Nghiên cứu khảo sát một số điều kiện phản ứng trong quy trình tổng hợp berberin từ piperonal

Trên thế giới, các quốc gia như Nhật Bản, Trung Quốc đã thành công trong tổng hợp hóa học, cũng như thương mại hóa chế phẩm berberin từ những năm 1980, do đó phương pháp tổng hợp hóa học

TRẦN THỊ KIM NGÂN

MÃ SINH VIÊN: 1201402

NGHIÊN CỨU KHẢO SÁT MỘT SỐ ĐIỀU KIỆN PHẢN ỨNG TRONG QUY TRÌNH TỔNG HỢP BERBERIN TỪ

PIPERONAL

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2017

TRẦN THỊ KIM NGÂN

MÃ SINH VIÊN: 1201402

NGHIÊN CỨU KHẢO SÁT MỘT SỐ ĐIỀU KIỆN PHẢN ỨNG TRONG QUY TRÌNH TỔNG HỢP BERBERIN TỪ

em trải qua bao khó khăn, gian khó, tận tình hướng dẫn, chỉ bảo cũng như động viên

và tạo mọi điều kiện giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu để em có thể hoàn thành khóa luận

Em xin chân thành cảm ơn ThS Nguyễn Minh Ngọc người thầy thứ hai trực tiếp

hướng dẫn đã quan tâm, giúp đỡ em trong thời gian thực hiện khóa luận

Em xin chân thành cảm ơn TS Nguyễn Văn Hải, ThS Nguyễn Văn Giang và

CN Phan Tiến Thành cùng các thầy giáo, cô giáo, và các anh chị kĩ thuật viên của

bộ môn Công nghiệp Dược – Trường Đại học Dược Hà Nội đã nhiệt tình giúp đỡ, cũng như tạo điều kiện thuận lợi cho em trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu tại bộ môn

Em cũng xin cảm ơn tới tất cả bạn bè, đặc biệt là bạn Nguyễn Văn Phương và

các bạn tại phòng thí nghiệm Tổng hợp hóa Dược – Bộ môn Công nghiệp Dược đã luôn gắn bó, động viên, chia sẻ và giúp đỡ em trong con đường tìm kiếm khoa học Lời cuối cùng, em xin được bày tỏ lòng biết ơn vô bờ bến đến bố mẹ và những người thân trong gia đình em đã luôn yêu thương, sát cánh bên em, là điểm dựa tinh thần vững chắc để em có được ngày hôm nay

Do thời gian làm thực nghiệm và kiến thức của bản thân còn có hạn, nên không tránh khỏi khóa luận còn nhiều thiếu sót Em rất mong nhận được sự đóng góp ý kiến của các thầy cô, bạn bè để khóa luận của em được hoàn thiện hơn Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 10 tháng 5 năm 2017 Sinh viên

Trần Thị Kim Ngân

2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị và dụng cụ nghiên cứu 22

(Carbon-13-Nuclear Magnetic Resonance spectroscory)

1H-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton

(Proton-Nuclear Magnetic Resonance spectroscory)

Ac2O Anhydrid acetic

Amphos Di-tert-butyl-(4-dimethylaminophenyl)phosphin

AMPK Protein kinase được hoạt hóa bởi adenosin monophosphat

(Adenosine Monophosphate-Activated Protein Kinase)

m/z Tỉ số khối lượng và điện tích

mARN Acid ribonucleic thông tin (Messenger Ribonucleic Acid)

MDA 3,4-Methylendioxyamphetamin

MIC Nồng độ ức chế tối thiểu

NH4OAc Amoni acetat

Bảng 2.1 Nguyên liệu và hóa chất 22

Bảng 3.1 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu suất phản ứng ngưng tụ

Bảng 3.4 Khảo sát ảnh hưởng của lượng xúc tác Ni2B tới hiệu suất phản ứng tổng

hợp homopiperonylamin thông qua lượng NaBH4 và NiCl2.6H2O đã sử

Bảng 3.8 Kết quả phân tích phổ MS của các sản phẩm 33

Bảng 3.9 Kết quả phân tích phổ 1H-NMR của các sản phẩm 34

Bảng 3.10 Kết quả phân tích phổ 13C-NMR của các sản phẩm 36

Hình 1.1 Cấu trúc hóa học của berberin 3Hình 1.2 Sơ đồ phản ứng chuyển hóa berberin thành berberinal trong môi trường kiềm

4

Hình 1.3 Sơ đồ phản ứng khử berberin thành tetrahydroberberin 3 4Hình 1.4 Quy trình chiết xuất berberin từ thân, rễ cây vàng đắng 8

Hình 1.7 Sơ đồ tổng hợp berberin của Viện Y học cổ truyền Trung Quốc 12

Hình 1.11 Tổng hợp berberin của Peng Yang, Yan Xiang Wang 15

Hình 1.13 Sơ đồ tổng hợp berberin của Virshinha Reddy 17

Hình 1.15 Sơ đồ tổng hợp piperonal từ 1,2-methylendioxybenzen 19

Hình 3.1 Sơ đồ tổng hợp (E)-5-(2-nitrovinyl)benzo[d][1,3]dioxol từ piperonal 26Hình 3.2 Sơ đồ tổng hợp trung gian homopiperonylamin 28Hình 3.3 Sơ đồ tổng hợp từ N-(2,3-dimethoxybenzyl)-2-(benzo[d][1,3]dioxol-5-

