KHẢO SÁT LƯỢNG FETAL BOVINE SERUM VÀ PHYTOHEMAGLUTININ TRONG QUY TRÌNH NHUỘM NHIỄM SẮC THỂ TẾ BÀO MÁU THỎ VÀ MÁU HEO

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC  LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT LƯỢNG FETAL BOVINE SERUM VÀ PHYTOHEMAGLUTININ TRONG QUY TRÌNH NHUỘM NHIỄM SẮC THỂ TẾ BÀO MÁU THỎ VÀ MÁU HEO Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa: 2004 - 2008 Sinh viên thực hiện: NGUYỄN THỊ XUÂN DIỆU Tháng 9/ 2008 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC ************************ LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT LƯỢNG FETAL BOVINE SERUM VÀ PHYTOHEMAGLUTININ TRONG QUY TRÌNH NHUỘM NHIỄM SẮC THỂ TẾ BÀO MÁU THỎ VÀ MÁU HEO Giáo viên hướng dẫn: ThS HỒ THỊ NGA BSTY NGUYỄN KIÊN CƯỜNG Sinh viên thực hiện: NGUYỄN THỊ XUÂN DIỆU Tháng / 2008 LỜI CẢM ƠN Em xin chân thành cảm ơn:  Ban giám hiệu Trường Đại Học Nơng Lâm Tp Hồ Chí Minh hỗ trợ tạo điều kiện thuận lợi cho em suốt trình học tập  Các thầy cô Bộ môn Công nghệ sinh học thầy cô Khoa dạy dỗ, truyền đạt kiến thức cho em suốt thời gian em học tập trường  ThS Hồ Thị Nga, BSTY Nguyễn Kiên Cường, trực tiếp hướng dẫn giúp đỡ, tao điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành đề tài  PGS.TS Trần Thị Dân hỗ trợ, lắng nghe động viên em, cho em lời khuyên quý báo giúp đỡ em lúc em gặp khó khăn  BSTY.Hồng Thanh Hải thầy cô Khoa Chăn Nuôi Thú Y tạo điều kiện để em hoàn thành tốt đề tài  Cơ Qch Tuyết Anh dành thời gian để tìm cung cấp cho em tài liệu kinh nghiệm quý báu  Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới Cô Năm, anh Hùng anh chị công nhân trại heo hỗ trợ em q trình tiến hành đề tài  Tơi xin gởi lời cảm ơn chân thành đến bạn lớp Công Nghệ Sinh Học 30 động viên, giúp đỡ suốt thời gian làm đề tài Nguyễn Thị Xuân Diệu iii TÓM TẮT NGUYỄN THỊ XUÂN DIỆU Lớp DH04SH, Bộ môn Công Nghệ Sinh Học, Trường Đại học Nơng Lâm Tp Hồ Chí Minh Với đề tài: “Khảo sát lượng fetal bovine serum phytohemaglutinin sử dụng quy trình nhuộm nhiễm sắc thể tế bào máu thỏ máu heo” Giáo viên hướng dẫn:ThS Hồ Thị Nga, BSTY Nguyễn Kiên Cường Đề tài thực qua giai đoạn: + Giai đoạn 1: Nuôi thỏ, lấy máu thỏ để tiến hành nuôi cấy nhuộm nhiễm sắc thể Mục đích tìm hiểu quy trình nhuộm để thu tế bào bạch cầu có NST giai đoạn metaphase, chụp ảnh NST, phân lập kiểu nhân phần mềm photoshop + Giai đoạn 2: Tiến hành lấy máu heo, ni cấy nhuộm, mục đích giống thỏ Máu thỏ nuôi cấy mơi trường RPMI 1640 có bổ sung chất giúp cho sinh trưởng phát triển tế bào huyết phơi bị (FBS), phytohemaglutinin (PHA), kháng sinh antimycotic – antibiotic Mẫu máu nuôi cấy với hai mức FBS ml, 1,5 ml, hai mức PHA 80 µl, 100 µl Đối với máu heo, chúng tơi có thử nghiệm thêm mức PHA 120 µl Máu nuôi cấy 72 37 0C tủ ấm CO2 Sau 72 giờ, cho thêm 40 µl colcemid vào môi trường ủ thời gian 60 phút