Đang tải... (xem toàn văn)
Nhân nuôi tế bào một mặt gia tăng về số lượng từ một nguồn tế bào hữu hạn, mặt khác tạo ra một quần thể tế bào đồng nhất, thích hợp cho việc nhân bản
Website: http://www.docs.vn Email : lienhe@docs.vn Tel (: 0918.775.368 lêi c¶m ơn T rong trình thực khoá luận tốt nghiệp này, em đà nhận đợc dẫn dắt tận tình PGS TS Trịnh Đình Đạt Em xin chân thành cám ơn thầy Em xin cám ơn thầy cô môn Di truyền đà bảo cho em thời gian qua Trong thời gian đợc thực tập phòng Công nghệ phôi trực thuộc Viện Công Nghệ Sinh Học - Trung Tâm Khoa Học Tự Nhiên Công Nghệ Quốc Gia, em đà đợc chú, cô, anh, chị giúp đỡ, tạo điều kiện cho em hoàn thành khoá luận Đặc biệt em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS Bùi Xuân Nguyên ngời đà bảo cho em tận tình Đồng thời em xin bày tỏ lòng biết ơn đến TS Nguyễn Thị Uớc, cử nhân Nguyễn Văn Hạnh, kỹ s Lê Văn Ty, kỹ s Nguyễn Hữu Đức, chị Nguyễn thị Thuỳ Anh Cuối cùng, em xin cám ơn gia đình bạn bè đà ủng hộ giúp đỡ em trình thực khoá luận tốt nghiệp Website: http://www.docs.vn Email : lienhe@docs.vn Tel (: 0918.775.368 Đặt vấn đề Công nghệ sinh học động vật tạo mét bíc chun biÕn lín viƯc s¶n xt giống loài vật nuôi cho suất cao nh trở thành công cụ hiệu việc bảo vệ đa dạng sinh học vật nuôi động vËt hoang d· Thµnh tùu nỉi bËt lÜnh vùc tái tạo cá thể động vật từ tế bào phôi đặc biệt tế bào sinh dỡng (Wilmut, 1997), thành tựu mở khả tạo động vật có tính trạng suất giống nh cá thể ban đầu, tạo cách mạng tuyển chọn sản xuất giống Từ tế bào sinh dỡng, nhiều phòng thí nghiệm giới đà sử dụng kỹ thuật cấy nhân để tạo động vật nhân Bắt đầu từ cừu Dolly đợc tạo từ tế bào tuyến vú (Willmut), hàng loạt chuột nhiều hệ đợc tạo phơng pháp tơng tự từ tế bào cận trứng (1998) Nhiều phòng thí nghiệm đà thành công việc tạo bò nhân với hy vọng tạo đàn bò kỷ lục (Pháp 2001, Trung Quốc 2001, Thái Lan 2000) Từ tế bào da tai bò, phòng Công Nghệ Phôi - Viện Công Nghệ Sinh Học thuộc Trung Tâm Khoa Học Tự Nhiên Công Nghệ Quốc Gia đà tạo phôi bò nhân Việt Nam Tỉ lệ phát triển đến giai đoạn phôi dâu, phôi nang đạt 20 - 25% (Bùi Xuân Nguyên cs, 1998) Hớng nghiên cứu tạo phôi động vật nhân trở thành hớng nghiên cứu trọng điểm nhằm nâng cao suất vật nuôi, bảo vệ đa dạng sinh học vật nuôi, bảo vệ đa dạng sinh học động vật hoang dà Đây hớng nghiên cứu đợc nhiều trờng đại học nớc ta quan tâm Nhân nuôi tế bào động vật bớc quan trọng công nghệ nhân động vật Cũng Viện Công Nghệ Sinh Học, dòng tế bào vật nuôi động vật hoang dà đợc nhân nuôi bảo quản đông lạnh thành công nh tế bào bò sữa cao sản, tế bào Sao la (Pseudoryx nghetinhensis), tế bào bò Tót (Bos gaurus), Nhân nuôi tế bào mặt gia tăng số lợng từ nguồn tế bào hữu hạn, mặt khác tạo quần thể tế bào đồng nhất, thích hợp cho việc nhân Do chất lợng tế bào nuôi định trực tiếp đến khả tạo phôi, trình phát triển phôi, trình phát triển động vật nh tính sản xuất vật nuôi Nhiễm sắc thể đơn vị mang thông tin di truyền bản, ổn định số lợng, hình thái, cấu trúc nhiễm sắc thể trình nuôi tế bào có ý nghĩa quan trọng phát triển tế bào nuôi nh khả tạo phôi, chất lợng phôi Chính khuôn khổ khoá luận này, giới hạn nghiên cứu tìm hiểu ban đầu nhiễm sắc thể tế bào bò Hà - ấn trình nuôi cấy bảo quản tế bào Chơng1 : Tổng quan tài liệu Website: http://www.docs.vn Email : lienhe@docs.vn Tel (: 0918.775.368 1.1 Sù h×nh thành nhiễm sắc thể điều kiện in vivo Ngời ta thờng nghiên cứu nhiễm sắc thể kỳ phân bào vào thời điểm nhiễm sắc thể co xoắn cực đại, bắt màu thuốc nhuộm mạnh có hình dạng điển hình Năm 1665, kính hiển vi đơn giản Robert- Hooke đà có số quan sát rút nhận xét: "Các mô, quan cối động vật có tảng cấu trúc chung" Trong thể sinh vật, tế bào mô, quan có khác chức năng, hình dạng nhng có cấu tạo chung tơng đối giống nhau: màng tế bào (Plasma membrane), bào tơng (Cytoplasma), nhân (Nucleus) Tế bào