Hình 3.4 Sơ đồ tổng hợp berberin clorid từ

ĐẶT VẤN ĐỀ

Berberin là một isoquinolin alkaloid tự nhiên và có mặt trong các loài thực vật

như hoàng liên (Ranunculaceae), vàng đắng (Coscinium fenestratum), hoàng liên chân gà (Coptis chinesis), hoàng liên gai (Berberidaceae) Từ hàng ngàn năm,

berberin và các dược liệu chứa berberin đã được sử dụng rộng rãi trong nền y học truyền thống Ấn Độ và đặc biệt là trong nền y học cổ truyền Trung Quốc Hiện nay, berberin chủ yếu được sử dụng trên lâm sàng để điều trị các bệnh tiêu chảy, nhiễm khuẩn đường ruột hay nhiễm trùng mắt do hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm tương đối mạnh trên nhiều loài khác nhau [4, 45] Không chỉ dừng lại ở đó, các nhà khoa học vẫn luôn dày công tìm tòi để khai thác, phát hiện thêm những giá trị tiềm năng vốn có của berberin Các nghiên cứu trong hơn 20 năm gần đây cho thấy, ngoài tác dụng trên vi sinh vật, berberin còn có rất nhiều tác dụng sinh học đáng quý khác như: chống ung thư [43], hạ huyết áp [54], chống trầm cảm, chống viêm và làm giảm cholesterol [28],… [3, 4] Đồng thời, việc nghiên cứu và phát triển các dẫn chất từ khung cấu trúc của berberin với hoạt tính sinh học mạnh đang ngày càng được quan tâm nhiều hơn [8] Các dạng muối thường được sử dụng làm thuốc là: berberin clorid, berberin sulfat, berberin bisulfat và berberin tannat [32]

Hiện nay, berberin trong công nghiệp chủ yếu được chiết xuất từ thân và rễ cây vàng đắng [34] Tuy nhiên, do bị khai thác quá mức nên từ năm 1996, loài cây thuốc

quý này đã được đưa vào Sách Đỏ Việt Nam [1] dẫn đến nguy cơ nguồn nguyên liệu

chiết xuất berberin trong tương lai sẽ không còn Đối với hai loài hoàng liên chứa berberin thì tại Trung Quốc, người ta ước tính rằng cần phải có hơn 53,7 triệu cây hoàng liên để đáp ứng cho nhu cầu một năm là 500 tấn berberin [29] Do vậy, cần thiết phải có một phương pháp thay thế nguồn berberin tự nhiên đang ngày càng cạn kiệt để đảm bảo hệ sinh thái cũng như vấn đề về chi phí kinh tế Trên thế giới, các quốc gia như Nhật Bản, Trung Quốc đã thành công trong tổng hợp hóa học, cũng như thương mại hóa chế phẩm berberin từ những năm 1980, do đó phương pháp tổng hợp hóa học là một hướng đi hứa hẹn đầy triển vọng Tuy nhiên, Việt Nam vẫn chưa có

nghiên cứu nào công bố liên quan về tổng hợp berberin Nhận thấy piperonal là một nguyên liệu công nghiệp sẵn có, rẻ tiền, đồng thời đóng vai trò quan trọng trong tổng hợp hóa dược với vai trò là chất trung gian trong tổng hợp: L-dopa [51], tadalafil [19], cephalotaxin [21], Ngoài ra, piperonal còn là nguồn nguyên liệu chủ yếu để tổng hợp homopiperonylamin-chất trung gian quan trọng trong quy trình sản xuất berberin hóa học Cho nên chúng tôi cho rằng, việc tổng hợp berberin từ một nguồn nguyên liệu như piperonal trở nên rất khả thi và thiết thực

Vì vậy, chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu khảo sát một số điều kiện phản

ứng trong quy trình tổng hợp berberin từ piperonal” Đề tài được thực hiện với mục

tiêu: Khảo sát được một số yếu tố đến quy trình tổng hợp berberin từ piperonal

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về berberin

1.1.1 Cấu trúc hóa học

Hình 1.1 Cấu trúc hóa học của berberin

- Danh pháp IUPAC: 5,6-dihydro-9,10-dimethoxybenzo[g]-1,3-benzodioxolo[5,6-a] quinolizini

- Công thức phân tử: [C20H18NO4]+

- Khối lượng phân tử: 336,36 đvC

- Thành phần: 71,35% C; 5,35% H; 19,14% N; 4,16% O

- Tên thường gọi: berberin

- Dạng muối trong Dược điển Việt Nam IV: berberin clorid dihydrat [2]

+ Dạng muối sulfat dễ tan trong nước tỷ lệ 1/150 [36], tan trong ethanol

+ Dạng muối acetat và phosphat tan tốt hơn trong nước tỉ lệ 1/30 [36]

- Dưới ánh sáng tử ngoại UV, berberin phát huỳnh quang màu vàng đậm [10]

- Nhiệt độ nóng chảy: [36]

+ Berberin (base): 144°C

+ Berberin clorid dihydrat: 204-206°C

1.1.2.2 Tính chất hóa học

 Phản ứng trao đổi gốc muối:

Berberin tự do có tính chất như một base yếu, có khả năng tạo muối bằng cách thay thế nhóm OH, tạo muối berberin không giống như các alkaloid khác mà tạo muối giống hydroxyd kim loại (loại đi phân tử nước)

[C20H18O4N]+OH- + HCl  [C20H18O4N]+Cl- + H2O

 Phản ứng mở vòng isoquinolin

Berberin kém ổn định trong môi trường kiềm mạnh do N không bền vững dễ hỗ

biến mở vòng Berberin (1) chuyển thành berberinal (2) [34] như sơ đồ sau:

Hình 1.2 Sơ đồ phản ứng chuyển hóa berberin thành berberinal trong môi trường

kiềm

 Phản ứng khử nối đôi của vòng isoquinolin:

