Hầu hết tế bào động vật khi phát triển trong in vivo đều bám vào một cấu trúc trong mô liên kết, màng cơ bản hay chất nền khoáng nhƣ xƣơng. Vì vậy khi nuôi cấy tế bào động vật trong in vitro phải sử dụng các bình thủy tinh hay chai Rough có tráng lớp bám dính giúp tế bào phát triển. Nhƣng theo Phan Kim Ngọc và Phạm Văn Phúc (2006), quá trình nuôi cấy in vitro của tế bào máu không cần lớp bám dính nhƣ những dòng tế bào khác và nó có thể phát triển tốt trong môi trƣờng huyền phù.
Vì thế chúng tôi tiến hành nuôi cấy thử nghiệm trên ống nghiệm 15ml theo quy trình nuôi cấy 1 ml máu trong 72 giờ giống chai Rough. Kết quả thu đƣợc theo bảng 4.3
Bảng 4.3 Kết quả nuôi cấy trên chai Rough và ống nghiệm 15 ml
Thiết bị Chai Rough Ống nghiệm 15 ml
Số lần lập lại 3 3 Thành công 2 2 Số phiến kính quan sát 18 18 Số phiến kính thành công 6 4 Tỷ lệ phiến kính thành công (%) 33,33 22,22 Số tế bào thành công 14 5
Kết quả sau thời gian nuôi cấy và nhuộm, chúng tôi khả năng nuôi cấy thành công ở ống nghiệm 15 ml và chai Rough là nhƣ nhau (số mẫu thành công đều là hai). Khi quan sát thì số phiến kính thành công khi nuôi trên ống nghiệm là 4, còn trên chai Rough là 6. Nhƣng số tế bào thành công ở ống nghiệm 15 ml là rất thấp (5 tế bào ở trung kỳ) so với chai Rough (14 tế bào thành công). Có thể do khi nuôi cấy ở ống 15 ml, thể tích môi trƣờng và máu chiếm 2/3 thể tích bình. Mặc dù trong môi trƣờng đã có Hepes giúp cung cấp lƣợng CO2 và trong quá trình nuôi cấy chúng tôi không đóng chặt nắp và có lắc đều hai lần trong ngày. Nhƣng vì không khí chiếm thể tích là rất thấp (1/3 thể tích) và diện tích mặt phẳng tiếp xúc của tế bào với không khí nhỏ khi nuôi cấy ở ống nghiệm 15 ml so với chai Rough. Điều này có thể làm không ổn định lƣợng khí và pH cần thiết cho tế bào, nên kết quả số lƣợng tế bào thu đƣợc ở ống nghiệm là không nhiều.
Tuy nhiên, kết quả trên là một bƣớc đầu cho việc dùng ống nghiệm 15 ml thay thế cho chai Rough trong nuôi cấy tế bào. Việc ứng dụng ống nghiệm 15 ml trong nuôi cấy tế bào máu sẽ tiết kiệm đƣợc giá thành.
Vì ống nghiệm 15 ml có giá thành rẻ hơn, có thể xử lý dễ dàng cũng nhƣ tái sử dụng lại nhiều lần để nuôi cấy tế bào máu. Ngoài ra, khi nuôi cấy với hàm lƣợng kháng đông nhƣ nhau,máu ở ống 15 ml ít bị đông hơn nuôi cấy trong chai Rough, nên có thể thu đƣợc nhiều bạch cầu hơn. Có thể do lớp bám dính tráng trong lòng của chai Rough làm các hồng cầu khi lắng xuống bám dính lại, dễ gây đông máu.
NST nuôi cấy trên chai Rough NST nuôi cấy trên ống nghiệm 15 ml
Hình 4.1 Nhiễm sắc thể nhuộm với giemsa (X 1000)
Sau khi nhuộm và chụp ảnh lại, dựa trên tỷ lệ chiều dài cánh p và q của NST chúng tôi xác định nhuộm sắc thể thỏ gồm kiểu hình: Metacentric, acrocentric, submetacentric, subtelocentric và telocentric.
Kết quả này giống với các công trình nghiên cứu trƣớc đây nhƣ Robson và Shaver (1979), Parkányi và ctv (2004).
Hình 4.2 Hình dạng nhiễm sắc thể thỏ (X 1000)
Chúng tôi cũng ghi nhận lại đƣợc đặc điểm của chu kỳ phân bào của các tế bào bạch cầu khi quan sát dƣới kính hiển vi. Chúng tôi nhận thấy hầu nhƣ các tế bào đều ở giai đoạn gian kỳ, đặc biệt là khi ủ colcemid ở thời gian 20 phút.
C B D E A A – Metacentric B – Submetacentric C – Subtelocentric D –Telocentric E – Acrocentric
Gian kỳ Tiền kỳ Trung kỳ sớm Trung kỳ Hậu kỳ Mạt kỳ
Hình 4.3 Chu kỳ phân chia của tế bào bạch cầu (X 1000)