Eukaryota, nhân đợc bao bọc màng nhân mang vật chất di truyền axit nucleic (ADN) Chúng đợc tập hợp nhiễm sắc thể Vậy nhiễm sắc thể phức hợp đơn vị di truyền, sản phẩm tiến hoá mà từ bắt đầu tồn đà có giá trị chọn lọc cao Mỗi loài sinh vật có nhiễm sắc thể đặc trng cho loài số lợng, hình thái, cấu trúc nhiễm sắc thể: ví dụ: nhiễm sắc thể bò 2n = 60; nhiễm sắc thể trâu 2n = 50; bé nhiƠm s¾c thĨ ngêi 2n = 46; bé nhiƠm sắc thể ruồi giấm 2n = Trong tế bào soma, nhiễm sắc thể tồn thành cặp tạo nên nhiễm sắc thể lỡng bội (2n) Trong tế bào sinh dục (các giao tử), nhiễm sắc thể có số l ợng giảm (n) Trong số trờng hợp tăng, giảm số lợng nhiễm sắc thể thiếu thừa số nhiễm sắc thể Đơn bội hoá đa bội hoá tạo nhiễm sắc thể bất thờng Nhiễm sắc thể Prokaryota thờng phân tử ADN trần màng nhân bao bọc Trong tế bào Eukaryota, cấu trúc nhiễm sắc thể hoàn toàn khác Bớc nhảy vọt cấu trúc nhiƠm s¾c thĨ ë sinh vËt bËc cao kÌm theo xuất máy nguyên phân màng nhân đà gây thay đổi kích thớc, số lợng nhiễm sắc thể chúng tế bào, phức tạp cấu tạo phân tử mối tơng quan yếu tố di truyền cấu thành khác cđa nh©n Website: http://www.docs.vn Email : lienhe@docs.vn Tel (: 0918.775.368 Díi kÝnh hiĨn vi quang häc, nhiƠm s¾c thĨ có cấu tạo từ hai sợi nhiễm sắc nhiễm sắc thể đơn (chromatide) Dới kính hiển vi điện tử chromatide đợc cấu tạo từ nhiều sợi nhiễm sắc Hai sợi nhiễm sắc đơn thể chạy dọc theo suốt chiều dài nhiễm sắc thể cuộn xoắn tạo nên sợi nhiễm sắc thể Ta nhìn thấy hầu hết dấu hiệu đặc trng nhiễm sắc thể kỳ tế bào soma Trên sợi nhiễm sắc thể có tâm động (centromer), tiểu phận có chức chuyển động đặc trng cho nhiễm sắc thể sinh vật bậc cao điểm trợt để kéo sợi nhiễm sắc hai phía trình phân bào Khi nhiễm sắc thể pha nghỉ đợc nhuộm quan sát dới kính hiển vi ta thấy chất nhiễm sắc phân thành hai kiểu khác biệt rõ rệt cấu tạo Một kiểu đợc nhuộm nhạt gọi chất nguyên nhiễm sắc (vùng sáng - euchromatin) Kiểu đợc nhuộm đậm gọi chất dị nhiễm sắc (vùng tốiheterochromatin) Chất nguyên nhiễm sắc trạng thái dÃn xoắn, chất dị nhiễm sắc trạng thái cuộn xoắn cao Ngời ta cho vùng sáng chứa gen hoạt động vùng tối chứa gen trạng thái không hoạt động Những sinh vật khác chất dị nhiễm sắc phân bố khác Có trờng hợp phần toàn nhiễm sắc thể chất dị nhiễm sắc nằm rải rác dạng đoạn xoắn xen kẽ với chất nguyên nhiễm sắc bọc quanh tâm động Về chức chất nguyên nhiễm sắc chứa ADN trạng thái hoạt động (có thể phiên mà đợc), chất dị nhiễm sắc mang ADN dạng không phiên mà đợc Chất dị nhiễm sắc chép muộn chất nguyên nhiễm sắc chu kỳ tế bào Cấu tạo hoá học nhiễm sắc thể gồm có ADN loại protein đặc biệt histon bao quanh ADN, có ARN protit ADN với histon tạo thành phức hợp Nucleoprotein chiếm 60 - 90% toàn nhiễm sắc thể Nhiễm sắc thể bao gồm hai gọi nhiễm sắc tử, nhiễm sắc tử đợc tạo thành từ chất Desoxyribonucleoprotein (DNP) bao gồm khoảng 40% ADN, 60% protein, nhiễm sắc tử đợc dính nối với thể nhỏ dạng chấm hay hạt gọi tâm động (centromer) Ngoài nhiễm sắc thể thờng, tế bào sinh dỡng mang hai nhiễm sắc thể giới tính XX XY đực Một số trờng hợp đặc biệt ví dụ nh loài tằm cặp nhiễm sắc thể giới tính XX đực XY cái, chim nhiễm sắc thể giới tính ZO đực ZZ Website: http://www.docs.vn Email : lienhe@docs.vn Tel (: 0918.775.368 Hình thái nhiễm sắc thể đợc Dhnuki (1965) đề cập đến trạng thái nhiễm sắc thể cuộn xoắn Ferguson- Smith (1962), Palmer, Funderburk (1965) nghiªn cøu vỊ eo thø hai, Engmanm (1979) nghiên cứu thể sáp, thể kép, thể khổng lồ, thể liên hợp Tuy nhiên dới ảnh hởng nhân tố khác số lợng hình dạng nhiễm sắc thể thay ®ỉi VÝ dơ: Díi t¸c dơng cđa nhiƯt ®é cao thấp nhiễm sắc thể kéo dài co ngắn lại, xạ ion hoá gây đứt nhiễm sắc thể thành phần riêng (đứt mạch) chúng thoát khỏi nhiễm sắc thể Theo Makino (1944), Kalicop (1968), Bhatacharya (1977) số lợng nhiễm sắc thể tế bào soma loài vật nuôi khác khác Nh