Liên kết đôi C=N của berberin dễ tham gia phản ứng cộng nucleophin Ngoài ra, nhân thơm chứa N có thể mất mạch kép khi có tác nhân khử cho các hydroalkaloid không màu (Sơ đồ hình 1.3)

Hình 1.3 Sơ đồ phản ứng khử berberin thành tetrahydroberberin 3

hợp với dẫn chất azol để tăng tác dụng chống nấm Khi phối hợp berberin với fluconazol làm giảm MIC của cả hai thuốc [22] Berberin và muối của nó còn được

chứng minh ức chế sự tăng trưởng Giardia lamblia, Entamoeba histolytica, Trichomonas vaginalis [18, 25, 26], Leishmania donovani hiệu quả Ngoài ra, bằng

cách ức chế giải phòng chất gây viêm và ức chế sự nhiễm virus nên berberin có tác

dụng kháng virus đối với virus cúm in vivo và in vitro [50]

1.1.3.2 Tác dụng hạ đường huyết

Tác dụng hạ đường huyết của berberin đã được báo cáo khi được dùng để điều trị tiêu chảy ở bệnh nhân tiểu đường năm 1988 [35] Các thuốc hạ đường huyết thường gặp phải tác dụng không mong muốn trên tiêu hóa và tim mạch nên berberin là một liệu pháp để thay thế Từ đó, nhiều bác sĩ bắt đầu sử dụng berberin để điều trị bệnh tiểu đường ở Trung Quốc, chủ yếu là bệnh đái tháo đường typ 2 Berberin có tác dụng

hạ đường huyết thông qua tăng cường hoạt động của thụ thể insulin, từ đó tăng hấp

thu và giảm tác động của glucose lên cơ thể, đồng thời bảo vệ và tái tạo tế bào beta ở tuyến tụy [16] Berberin làm giảm sự đề kháng insulin trên chuột bị béo phì, tương tự như metformin [15] Berberin tăng cường sự chuyển hóa glucose bằng cách kích thích quá trình đường phân Ngoài ra, berberin cũng có tác dụng ức chế α-glucosidase, làm phân hủy tinh bột và disaccharid thành glucose Berberin làm giảm lượng insulin trong máu thông qua tăng cường độ nhạy insulin ở bệnh nhân tiểu đường typ 2 mới được chẩn đoán [53]

mô rắn [20] Dựa trên bằng chứng in vitro, berberin ảnh hưởng đến một vài bước phát

triển khối u bao gồm tăng sinh tế bào, chết tế bào và xâm lấn [43, 44] Tuy nhiên, có nhiều bằng chứng cho thấy rằng berberin cũng có thể ức chế sự phát triển của khối u trong cơ thể [43] Ngoài ra, berberin tăng hiệu quả của hóa trị liệu hoặc hiệu ứng xạ trị

1.1.3.4 Tác dụng hạ huyết áp và chống loạn nhịp tim

Berberin đã được sử dụng trong điều trị một số bệnh về tim như cao huyết áp và loạn nhịp trong y học dân gian [3, 13], phòng ngừa nhịp nhanh thất; rối loạn nhịp thất

cơ tim do thiếu máu cục bộ gây ra, cải thiện chức năng co bóp tim và giảm sự đề

kháng mạch máu và huyết áp [9, 31] Các nghiên cứu in vivo trên động vật [40] và

người [31, 54] cũng cho thấy berberin đã đem lại lợi ích cho những bệnh nhân suy tim sung huyết nặng Berberin có hiệu ứng giãn mạch/hạ huyết áp do tăng cường acetylcholin [9] Tác dụng tim mạch của berberin là do sự phong tỏa của các kênh kali nhạy cảm với ATP và sự kích thích của kênh Na+ - Ca2+ Cơ chế tác dụng chống loạn nhịp của berberin không rõ ràng, nhưng kết quả từ mô hình thí nghiệm trên thỏ cho thấy có liên quan đến ức chế sự rối loạn nhịp chậm ở cơ thất [55]

1.1.3.5 Tác dụng hạ lipid máu

Các nghiên cứu gần đây cho thấy berberin là một thuốc tiềm năng trong điều trị bệnh tăng lipid máu nhờ làm giảm nồng độ cholesterol và triglycerid huyết tương thông qua cơ chế khác với các thuốc đang được sử dụng hiện nay như statin, fibrat,

có thể được sử dụng như là một liệu pháp đơn trị để điều trị các bệnh nhân tăng cholesterol máu hoặc phối hợp với statin [28] Cụ thể, berberin hoạt hóa AMPK [5], [27], tăng sự biểu hiện của receptor lipoprotein tỉ trọng thấp (LDLR) bằng cách ổn

định LDLR mARN thông qua con đường kinase điều hòa tín hiệu ngoại bào ERK

[27] Khi phối hợp berberin với statin trên chuột, nồng độ lipoprotein tỉ trọng thấp giảm rõ rệt so với dùng đơn độc statin [30]

1.1.4 Biệt dược

Asterasick 100 mg (Công ty cổ phần Dược phẩm Đồng Nai), Berberin SK 100

mg (Công ty cổ phần Dược phẩm Sao Kim – Việt Nam), Cossinmin 50 mg (Công

ty cổ phần Dược vật tư Y tế Bình Thuận), Loberin 25 mg (Công ty cổ phần Dược phẩm Nam Hà – Việt Nam), Antexsick 50 mg (Công ty cổ phần Dược TW Mediplantex – Việt Nam), Bermoric 50 mg (Công ty cổ phần Dược Hà Tĩnh – Việt Nam)

