BƢỚC đầu xây DỰNG QUY TRÌNH NHUỘM NHIỄM sắc THỂ TRÊN tế bào máu THỎ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC  KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP BƢỚC ĐẦU XÂY DỰNG QUY TRÌNH NHUỘM NHIỄM SẮC THỂ TRÊN TẾ BÀO MÁU THỎ Ngành học: CƠNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa : 2003 - 2007 Sinh viên thực hiện: MAI MINH MẪN Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 09/2007 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC  BƢỚC ĐẦU XÂY DỰNG QUY TRÌNH NHUỘM NHIỄM SẮC THỂ TRÊN TẾ BÀO MÁU THỎ Giáo viên hƣớng dẫn Sinh viên thực THS HỒ THỊ NGA MAI MINH MẪN BSTY NGUYỄN KIÊN CƢỜNG Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 09/2007 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com LỜI CẢM TẠ Con xin gửi đến Ba Má lịng thành kính ghi ơn Con kính chúc Ba Má sức khỏe, ln phấn đấu để trở thành ngƣời có ích cho xã hội để không phụ công dƣỡng dục Ba Má Tôi xin chân thành gửi lời cảm ơn đến: * Ban giám hiệu Trƣờng Đại Học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh, Ban Chủ Nhiệm Bộ Mơn Cơng Nghệ Sinh Học tất quý thầy cô tận tụy truyền đạt kiến thức quý báu cho suốt thời gian học tập trƣờng * ThS Hồ Thị Nga, BSTY Nguyễn Kiên Cƣờng, trực tiếp hƣớng dẫn giúp đỡ suốt thời gian thực đề tài tốt nghiệp * PGS.TS Trần Thị Dân, KS Nguyễn Văn Út giúp đỡ nhƣ động viên lúc tơi gặp khó khăn * TS Dƣơng Nguyên Khang thầy cô Khoa Chăn Nuôi Thú Y tạo điều kiện để hoàn thành tốt đề tài * Thầy Đinh Xuân Phát, Cô Quách Tuyết Anh dành thời gian quý báu để cung cấp cho tài liệu, kinh nghiệm quý báu * Cùng toàn thể lớp CNSH29 hỗ trợ, giúp đỡ động viên suốt thời gian học tập trƣờng Sinh viên thực MAI MINH MẪN iii LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com TĨM TẮT MAI MINH MẪN, Đại học Nơng Lâm Tp Hồ Chí Minh Tháng 8/2007 “BƢỚC ĐẦU XÂY DỰNG QUY TRÌNH NHUỘM NHIỄM SẮC THỂ TRÊN TẾ BÀO MÁU THỎ” Giáo viên hƣớng dẫn: ThS Hồ Thị Nga BSTY Nguyễn Kiên Cƣờng Đề tài đƣợc thực Phòng thí nghiệm Sinh lý Khoa Chăn Ni Thú Y, Đại Học Nơng Lâm Tp Hồ Chí Minh đối tƣợng thỏ Nhiễm sắc thể yếu tố ảnh hƣởng đến di truyền giống loài Xây dựng đƣợc kiểu nhân loài bƣớc đầu cho việc nghiên cứu sâu chế di truyền lồi Phƣơng pháp hiệu nghiên cứu kiểu nhân nuôi cấy tế bào bạch cầu máu nhuộm Máu thỏ nuôi cấy với hai liều lƣợng 0,4 ml ml môi trƣờng RPMI 1640 có bổ sung số chất giúp cho sinh trƣởng phát triển tế bào nhƣ huyết phơi bị (FBS), Pokeweed (lectin), kháng sinh antimycotic – antibiotic Mẫu máu đƣợc nuôi cấy chủ yếu chai Rough 72 37 0C tủ ấm CO2 Sau 72 giờ, cho thêm 40 µl colcemid vào môi trƣờng ủ theo ba mức thời gian 20 phút, 40 phút 60 phút trƣớc xử lý để nhuộm Bên cạnh ống nghiệm 15 ml đƣợc sử dụng để nuôi cấy thử nghiệm Kết cho thấy nuôi cấy 1ml máu thỏ với môi trƣờng RPMI 1640 72 37 0C ủ với colcemid thời gian 60 phút thu đƣợc tế bào giai đoạn trung kỳ nhiều Ngồi ra, ni cấy máu thỏ với ống nghiệm 15 ml thu đƣợc tế bào giai đoạn trung kỳ Mặc dù vậy, chƣa xây dựng đƣợc kiểu nhân (karyotype) nhiễm sắc thể thỏ nhiễm sắc thể chƣa trãi nhuộm iv LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com