Nghiên cứu quy trình xác định diquat, paraquat trong thực phẩm bằng kỹ thuât HPLC

Nghiên cứu quy trình xác định diquat, paraquat thực phẩm kỹ thuât HPLC Cao Công Khánh*, Nguyễn Tường Vy** *Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thựcphẩm quốc gia **Trường Đợi học Dược Hà Nội SUMMARY Food safety is a concern o f society today Diquat and paraquat herbicides are chemicals widely used in agriculture worldwide Many countries have promulgated standards, MRL o f diquat, paraquat in food To help control food quality, we study the process o f defining diquat, paraquat in food by HPLC Subjects o f the study sample is some kind o f food (rice, corn, soybeans, potatoes) and some vegetables (spinach, spinach, broccoli, cabbage) Investigation o f chromatographic conditions to determine diquat, paraquat in food Conduct evaluation and repeat the correct method The results obtained show that our method o f achieving the requirements o f the AOAC The HPLC method was proposed to determination diquat, paraquat in food with the conditions as follows: - Column:PolymerX5uRP-l 100A(150mmx4,6mm;5pm) - Mobile phase: Mix 10,3ml diethylamin, 3,0g sodium pentansulfonat, U,2g sodium natri perchlorat, l,36g kali dihydro phosphat per liter H p , adjusted pH=2,0 by acid percloric - Injection volume: 50p i; flow rate: 1ml/min - Detector PDA: X= 257nm (for paraquat) andX= 308nm (for diquat) Ti/kh6a:A0AC, diquat, HPLC, paraquat, polymerX Đặt vấn đề An toàn vệ sinh thực phẩm mối quan tâm xã hội diquat (DQ) paraquat (PQ) hóa chất diệt cỏ sử dụng rộng rãi giới nông nghiệp [6], [7] Đây chất tan tốt nước, độc (đặc biệt với phổi), có tỷ lệ tử vong cao [2] Nhiểu nước ban hành paraquat hệ thống HPLC -Thẩm định phương pháp phân tích xây dựng Hóa chất, thiết bị đối tượng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu tiêu chuẩn, giới hạn cho phép diquat, paraquat - Một số loại lương thực: gạo, ngô, đậu tương - Một số loại rau: rau muống, rau dền, cải xanh, cải b ắp , thực phẩm, đồng thời đưa phương Các loại đối tượng nghiên cứu lấy ngẫu pháp để xác định hai chất diệt cỏ Tại Việt Nam, nhiên từ chợ Hà Nội Bộ Y tế đưa giới hạn cho phép hai chất Dụng cụ, trang thiết bị số loại thực phẩm chưa ban - Cột sắc ký: PolymerX 5u RP-1 100A (150mm X hành phương pháp thống để xác định chúng 4,6mm;5|am) tiền cột C18 [1] Để góp phẩn kiểm soát chất lượng thực phẩm, - Hệ thống HPLC Shimazu với detector DAD nghiên cứu quy trình xác định diquat, - Cân phân tích có độ xác 0,1 mg paraquat thực phẩm kỹ thuật HPLC với - Máy đo pH, máy nghiền mẫu, máy ly tâm, bể mục tiêu: - Khảo sát điểu kiện phân tích diquat, cách thủy - Bộ chiết pha rắn cột chiết pha rắn SI-1 (phenomenex) - Các dụng cụ xác: bình định mức, autopipet, ống nghiệm , Hóa chất, chất chuẩn - Chuẩn diquat dibromua, paraquat diclorua (Dr Ehrentorfer) có độ tinh khiết >99,0% - Các hóa chất: Diethylamin, natri pentasulfonat, natri perclorat, kali dihydro phosphat, acid perloric, ể Tốc độ dòng: 1ml/phút Thể tích tiêm m ẫũ 50 mI Các điều kiện sắc ký có khác biệt so với điều kiện AOAC 992.17 [3] giúp tách hai chất diquat, paraquat tốt hơn, thu sắc đồ phân tích hình Phương pháp xử lý mẫu Theo AOAC 992.17 [3] số tài liệu khác [4] [5], diquat paraquat chiết khỏi mẫu natri hydroxỵd, acid hydrocloric đạt yêu cầu