vậy, phạm vi loài số lợng nhiễm sắc thể số ổn định Bớc đầu Barnicot Huseley (1961) đà xử lý quan sát nhiễm sắc thể dới kính hiển vi địên tử thành công Sau Dupraw (1965) đà dùng phơng pháp Gall xử lý quan sát nhiễm sắc thể đợc sợi cuộn vòng nhiễm sắc thể có đờng kính 250 Angtron Năm 1970 Dupraw đà xuất toàn ảnh chụp nhiễm sắc thể qua kính hiển vi điện tử Ris Cubai (1976) đà xử lý tác nhân phụ, tách sợi 250 Angtron thành hai sợi khoảng 100 Angtron, nh nhiễm sắc thể kỳ giữa, đờng kính sỵi cã thĨ tõ 230 - 250 Angtron thËm chÝ lên 300 Angtron Barh Golomh (1971) đà sử dụng nghiên cứu nhận dạng nhiễm sắc thể Từ cấu trúc sợi cuộn Dupraw đà trở thành cấu trúc nhiễm sắc thể đại Tế bào đơn vị cấu tạo nên thể sống muốn bảo tồn phát triển thể sống phải tiến hành sinh sản Trong sinh vật tuỳ theo mức độ tiến hoá mà có hình thức sinh sản khác Động vật có vú phát triển cao tế bào có hai hình thức phân chia hình thức phân chia nguyên phân xảy hầu hết tế bào thể hình thức giảm phân để tạo tế bào sinh dục Sự sinh sản tế bào trình sinh trởng phân chia có tÝnh chÊt chu kú gäi lµ chu kú tÕ bµo Trong trình phân bào này, số nhiễm sắc thể tăng lên gấp đôi sau nhiễm sắc thể phân phối cho tế bào Kết số nhiễm sắc thể tế bào giống hệt tế bào mẹ Phân bào nguyên phân trình liên tục, nhng để tiện cho nghiên cứu chia làm bốn thời kỳ liên tiếp nhau: kỳ đầu, kỳ giữa, kỳ sau, kỳ cuối Giữa hai lần phân chia gọi gian kỳ Nguời ta gọi biến đổi tế bào từ lúc bắt đầu lần phân chia thứ bắt đầu lần phân chia thứ hai chu kỳ tế bào Gian kỳ chiếm phần lớn thời gian thời kỳ phân bào chiếm phần nhỏ Website: http://www.docs.vn Email : lienhe@docs.vn Tel (: 0918.775.368 Trong trình phân bào (nguyên phân hay giảm phân) thấy nhiễm sắc thể thay đổi, nhng mặt cấu trúc sở phức hợp ADN histon đảm bảo cho tính nguyên vẹn nhiễm sắc thể Tế bào soma trung kỳ hình thái nhiễm sắc thể ổn định, chênh lệch tế bào thuộc phạm vi cá thể thể loài không đáng kể Vì nghiên cứu cấu tạo nhân loài khác tốt vào kỳ lúc loài đợc đặc trng nhiễm sắc thể hình thái số lợng Phân bào giảm phân trình sinh giao tử đơn bội từ tế bào lỡng bội sau hai lần phân chia Nguyên phân trình truyền lại cho tế bào toàn thông tin di truyền tế bào mẹ đảm bảo cho ổn định số lợng, hình thái nhiễm sắc thể tế bào thể Gian kỳ khoảng thời gian hai lần phân chia, gian kỳ tế bào không phân chia xảy trình chuyển hoá mạnh mẽ, tổng hợp chất khác nhau, cần thiết cho hoạt động đặc biệt tế bào nh sù ph©n chia cđa nã Gian kú (interphase) chia làm ba giai đoạn G1 - S - G2, tiếp sau G tế bào phân chia cho hai tế bào con, sau tế bào lại bắt đầu chu trình tế bào Gian kỳ gồm giai đoạn: _ Giai đoạn thứ bắt đầu sau kết thúc phân chia tế bào gọi giai đoạn G1 Trong giai đoạn G1 tế bào không lớn lên tạo lập hình dáng vốn có cho mà tích luỹ chất giàu lợng khác nhau, nucleotid, axitamin, enzym Trong thời kỳ tế bào chuẩn bị tăng gấp đôi cấu trúc di truyền _ Giai đoạn S (Synthese = tổng hợp) xÃy nhân đôi vật chất di truyền, tái sinh phân tử ADN Các protein ARN đợc tổng hợp mạnh mẽ _ Giai đoạn G2 giai đoạn sau tổng hợp, tổng hợp ARN tiếp tục nhiễm sắc thể đà chứa hai tức nhiễm sắc tử mang phân tử ADN, hai sợi tế bào tích luỹ lợng chuẩn bị cho phân chia tới, nhiễm sắc thể xoắn lại chia làm hai Dới kính hiển vi quang học không quan sát thấy nhiễm sắc thể gian kỳ, nhng theo dấu hiệu thu đợc quan sát dới kính hiển vi điện tử thấy đa số nhân gian kỳ có hình dạng nhiễm sắc thể, nhiên nhiễm sắc thể mảnh nên dới kính hiển vi quang học không thấy dợc toàn cấu trúc hình dạng Website: http://www.docs.vn Email : lienhe@docs.vn Tel (: 0918.775.368 cđa nhiƠm s¾c thĨ mà thấy đợc chỗ vặn xoắn chúng tạo nên khối chất nhiễm sắc Các thời kỳ phân chia: Kỳ đầu (Prophase): kỳ đầu nhân xuất sợi lúc đầu mảnh dài, sau mảnh ngắn Trứơc ngời ta cho từ hạt chất nhiễm sắc tập hợp lại thành sợi dài, sau sợi