SUMMARY MAI MINH MAN, Nong Lam University, August 2007 “THE INITIAL STEP OF SETTING UP STAINING RABBIT PERIPHERAL BLOOD CHROMOSOME PROCESS” Supervisors HO THI NGA, MSc NGUYEN KIEN CUONG, DMV A study was carried out on rabbit chromosome at physiology laboratory of Faculty of Animal Science and Veterinary Medicine, Nong Lam University Ho Chi Minh City Chromosome is an element which affects the species genetics Setting up karyotype of species is the initial step of researching extendedly into species’ genetic mechanism The most effective researching karyotype method is that culturing and staining lymphocyte Rabbit peripheral blood (anticoagulated by heparin) was cultured with two dosages, 0,4 ml and ml It was cultured in RPMI 1640 medium which supplements some mitogenic agents: fetal bovine serum (FBS), pokeweed (lectin), antimycotic – antibiotic Blood cell was cultured primarily in Rough vase for 72 hours at 37 0C In addition, 15 ml falcon tubes were also used to culture After 72 hours, we added colcemid to medium and incubate in 20 min, 40 and 60 before the cell was fixed The best result was that culturing ml rabbit peripheral blood and incubating with colcemid in 60 Besides, the cells also grew and divided when they were cultured in 15 ml falcon tubes So that, we could replace Rough vase with 15 ml falcon tubes in culturing blood leukocytes However, we haven’t established rabbit karyotype yet because chromosome didn’t spread on slides v LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com MỤC LỤC Trang Lời cảm tạ iii Tóm tắt iv Summary v Mục lục vi Danh sách chữ viết tắt .ix Danh sách bảng x Danh sách hình xi Chƣơng MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu yêu cầu 1.2.1 Mục tiêu 1.2.2 Yêu cầu Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan thỏ 2.1.1 Phân loài 2.1.2 Một số đặc điểm sinh lý 2.1.3 Đặc điểm máu thỏ 2.2 Nhiễm sắc thể 2.2.1 Khái niệm 2.2.2 Hình thái kích thƣớc 2.2.3 Số lƣợng nhiễm sắc thể 2.2.4 Cấu trúc nhiễm sắc thể 2.2.4.1 Cấu trúc hiển vi nhiễm sắc thể ………………………….6 2.2.4.2 Cấu trúc siêu vi nhiễm sắc thể 2.3 Chu Kỳ sống tế bào 2.3.1 Gian kỳ vi LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 2.3.1.1 Pha G1 10 2.3.1.2 Pha S 10 2.3.1.3 Pha G2 10 2.3.1.4 Phân bào 10 2.3.2 Nguyên phân 11 2.3.2.1 Đặc điểm nguyên phân 11 2.3.2.2 Các kỳ phân bào 12 2.4 Sơ lƣợc kỹ thuật nghiên cứu nhiễm sắc thể 14 2.4.1 Kỹ thuật splash 14 2.4.2 Kỹ thuật squash 16 2.5 Nghiên cứu kiểu nhân nhiễm sắc thể thỏ 16 Chƣơng NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 20 3.1 Thời gian địa điểm 20 3.2 Đối tƣợng 20 3.3 Nội dung nghiên cứu 20 3.4 Vật liệu hóa chất 20 3.4.1 Thiết bị 20 3.4.2 Dụng cụ 21 3.4.3 Hóa chất 21 3.5 Bố trí thí nghiệm 23 3.5.1 Thí nghiệm 23 3.5.2 Thí nghiệm 23 3.5.3 Thí nghiệm 24 3.5.4 Chỉ tiêu quan sát 24 3.6 Phƣơng pháp tiến hành 24 3.6.1 Phƣơng pháp lấy máu thỏ 24 3.6.1.1 Phƣơng pháp lấy máu tim 24 3.6.1.2 Phƣơng pháp lấy máu động mạch tai 24 3.6.2 Phƣơng pháp nuôi cấy tế bào máu 25 vii LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 3.6.3 Kỹ thuật nhuộm nhiễm