trước xử lý để nhuộm Kết quả: - Đối với máu thỏ + Ở mức FBS (1 ml 1,5 ml), sử dụng lượng PHA 100 µl cho kết tốt so với sử dụng 80 µl PHA nhiên khác biệt chưa rõ nét + Ở mức PHA (80 µl 100 µl), kết không khác biệt hai lượng FBS (1 ml 1,5ml) - Đối với máu heo + Ở mức FBS (1 ml 1,5 ml), kết cho thấy sử dụng PHA với lượng 120 µl tốt so với hai lượng cịn lại (80 µl 100 µl) + Đối với FBS, kết tương tự thỏ, khơng có khác biệt hai lượng FBS (1 ml 1,5 ml) sử dụng mức PHA (80,100 120 µl) - Đã phân lập kiểu nhân máu heo phần mềm photoshop phân biệt vài cặp NST đồng dạng máu thỏ iv SUMMARY NGUYEN THI XUAN DIEU Class: DH04SH, Biotechnology Department of Nong Lam University Advisor: HO THI NGA, MSc AND NGUYEN KIEN CUONG, DMV Name of thesis: “Investigating the dosages of fetal bovine serum and phytohemaglutinin for the staining methods of leukocyte chromosome in rabbit and pig” The topic consists of two stages: + Stage 1: To establish a staining proccess to obtain leukocytes which having chromosomes in metaphase stage, take photograph the choromosomes and set up the rabbit karyotype by photoshop program + Stage : To culture and stain leukocytes of pig as for rabbit bood Peripheral blood (anticoagulated by heparin) was cultured medium in RPMI 1640 supplemented some mitogenic agents: fetal bovine serum (FBS), PHA, antimycotic – antibiotic The blood samples were cultured with two dosages of FBS 0,4 ml or ml, and two dosages of PHA - 80 µl or 100 µl For pig blood, one more dosage of PHA - 120 µl was added Blood cell was cultured in Rough vase for 72 hours at 370C After 72 hours, colcemid was added to the medium that was incubated in 60 minutes before the cell was fixed The results: - Rabbit blood: + With either volume of FBS (1 ml or 1.5 ml), a dosage of 100 µl PHA was better than that of 80 µl PHA but the difference was not clear + With either volume of PHA (80 µl or 100 µl), there were not significantly difference between the result of using ml FBS or 1.5 ml FBS to culture leukocytes - Pig blood + With either volume of FBS (1 ml or 1.5 ml), when using a dosage of 120 µl PHA, the result was better than other dosages of PHA (80 µl and 100µl) + Regarding to levels of FBS, the result was similar to the that of rabbit blood - Karyotype of pig was successfully set ut by using photoshop program; however, just some pairs of rabbit chromosomes were distinguished v MỤC LỤC TRANG Lời cảm ơn iii Tóm tắt iv Mục lục vi Danh mục chữ viết tắt .viii Danh mục hình biểu đồ ix Danh mục bảng sơ đồ .xi Chương 1: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích đề tài 1.3 Yêu cầu đề tài .2 Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .3 1.1 Đặt vấn đề Máu tổ chức liên kết đặc biệt gồm hai phần huyết tương thành phần hữu hình Huyết tương gồm nước chất hoà tan, chủ yếu loại protein, ngồi