bị đứt đoạn tạo thành nhiễm sắc thể, ngày ngời ta đà khẳng định sợi kỳ đầu ngắn dày nhiễm sắc thể gian kỳ Vào cuối kỳ đầu, màng nhân hạch nhân biến Số trung thể tăng lên gấp đôi, nửa số trung thể di chuyển tới cực đối lËp cđa tÕ bµo Xung quanh trung thĨ xt hiƯn tia nên trông trung thể giống nh Từ nguyên liệu bào tơng hình thành nên sợi thoi vô sắc Thoi gồm sợi không bắt màu từ sang Thoi nµy cã chøa protein giµu lu huúnh, ARN, lipoprotein ATP Kỳ (Metaphase): Tại kỳ nhiễm sắc thể có hình dạng đặc trng xuất sợi thoi toả từ hai cực đối diện tÕ bµo dÝnh víi trung tư n»m ë hai cùc Các sợi thoi lần lợt dính với tâm động nhiễm sắc thể Các nhiễm sắc thể tập trung mặt phẳng xích đạo tế bào, cặp sợi nhiễm sắc Nghĩa nhiễm sắc thể kết xoắn cực đại Kỳ sau (Anaphase): kỳ sau đôi nhiễm sắc thể tách thành nhiễm sắc thể đơn thể quay ngợc đầu rời xa đờng xích đạo tiến hai cực tế bào, vai nhiễm sắc thể đơn Thoi vô sắc biến đi, bào tơng xung quanh dày co thắt mạnh Càng sau vai nhiễm sắc thể mờ không thấy rõ sợi nhiễm sắc đà cởi xoắn Kỳ cuối (Telophase): Sự vận chuyển nhiễm sắc thể hai cùc cđa tÕ bµo kÕt thóc Nh vËy nhãm nhiễm sắc thể hai cực có số lợng thành phần giống Màng nhân hình thành bao bọc nhóm nhiễm sắc thể Các nhiễm sắc thể dÃn xoắn, hình thành nhân Các sợi thoi biến mất, tế bào chất đợc phân chia bao lấy nhân hai cực tế bào Trong thời kỳ phân bào, bào quan phân phối đôi cho tế bào Ty thể thờng phân thành hạt bé lại kéo dài ra, máy golgi cắt đoạn phân bào nguyên phân trải qua hai trình chia nhân chia bào tơng Trong trình phân chia nhân nhiễm sắc thể tạo hai nhiễm sắc thể từ gian kú song chóng cha t¸ch rêi Website: http://www.docs.vn Email : lienhe@docs.vn Tel (: 0918.775.368 Đến cuối kỳ đầu hai nhiễm sắc thể bắt đầu tách rời Nh số lợng nhiễm sắc thể 2n cực tế bào kết thúc kỳ phân chia, tế bào có đủ lỡng bội 2n giống tế bào mẹ số lợng, hình thái, kích thớc Theo Ford (1973) nuôi cấy tế bào chu kỳ phân chia tế bào, thời kỳ G1 chiếm khoảng 12 - 24 giờ, thêi kú S chiÕm kho¶ng giê, thêi kú G2 chiếm khoảng - Thời gian phân chia nguyên phân ngắn khoảng 30 phút đó: Kỳ đầu 30 phút Kỳ giữa15 phút Kỳ sau 15 phút Kỳ cuối 30 phút Nghiên cứu nhiễm sắc thể dựa vào việc xác định rõ giai đoạn phân chia tế bào để thu đợc kết tốt nh kỳ trình nguyên phân Tuy nhiên trình sinh sản phát triển cá thể lúc tế bào trì đợc hoàn toàn xác số lợng hình dạng nhiễm sắc thể mà có biến động Những biến đổi nhiễm sắc thể chia thành hai loại: _ Biến đổi số lợng nhiễm sắc thể _ Biến đổi cấu trúc nhiễm sắc thể 1.2 Những nghiên cứu nhiễm sắc thể điều kiện in vitro 1.2.1 Lợc sử nghiên cứu chung nhiễm sắc thể Nghiên cứu nhiễm sắc thể ngời động vật đà đợc nhiều nhà khoa học ý tới, đặc biệt vật nuôi Nghiên cứu nhiễm sắc thể động vật nói chung động vật nông nghiệp nói riêng đợc tiến hành từ đầu kỷ XIX _ Năm 1665 Robert - Hooke nhà nghiên cứu ngời Anh đà tạo kính hiển vi quang học giới Bằng kính hiển vi đơn giản ông đà có số quan sát làm cho ngời ta hiểu mô, quan cối động vật có tảng cấu trúc chung _ Năm 1838 - 1839 nhà thực vật học Slayden nhà động vật học Schwan Đức đà phát thể sinh vật đợc cấu tạo từ tế bào, học thuyết tÕ bµo Website: http://www.docs.vn Email : lienhe@docs.vn Tel (: 0918.775.368 đời Theo Enghen ba phát minh vĩ đại khoa học tự nhiên kỹ 19 _ Năm 1831 Robert Braum tìm thấy thể nhiễm sắc nhân _ Từ năm 1862 - 1915 Beveri (Đức) Wilsen (Mỹ) cho nhiễm sắc thể khác mang tính di truyền khác _ Năm 1869 lần nhà sinh vật học ngời Thuỵ Sỹ F.Misher đà phát axit nucleic nhân tế bào _ Từ năm 1887 - 1902 Beveri phát triển lý luận nhiễm sắc thể _ Năm 1927 Kalinte công bố số lợng nhiễm sắc thể bò 2n = 60 _ Năm 1956 Tjo Levan dùng kỹ thuật nuôi cấy tế bào bào thai dùng sốc nhợc trơng đà đếm xác số lợng nhiễm sắc thể ngời 2n = 46 Trong thời gian với phơng pháp nghiên cứu nhiễm sắc thể khác nh: nuôi cấy