sắc thể 26 3.6.3.1 Kỹ thuật trãi nhiễm sắc thể 26 3.6.3.1 Nhuộm nhiễm sắc thể với giemsa 27 3.7 Xử lý số liệu 27 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28 4.1 Kết nhuộm theo thời gian ủ với colcemid 28 4.2 Kết nhuộm theo lƣợng máu nuôi cấy 29 4.3 Kết nuôi cấy thử nghiệm ống ly tâm 15ml 31 4.4 Một số nguyên nhân ảnh hƣởng tới kết nuôi cấy nhuộm 35 CHƢƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 38 5.1 Kết luận 38 5.2 Đề nghị 38 CHƢƠNG TÀI LIỆU THAM KHẢO 39 viii LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT ADN Acid deoxyribonucleotide ARN Acid ribonucleotide Ctv Cộng tác viên IU International unit FBS Fetal bovine serum NST Nhiễm sắc thể PHA Phytohemaglutinin PBS Phosphate buffer saline ix LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com DANH SÁCH CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1 Số lƣợng nhiễm sắc thể số loài Bảng 1.2 Đặc điểm băng nhiễm sắc thể thể 17 Bảng 3.1 Môi trƣờng nuôi cấy 0,4 ml máu 22 Bảng 4.1 Kết nhuộm theo thời gian ủ với colcemid 28 Bảng 4.2 Kết nhuộm theo lƣợng máu nuôi cấy 30 Bảng 4.3 Kết nuôi cấy chai Rough ống nghiệm 15 ml 32 x LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 27 Bƣớc 8: Sau đem ủ 15 phút 40C, ly tâm bỏ nhƣ bƣớc Bƣớc 9: Lặp lại trình cố định bƣớc - ba lần Chỉ trộn nhẹ không cần ủ lạnh lần ly tâm Cuối ta thu đƣợc lƣợng bạch cầu 0,5 ml dung dịch cố định Bƣớc 10: Sau lần ly tâm cuối cùng, ta thu đƣợc lƣợng bạch cầu 0,5 ml dung dịch cố định Dùng pipette Pasteur hút 50 µl dịch tế bào, đặt pipette vng góc với phiến kính khoảng cách 60 cm, sau nhỏ giọt xuống phiến kính Thao tác giúp cho NST trải mặt phiến kính Chú ý: phiến kính phải phải đặt -200C 30 phút trƣớc sử dụng 3.6.3.2 Nhuộm nhiễm sắc thể với giemsa Sau trải tế bào phiến kính, để phiến kính khơ tự nhiên nhiệt độ phịng Ngâm phiến kính vào dung dịch nhuộm 15 phút, rữa nhẹ nƣớc sau để khơ xem dƣới kính vi độ phóng đại 1000 lần Hình ảnh nhiễm sắc thể đƣợc chụp lại xử lý phần mềm photoshop 3.7 Xử lý số liệu Mặc dù bố trí thí nghiệm ngẫu nhiên yếu tố, chúng tơi khơng xử lý thống kê mà nhận định tỷ lệ thành cơng cịn thấp LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 28 Chƣơng KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Kết nhuộm theo thời gian ủ với colcemid Sau nuôi cấy 72 để tế bào lympho máu thỏ đạt giai đoạn trung kỳ, bình ni cấy đƣợc cho thêm 40 µl colcemid (10 µl/ml) đem ủ ba mức thời gian 20, 40, 60 phút để chọn thời gian ủ tối ƣu Kết nhuộm theo thời gian ủ với colcemid đƣợc trình bày bảng 4.1 Bảng 4.1: Số lƣợng tế bào đạt trung kỳ theo thời gian ủ colcemid Thời gian 20 phút 40 phút 60 phút Số mẫu 10 10 10 Số mẫu thành công Số phiến kính quan sát 60 60 60 Số phiến kính thành cơng Tỷ lệ phiến kính thành cơng (%) 6,66 13,33 Số tế bào thành công 17 Từ kết trên, chúng tơi nhận thấy q trình ủ mẫu máu ni cấy với 40 µl colcemid thời gian 20 phút khơng có mẫu thành cơng, nhƣng kéo dài thời gian ủ đến 40 phút có hai mẫu thành cơng 60 phút có tới bốn mẫu thành cơng Nhƣ vậy, ngâm tế bào với colcemid thời gian dài tỷ lệ mẫu nhuộm thành công nhiều Mỗi mẫu nuôi