0,52 38,56 ± 0,37 55,01 ± 0,25 76,01 ± 0,35 2,85 27,34 ± 0,32 35,95 ± 0,52 51,08 ± 0,22 72,11 ± 0,45 2,96 2,0 2,5 3,0 3,5 IC50 EPSTC21 36,94 ± 0,35 57,14 ± 0,32 67,41 ± 0,30 78,99 ± 0,30 - Acid ascorbic EPSMC3 - 27,14 ± 0,30 47,66 ± 0,55 68,05 ± 0,47 80,93 ± 0,45 - - 1,32 2,06 Nồng độ (mg/mL) 0,00125 0,0025 0,0050 0,1250 Hoạt lực chống oxy hóa (%) 27,05 ± 0,12 58,30 ± 0,17 89,57 ± 0,1 93,12 ± 0,12 0,00217 Tỷ lệ bắt gốc tự DPPH (%) EPS thu từ chủng Lb fermentum (TC13, TC16, TC21, MC3) Kết luận: EPS sinh tổng hợp từ chủng Lb fermentum TC13, TC16, TC21, MC3 có khả chống oxy hóa Khả chống oxy hóa tăng dần theo chiều tăng nồng độ EPS thay đổi không giống so sánh EPS từ chủng khác Khả bắt gốc tự EPS sinh tổng hợp từ chủng Lb fermentum TC21 đạt tương đối cao, nồng độ 1,0 mg/ml, EPS từ chủng có tỉ lệ bắt gốc tự đạt 36,94% tăng nhanh nồng độ EPS tăng lên 1,5 mg/ml (đạt 57,14 Lê Thị Cẩm Ly 20174911 Phần VI Ứng dụng vào sản phẩm thực phẩm phổ biến thị trường Ứng dụng vào sản phẩm sữa EPS có nguồn gốc từ LAB sử dụng rộng rãi ngành công nghiệp sữa Trong thập kỷ gần đây, chủng khởi động từ sữa tổng hợp mức EPS chấp nhận trở thành mục tiêu nghiên cứu EPS hoạt động chất làm đặc chất tạo kết cấu cách tăng độ nhớt sản phẩm cuối chất ổn định cách liên kết nước tương tác với thành phần sữa khác, chẳng hạn protein mixen, để cải thiện độ cứng mạng casein Hơn nữa, EPS làm giảm khả tổng hợp đặc tính thuận lợi chế biến thực phẩm từ sữa EPS thường sử dụng sản xuất nhiều loại thực phẩm từ sữa lên men sữa chua, kefir , sữa chua uống, tráng miệng làm từ sữa mát LAB sản xuất EPS biết đến để cải thiện đặc tính kết cấu cảm quan loại thực phẩm khác nhau, đặc biệt trường hợp loại giảm chất béo, việc giảm hàm lượng chất béo ảnh hưởng tiêu cực đến đặc tính sản phẩm Nghiên cứu tính chất lưu biến sản phẩm từ sữa cho thấy, gần tượng tách nước lên bề mặt gel vấn đề cần giải Để giải vấn đề này, người ta thường phải bổ sung chất phụ gia vào sản phẩm sữa lên men chất tạo độ đặc, chất ổn định, hợp chất hóa học tổng hợp, Các hợp chất thường bị số nước giới không cho phép sử dụng Vì vậy, EPS xem polyme thiên nhiên thay hợp chất hóa học Đối với sản phẩm mát, khả giữ nước EPS hình thành trình sản xuất mát đáp ứng yêu cầu quan trọng việc cải thiện kết cấu loại mát cho phép giảm lượng lượng sản phẩm cuối Trong trình sản xuất sữa chua, việc bổ sung chất ổn định, tăng hàm lượng protein trì hàm lượng khống chất thấp ngăn cản trình tổng hợp sữa chua Việc kiểm sốt q trình tổng hợp cách sử dụng chủng khởi động sản xuất EPS giải pháp rõ ràng Ứng dụng sản phẩm thịt lên men Việc áp dụng LAB sản xuất thịt có từ thời tiền sử làm phát sinh nhiều loại thực phẩm truyền thống toàn giới Hiện nay, Lactobacillus Pediococcus nay, chi LAB sử dụng phổ biến để tăng tính an tồn thực phẩm cách giảm nồng độ vi khuẩn địa sản phẩm thịt sống thơng qua việc hình thành axit lactic axit axetic, cạnh tranh dinh dưỡng trực tiếp sản xuất bacteriocin Các q trình góp phần vào độ ẩm, kết cấu màu sắc sản phẩm thịt Các nghiên cứu chứng minh sản xuất EPS LAB cách tiếp cận đầy hứa hẹn việc cải thiện kết cấu sản phẩm thịt Tuy nhiên, nhiều trở ngại cần phải vượt qua trước việc sử dụng rộng rãi LAB tổng hợp EPS trở thành thực cơng