bạch cầu máu ngoại vi, nuôi cấy tuỷ xơng, đà có nhiều tác giả công bố số lợng hình thái nhiễm sắc thể gia súc gia cầm Dựa vào phân tích nhiễm sắc thể nguyên phân phân tích nhiễm sắc thể khổng lồ loài Anopheles sundaicus, S Sukowati V Baimai (1996) đà kết luận rằng: loài Anopheles sundaicus gồm ba dạng, ba dạng có kiểu nhân nguyên phân giống 2n = Thành tựu nghiên cứu nhiễm sắc thể ngời Chrustchoft Berlin dùng tế bào bạch cầu, tế bào máu ngoại vi nuôi cấy môi trờng tổng hợp Năm 1935 Chrustchoft cộng đà công bố phơng pháp nuôi cấy tế bào bạch cầu đa nhân Nghiên cứu nhiễm sắc thể ngời đà đợc phát triển sớm nhiều phòng thí nghiệm nhiều nớc Một số lợng lớn mẫu đà đợc nghiên cứu, phân tích, phát dị dạng nhiễm sắc thể mối liên quan tới trình sống đà giúp cho phát triển ngành tế bào học di truyền ngời thu đợc thành tựu đáng kể nh ngày Bên cạnh nhà khoa học Nhật Bản Tây Âu đặc biệt quan tâm nghiên cứu tới nhiễm sắc thể vật nuôi Nuôi cấy tế bào môi trờng thử nghiệm từ năm 1880 từ Roux giữ đĩa phôi gà nớc muối sinh lý ấm vµi ngµy Website: http://www.docs.vn Email : lienhe@docs.vn Tel (: 0918.775.368 Anold (1887) đà ghép mảnh mô vào ếch, sau thời gian có tế bào bạch cầu đa nhân vây quanh Ông đà lấy mảnh mô giữ đĩa nớc muối sinh lý ấm quan sát chuyển động sống thời gian ngắn Năm 1903 Folly đà giữ tế bào bạch cầu giọt treo lơ lửng nớc muối sinh lý ấm với thời gian tháng Becbe Swing (1906) đà miêu tả việc cấy tế bào bạch cầu đơn nhân máu động vật có sức đề kháng mẫn cảm Năm 1907 Rossnarisian đà tách mảnh mô từ ống vùng rốn phôi đám tế bào lympho ếch Các mảnh mô sống vài tuần lễ có nhiều sợi thần kinh xuất tế bào Thời gian sau Carell đà phát chất chiết xuất từ phôi thai có khả kích thích tăng cờng ảnh hởng tới phát triển số tế bào định Waren Leweis (1911 - 1912) đà bắt đầu tìm hiểu nhân tố cho vào môi trờng cần thiết cho sinh trởng trình sống tế bào Công việc đợc Fisher tiếp tục nghiên cứu năm nhà khoa học tiếp tục nghiên cứu nh: Sanhevtecly, Morgan, White, Waymouth Eagle đà giúp cho phát triển môi trờng tổng hợp dùng để nuôi cấy tế bào ngày hoàn thiện (Paul, 1960) Có thể nói tất nghiên cứu nhiễm sắc thể ngời động vật trớc năm 1940 đợc tiến hành việc cắt mảnh mô Nói chung mảnh mô đựợc cố định dung dịch osurium chronium bao gồm dung dịch cố định, thuốc nhuộm với chất kết tinh màu tím thuốc nhuộm hematocylin Makino (1944) đà dùng mô dịch hoàn để nghiên cứu nhiễm sắc thể bò môi trờng hổn hợp Champy Fleming Hỗn dịch axit axetic đặc dung dịch cố định mẫu đợc tiến hành nhuộm Haidenhai- sắt- Hematocylin Slizinsky (1945) đà thử nghiệm sử dụng thuốc nhuộm carmin axetic cố định để nghiên cứu nhiễm sắc thể tuỷ ngời Nhng tất kết không mỹ mÃn sử dụng nguyên liệu năm 1950 kỹ thuật nuôi cấy nhiễm sắc thể đà đợc tiến hành năm 1950 nh sau: Phát triển kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào môi trờng tổng hợp dùng chất kích thích phân bào phytohaemaglutinin (PHA) có khả kích thích bạch cầu đơn nhân _ Sử dụng Colchicin để cố định trình phân bào trung kỳ giai đoạn tốt để đếm quan sát hình dạng nhiễm sắc thÓ 10 Website: http://www.docs.vn Email : lienhe@docs.vn Tel (: 0918.775.368 Cách pha : Cân 5.59g KCl pha lít nớc cất, để tủ lạnh dùng dần _ Dung dịch cố định Công thức: etanol : axit acetic = tØ lƯ : _ Tripcin 400ml _ §Ưm Photphat pH = 6.8 Cách pha : 0.453g KH2PO4 1.19g Na2HPO4 100ml níc cÊt _ Thuèc nhuém Giemsa Cách pha : lấy 1g bột Giemsa hoà tan 54ml Glixerin 50 o 600C Sau làm lạnh nhiệt độ phòng cho thêm 84ml metanol, khuấy đều, lọc qua Thuốc nhuộm bảo quản tủ lạnh, dùng dần 2.3.4 Nuôi thu thập tế bào 2.3.4.1 Nuôi tế bào 2.3.4.1.1 Thu mẫu tế bào từ da tai bò Hà - ấn cái: Vệ sinh vùng định thu mẫu, sát trùng cồn 70% Cắt dụng cụ chuyên dụng Mô da đợc thu vào môi trờng PBS(-), đem phòng thí nghiệm Rửa mẫu nhiều lần PBS(-) Tách phần biểu bì, cắt nhỏ đến 0.1 x0.1 