cấy đƣợc trải sáu phiến kính Các phiến kính đƣợc nhuộm với giemsa % đọc dƣới kính hiển vi có độ phóng đại 1000 lần để quan sát NST giai đoạn trung kỳ LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 29 Kết cho thấy số lƣợng phiến kính thành cơng số tế bào giai đoạn trung kỳ ủ với colcemid thời gian 60 phút nhiều (8 phiến kính 17 tế bào thành cơng) Trong đó, ủ với colcemid thời gian 40 phút số phiến kính thành cơng có số tế bào thành cơng có Nhƣ vậy, kéo thời gian ủ colcemid tế bào bạch cầu thỏ, tác động phá hủy thoi vô sắc colcemid mạnh hơn, nên số lƣợng tế bào bị phá hủy thoi vô sắc nhiều Dẫn đến số lƣợng tế bào thu đƣợc trung kỳ nhiều Trong ba mức ủ thời gian với colcemid 20 phút, 40 phút 60 phút 60 phút cho kết tốt Nhƣng theo chúng tôi, thời gian nhƣ chƣa tối ƣu cho tế bào máu thỏ, cần khảo sát thêm nồng độ thời gian ủ colcemid tế bào máu thỏ Theo Kannan ctv (2006) nuôi cấy bạch cầu máu thỏ, ủ colcemid với nồng độ 10 µg/ml thời gian 90 phút thu đƣợc nhiều tế bào trung kỳ Parkányi ctv (2004) ủ tế bào với colcemid 90 phút nhƣng nồng độ colcemid giảm nhiều có 0,6 µg/ml tỷ lệ thành công cao Nồng độ thời gian colcemid thay đổi theo loại tế bào, theo kinh nghiệm hóa chất phịng thí nghiệm Nhƣ Sarkar ctv (1962) tiến hành nuôi cấy lớp tế bào giác mạc tế bào phổi thỏ ủ tế bào với colcemid nồng độ 10 µg/ml 10 đến 16 giờ, Korstanje ctv (2003) nuôi cấy tế bào phổi thỏ với nồng độ colcemid 0,1 µg/ml thời gian ủ đạt đƣợc kết cao 4.2 Kết nhuộm theo lƣợng máu Trong q trình ni cấy, thành phần dinh dƣỡng yếu tố tối quan trọng cho kết ni cấy Vì ni cấy in vtro, tế bào sinh trƣởng phát triển hay không phụ thuộc nhiều vào điều kiện mơi trƣờng Do chúng tơi tiến hành nuôi cấy thử nghiệm lƣợng máu với hai mức độ 0,4 ml ml để khảo sát nồng độ dinh dƣỡng cần thiết Kết thu đƣợc trình nhuộm thể qua bảng 4.2 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 30 Bảng 4.2 Kết nhuộm theo lƣợng máu nuôi cấy Lƣợng máu 0,4 ml ml Số mẫu 15 15 Số mẫu thành cơng 3 Số phiến kính quan sát 90 90 Số phiến kính thành cơng 3,33 10 18 Tỷ lệ phiến kính thành cơng (%) Số tế bào thành công Chúng tiến hành nuôi cấy theo hai nồng độ máu khác nhau, kết nuôi cấy với lƣợng máu 0,4 ml ml có số lƣợng mẫu thành cơng ba Mỗi mẫu nuôi cấy đƣợc trải sáu phiến kính, nhuộm màu với giemsa % xem dƣới kính hiển vi độ phóng đại 1000 lần Kết cho thấy nuôi cấy mẫu máu 0,4 ml số phiến kính thành cơng có ba, số tế bào trung kỳ (5 tế bào) Nhƣng tăng lƣợng máu số phiến kính thành cơng lại tăng lên phiến kính số lƣợng tế bào thu đƣợc trung kỳ 18 Trên lý thuyết, lƣợng máu hơn, tế bào nhận đƣợc nhiều dinh dƣỡng hơn, giúp cho trình phân bào đƣợc tốt Đặc biệt mẫu máu đƣợc nuôi cấy môi trƣờng RPMI 1640 môi trƣờng nuôi cấy tốt cho tế bào máu (Kannan ctv, 2006) Bên cạnh đó, Parkányi ctv (2004); Kannan ctv (2006) tiến hành nuôi cấy với lƣợng máu 0,25 ml 0,3 ml ml RPMI 1640 thu đƣợc nhiều tế bào trung kỳ Kết chúng tơi có khác biệt, mẫu máu ml nuôi cấy lại cho kết tốt mẫu máu 0,4 ml Kết q trình lấy máu, chúng tơi sử dụng ống có tráng sẵn heparin Do chúng tơi khơng xác định đƣợc nồng độ heparin