cịn có chất điện giải, chất dinh dưỡng, enzym, hormon, khí chất thải Thành phần hữu hình gồm hồng cầu, bạch cầu tiểu cầu Ở động vật, khối lượng máu thay đổi theo loài Lượng máu thỏ chiếm khoảng 5,5% so với trọng lượng thể Ở heo khối lượng máu chiếm khoảng 7% - 8% trọng lượng thể Lấy máu chống đông cho vào ống nghiệm ly tâm, ta thấy máu phân thành phần rõ rệt, phần trong, vàng nhạt, chiếm 55-60% thể tích huyết tương Phần đặc màu đỏ thẫm, chiếm 40 - 45% thể tích tế bào máu Trong tế bào máu hồng cầu chiếm số lượng chủ yếu bạch cầu, tiểu cầu chiếm tỷ lệ thấp 21 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 22 3.2 Nội dung nghiên cứu 22 + Thu nhận máu thỏ máu heo, sau ni cấy để thu nhận lượng đủ tế bào lympho giai đoạn trung kì, sau tiến hành nhuộm 22 + Xem mẫu kính hiển vi để xác định hình dạng NST thỏ NST heo 22 + Xử lý photoshop để phân lập kiểu nhân tế bào thỏ heo .22 3.3 Vật liệu dụng cụ hóa chất 22 vi 3.3.1 Vật liệu 22 3.3.2 Thiết bị, dụng cụ 22 - Tủ nuôi cấy tế bào .22 - Tủ ấm 370C 22 - Tủ cấy vô trùng 22 - Tủ lạnh -200C 40C 22 - Bình rough hay ống ly tâm 15ml 22 - Đầu côn lớn nhỏ, eppendorf 22 - Máy ly tâm ống nghiệm 15ml 22 - Micro pipette 10 – 100µ 100 – 1000µ 22 - Kính hiển vi quang học 22 3.3.3 Các hóa chất sử dụng chức chúng 23 Stt 23 Hóa chất 23 Thành phần 23 Chức 23 Lượng/ 23 1ml máu 23 NUÔ 23 I CẤY 23 23 Môi trường RPMI 1640 (1X) 23 L glutamine, 25mM HEPES 500ml môi trường 23 Nuôi cấy tế bào bạch cầu, cung cấp dinh dưỡng, ổn định nồng độ CO2 5% pH cho phát triển tế bào 8ml 23 23 23 PHA 23 PHA 23 Kích thích bạch cầu phân bào 23 80µl 23 23 Huyết phơi thai bò (FBS) .23 FBS 23 vii Cung cấp protein, hấp thu ion kim loại độc 23 ml 23 23 Antibiotic – Antimycotic (100X) 23 10000 IU/ml penicilin G sodium, 10000 µg/ml streptomicin sufate, 25 µg/ml amphotericin dung dịch muối 0.85% .23 Ức chế phát triển vi khuẩn nấm gây hại cho tế bào 23 100µl 23 NHUỘM 23 23 Colcemid (10 µg/ml) 23 Colcemid 23 Phá hủy thoi vô sắc tế bào, ức chế nhân đôi centromere NST làm tế bào dừng lại giai đoạn trung kì .23 40µl 23 23 Dung dịch KCl 0.075M (nhược trương) 23 0.56g KCl 100ml nước khử ion 23 Làm tăng thể tích tế bào 23 12ml 23 23 Dung dịch cố định 23 methanol acid acetic (tỷ lệ 3/1) 23 Loại bỏ lipid biến tính protein màng làm cho màng tế bào màng nhân lỏng lẽo dễ giải phóng NST 23 33 – 44 ml 23 23 Dung dịch nhuộm 23 ml giemsa 100 ml dung dịch sorensen buffer .23 Nhuộm NST 23 23 Dung dịch sorensen buffer .23 KH2PO4 9,08/1000ml nước cất Na2HPO4 11,88/1000ml nước cất 23 Pha dung dịch nhuộm 23 viii 50ml 23 Ghi chú: PHA: phytohemaglutinin; FBS: Fetal bovine serum; RPMI: môi trường nuôi cấy tế bào động vật24 3.4 Phương pháp nghiên cứu 24 3.4.1 Cách lấy mẫu 24 * Lấy máu thỏ: máu đươc lấy máu động mạch tai 24 Đầu tiên thỏ cố định, xác định động mạch tai, sát trùng với cồn nơi cần