1.2 Các phương pháp tổng hợp berberin

Nguồn nguyên liệu berberin chủ yếu được chiết xuất từ thân rễ cây vàng đắng (Sơ đồ hình 1.4) Đây là phương pháp chính sản xuất berberin trong công nghiệp hiện nay Tuy nhiên, do những nhược điểm đã trình bày trong phần “Đặt vấn đề” nên cần tìm phương pháp khác để thay thế nhằm đảm bảo nguồn cung cấp berberin Để khắc phục vấn đề này, tác giả Lại Đức Lưu và cộng sự đã nghiên cứu phương pháp sử dụng công nghệ khí canh, song mới chỉ dừng lại ở quy mô phòng thí nghiệm Chính vì vậy, cần phải có hướng đi mới cho berberin Một trong những hướng đi triển vọng hiện nay là tổng hợp từ con đường hóa học

Hình 1.4 Quy trình chiết xuất berberin từ thân, rễ cây vàng đắng

1.2.1 Phương pháp của Pictet và Gams (1911)

Năm 1911, hai tác giả Pictet và Gams [39] năm 1911 đã đưa ra quy trình tổng hợp berberin sớm nhất (hình 1.5)

 Quy trình:

Cloro hóa acid 2-(3,4-dimethoxybenzyl)acetic 4 bằng PCl3 thu được hợp chất 5 Trong môi trường kiềm với xúc tác thích hợp, ngưng tụ 5 với homopiperonylamin cho homoveratroylhomopiperonylamin 7 Ở nhiệt độ 68-70oC, hợp chất 7 đun nóng

với phosphopentoxid đóng vòng tạo thành 6,7-methylendioxy-3’,4’-dimethoxy-3,4-

dihydroprotopapaverin 8 Khử hóa 8 với tác nhân khử thiếc trong HCl thu được một hỗn hợp gồm 6,7-methylendioxy-3',4'-dimethoxy-1,2,3,4-tetrahydroprotopapaverin 9

và 6,7-methylendioxy-3',4'-dimetoxy-9-keto-protopapaverin Phân lập được 9, ngưng

tụ 9 với formadehyd, rồi xử lý bằng HCl thu được tinh thể màu vàng Sản phẩm phân

hủy bằng Br2 và cacbon disulfua tạo thành berberin

Bột vàng đắng

H2SO4 0,4%

Bã dược liệu Dịch chiết

NaCl

Tủa (Berberin clorid thô) EtOH 96o

Berberin clorid

Lọc

Tẩy màu, kết tinh lại

Ngâm ở nhiệt độ phòng

Hình 1.5. Tổng hợp berberin của Pictet và Gams

1.2.2 Phương pháp của Kametani và cộng sự (1969)

Năm 1969, Kametani [24] và các cộng sự công bố quy trình tổng hợp berberin iodid theo sơ đồ hình 1.6

 Quy trình:

3,4-Methylendioxyphenylethylamin 6 được ngưng tụ với bromo-4-methoxyphenylacetat 11 ở 170oC trong 4h tạo thành hợp chất 12 Đóng vòng

methyl-5-benzyloxy-2-12 nhờ phosphoryl clorid thu được 3,4-dihydroisoquinolin 13 Hợp chất 13 khử hóa bằng

NaBH4 cho 1,2,3,4- etrahydroisoquinolin 14 Debenzyl hóa, loại nhóm bảo vệ của 14 với acid clorohydric đậm đặc trong ethanol được hợp chất phenolic 15 Sau đó thực hiện phản ứng Mannich giữa (15) và HCHO trong HCl tạo thành 12–bromonandinin 16 Loại brom của 16 thu được hợp chất nandinin 17 Methyl hóa nandinin 17 với diazomethan tạo thành hợp chất canadin 18 Canadin 18 đem khử hóa với I2 trong 1h thu được berberin iodid

Hình 1.6 Tổng hợp berberin idodid của Kametani

1.2.3 Phương pháp của Viện Y học cổ truyền Trung Quốc

Năm 1980, Viện Y học cổ truyền Trung Quốc đưa ra quy trình tổng hợp berberin

từ phenol, berberin thu được có độ tinh khiết cao (>99%) so với phương pháp chiết xuất từ thực vật (97%) Hiệu suất của toàn bộ quy trình là 15%

Năm 1981, xí nghiệp dược phẩm Đông Bắc, Trung Quốc đã sản xuất berberin theo quy trình này với sản lượng 30 tấn/năm Tuy nhiên, do quy trình phức tạp, hiệu

suất thấp, chi phí lớn, các tác nhân gây ô nhiễm môi trường như benzen, dimethylsulfoxid nên năm 1994, phương pháp này đã bị ngừng lại [23, 57]

Quy trình gồm 17 bước được biểu diễn trong sơ đồ hình 1.7

 Quy trình:

Phenol 19 được cloro hóa ở 24-28oC bằng tác nhân là khí Cl2 rồi thủy phân

thu được catechol 22 Catechol phản ứng với CH2Cl2 ở nhiệt độ 110-115oC tạo

thành hợp chất 23 Hợp chất 23 lần lượt tác dụng với 1,3,5-trioxan, hexamethylentetramin, acid acetic thu được piperonal 26 Ngưng tụ 26 với

ClCH2CO2CH3 trong môi trường kiềm tạo thành hợp chất 27 Thủy phân 27 bằng

NaOH rồi xử lí tiếp với CH3COOH thu được 29 Ngưng tụ 29 với NH3 cho hợp

chất imin 30 Khử hóa 30 tạo thành homopiperonylamin 6 Tiếp theo, 6 ngưng tụ

với 2,3-dimethoxybenzaldehyd, rồi khử hóa bằng H2, xúc tác Ni cho 31 Muối của

31 với HCl tham gia phản ứng đóng vòng với glyoxal được 33 Trong điều kiện thích hợp, xử lý 33 thu được berberin clorid