thích hợp, nên q trình ni cấy máu dễ bị đơng trở lại Vì số lƣợng bạch cầu thu lại q trình ni cấy bị nhiều dẫn đến tỷ lệ thành công nuôi cấy 0,4 ml máu thấp nuôi cấy 1ml máu số lƣợng bạch cầu LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 31 Do đó, chúng tơi bổ sung thêm heparin vào ống kháng đông có tráng sẵn heparin kết ni cấy máu không bị đông Chúng thu nhiều tế bào bạch cầu phiến kính, nhƣng số lƣợng bạch cầu thu đƣợc trung kỳ thấp Điều chúng tơi khơng xác định lƣợng heparin thích hợp bổ sung vào ống tráng sẵn heparin Vì heparin ảnh hƣởng khơng tốt đến kết ni cấy Theo Eldridge (1985) lƣợng kháng đơng heparin thích hợp 14,3 IU/ml máu, Margre ctv (1992) cho 10 – 20 IU/ml máu thích hợp Một yếu tố ảnh hƣởng đến kết nuôi cấy bổ sung 10% FBS môi trƣờng nuôi cấy Với hàm lƣợng FBS có lẽ chƣa đủ thích hợp tế bào máu thỏ, điều làm ảnh hƣởng đến phát triển bạch cầu Theo George (1994), Parkányi ctv (2004); Kannan ctv (2006), nuôi tế bào môi trƣờng RPMI 1640 bổ sung FBS 20 %, kết thu nhiều tế bào trung kỳ Mặt khác, tác giả khác nuôi cấy tế bào để nghiên cứu NST dùng chất kích thích phân bào PHA cịn chúng tơi sử dụng Pokeweed Trên thực tế PHA đƣợc sử dụng phổ biến Pokeweed So PHA khả làm lắng tụ hồng cầu nhƣ kích thích tế bào bạch cầu phân chia Pokeweed yếu (Margre ctv, 1993) Vì ảnh hƣởng khơng tốt đến kết nuôi cấy 4.3 Kết nuôi cấy thử nghiệm ống ly tâm 15ml Hầu hết tế bào động vật phát triển in vivo bám vào cấu trúc mô liên kết, màng hay chất khống nhƣ xƣơng Vì nuôi cấy tế bào động vật in vitro phải sử dụng bình thủy tinh hay chai Rough có tráng lớp bám dính giúp tế bào phát triển Nhƣng theo Phan Kim Ngọc Phạm Văn Phúc (2006), trình ni cấy in vitro tế bào máu khơng cần lớp bám dính nhƣ dịng tế bào khác phát triển tốt mơi trƣờng huyền phù Vì chúng tơi tiến hành ni cấy thử nghiệm ống nghiệm 15ml theo quy trình ni cấy ml máu 72 giống chai Rough Kết thu đƣợc theo bảng 4.3 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 32 Bảng 4.3 Kết nuôi cấy chai Rough ống nghiệm 15 ml Thiết bị Chai Rough Ống nghiệm 15 ml Số lần lập lại 3 Thành công 2 Số phiến kính quan sát 18 18 Số phiến kính thành cơng 33,33 22,22 14 Tỷ lệ phiến kính thành công (%) Số tế bào thành công Kết sau thời gian nuôi cấy nhuộm, khả nuôi cấy thành công ống nghiệm 15 ml chai Rough nhƣ (số mẫu thành công hai) Khi quan sát số phiến kính thành cơng ni ống nghiệm 4, cịn chai Rough Nhƣng số tế bào thành công ống nghiệm 15 ml thấp (5 tế bào trung kỳ) so với chai Rough (14 tế bào thành cơng) Có thể ni cấy ống 15 ml, thể tích mơi trƣờng máu chiếm 2/3 thể tích bình Mặc dù mơi trƣờng có Hepes giúp cung cấp lƣợng CO2 q trình ni cấy chúng tơi khơng đóng chặt nắp có lắc hai lần ngày Nhƣng khơng khí chiếm thể tích thấp (1/3 thể tích) diện tích mặt phẳng tiếp xúc tế bào với khơng khí nhỏ ni cấy ống nghiệm 15 ml so với chai Rough Điều làm khơng ổn định lƣợng khí pH cần thiết cho tế bào, nên kết số lƣợng tế bào thu đƣợc ống nghiệm không nhiều Tuy nhiên, kết bƣớc đầu cho việc dùng ống nghiệm 15 ml thay cho chai Rough nuôi cấy tế bào Việc ứng dụng ống nghiệm 15 ml nuôi cấy tế