lấy Đâm kim nhẹ vào động mạch sau dùng ngón ngón để giữ kim cố định, đồng thời rút từ từ khoảng 4ml máu, chuyển nhanh qua ống kháng đông chứa heparin, sau lắc nhẹ ống để máu trộn với heparin .24 * Lấy máu heo: máu lấy tĩnh mạch cổ 24 Đầu tiên cố định heo nằm ngửa, sau sát trùng phần cổ cồn Đâm kim vào tĩnh mạch cổ từ từ rút khoảng 6ml máu cho vào ống kháng đông heparin, sau lắc nhẹ để máu trộn với heparin .24 3.4.2 Phương pháp nuôi cấy tế bào máu 24 Máu sau lấy chuyển nhanh phịng thí nghiệm để ni cấy Trộn mơi trường ni cấy cho vào bình rough Sau hút lượng máu cho vào môi trường nuôi cấy, lắc nhẹ để máu lẫn vào môi trường Thao tác quan trọng định đến sản phẩm ni cấy Bình ni cấy chuyển vào tủ ấm CO2 nuôi cấy 370 72 Ni bình Rough đậy chặt nắp để tránh nhiễm khuẩn 24 Trong thời gian ni cấy phải lắc nhẹ bình Rough hai lần ngày, diều làm cho hồng cầu lắng xuống đáy tế bào bạch cầu phân chia nhiều (Kannan ctv, 2006) 24 3.4.3 Điều kiện khảo sát 24 Lượng PHA khảo sát hai mức 80 µl 100 µl máu thỏ khảo sát mức 80 µl, 100 µl 120 µl máu heo Ngoài ra, Lượng FBS khảo sát mức ml 1,5 ml Sử dụng hóa chất PHA để thay cho pokeweed (Mai Minh Mẫn, 2007) PHA thông dụng khả làm lắng tụ hồng cầu kích thích bạch cầu phân chia mạnh .24 3.5 Nội dung khảo sát .24 (1) Khảo sát máu thỏ 24 Giải đoạn có đợt lấy máu, đợt ni cấy bình tương ứng với mức PHA FBS (80 µl PHA + 1ml FBS; 80 µl PHA + 1,5 ml FBS; 100 µl PHA + ml FBS; 100 µl PHA + 1,5 ml FBS), bình nhuộm phiến kính 25 Bảng 3.1: Số mẫu khảo sát máu thỏ .25 Lượng PHA (µl) 25 Luợng FBS (ml) .25 ix 80 25 100 25 25 30 25 30 25 1.5 25 30 25 30 25 (2) Khảo sát heo 25 Giai đoạn có đợt lấy máu, đợt ni cấy bình tương ứng với mức PHA FBS (80 µl PHA + 1ml FBS; 80 µl PHA + 1,5 ml FBS; 100 µl PHA + ml FBS; 100 µl PHA + 1,5 ml FBS; 120 PHA + 1ml FBS ; 120 PHA + 1,5 ml FBS), bình nhuộm phiến kính.25 Bảng 3.2 Số mẫu khảo sát máu heo .25 Lượng PHA (µl) 25 Luợng FBS (ml) .25 80 25 100 25 120 25 25 20 25 20 25 20 25 1.5 25 20 25 20 25 20 25 3.6 Quy trình thực 25 * Nuôi cấy 25 Cho 1ml máu kháng đông (heparin EDTA) vào 9ml môi trường nuôi cấy (chứa 8ml RPMI 1640 + 1ml FBS + 80µl PHA + 100µl antibiotic – antimycotic) nuôi cấy 370C 72 * Nhuộm 25 26 x ... đích đề tài Khảo sát lượng FBS PHA thích hợp sử dụng quy trình nhuộm NST cho máu thỏ máu heo Từ đó, phân lập kiểu nhân máu thỏ máu heo 1.3 Yêu cầu đề tài - Nuôi cấy tế bào máu thỏ máu heo đến giai... học Nơng Lâm Tp Hồ Chí Minh Với đề tài: ? ?Khảo sát lượng fetal bovine serum phytohemaglutinin sử dụng quy trình nhuộm nhiễm sắc thể tế bào máu thỏ máu heo? ?? Giáo viên hướng dẫn:ThS Hồ Thị Nga,... kì - Thực nhuộm NST thỏ heo theo quy trình - Đọc mẫu nhận dạng NST Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Nhiễm sắc thể 2.1.1 Định nghĩa nhiễm sắc thể Ở tế bào sinh vật có nhân thức, nhiễm sắc thể cấu trúc