Hình 1.7 Sơ đồ tổng hợp berberin của Viện Y học cổ truyền Trung Quốc

1.2.4 Phương pháp của Lin (1981)

Năm 1981, Lin và cộng sự tập trung vào rút ngắn giai đoạn chuyển hợp chất 24 thành homopiperonylamin 6 (sơ đồ hình 1.8) Theo đó, quy trình tổng hợp 6 từ 24

gồm 7 giai đoạn nay chỉ còn hai (thế SN2 và hydro hóa)

Hình 1.8 Tổng hợp từ hợp chất 24 đến hợp chất 6

Sau đó, phương pháp này tiếp tục được cải tiến đi từ nguyên liệu ban đầu là

catechol 22 (sơ đồ hình 1.9) Phương pháp cải tiến này có ưu điểm là chi phí thấp,

hiệu suất cao, sản phẩm thu được có độ tinh khiết cao

Hình 1.9 Tổng hợp berberin của Lin Đầu tiên, 22 phản ứng với CH2Cl2 trong môi trường NaOH, H2O, Bu4NBr, ở nhiệt độ 90-100oC tạo thành hợp chất 23 Alkyl hóa 23 với 1,3,5-trioxan thu được hợp chất 24 Tiếp theo, 24 được chuyển thành 6 qua 2 giai đoạn như sơ đồ hình 1.8: thế -Cl của 24 bằng -CN với tác nhân là NaCN, xúc tác benzyltriethylamoni clorid

(1) và khử hóa -CN bằng H2 (2) Hiệu suất 2 giai đoạn này là 60% Sau đó ngưng tụ

6 với 2,3-dimethoxybenzaldehyd, khử hóa với H2 được 31 Lần lượt xử lý 31 với

oxalaldehyd, CuCl2, NaCl trong Ac2O/AcOH dung dịch NH3 được sản phẩm cuối

cùng là berberin 1.

1.2.5 Phương pháp của Chen (2007)

Năm 2007, nghiên cứu cải tiến quy trình sản xuất berberin của Chen và cộng sự

đưa ra bắt đầu từ nguyên liệu dimethoxylphenylmethanol 35 (Hình 1.10) Quy trình

gồm 6 giai đoạn, hiệu suất mỗi giai đoạn đều trên 90%, toàn bộ quy trình là 67% Quy trình này được đưa vào sản xuất cùng năm đó trong công nghiệp bởi công ty dược phẩm Changzhou Yabang, Trung Quốc [23]

Hình 1.10 Tổng hợp berberin của Chen

 Quy trình:

Methyl hóa 2,3-dimethoxybenzyl methanol 35 bằng dimethylsulfat trong dung dịch NaOH 30% ở 80°C thu được 1-(methoxymethyl)-2,3-dimethoxybenzen 36, hiệu suất 98% Tiếp theo, cho 36 phản ứng với paraformaldehyd và HCl trong toluen ở 30°C thu được 2-(methoxymethyl)-3,4-dimethoxybenzyl clorid 37, hiệu suất 91%

Thế Cl- của 37 bằng CN- trong với tác nhân là NaCN trong toluen, xúc tác

tetrabutylamoni bromid được 38, hiệu suất 95% 38 tạo 39 với methanol rồi ngưng tụ với homopiperonylamin 6 thu được hợp chất 40 Thực hiện phản ứng đóng vòng giữa

40 và phosphopentaclorid, dichloromethan ở 40°C cho berberin thô Hòa tan sản

phẩm thô trong một lượng nhỏ acid acetic, toluen và acid clorohydric đặc ở 50°C, khuấy trong 30 phút thu được berberin hydroclorid, hiệu suất 89%.

1.2.6 Phương pháp của Peng Yang (2008) [52], Yan Xiang Wang (2009) [48, 49]

Năm 2008, Peng Yang và Yan Xiang Wang đã đưa ra quy trình tổng hợp berberin

(Hình 1.11) đi từ chất ban đầu là homopiperonylamin 6 Tương tự như phương pháp

của Lin (1981) nhưng thay đổi tác nhân khử và các thông số quy trình

 Quy trình:

Ngưng tụ homopiperonylamin 6 với 2,3-dimethoxybenzaldehyd ở 100°C được hợp chất 41 Hợp chất 41 khử hóa bằng NaBH4 trong methanol, đun hồi lưu trong 5h

được sản phẩm trung gian 31, hiệu suất 60-80% Cho 31 phản ứng với glyoxal, xúc

tác CuSO4 và HCl trong axit formic thu được berberin dưới dạng muối format Sản phẩm thu được hòa tan trong methanol và nước, tiếp tục cho phản ứng với CaO rồi thêm dung dịch HCl trong ethanol để thu được berberin ở dạng berberin clorid

Hình 1.11 Tổng hợp berberin của Peng Yang, Yan Xiang Wang

1.2.7 Phương pháp của Alice Gatland (2014) [17]

Năm 2014, Alice Gatland và cộng sự thuộc phòng thí nghiệm Hóa học trường đại

học Oxford đề xuất quy trình tổng hợp berberin đi từ aldehyd 42 và acid 43, sử dụng xúc tác chứa Pd với hiệu suất 50% Quy trình được trình bày ở sơ đồ hình 1.12

Hình 1.12 Tổng hợp berberin của Alice Gatland

Hợp chất 44 và 45 kết hợp dễ dàng bằng phản ứng aryl hóa với xúc tác Cs2CO3

và (Amphos)2PdCl2 cho hợp chất 46, hiệu suất 84% Xử lý 46 với NH4Cl ở 90oC thu

được isoquinolin 47 Tiếp tục tăng nhiệt độ lên 110oC để loại nhóm pivaloat thu được berberin, hiệu suất 82% Kiềm hóa bằng NaOH rồi chiết với DCM Xử lí dịch chiết

với HCl thu được berberin clorid tinh khiết Bên cạnh đó, có thể tiến hành phản ứng

one-pot sử dụng dung môi THF, EtOH và H2O để thu được berberin clorid từ hợp

chất 44 và 45 với hiệu suất 40% Hiệu suất toàn bộ quy trình là 68% tính theo 42 hoặc 50% tính theo 43.