bào máu tiết kiệm đƣợc giá thành Vì ống nghiệm 15 ml có giá thành rẻ hơn, xử lý dễ dàng nhƣ tái sử dụng lại nhiều lần để nuôi cấy tế bào máu Ngồi ra, ni cấy với hàm lƣợng kháng đông nhƣ nhau,máu ống 15 ml bị đông nuôi cấy chai Rough, nên thu đƣợc nhiều bạch cầu Có thể lớp bám dính tráng lịng chai Rough làm hồng cầu lắng xuống bám dính lại, dễ gây đông máu LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 33 NST nuôi cấy chai Rough NST ni cấy ống nghiệm 15 ml Hình 4.1 Nhiễm sắc thể nhuộm với giemsa (X 1000) Sau nhuộm chụp ảnh lại, dựa tỷ lệ chiều dài cánh p q NST xác định nhuộm sắc thể thỏ gồm kiểu hình: Metacentric, acrocentric, submetacentric, subtelocentric telocentric Kết giống với công trình nghiên cứu trƣớc nhƣ Robson Shaver (1979), Parkányi ctv (2004) D B E A – Metacentric B – Submetacentric A C – Subtelocentric D –Telocentric C E – Acrocentric Hình 4.2 Hình dạng nhiễm sắc thể thỏ (X 1000) Chúng ghi nhận lại đƣợc đặc điểm chu kỳ phân bào tế bào bạch cầu quan sát dƣới kính hiển vi Chúng nhận thấy hầu nhƣ tế bào giai đoạn gian kỳ, đặc biệt ủ colcemid thời gian 20 phút LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 34 Gian kỳ Trung kỳ sớm Hậu kỳ Tiền kỳ Trung kỳ Mạt kỳ Hình 4.3 Chu kỳ phân chia tế bào bạch cầu (X 1000) 4.4 Một số nguyên nhân ảnh hƣởng tới kết nuôi cấy nhuộm Chúng chƣa thể xác định đƣợc số lƣợng nhƣ xây dựng kiểu nhân nhiễm sắc thể thỏ số tế bào giai đoạn trung kỳ thấp, NST chƣa rải phiến kính Kết nhuộm khơng tốt số yếu tố sau: LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 35 a) Thao tác lấy máu Việc lấy máu ảnh hƣởng lớn đến kết nuôi cấy Khi lấy máu tim, lƣợng máu lấy đƣợc nhiều nhanh lấy máu động mạch tai Vì máu nhanh chóng đƣợc hịa tan với chất kháng đơng hơn, q trình ni cấy mẫu máu bị đơng so với lấy máu động mạch tai Tuy nhiên việc lấy máu tim địi hỏi ngƣời lấy phải có kinh nghiệm khơng dễ gây chết thỏ Ngồi vấn đề vô trùng lúc lấy máu ảnh hƣởng đến kết nuôi cấy Máu môi trƣờng ngồi khó bảo đảm điều kiện vơ trùng, mặt khác máu sau lấy xong xử lý vơ trùng nhƣ lọc hay hấp Vì mẫu máu dễ bị nhiễm khuẩn lấy Khi bị nhiễm tế bào nuôi cấy bị cạnh tranh nguồn dinh dƣỡng vi khuẩn Vì thời gian để tế bào động vật nhân đôi chậm (khoảng 20 – 40 giờ), thời gian để vi khuẩn nhân đôi Mặt khác tế bào động vật tồn dạng cô lập, chúng khơng sống đƣợc khơng đƣợc cung cấp môi trƣờng phức hợp Nếu bị nhiễm, môi trƣờng thay đổi, tế bào chết bị phá hủy b) Chất kháng đông Hàm lƣợng kháng đông ảnh hƣởng nhiều đến q trình ni cấy Chúng tơi sử dụng ống có tráng lớp kháng đơng sẵn, nhƣng sau lần nuôi nhận thấy máu dễ bị đông Khi hàm lƣợng kháng đông không đủ máu cấy bị đông lại số lƣợng bạch cầu bị nhiều không tìm thấy tế bào giai đoạn metaphase Ngồi mẫu nuôi cấy bị đông ảnh hƣởng nhiều đến trình đồng mẫu, làm tế bào kết dính khơng tách ra, đồng mẫu không đủ lực học làm vỡ màng nhân, giải phóng NST c) Thao tác ni cấy phịng thí nghiệm Tủ cấy dụng cụ thao tác phải đƣợc chiếu tia UV trƣớc lần thực hiện, tất dụng cụ phải đƣợc sát trùng cẩn thận trƣớc mang vào phòng cấy tủ cấy vô trùng.Chú ý lắc môi trƣờng mẫu máu