mm Sắp xếp miếng nhỏ vào đĩa, nuôi DMEM 10% FBS, nuôi 30 0C, 5% CO2, độ ẩm bÃo hoà Sau - 10 ngày tế bào mọc từ miếng da Dùng tripsin để cấy chuyển tế bào đà mọc đầy đĩa nuôi 2.3.4.1.2 Nuôi tế bào sau lần cấy chuyển: Sau cho tripsin tế bào bong khỏi đĩa nuôi Trung hoà tripsin thừa DMEM 10% FBS Ly tâm, loại bỏ môi trờng, cho môi trờng DMEM vào hoà tan cặn gieo vào đĩa nuôi 15 phút với mật độ 150.000 tế bào/ đĩa Với mật độ này, thờng sau ba ngày tế bào mọc đầy đĩa nuôi Từ cấy chuyển tiếp để trì làm nhiễm sắc thể để phân tích sử dụng cho nghiên cứu khác 2.3.4.2 Phơng pháp tách tế bào khỏi giếng nuôi: _ Loại bỏ dung dịch nuôi _ Thêm 100ml trypsin cho giếng nuôi, trung hoà tripsin DMEM 10%, để 10 phút 18 Website: http://www.docs.vn Email : lienhe@docs.vn Tel (: 0918.775.368 _ Đánh tan tÕ bµo b»ng pipet vµ cho vµo èng nhùa 10ml _ Thêm vào giếng nuôi 200ml dung dịch PBS(-), đánh kỹ hút cho vào ống nhựa Hình : ảnh chụp tế bào bò Hà - ấn sau nuôi 2.3.5 Phơng pháp làm tiêu nhiễm sắc thể 2.3.5.1 Làm tiêu nhiễm sắc thể _ Sau tế bào đợc tách khỏi giếng nuôi, cho vào ống nhựa 10ml Tiến hành ly tâm với tốc độ 1000 vòng/phút 10 phút (tránh để lâu tế bào bị phân huỷ tripsin) _ Hút bỏ phần _ Thêm vào ống đà ly tâm 9ml dung dịch nhợc trơng _ Để 15 phút 370 C _ Sau 15 phút, thêm vào ống 1ml dung dịch cố định _ Để 19 Website: http://www.docs.vn Email : lienhe@docs.vn Tel (: 0918.775.368 _ Ly tâm 1000 vòng/phút 10 phút _ Hút bỏ phần _ Thêm vào 6ml dung dịch cố định _ Để 20 phút 40 C _ Sau 20 phút, ly tâm 1000 vòng/phút 10 phút _ Hút bỏ phần _ Thêm vào 2ml dung dịch cố định _ Ly tâm 1000 vòng/phút 10 phút _ Hút bỏ phần _ Thêm vào 600ml dung dịch cố định _ Dùng pipet hoà tế bào với môi trờng cố định _ Chuẩn bị lam kính _ Dùng pipet hoà tế bào với môi trờng cố định _ Lam kính rửa sạch, dể tủ lạnh nhiệt độ 00C khoảng 30 phút _ Nhỏ giọt dung dịch chøa tÕ bµo b»ng pipet xuèng lam kÝnh cho khoảng cách pipet đến lam kính khoảng mét Động tác có tác dụng làm giọt mẫu rơi từ cao xuống đợc dàn mỏng đều, tế bào vỡ tung nhiễm sắc thể _ Để khô từ 12 - 24 nhiệt độ phòng 2.3.5.2 Nhm nhiƠm s¾c thĨ b»ng thc nhm Giemsa _ Nhuộm tiêu thuốc nhuộm Giemsa 6% đệm photphat 10 phút _ Rửa tiêu nớc cất _ Để khô 2.3.6 Đọc tiêu Tiêu sau nhuộm đà để khô, quan sát dới kính hiển vi Olympus Trớc tiên quan sát chung vật kính 10, xác định vị trí nhiễm sắc thể vi trờng 20 Website: http://www.docs.vn Email : lienhe@docs.vn Tel (: 0918.775.368 Sau quan sát vật kính 40 Nhiễm sắc thể bắt màu tím đậm Quan sát hình thái, đếm số lợng nhiễm sắc thể, ghi lại toạ độ vi trờng chọn vi trờng rõ nét để chụp ảnh nhiễm sắc thể 2.3.7 Xử lý số liệu Các công thức toán học dùng tính toán xử lý số liệu 2.3.7.1 Tính giá trị trung bình n X = i =n Xi n i= 1,2, n X : sè nhiƠm s¾c thĨ trung bình X i : số nhiễm sắc thể lần quan sát đợc n: số lần quan sát 2.3.7.2 TØ lÖ % fi = Mi % Ni fi : tØ lƯ % Mi : sè lỵng phiÕn kú có 60 nhiễm sắc thể lần chuyển thứ i Ni : số lợng phiến kỳ lần chuyển thứ i 2.3.7.3 Giá trị tính toán: Aì Ni Ti = C Ti : gía trị tính toán A : tổng lợng phiến kỳ có 60 nhiễm sắc thể lần chuyển Ni : tổng lợng phiến kỳ lần chuyển thứ i C : tổng lợng phiến kỳ lần chuyển 2.3.7.4 So sánh nhiỊu tØ lƯ b»ng tiªu chn X2 21 Website: http://www.docs.vn Email : lienhe@docs.vn Tel (: 0918.775.368 X (Oi − Ti ) =∑ Ti i =1 n Oi : giá trị quan sát Ti : giá trị tính toán 2.3.8 Bố trí thí nghiệm Bò Hà ấn Thu tế bào da Tế Bào Nuôi tế bào Cấy chuyển Lần chuyển Làm NST Nhuộm Phân tích Cấy chuyển Lần chuyển Làm NST Nhm Ph©n tÝch Nhm Ph©n tÝch CÊy chun → Lần chuyển Làm NST Cấy chuyển 10 22 Website: http://www.docs.vn Email : lienhe@docs.vn Tel (: 0918.775.368 Lần chuyển 10 Làm NST Nhuộm Phân tích Nhuộm Phân tích Nhuộm Phân tích Cấy chuyển 10 14 Lần chuyển 14 Làm NST Cấy chuyển 14 18 Lần chuyển 18 Làm NST Chơng3: Kết nghiên cứu thảo luận 