1.2.8 Phương pháp của Virshinha Reddy (năm 2015) [41]

Hình 1.13 Sơ đồ tổng hợp berberin của Virshinha Reddy

Năm 2015, Virshiha Reddy và cộng sự đã đưa ra phương pháp tổng hợp berberin gồm 4 giai đoạn đi từ một nguyên liệu thương mại sẵn có là dẫn chất silylat của

alkynyl arylethanol Đây là quy trình tổng hợp berberin mới nhất và hiệu suất toàn bộ quy trình đạt 32% đi từ 48 (Hình 1.13)

 Quy trình:

Thủy phân 48 bằng tetrabutylamoni florid để loại nhóm bảo vệ thu được dẫn xuất của 2-alkynylarylethanol 49, hiệu suất 88% Alkyl hóa hợp chất 49 với 2,3-dimethoxy-5-bromobenzaldehyd 50 ở 70oC trong 3h, tạo thành tiền chất của

isoquinolin 51, hiệu suất 65% Đóng vòng 51 trong điều kiện tối ưu hóa thu được dẫn xuất của isoquinolin 52, hiệu suất 78% Cuối cùng, trong điều kiện Appel [42] isoquinolin 52 đóng vòng tạo thành berberin, hiệu suất 72%.

1.3 Piperonal: nguồn nguyên liệu tiềm năng để tổng hợp sản xuất berberin

 Cấu trúc hóa học

Hình 1.14 Cấu trúc hóa học của piperonal

- Danh pháp IUPAC: 1,3-benzodioxol-5-carbaldehyd

- Công thức phân tử: C8H6O3

- Khối lượng phân tử: 150,13 đvC

- Tên gọi khác: Heliotropin [7]

- Dễ bị oxy hóa bởi các tác nhân oxy hóa chuyển thành dạng acid

- Nhóm CHO có thể tham gia phản ứng aldol hóa, dễ ngưng tụ với hợp chất có H linh động khi gắn với nhóm hút điện tử mạnh

 Sản xuất

Piperonal được sản xuất theo hai phương pháp chính là chiết xuất từ vani, húng quế hoặc tổng hợp hóa học từ safrol, catechol hoặc 1,2-methylendioxybenzen Tuy nhiên, hàm lượng piperonal trong thực vật rất ít, nên phương pháp chiết xuất không được ứng dụng rộng rãi Trên thực tế, trong công nghiệp piperonal tổng hợp hóa học chiếm đến 90% [33] Piperonal có thể thu được với hiệu suất tốt và tính chọn lọc cao

bằng cách cho 1,2-methylendioxybenzen phản ứng với N-alkylformanilid và một

trong số các hợp chất: phosgen, phospho oxyclorid, phospho oxybromid, thionyl clorid, thionyl bromid, sulfuryl clorid, sulfuryl bromid, phospho triclorid, và phospho pentaclorid, sau đó thủy phân thu được sản phẩm [33] như trên sơ đồ hình 1.15

Hình 1.15 Sơ đồ tổng hợp piperonal từ 1,2-methylendioxybenzen

 Ứng dụng

Piperonal được sử dụng rộng rãi trong ngành mỹ phẩm về nước hoa vì có mùi hoa anh đào dễ chịu Ngoài ra, nó còn là nguyên liệu quan trọng trong ngành hóa chất nông nghiệp, hay mạ kim loại [33] Trong ngành công nghiệp thực phẩm, piperonal được sử dụng với vai trò là một loại gia vị và hương liệu [12] Piperonal cũng đồng thời là nguyên liệu ban đầu để tổng hợp tadalafil – một thuốc điều trị tăng huyết áp động mạch phổi [19] Năm 1988, Công ước Liên Hợp Quốc về các thuốc gây nghiện hướng tâm thần đã liệt kê piperonal vào danh sách chất tiền thân gây nghiện trong sản xuất MDA và MDMA [56]

Giá: 37$/kg tương đương 800.000 VNĐ/kg

1.4 Lựa chọn phương pháp tổng hợp

Các con đường tổng hợp berberin phần lớn thông qua hợp chất trung gian

homopiperonylamin (6)

Hợp chất 6 có thể được tổng hợp trực tiếp thông qua các nguyên liệu sau:

Trong các phương pháp đề cập ở mục 1.2, chúng tôi nhận thấy quy trình tổng hợp

berberin đi từ 6 theo Peng Yang và Yan Xiang Wang đơn giản, cho hiệu suất cao, có

khả năng thực hiện trong điều kiện thực tế của Việt Nam Chúng tôi quyết định lựa chọn con đường này để tiến hành nghiên cứu tổng hợp berberin