dùng dung dịch acid hydrocloric 2M Sau đó, mẫu cho HPLC điểu chinh pH = 9-10 làm qua cột SPE silica rổi định lượng sắc ký lỏng hiệu cao Xử lý kết - Sử dụng phẩn mềm cài đặt sẵn hệ thống HPLC - Phương pháp tính toán thống kê có hỗ trợ Thẩm định phương pháp Khoảng tuyến tính đường chuẩn: Chúng đả tiến hành xây dựng đường chuẩn sau: pha dãy dung dịch chuẩn hỗn hợp diquat, paraquat có nổng độtừ0,05fig/ml tới 30|jg/ phần mểm Microsoft Excel ml dung dịch pha động Tiến hành chạy sắc Kết bàn luận Hinh Sác đỗ hõn hợp chuổn diquũt (Ầ=3ũ8nm) vò paraquat (Ằ=257nm} Lựa chọn điều kiện sắc ký Chúng tòi tham khảo nghiên cứu [3], [4], [5], tiến hành khảo sát lựa chọn điểu kiện ký với điểu kiện đả lựa chọn Kết thu sau: Bòng l Sự phụ thuộc diện tích p k vào nóng độ áiquũt, paraquat sắc ký sau: - Pha động: 10,3ml diethylamin, 3g natri pentasulíonat, 12,2g natri perclorat, 1,36g kali Nổng độ (|ig/ml) Diên tích pic (mAU*s) Diquat Paraquat Nóng độ (ịjg/ml) Diện tích pic(m AU *s) Diquat dihydro phosphat pha 1L nước, chỉnh pH=2 với acid percloric - Cột tách: PolymerX 5u RP-1 100A (150mm X 4,6mm;5nnn) tiền cột C18 - Detector DAD: với bước sóng 257nm cho paraquat, 308 cho diquat Para­ quat 0,05 15148 17474 2,0 589554 677290 0,1 29199 33399 5,0 1434396 1677284 0,2 61667 67735 10,0 2700191 3258491 0,5 146811 168703 20,0 5633287 6307266 1,0 294768 341114 30,0 8060946 9681029 Kết thu bảng Do LOQ = 3,33 X LOD [3], nên giới hạn định lượng diquat, paraquat dung môi pha động 0,03ụg/ml, nển mẫu 0,045ụg/ml Xác định độ lặp lại độ thu hồi: - Sử dụng phương pháp thêm chuẩn: thêm 10 15 20 25 30 35 lượng xác diquat, paraquat chuẩn vào mẫu thử cho nồng độ nằm khoảng tuyến tính - Sử dụng mẫu trắng, thêm chuẩn mức nồng độ khác 200, 500 lOOOng Mỗi mức nống độ làm lặp lại lẩn Sáng2 Giới họn phát cùa diquat poroquaĩ N én m ẫ u Mẫu trắng L O D (|ig /n il) D iq u a t P a q u a t 0,015 0,015 Phương pháp có độ lặp lại từ 4,4 - 6,6% nổng độ từ 200-1000 ng nằm giới hạn cho phép Khoảng tuyến tính diquat paraquat tương đối rộng, nồng độ từ 0,05|ag/ml tới 30|jg/ml, với hệ số tương quan tuyến tính >0,999 Trong phân tích thực tế, tùy theo nồng độ diquat paraquat mẫu thực để lập đường chuẩn thích hợp Giới hạn phát (LOD) giới hạn định lượng (LOQ) €)ể xác định giới hạn phát hiện, dùng chuẩn 0,05|jg/ml pha loãng dịch chiết mẫu trắng thu chiểu cao chất phân tích gấp lẩn tín hiệu đường mẫu trắng Mẫu ứắng mẫu ngô chất phân tích, chuẩn bị giống với mẫu thử AOAC (Bảng 3) Độ thu hồi phương pháp mức nồng độ từ 200-1000 ng 70% (Bảng 4), áp dụng phương pháp để xác định diquat, paraquat loại thực phẩm Phân tích mẫu thực tế: Sau tiến hành khảo sát phương pháp, tiến hành phân tích mẫu thực tế gồm sổ loại ngũ cốc: gạo, ngô, khoai, lạc, đậu tương số loại rau xanh: rau muống, rau dền, rau cải xanh, Các mẫu lấy ngẫu nhiên từ chợ Hà Nội phân tích theo quỵ trình nhưtrên Kết thu (Bảng 5) Báng ỉ Két quà độ lợp lợi phương pháp Thêm chuẩn 200ng s (m A U *s) TB SD R SD (% ) T h ê m c h u ẩ n SO O ng T h ê m c h u ẩ n lO O O n g D iq u a t P a q u a t D iq u a t P a q u a t D iq u a t P a q u a t 40210 42556 10U Ũ4 121656 243382 238428 42358 43517 113037 121685 246435 233669 44089 45025 111041 123637 232082 263834 45157 45354 105579 117595 242651 253951 42155 47263 119852 138075 212644 265805 