nghiệp Ví dụ, chất lượng thực phẩm cao đồng đảm bảo sản xuất EPS LAB trì phạm vi nồng độ định, xác định rõ ràn Ứng dụng đồ uống có nguồn gốc từ thực vật Mối quan tâm đến chế độ ăn chay ăn chay tăng lên năm gần Các vấn đề liên quan đến sức khỏe (ví dụ dị ứng protein sữa khơng dung nạp lactose) tính bền vững mối quan tâm đạo đức dẫn đến xuất chế độ ăn khơng có thịt sữa Mặc dù có gia tăng đáng kể việc sản xuất tiêu thụ sản phẩm thay sữa có nguồn gốc thực vật, thách thức để sản xuất sản phẩm có hương vị kết cấu người tiêu dùng chấp nhận LAB tổng hợp EPS đóng vai trò thiết yếu thực phẩm lên men từ thực vật, chẳng hạn đồ uống sữa chua chất thay mát, polysaccharide hình thành cải thiện đặc tính kết cấu cảm quan kéo dài thời hạn sử dụng sản phẩm có nguồn gốc thực vật Do đó, việc khai thác sản xuất EPS chỗ nhà sản xuất thực phẩm có nguồn gốc thực vật, ví dụ ngũ cốc, đặc biệt quan tâm nhằm mục đích đạt kết cấu tốt sản phẩm sữa lên men Ứng dụng sản xuất bánh mỳ EPS LAB tạo sử dụng tiệm bánh nhiều thập kỷ Ban đầu, dextran hydrocolloid có đặc tính làm đặc thêm vào bột chua Gần đây, việc sử dụng văn hóa tổng hợp EPS thu hút quan tâm ngày tăng từ ngành cơng nghiệp bánh mì, chủ yếu liên quan đến việc sản xuất sản phẩm không chứa gluten vốn coi thành phần quan trọng tạo nên cấu trúc chất lượng bánh mì Tổng kết Ngày có nhu cầu loại bỏ việc sử dụng thành phần nhân tạo phụ gia ngành cơng nghiệp thực phẩm Do đó, chất phụ gia thực phẩm tự nhiên trở nên phổ biến năm gần nhu cầu người tiêu dùng sản phẩm tự nhiên an toàn Nhờ đặc tính lưu biến chức cơng nghệ chúng, EPS vi sinh vậtcó thể thay có giá trị để cải thiện đặc tính hóa lý sản phẩm thực phẩm Tùy thuộc vào thành phần monome, loại liên kết, số lượng độ dài chuỗi bên, trọng lượng phân tử, EPS thay đổi đặc tính thực phẩm theo nhiều cách khác Danh mục tài liệu tham khảo [1]- Daba, Elnahas, & Elkhateeb, 2021 ; Hassan, 2008 ; Mende et al., 2016 [2]- https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0924224421001151 [3] Nghiên cứu thu nhận, khảo sát cấu trúc tính chất Exopolysaccharide sinh tổng hợp từ Lactobacillus fermentum- Luận án tiến sỹ - Trần Thị Ái Luyến [4]- ‘Ropy’ phenotype, exopolysaccharides and metabolism: Study on food isolated potential probiotics-LAB Microbiological Research, 214 (2018) [5]- Effect of exopolysaccharide produced by isogenic strains of Lactococcus lactis on halffat Cheddar cheese- Journal of Dairy Science, 93 (2010) [6]- https://www.longdom.org/open-access/food-and-health-applications-ofexopolysaccharides-produced-by-lactic-acid-bacteria-2329-888X-1107.pdf?fbclid=IwAR3GK3fVNoLS4lQJxzSWdYsvMTIXJtoQI0rX6up8uuwa9tZlm8DXN OvmiR ... Phần VI Ứng dụng vào sản phẩm thực phẩm phổ biến thị trường 25 Ứng dụng vào sản phẩm sữa 25 Ứng dụng sản phẩm thịt lên men 25 Ứng dụng đồ uống có nguồn gốc từ thực vật... VI Ứng dụng vào sản phẩm thực phẩm phổ biến thị trường Ứng dụng vào sản phẩm sữa EPS có nguồn gốc từ LAB sử dụng rộng rãi ngành công nghiệp sữa Trong thập kỷ gần đây, chủng khởi động từ sữa tổng. .. chúng ứng dụng sản phẩm thực phẩm; đặc biệt sản phẩm lên men từ sữa, kem, qua góp phần hồn thiện cấu trúc sản phẩm Chẳng hạn như, sản phẩm loại sốt có chứa chất béo, khả giữ dầu PS có mặt sản phẩm