3.1 Số lợng nhiễm sắc thể bò Hà - ấn nuôi in vitro 23 Website: http://www.docs.vn Email : lienhe@docs.vn Tel (: 0918.775.368 Quá trình làm tiêu tế bào bò Hà - ấn nuôi invitro đạt kết tốt hay không tốt phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác nhau, có yếu tè quan träng nh thêi gian lÊy tÕ bµo ë lần chuyển, thời gian xử lý hoá chất, nồng độ hoá chất, kỹ thuật làm tiêu nhiễm sắc thể Trong khuôn khổ khoá luận tốt nghiệp này, tiến hành nghiên cứu nhiễm sắc thể tế bào bò Hà - ấn qua lần chuyển thứ 4, 6, 8, 10, 14, 18 Mới gần Chikara Kubota cs (2000) đà tiến hành nghiên cứu nhiễm sắc thể tế bào fibroblast bò nuôi in vitro lần chuyển thứ 5, 10, 15 Kết cho thấy 70- 80% có nhiễm sắc thể hoàn chỉnh (2n = 60) coi nhiễm sắc thể không thay đổi Trong trình nghiên cứu, thu đợc kết 70 77% có nhiễm sắc thể hoàn chỉnh Nh vậy, sơ kết luận nhiễm sắc thể tế bào bò Hà - ấn trình nuôi in vitro không thay đổi Điều có ý nghĩa quan trọng chất lợng tế bào nuôi 3.1.1 Kết nghiên cứu lần chuyển thứ Bảng 1: Số lợng nhiễm sắc thể bò Hà - ấn lần chuyển thứ Số lợng nhiễm sắc thể Số lợng phiến kỳ Tỉ lệ(%) > 60 3.26 60 68 73.91 60 - 55 4.35 55 - 50 6.52 50 - 45 6.52 45 - 40 5.43 40 - 35 0 35 - 30 0 < 30 0 Quá trình làm tiêu nhiễm sắc thể lần chuyển thứ ta thu đợc 92 phiến trung kỳ, đó: _ Số lợng phiến kỳ đếm đợc > 60 nhiễm sắc thể 3, chiếm tỉ lệ 3.26% _ Số lợng phiến kỳ đếm đợc 60 - 55 nhiễm sắc thể 4, chiếm tỉ lệ 4.35% 24 Website: http://www.docs.vn Email : lienhe@docs.vn Tel (: 0918.775.368 _ Số lợng phiến kỳ đếm đợc 55 - 50 nhiễm sắc thể 6, chiếm tỉ lệ 6.52% _ Số lợng phiến kỳ đếm đợc 50 - 45 nhiễm sắc thể 6, chiếm tỉ lệ 6.52% _ Số lợng phiến kỳ đếm đợc 45 - 40 nhiễm sắc thể 5, chiếm tỉ lệ 5.43% _ Số lợng phiến trung kỳ đếm đợc < 40 nhiễm sắc thể 0, chiếm tỉ lệ 0% _ Số lợng phiến kỳ đếm đợc 60 nhiễm sắc thĨ lµ 68, chiÕm tØ lƯ 73.91% TØ lƯ nµy cho thấy số lợng phiến kỳ có 60 nhiễm sắc thể lớn Ta kết luận nhiễm sắc thể tế bào bò Hà - ấn trình nuôi in vitro lần chuyển không thay đổi (2n = 60) 25 Website: http://www.docs.vn Email : lienhe@docs.vn Tel (: 0918.775.368 Hình 3: ảnh nhiễm sắc thể tế bào bò Hà - ấn lần chuyển thứ 3.1.2 Kết nghiên cứu lần chuyển thứ Bảng 2: Số lợng nhiễm sắc thể bò Hà - ấn lần chuyển thứ Số lợng nhiễm sắc thể Số lợng phiến kú gi÷a TØ lƯ(%) > 60 0.69 60 109 75.17 60 - 55 0.69 55 - 50 19 13.10 50 - 45 10 6.69 45 - 40 2.76 40 - 35 0 35 - 30 0.69 < 30 0 Quá trình làm tiêu nhiễm sắc thể lần chuyển thứ ta thu ®ỵc 145 phiÕn trung kú, ®ã: _ Sè lỵng phiến kỳ đếm đợc > 60 nhiễm sắc thể 1, chiếm tỉ lệ 0.69% _ Số lợng phiến kỳ đếm đợc 60 - 55 nhiễm sắc thể 1, chiếm tỉ lệ 0.69% _ Số lợng phiến kỳ đếm đợc 55 - 50 nhiễm sắc thể 19, chiếm tỉ lệ 13.10% _ Số lợng phiến kỳ đếm đợc 50 - 45 nhiễm sắc thể 10, chiếm tỉ lệ 6.69% _ Số lợng phiến kỳ đếm đợc 45 - 40 nhiễm sắc thể 4, chiếm tỉ lệ 2.76% _ Số lợng phiến kỳ đếm đợc < 40 nhiễm sắc thể 1, chiÕm tØ lƯ 0.69% _ Sè lỵng phiÕn kú đếm đợc 60 nhiễm sắc thể 109, chiếm tỉ lệ 75.17% Tỉ lệ cho thấy số lợng phiến kỳ có 60 nhiễm sắc thể lớn nhÊt 26 Website: http://www.docs.vn Email : lienhe@docs.vn Tel (: 0918.775.368 Ta cã thĨ kÕt ln r»ng bé nhiƠm s¾c thĨ tế bào bò Hà - ấn trình nuôi in vitro lần chuyển thứ không thay đổi (2n = 60) Hình 4: ảnh nhiễm sắc thể tế bào bò Hà - ấn lần chuyển thứ 3.1.3 Kết nghiên cứu lần chuyển thứ Bảng 3: Số lợng nhiễm sắc thể bò Hà - ấn lần chuyển thứ Số lợng nhiễm sắc thể Số lợng phiến kỳ TØ lÖ(%) > 60 2.86 60 105 75.00 60 - 55 4.29 55 - 50 2.86 50 - 45 13 9.29 45 - 40 3.57 40 - 35 0.71 35 - 30 0 < 30 1.43 27 Website: http://www.docs.vn Email : lienhe@docs.vn Tel (: 0918.775.368 Quá trình làm tiêu nhiễm sắc thể lần chuyển thứ ta thu đợc 140 phiến trung kỳ, đó: _ Số lợng phiến kỳ đếm đợc > 60 nhiễm sắc thể 4, chiếm tỉ lệ 2.86% _ Số lợng phiến kỳ đếm đợc 60 - 55 nhiễm sắc thể 6, chiếm tỉ lệ 