đƣa vào môi trƣờng LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 36 Giai đoạn đầu ni cấy khơng thành cơng thao tác đƣa máu vào môi trƣờng lắc không đƣợc đều, kết tế bào không tan môi trƣờng làm chúng đông lại tạo lớp tế bào máu bề mặt môi trƣờng Do chúng tơi bị nhiều tế bào, nên kết không tốt Khi lắc đều, tế bào máu trải nằm dƣới đáy chai Rough e) Thời gian ngâm dung dịch nhƣợc trƣơng Chúng tiến hành ngân dung dịch nhƣợc trƣơng 15 phút bồn ủ nhiệt tiến hành ly tâm 10 phút, tổng thời gian 25 phút Với thời gian này, nhận thấy số tế bào màng nhân cịn, NST khơng thể phóng thích đƣợc trải Nhƣ Hayes (2002) Kannan (2006) nhiều protocol khác có tổng thời gian ngâm với dung dịch nhƣợc trƣơng 30 phút Màng nhân chƣa bị vỡ Hình 4.4 Nhân tế bào bạch cầu thỏ chƣa vỡ (X 1000) f) Thao tác trải nhiễm sắc thể Các nhiễm sắc thể trung kỳ cố định phiến kính khơng trải nhƣ mong nuốn Có thể mẫu ni cấy bị đơng, làm tế bào kết dính lại, nhỏ xuống phiến kính khó phân tách Một ngun nhân nhỏ giọt dung dịch chƣa nhân tế bào bạch cầu, tiến hành với độ cao 40 – 60 cm Có thể mơi trƣờng thí nghiệm tế bào máu thỏ độ cao chƣa thích hợp LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 37 Hình 4.5 Nhiễm sắc thể khơng trải đêu phiến kính (X 1000) d) Thiết bị thí nghiệm Độ phóng đại kính hiển vi độ phân giải máy ảnh yếu tố ảnh hƣởng lớn đến kết Ban đầu chúng tơi chụp hình máy kỹ thuật số, hình thu đƣợc mờ khó nhận dạng nhiễm sắc thể Khi chuyển sang chụp máy ảnh có gắn trực tiếp lên kính hiển vi ảnh đẹp quan sát nhiễm sắc thể rõ LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 38 Chƣơng KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận ‫ ־‬Quy trình ni cấy 1ml máu thỏ thời gian 72 37 0C để nhuộm nhiễm sắc thể cho kết tốt ‫ ־‬Ủ tế bào sau nuôi cấy với colcemid 60 phút trƣớc đem nhuộm thu đƣợc nhiều tế bào giai đoạn trung kỳ ‫ ־‬Ống nghiệm 15 ml sử dụng ni cấy tế bào máu nghiên cứu nhiễm sắc thể 5.2 Đề nghị ‫ ־‬Thử nghiệm nồng độ kháng đơng heparin thích hợp ‫ ־‬Khảo sát thêm thời gian ngâm colcemid tới bào thỏ ‫ ־‬Khảo sát thêm nồng độ FBS môi trƣờng nuôi cấy ‫ ־‬Tiếp tục xây dựng kiểu nhân (karyotype) thỏ xác định số lƣợng NST thỏ LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 39 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Dƣơng Nguyên Khang, 2006 Sinh lý thể dịch Sinh lý vật nuôi (PGS.TS Trần Thị Dân, TS Dƣơng Nguyên Khang) Nhà xuất nông nghiệp Trang 89 109 Nguyễn Nhƣ Hiền, 2005 Sinh học phân tử tế bào sở khoa học công nghệ sinh học Nhà xuất giáo dục, Hà Tây Trang 133 - 192 Phan Kim Ngọc Phạm Văn Phƣớc, 2006 Nuôi cấy tế bào động vật Công nghệ sinh học người động vật Nhà xuất giáo dục Trang 92 - 149 Trịnh Văn Thịnh, 1978 Cơ thể sinh lý gia súc Sổ tay thực hành chăn nuôi thú y Nhà xuất nông nghiệp Trang - 36 TÀI LIỆU TIẾNG NƢỚC NGOÀI Eldridge F E., 1985 Laboratory Procedures for chromosome studies Cytogenetic of liverstock The avi publishing company, United States of America 93 – 112 Ford C E., Pollock D.L., and Gustavsson I., 1980 Proceedings of the first international conference for the standardisation of banded