Mặt khác, hợp chất nitro 53 - nguyên liệu để tổng hợp 6 có thể dễ dàng được tổng

hợp từ piperonal bằng phản ứng ngưng tụ với nitromethan [46] Hơn thế nữa, piperonal còn có những ưu điểm về giá thành [59] cũng như trữ lượng sẵn có, nguyên

liệu dễ kiếm Vì vậy, chúng tôi lựa chọn tiến hành tổng hợp berberin theo phương pháp Peng Yang và Yan Xiang Wang [48, 49] qua trung gian homopiperonylamin,

từ nguyên liệu piperonal và đồng thời cải tiến một số phản ứng để thu được hiệu suất cao

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN

CỨU 2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị và dụng cụ nghiên cứu

Đề tài sử dụng một số nguyên liệu, hóa chất, dung môi và thiết bị của phòng thí nghiệm Tổng hợp hóa dược, Bộ môn Công nghiệp Dược (xem bảng 2.1; 2.2)

Bảng 2.1 Nguyên liệu và hóa chất

Bảng 2.2 Các thiết bị, máy móc nghiên cứu

7 Cân kỹ thuật Sartorius BP 2001S, độ nhạy 10-2 Thụy Sĩ

2.2 Nội dung nghiên cứu

 Tổng hợp berberin và các chất trung gian từ piperonal theo sơ đồ hình 2.1 bao

gồm:

- Tổng hợp (E)-5-(2-nitrovinyl)benzo[d][1,3]dioxol (II) từ piperonal

- Tổng hợp homopiperonylamin (III) từ (E)-5-(2-nitrovinyl)benzo[d][1,3]dioxol

- Tổng hợp N-(2,3-dimethoxybenzyl)-2-(benzo[d][1,3]dioxol-5-yl)ethanamin (IV)

từ homopiperonylamin

- Tổng hợp berberin clorid (V) từ

N-(2,3-dimethoxybenzyl)-2(benzo[d][1,3]dioxol-5-yl)ethanamin

Hình 2.1 Sơ đồ tổng hợp berberin từ piperonal

 Sơ bộ kiểm tra độ tinh khiết của berberin và các hợp chất trung gian bằng SKLM với hệ dung môi thích hợp và đo nhiệt độ nóng chảy

 Xác định cấu trúc sản phẩm tổng hợp được bằng phổ khối lượng (MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR, 13C-NMR)

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Tổng hợp hóa học

Sử dụng các phương pháp thực nghiệm cơ bản trong hóa học hữu cơ để tổng hợp các chất dự kiến: phản ứng ngưng tụ aldol hóa, khử hóa, ngưng tụ imin, đóng vòng (Hình 2.1)

Theo dõi tiến triển của phản ứng bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng (SKLM) thực hiện trên bản mỏng silicagel 60 F254 với các hệ dung môi khai triển thích hợp

Sử dụng phương pháp cất, chiết lỏng-lỏng, kết tinh,…để tinh chế sản phẩm

2.3.2 Kiểm tra độ tinh khiết

- Sơ bộ kiểm tra độ tinh khiết của sản phẩm và theo dõi tiến trình của phản ứng bằng phương pháp sắc kí lớp mỏng (TLC) SKLM được thực hiện trên bản mỏng silicagel 60 F254 Merck 70-230 mesh với hệ dung môi thích hợp Quan sát chất dưới đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm hoặc hiện màu bằng dung dịch ninhydrin 0,1% trong ethanol Hệ dung môi sử dụng:

Được ghi tại Phòng Phân tích, Kiểm nghiệm và Tương đương sinh học, Viện Công nghệ dược phẩm quốc gia, trên máy LC-MS/MS Agilent 1290/6460 (Mỹ) với chế độ đo ESI

Đo trên máy LC-MS/MS-Xevo, tại phòng Phân tích khối phổ, Viện Hóa học

- Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, chế độ đo ESI

C-NMR):

Được ghi tại Phòng thí nghiệm Hóa dược, Khoa Hóa học, Trường Đại học Khoa học tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội, trên máy Bruker 500 MHz Ascend,

sử dụng dung môi thích hợp, chất chuẩn nội tetramethylsilan

Đo trên máy Bruker AV 500, tần số 500 MHz (đối với 1H-NMR), 125 MHz (đối với 13C-NMR), tại Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, chuẩn nội tetramethylsilan, dung môi thích hợp

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 Tổng hợp hóa học

thu được II

 Kết quả

 Cảm quan: Bột kết tinh màu vàng

 Khối lượng: 15,42 g Hiệu suất: 79,89%

 Nhiệt độ nóng chảy: 154,3 - 155,8oC

 Rf = 0,82 (Hệ dung môi CH2Cl2 : MeOH = 90:1)

 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất phản ứng

Tiến hành khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ, thời gian và dung môi kết tinh tới kết

quả phản ứng Kết quả được trình bày trong bảng 3.1, bảng 3.2 và bảng 3.3

Theo bảng 3.1, khi tiến hành thực hiện phản ứng ở nhiệt độ 110oC và 120oC thì khối phản ứng không bị kheo nhầy như khi tăng nhiệt lên đến 130 oC Tuy nhiên, khi

đun ở nhiệt độ 110 oC, kết thúc phản ứng cùng một thời gian như thực hiện ở 120 oC làm hiệu suất thấp hơn Phản ứng tiến hành ở 120 oC đạt hiệu suất cao nhất (79,89%)

Bảng 3.1. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu suất phản ứng ngưng

tụ nitro

Nhiệt độ phản

ứng

Cảm quan khối phản ứng Khối lượng (g)

Hiệu suất (%)