4.29% _ Số lợng phiến kỳ đếm đợc 55 - 50 nhiễm sắc thể 4, chiếm tỉ lệ 2.86% _ Số lợng phiến kỳ đếm đợc 50 - 45 nhiễm sắc thể 13, chiếm tỉ lệ 9.28% _ Số lợng phiến kỳ đếm đợc 45 - 40 nhiễm sắc thể 5, chiếm tỉ lệ 3.57% _ Số lợng phiến kỳ đếm đợc < 40 nhiễm sắc thể 3, chiếm tỉ lệ 2.13% _ Số lợng phiến kỳ đếm đợc 60 nhiễm sắc thể 105, chiếm tỉ lệ 75% Tỉ lệ cho thấy số lợng phiến kỳ có 60 nhiễm sắc thể lớn Ta kết luận nhiễm sắc thể tế bào bò Hà - ấn trình nuôi in vitro lần chuyển thứ không thay đổi (2n = 60) 28 Website: http://www.docs.vn Email : lienhe@docs.vn Tel (: 0918.775.368 Hình 5: ảnh nhiễm sắc thể tế bào bò Hà - ấn lần chuyển thứ 3.1.4 Kết nghiên cứu lần chuyển thứ 10 Bảng 4: Số lợng nhiễm sắc thể bò Hà - ấn lần chuyển thứ 10 Số lợng nhiễm sắc thể Số lợng phiến kỳ Tỉ lệ(%) > 60 6.94 60 54 75.00 60 - 55 2.77 55 - 50 4.16 50 - 45 1.38 45 - 40 0 40 - 35 2.77 35 - 30 1.38 < 30 5.55 Quá trình làm tiêu nhiễm sắc thể lần chuyển thứ 10 ta thu đợc 72 phiến kỳ giữa, đó: _ Số lợng phiến kỳ đếm đợc > 60 nhiễm sắc thể 5, chiếm tỉ lệ 6.94% _ Số lợng phiến kỳ đếm đợc 60 - 55 nhiễm sắc thể 2, chiếm tỉ lệ 2.77 % _ Số lợng phiến kỳ đếm đợc 55 - 50 nhiễm sắc thể 3, chiếm tỉ lệ 4.16% _ Số lợng phiến kỳ đếm đợc 50 - 45 nhiễm sắc thể 1, chiếm tỉ lệ 1.38% _ Số lợng phiến kỳ đếm đợc 45 - 40 nhiễm sắc thể 0, chiếm tỉ lệ 0% _ Số lợng phiến trung kỳ đếm đợc < 40 nhiễm sắc thể 7, chiếm tỉ lệ 9.71% _ Số lợng phiến kỳ đếm đợc 60 nhiễm sắc thể 54, chiếm tỉ lệ 75% Tỉ lệ cho thấy số lợng phiến kỳ có 60 nhiễm sắc thể lớn Ta kết luận nhiễm sắc thể tế bào bò Hà - ấn trình nuôi in vitro lần chuyển thứ 10 không thay đổi (2n = 60) 29 Website: http://www.docs.vn Email : lienhe@docs.vn Tel (: 0918.775.368 Hình 6: ảnh nhiễm sắc thể tế bào bò Hà - ấn lần chuyển thứ 10 3.1.5 Kết nghiên cứu lần chuyển thứ 14 Bảng 5: Số lợng nhiễm sắc thể bò Hà - ấn lần chuyển thứ 14 Số lợng nhiễm sắc thể Số lợng phiến kỳ Tỉ lệ(%) > 60 2.97 60 75 73.27 60 - 55 7.92 30 Website: http://www.docs.vn Email : lienhe@docs.vn Tel (: 0918.775.368 55 - 50 7.92 50 - 45 4.95 45 - 40 0.99 40 - 35 0.99 35 - 30 0 < 30 0 Quá trình làm tiêu nhiễm sắc thể lần chuyển thứ 14 ta thu đợc 101 phiến kỳ giữa, đó: _ Số lợng phiến kỳ đếm đợc > 60 nhiễm sắc thể 3, chiếm tỉ lệ 2.97% _ Số lợng phiến kỳ đếm đợc 60 - 55 nhiễm sắc thể 8, chiếm tỉ lệ 7.92% _ Số lợng phiến kỳ đếm đợc 55 - 50 nhiễm sắc thể 8, chiếm tỉ lệ 7.92% _ Số lợng phiến kỳ đếm đợc 50 - 45 nhiễm sắc thể 5, chiếm tỉ lệ 4.95% _ Số lợng phiến kỳ đếm đợc 45 - 40 nhiễm sắc thể 1, chiếm tỉ lệ 0.99% _ Số lợng phiến kỳ đếm đợc < 40 nhiễm sắc thể 1, chiếm tỉ lệ 0.99% _ Số lợng phiến kỳ đếm đợc 60 nhiễm sắc thể lµ 75, chiÕm tØ lƯ 73.27% TØ lƯ nµy cho thấy số lợng phiến kỳ có 60 nhiễm sắc thĨ lµ lín nhÊt Ta cã thĨ kÕt ln r»ng nhiễm sắc thể tế bào bò Hà - ấn trình nuôi in vitro lần chuyển thứ 14 không thay đổi (2n = 60) 31 Website: http://www.docs.vn Email : lienhe@docs.vn Tel (: 0918.775.368 Hình 7: ảnh nhiễm sắc thể tế bào bò Hà - ấn lần chuyển thứ 14 3.1.6 Kết nghiên cứu lần chuyển thứ 18 Bảng 6: Số lợng nhiễm sắc thể bò Hà - ấn lần chuyển thứ 18 Số lợng nhiễm sắc thể Số lợng phiÕn kú gi÷a TØ lƯ(%) > 60 1.61 60 89 71.77 60 - 55 6.45 55 - 50 7.25 50 - 45 6.45 45 - 40 3.22 40 - 35 0 32 ... (: 0918.775.368 Bộ nhiễm sắc thể tế bào bò Hà - ấn qua trình nuôi invitro giống nh nhiễm sắc thể tế bào bò Hà - ấn invivo hình thái Bộ nhiễm sắc thể gồm 30 cặp có cặp nhiễm sắc thể giới tính,... kÕt luËn r»ng nhiễm sắc thể tế bào bò Hà - ấn trình nuôi in vitro lần chuyển thứ không thay đổi (2n = 60) Hình 4: ảnh nhiễm sắc thể tế bào bò Hà - ấn lần chuyển thứ 3.1.3 Kết nghiên cứu lần chuyển... chất lợng phôi Chính khuôn khổ khoá luận này, giới hạn nghiên cứu tìm hiểu ban đầu nhiễm sắc thể tế bào bò Hà - ấn trình nuôi cấy bảo quản tế bào Chơng1 : Tổng quan tài liệu Website: http://www.docs.vn