karyotypes of domestic animals Hereditas 92: 158 - 160 Hayes H., Rogel-Gaillard C., Zijlstra C., Haan de A N., C U., Bourgeaux N., Bertaud M., and Bosma A A., 2002 Establishment of R-banded rabbit karyotype nomenclature by FISH lacalization of 23 chromosome-speccific genes on both G-and R-band chromosome Cytogenet Genome Res 98: 199 - 205 Kannan T P., Quah B B., Azlina A., and Samsudin A R.,2006 Mitotic index and chromosomal analyses for hydroxyapatide Archives of Orofacial Sciences 1: 15 - 20 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 40 10 Korstanje R., Gillissen G F., Versteeg S A., Van OOST B A., Bosma A A., Gaillard C R., Van Zutphen L F M., and Van Lith H A., 2003 Mapping of rabbit microsatellite markers using chromosome specific libraries Journal of heredity 94: 161 – 169 11 Nicolai Pand Shaver E L, 1977 The Chromosome complement of rabbit blastocysts resulting from spermatozoa stored at 50C Biology of reproduction 17: 640 -646 12 Parkányi V., Chrenek P., Rafay J., Suvegová K., Jurcík R., Makarevich A V., Pivko J., Hetényi L., and Paleyanda R K., 2004 Aneuploid in the transgenic rabbit Folia Biologica (Praha) 50: 194 - 199 13 Robson K E., and Shaver E L., 1979 The chromosome complement of rabbit blastocyst resulting from spermatozoa stored in vitro at -196 0C Biology of reproduction 20: 516 - 522 14 Sarkar P., Basu P K., and Miller I., 1962 Karyologic studies on cells from rabbit cornea and other tissues growm in vitro Investigative Ophthalmology 1: 33 – 40 15 Seabright M., 1971 A rapid banding technique for human chromosomes Lancet 2: 971 – 972 TÀI LIỆU THAM KHẢO TRÊN MẠNG George S., 1994 Mitotic metaphase chromosome preparation from peripheral blood for high resolution http://biomed.humanapress.com/index.php?option=com_opbookdetails&tas k=chapterdetails&category=biomedprotocols&chapter_code=0-89603-289-2:1 Herbert C M., 1993 Working with animal chromosome http://books.google.com.vn/books?id=n97sOVn9iH8C&printsec=toc&dq= working+with+animal+chromosome&psp=1&hl=en#PPP1,M1 http://mbbnet.umn.edu/icons/chromosome.jpeg LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 41 http://www.accessexcellence.org/RC/VL/GG/images/chromosome.jpg http://medical-dictionary.thefreedictionary.com/Centromer http://fig.cox.miami.edu/~cmallery/150/proceuc/chromosome.jpg) http://kvhs.nbed.nb.ca/gallant/biology/cycle.jpg) http://fig.cox.miami.edu/~cmallery/150/mitosis/c12x5mitosis-collage.jpg LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com ... NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC  BƢỚC ĐẦU XÂY DỰNG QUY TRÌNH NHUỘM NHIỄM SẮC THỂ TRÊN TẾ BÀO MÁU THỎ Giáo viên hƣớng dẫn Sinh viên thực THS HỒ THỊ NGA MAI MINH MẪN... TẮT MAI MINH MẪN, Đại học Nơng Lâm Tp Hồ Chí Minh Tháng 8/2007 “BƢỚC ĐẦU XÂY DỰNG QUY TRÌNH NHUỘM NHIỄM SẮC THỂ TRÊN TẾ BÀO MÁU THỎ” Giáo viên hƣớng dẫn: ThS Hồ Thị Nga BSTY Nguyễn Kiên Cƣờng... cầu thực tế, đƣợc phân công Bộ môn Công Nghệ Sinh Học Trƣờng Đại Học Nông Lâm với giúp đỡ Khoa Chăn Nuôi Thú Y, thực đề tài ? ?Bƣớc đầu xây dựng quy trình nhuộm nhiễm sắc thể tế bào máu thỏ? ??, để