40936 42014 107469 126719 213348 265365 42484 44288 109680 124895 231757 253508 1866 1964 6509 7109 15320 14280 ,4 ,4 ,9 ,7 ,6 ,6 Bảng Két độ thu hôi cùa phương pháp Lương thêm(ng) rim thấy (ng) Diquat Paraquat Diquat Paraquat 133,5 127,5 66,7 70,7 140,8 130,3 70,4 72,4 146,7 134,8 73,4 75,0 150,4 135,7 75,2 75,5 140,1 141,3 70,1 78,8 136,0 125,9 68,0 69,8 340,9 359,0 68,2 71,8 381,6 359,1 76,3 71,8 374,8 364,8 75,0 73,0 356,2 347,1 71,2 69,4 404,8 407,1 81,0 81,4 362,6 373,9 72,5 74,8 825,7 700,8 82,6 70,1 836,1 686,9 83,6 68,7 787,2 775,1 78,7 77,5 823,2 746,2 82,3 74,6 721,0 780,9 72,1 78,1 723,4 779,6 72,3 78,0 200 ng 500 ng 1000 ng Mẫu Dộlặplại-RSD(%) Rtb(%) Độ thu hối R (%) Diquat Paraquat Diquat Paraquat 70,6 73,7 4,5 4,5 74,0 73,7 6,0 5,6 78,6 74,5 6,6 5,6 Thêm vào (ng) rim thấy (ng) R(%) KPH - 200 141 70,5 KPH - 200 139 69,5 Diquat KPH - Paraquat KPH - Diquat KPH - Paraquat KPH - Diquat KPH - Paraquat KPH - ChẫtPT Diquat Ngô Paraquat Khoai Lạc Đậu tương BA I N G H I E N c u u ^ Diquat KPH - Paraquat KPH - Gạo KPH - 100 76,2 76,2 KPH - 200 73,1 73,1 Diquat KPH - Paraquat KPH - Diquat KPH - Paraquat KPH - Diquat KPH - Paraquat KPH - Diquat KPH - Paraquat KPH - Diquat Ldi Xdnn Paraquat Rau dén Rau muống Cải bắp Cấn tây Đã kiểm tra phân tích 10 mẫu thực phẩm phát thấp (15 ppb), có tương quan chặt chẽ Hà Nội, chưa phát mẫu có chứa dư lượng thuốc diệt cỏ diquat, paraquat nồng độ diện tích píc (> 0,999), độ thu hồi độ lặp lại cao đáp ứng yêu cẩu AOAC Điểm khác biệt để tài so với phương pháp AOAC Kết luận pha động tách hai chất diquat paraquat tốt Phương pháp sử dụng Sau tiến hành thẩm định phương pháp phân để phân tích diquat, paraquat nhiều loại thực phẩm tích, thu kết sau: giới hạn TÀI LIỆU THAM KHẢO QĐ 46/2007/QĐ-BYT, Quy định giới hạn tối đa ô nhiễm sinh học hoá học thực phẩm Lê Hổng Hà, Tinh hình ngộ độc thuốc diệt cỏ paraquat (Gramoxone) số tinh phía Nam - Biện pháp phòng ngừa điều trị, Bệnh Viện Chợ Rẫy AOAC Official method 992.17, Diquat and paraquat residues ìn potatoes, Liquid chromatographic method (1995) J.w Munch and WJ Bashe (1997), "Determination of diquat and paraquat in drinking water by liquid-solid extraction and high performance liquid chromatoghraphy with ultraviolet detection", U S Environmental Protection Agency, Method 549.2, Revision 1.0 Takeaki Nagata, Keiko Kudo, Kojiro Kimura and Tohru Imamura (1993), "Simultaneous determination of paraquat and diquat in human tissues by high performance liquid chromatography", Journal of Chromatography,\/o\.6^7, pp 119-123 Diquat, World health organization, Food and agriculture Paraquat, World health organization, Food and agriculture, Data sheets on pesticides No Rev 1, ... hạn định lượng diquat, paraquat dung môi pha động 0,03ụg/ml, nển mẫu 0,045ụg/ml Xác định độ lặp lại độ thu hồi: - Sử dụng phương pháp thêm chuẩn: thêm 10 15 20 25 30 35 lượng xác diquat, paraquat. .. (Bảng 4), áp dụng phương pháp để xác định diquat, paraquat loại thực phẩm Phân tích mẫu thực tế: Sau tiến hành khảo sát phương pháp, tiến hành phân tích mẫu thực tế gồm sổ loại ngũ cốc: gạo,... - Paraquat KPH - Diquat KPH - Paraquat KPH - Diquat KPH - Paraquat KPH - Diquat KPH - Paraquat KPH - Diquat Ldi Xdnn Paraquat Rau dén Rau muống Cải bắp Cấn tây Đã kiểm tra phân tích 10 mẫu thực