Dung môi kết tinh: khi dùng ethanol để kết tinh sản phẩm thì phải sử dụng lượng

dung môi rất lớn (2000ml), hay sử dụng aceton chỉ cần 200 ml dung môi nhưng II

tan tốt trong aceton nên khó kết tinh dẫn đến giảm hiệu suất mạnh chỉ đạt 23,47% Khi phối hợp ethanol : aceton = 2:1 thì thấy hiệu suất đạt 79,89%, kết tinh được nhiều

nhất và ít tốn dung môi nhất (Bảng 3.3)

Bảng 3.3 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của dung môi kết tinh đến hiệu suất phản

 Giai đoạn 1

Cho 45,0 ml THF khan; 9,0 ml ethanol tuyệt đối và 2,25 g natri bohydrid vào bình cầu 2 cổ dung tích 250 ml Thêm từ từ dung dịch gồm 4,35 g (E)-5-(2-nitrovinyl) benzo[d][1,3]dioxol trong 30 ml THF trong thời gian 15 phút sao cho nhiệt độ được duy trì không quá 30 oC Phản ứng diễn ra trong 1h30ph ở nhiệt độ phòng Kết thúc phản ứng, cô quay loại bớt dung môi (khoảng ½) rồi thêm 27 ml methanol

 Giai đoạn 2

Đổ toàn bộ huyền phù xúc tác được chuẩn bị ở trên vào khối phản ứng ở giai đoạn 1 Sau đó, thêm vào từ từ 17,25 g NaBH4 Hỗn hợp phản ứng được khuấy trong 2h, ở nhiệt độ 20 oC Đổ 90 ml HCl vào khối phản ứng Lọc loại xúc tác Dịch lọc được cất chân không tới khô Hòa tan hoàn toàn cắn trong nước, lọc loại tủa, thu lấy dịch Dịch nước thu được điều chỉnh pH bằng dung dịch NaOH 20% tới giá trị pH= 10-11 rồi chiết 3 lần với diclomethan, mỗi lần 45 ml Gộp dịch chiết thu được, chiết lại pha hữu cơ với nước rồi làm khan bằng natri sulfat Cất loại dung môi thu được homopiperonylamin

 Kết quả

 Cảm quan: Chất lỏng, sánh, màu vàng nhạt Dưới 0oC kết tinh dưới dạng tinh thể hình kim

 Khối lượng: 2,70 g Hiệu suất: 72,63 %

Rf = 0,67 ( Hệ dung môi n-BuOH : AcOH : H2O = 9,0: 2,0: 2,5)

 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất phản ứng

Tiến hành khảo sát ảnh hưởng của lượng xúc tác Ni2B tới hiệu suất phản ứng thông qua lượng NaBH4 và NiCl2.6H2O Kết quả được thể hiện trong bảng 3.4 Bảng 3.4. Khảo sát ảnh hưởng của lượng xúc tác Ni2B tới hiệu suất phản ứng tổng hợp homopiperonylamin thông qua lượng NaBH4 và NiCl2.6H2O đã sử dụng

Khối lượng

NaBH 4 (g)

Khối lượng NiCl 2 6H 2 O (g)

Ni 2 B (g)

Khối lượng sản phẩm (g)

Hiệu suất (%)

Hòa tan hoàn toàn 0,96 g homopiperonylamin; 0,05 g NaOH; 0,48 g Na2SO4

vào 8 ml methanol Thêm từ từ dung dịch gồm 0,97 g 2,3-dimethoxybenzaldehyd trong methanol trong 10 phút Đun hồi lưu ở 75oC trong 6h Sau đó thêm từ từ vào khối phản ứng 0,64 g NaBH4 và 16 ml methanol Tiếp tục đun hồi lưu trong 6h

Kết thúc phản ứng thêm nước cất để hòa tan phần chất rắn rồi chiết với ethyl acetat 3 lần, mỗi lần 25,0 ml Gộp dịch chiết, cất quay loại hết dung môi Hòa tan cắn bằng dung dịch HCl trong methanol tới pH = 1-2 Tiếp tục cô đến cắn Rửa cắn với diethyl ether, rồi hòa tan trong aceton nóng Để lạnh kết tinh, lọc, sấy khô thu được

 Rf = 0,73 (Hệ dung môi n-BuOH : AcOH : H2O = 9,0: 2,0: 2,5)

 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất phản ứng

Tiến hành khảo sát ảnh hưởng của dung môi đến thời gian phản ứng ngưng tụ tạo imin (Hết nguyên liệu amin trên sắc ký đồ) thu được kết quả như bảng dưới đây

Bảng 3.5.Khảo sát việc lựa chọn dung môi tiến hành phản ứng ngưng tụ tạo amin

IV

Theo bảng 3.5: Tiến hành phản ứng không sử dụng dung môi thì phản ứng

không xảy ra, còn với dung môi methanol giúp giảm thời gian phản ứng 12 lần xuống còn 6h, thay vì 72h khi thực hiện với dicloromethan Do đó, trong khóa luận này, chúng tôi chọn methanol làm dung môi tiến hành phản ứng ngưng tụ imin từ

Thêm 15,8 ml dung dịch acid formic 85% và 1,58 g đồng sulfat vào bình cầu

100 ml, đun hồi lưu Sau 2h tiếp tục thêm 0,79 g hợp chất IV và 1,6 ml glyoxal đun

hồi lưu ở 100oC Phản ứng hoàn thành sau 26h Hạ nhiệt độ khối phản ứng về nhiệt

độ phòng Cất kiệt loại dung môi Bổ sung 17 ml aceton, lọc lấy dịch Dịch thu được đun sôi rồi thêm 8,0 ml HCl đặc, để lạnh kết tinh qua đêm Lọc lấy tủa thu được

berberin clorid V

 Kết quả: