Trên thế giới, các bufadienolid trong đó có bufalin đã được phân tích bằng nhiều kỹ thuật như miễn dịch huỳnh quang [8], sắc ký lớp mỏng [7], sắc ký lỏng với detector PDA [9], song phổ b
Trang 12 Todeschini, R and V Consonni (2000), Hondbook of Molecular Descriptors 1 St ed Methods and Principles in Medicinal Chemistry, ed
R Mannhold, H Kubinyi (2002), and H Timmerman Vol 11., D-69469 Weinheim, Federal Republic of Germany: WILEY-VCH Verlag GmbH 667.
3 Marrero-Ponce, Y and V Romero (2002), TOMOCOMD software (TOpologicơl Molecular COMputer Design) for Windows: Central
University of Las Villas Villa Clara Cuba p (http://tomocomd.com/).
4 Marrero-Ponce,Y.(2004),Total and local (atom and atom type) molecular quadratic indices: significance interpretation, comparison to
other molecular descriptors, and QSPR/QSAR applications Bioorg Med Chem 12 (24): p 6351-69.
5 Marrero-Ponce, Y., et al (2005), Non-stochastic and Stochastic Linear Indices of the"Molecular Pseudograph's Atom Adjacency Matrix":
Application to'in silico'Studies for the Rational Discovery of New Antimalarial Compounds Bioorg Med Chem 13 (4): p 1293-304.
6 Marrero-Ponce, Y and F Torrens (2008), Novel 2D TOMOCOMD-CARDD Descriptors: Atom-based Stochastic and non-Stochastic Bilinear Indices and their QSPR Applications J/Wứf/7 Chem 44 (3): p 650-673.
7 STATISTICA (data analysis software system) V 9.2009, Tulsa,OK:: StatSoft Inc.
8 OECD Principles for the Validation, for Regulatory Purposes, of (Quantitative) Structure-Activity Relationship Models, in 37^^ Joint Meeting of the Chemicals Committee and Working Party on Chemicals, Pesticides ond Biotechnology 17-19 November 2004 Paris.
9 OECD, in Guidance Document on the Validation of (Quantitative) structure-Activity Relationship [(Q)SAR] Models, Series on Testing
and Assessment No 692007: Poris p 154pp.
10 Alvarez-Ginarte, Y.M., et al (2008), Chemometric and Chemoinformatic Analyses of Anabolic and Androgenic Activities of Testosterone
and Dihydrotestosterone Analogues Bioorg Med Chem 16 (12): p 6448-6459.
11 Paul, S.M., et al (2010), How to improve R&D productivity: the pharmaceutical industry's grand challenge Nature Reviews Drug
Discovery, March 9: p 203-214.
Xây dựng quy trình xác định bufalin
trong sản phẩm có chứa bột cóc
bằng LC-MS/MS
Lê Đình Chi', Lê Thị Hổng Hảo^
Irường Đại học Dược Hà Nội, ^Viện Kiểm nghiệm an toàn Vệ sinh thực phẩm quốc gia
SUMMARY
A selective LC-MS/MS method has been developed to determine the residue of bufalin, a toxin of Vietnamese toad, in products containing toad powder In this method, bufolin was extracted from sample with methanol, the methanol extraction was then centrifuged twice at 6000 rpm and gone through the Supm-poly® HLB SPE column for pre-treatment before a no lysing by LC-MS/MS The chromatographic procedure using C IS column as stationary phase with a gradient elusion using acetonitrile -0.1% (m/v) formic odd mixture The ESI(-\-)-MS/MS detection using the primary ion (m/z = 387) and 2 secondary ions (m/z = 351 and 255) to identify bufalin and the secondary ion (m/z = 351) for quantitative determination of bufalin The limit of quantification (LOQ) and limit of detection (LOD) for bufolin of the established method were 4.16 ng/ml and 1.25 ng/ml, respectively The method was also validated
in terms of specificity, linearity, accuracy and precision, and has been proved to be reliable enough for identification and quantitative determination ofbufalin in products containing toad powder.
Từ khóa: bufalin, độc tố cóc, sốc ký lỏng, khối phổ, LC-MS/MS.
Bufalin, tên khoa học là (sp, 5(ỉ)-3, [4] Các hợp chất nhóm bufadienolid cũng chính là 14-dihydroxỵbufa-20, 22-dienolide (công thức phân thành phẩn chủ yếu tạo thành độc tố cóc (bufotoxin) tử: khối lượng phân tử: 386,52, công thức gây nên nhiều trường hợp tử vong do án thịt cóc bị cấu tạo được trình bày ở hình 1 là một chất thuộc nhiễm độc tại Việt Nam [2] Thịt cóc đã từ lâu được sử nhóm bufadienolid và đã được xác định là thành phần dụng để tăng cường dinh dưỡng [1 ] và hiện đang có
1 0 Nghiên cứu duợcThông tin thuõc i Số 1/2015
Trang 2nhiều loại chế phẩm chế biến từ Cóc lưu hành trên thị
trường như bột đạm cóc (Viện Dinh dưỡng), bột cóc
Royal Baby (Công ty cổ phẩn Dược Hải Phòng) Song
trên thực tế tại Việt Nam, hiện chưa có quy định và
phương pháp phân tích chính thức để kiểm soát giới
hạn bufadienolid, trong đó có bufalin, trong các chế
phẩm có chứa bột cóc Trên thế giới, các bufadienolid
(trong đó có bufalin) đã được phân tích bằng nhiều
kỹ thuật như miễn dịch huỳnh quang [8], sắc ký lớp
mỏng [7], sắc ký lỏng với detector PDA [9], song
phổ biến nhất là sắc ký lỏng kết nối khối phổ [5], [6],
Trước nhu cầu thực tế kể trên, để góp phẩn kiểm soát
an toàn của nhóm chế phẩm có thành phẩn từ Cóc,
nghiên cứu này nhằm mục tiêu xây dựng quy trình
để phân tích bufalin trong các chế phẩm này bằng kỹ
thuật sắc ký lỏng kết nối khối phổ hai lần (LC-MS/MS)
nhằm hướng tới chuẩn hóa giới hạn bufalin nói riêng
và các độc tố cóc nói chung trong các chế phẩm có
chứa bột cóc
Hình 1 Công thức cổu too của buUn
Nguyên vật liệu và phưcAig pháp nghiên cứu
Nguyên tìẹu
- Chất đối chiếu bufalin mã số B0261 (hàm lượng
98,0% nguyên trạng, số lô: 0001445062) của hãng
Sigma - Adrich, Mỹ
- Mẳu chế phẩm có thành phẩn bột cóc không
nhiễm bufalin để làm nển mẫu trắng (mã hóa; mẫu
MI) (có thành phần chính là bột cóc 50% (kl/kl) cùng
lysin, kẽm, vitamin D3)
- Mẫu chế phẩm có thành phẩn bột cóc (mã hóa:
mẫu M2, M3) (Thành phẩn: M2 gồm bột cóc (50% kl/
kl), bột đậu xanh (50% kl/kl); M3 là bột cóc)
- Methanol, acetonitril loại dùng cho HPLC;
methanol, ethanol, ethyl acetat, cloroform, acetonitril,
acid formic, acid acetic băng loại tinh khiết phân tích
(Merck, Đức)
- Nước cất 2 lẩn được lọc qua thiết bị lọc siêu sạch
- Các dung dịch, trừ khi nói rõ dung môi, đểu được
chuẩn bị trong nước cất 2 lẩn được lọc qua thiết bị lọc siêu sạch, sau khi chuẩn bị được lọc lại qua màng lọc 0,45 |am trước khi sử dụng với hệ thống sắc ký
n iế t bị
- Hệ thong sắc ký lỏng kết nối hai lần khối phổ (LC/
MS-MS): máy HPLC 20 AXL (Shimadzu, Nhật), khối phổ ABI5500 QQQ (Aplied Biosystem, Mỹ)
- Cột sắc ký c,3 Symmetry Waters (250 mm X 4,6 mm; 5 |jm) (Waters, Mỹ)
-Tiển cột c,g Symmetry Waters (20 mm X 3,9 mm;
5 |jm) (Waters, My)
- Cột chiết pha rắn Supra-poly® HLB (Hydrophilic/ Lipophilic Balanced), cỡ hạt 30 (Perkin Elmer, Mỹ)
Phương pháp nghiên cứu
- Dựa vào cấu tạo, tính chất hóa lý của bufalin và
bằng nghiên cứu thực nghiệm để xây dựng, thẩm định phương pháp xác định bufalin trong chế phẩm gổm các giai đoạn: Xử lý mẫu để chiết bufalin và phân tích bufalin trên hệ thống LC/MS-MS
- Xử lý kết quả bằng phương pháp thống kê có sử dụng phần mềm Microsoft Excel
Kết quả nghiên cúu
Xâỵ dựng quỵ trình chiết bufalin từ mẫu chế phẩm
Để thu được quy trình xử lý mẫu cho phép chiết được hết bufalin từ mẫu chế phẩm có bột cóc, dung môi chiết và các điểu kiện khác của quá trình chiết bao gồm thể tích dung môi sử dụng, thời gian chiết, điểu kiện lỵ tâm sau chiết đã được khảo sát vể dung môi chiết, quá trình khảo sát sơ bộ được thực hiện với methanol, ethanol, acetonitril, ethyl acetat và cloroform Kết quả thực nghiệm cho thấy methanol cho phép chiết bufalin với hiệu suất tốt nhất (trên 80%, xem thêm phẩn thẩm định quy trình), do đó, methanol được dùng làm dung môi chiết bufalin từ nển mâu Sau đó, các thông số: thể tích methanol đem chiết, loại cột SPE sử dụng đều được khảo sát để chọn ra điểu kiện thích hợp Từ kết quả thực nghiệm, quy trình chiết bufalin từ nển chế phẩm có bột cóc được thiết lập gổm các bước như sau:
- Cân chính xác khoảng 1,00 gam mẫu vào ống ly tâm 50 ml, thêm vào ống 10 ml methanol
- Lắc xoáy ống ly tâm 1 phút, sau đó lắc siêu âm 15 phút ở nhiệt độ phòng
- Ly tâm 5 phút, tốc độ 6000 vòng/phút
- Gạn lấy phần dịch, cô quay ở 40°c tới cắn, hòa
tan cắn bằng 1,0 ml methanol Pha loãng bằng nước thành 10,0 ml, cho vào ống ly tâm
- Ly tâm 5 phút, tốc độ 6000 vòng/phút Lọc phần dịch trong qua giấy lọc
Số 1/2015 1 Nghiên cứu duợcf hòng tin thuốc 1 1
Trang 3m/z = 255
Hình 2 Kết quở bân phá ion mẹ (m /z=387) củơ buíơlin (Hơi ion con có cường độ mợnh nhâtcó íĩìứ lân lượt là 351 và 255)
Bâng 1 Chương trinh grơdientdung môi
- Cho dịch lọc qua cột chiết pha rắn Supra-poly®
HLB đã hoạt hóa trước bằng 1 ml methanol và 1 ml
nước
-Thu dịch lọQ cô cách thủy lấy cắn, hòa tan trong
1,00 ml methanol và tiêm vào hệ thống sắc kí
Xây dựng quy trình phân tích bufalin bằng LC/
MS-MS
Để phân tích bufalin trong mẫu chế phẩm, các
điểu kiện của hệ thống sắc ký, điểu kiện phân tích MS-
MS và các thông tin sửdụng để định danh, định lượng
bufalin đã được khảo sát ỉựa chọn Hệ thống sắc ký
gồm cột Symmetry Waters (250 mm X 4,6 mm; 5
|JIT|) với tiền cột c^g Symmetry Waters (20 mm X 3,9
mm; 5 |jm), cột và tiền cột để trong điểu kiện nhiệt độ
phòng thí nghiệm Pha động là hỗn hợp acetonitrỉl và
dung dịch acid formic 0,1 % (thành phần theo chương
trình gradient dung môi ở bảng 1), tốc độ dòng duy trì
ở 1,0 ml/phút Detector khối phổ hai lần với nguồn ion
hóa bằng phun điện tử (ESI (+)-MS/MS) sử dụng thế
của nguồn ion hóa (ESI) là 5500 V Thể tích tiêm mẫu là
10 ịllL Để xây dựng đường chuẩn phân tích, sử dụng
các dung dịch chuẩn bufalin pha trong methanol có
nồng độ trong khoảng từ 10 đến 1000 ng/ml (ppb)
Kết quả phân tích thực nghiệm trên hệ thống LC/
MS-MS cho thấy khi phân tích ở các điểu kiện đã chọn,
bufalin cho mảnh mẹ có m/z = 387 và hai mảnh con
có m/z lẩn lượt là 351 và 255 (hình 2) Sử dụng cả ba mảnh này để định danh bufalin cho phép đạt số điểm
định danh (Identification point - IP) là 4, phù hợp với
quy định của EC về định danh bằng khối phổ hai lẩn [3] Mảnh ion con m/z = 351 có cường độ mạnh nhất được sử dụng để định lượng bufalin
Thẩm định quy trình phân tích bufalin trong chế phẩm
Độ đặc hiệu
Độ đặc hiệu của quy trình được đảm bảo nhờ tính đặc hiệu của detector MS-MS Bufalin được định danh nhờ kết hợp giữa mảnh ion mẹ m/z = 387 và hai ion con có m/z = 255 và m/z = 351 tạo thành khi bắn phá ion mẹ Sự xuất hiện của các mảnh này cho phép xác định sự có mặt của bufalin với số điểm định danh (IP)
là 4, phù hợp với quy định của EC [3] Khi phân tích
các mẫu trắng (mẫu MI không có bufalin), mẫu trắng thêm chuẩn và mẫu M2 có nhiễm bufalin, kết quả thực nghiệm trên sắc ký đổ cho thấy trên mẫu trắng thêm chuẩn và mẫu chế phẩm nhiễm bufalin, pic của bufalin được tách riêng khỏi các thành phẩn khác trong mẫu, trong khi trên mẫu trắng không xuất hiện pic tại thời điểm thời gian lưu của bufalin (hình 3)
12 Nghiên cứu duợcThông tin thuõc I Số 1/2015
Trang 4^ muÊrnU arfitSfma
Hình 3 Khởo sát độ đặc hiệu củũ quy trình (A: nên mẫu trâng (chếphẩm không chỨQ buíũlin), B: nên mẫu trâng thêm buíơlin chuẩn, C: mău chếphẩm có chứa buíolin)
Độ thích hợp hệ thống
Độ thích hợp hệ thống được đánh giá qua độ lặp lại vé thời gian lưu và diện tích pic buíalin khi tiêm 6 lẩn dung dịch chuẩn buíalin 20 ng/ml Kết quả thực nghiệm cho thấy hệ thống sắc ký có điểu kiện đã chọn thích hợp cho việc phân tích định lượng buíalin, qua độ dao động thấp vể thời gian lưu (RSD = 0,1 %) và diện tích pic (RSD = 0,6%) với buíalin
Độ tuyến tỉnh
Độ tuyến tính được đánh giá trong khoảng nồng độ buíalin từ 10 ng/ml đến 1000 ng/ml Đáp ứng diện tích pic của buíalin ở các nồng độ khác nhau được trình bày tại bảng 2
Bâng 2 Quan hệ tuyển tính giữơ diện tích pic và nông độ buíũlin
Nổng độ bufolin (ng/ml) 10,0 20,0 50,0 100,0 200,0 500,0 1000,0
Diện tích pic bufalin ( cps.s) 267Ì2 51500 78311 111023 214167 462054 899143
Như vậy, trong khoảng nồng độ đã khảo sát có sự tương quan tuyến tính chặt chẽ giữa diện tích pic và nồng
độ bufalin
Độ lặp lợi, độ đúng
Độ lặp lại của quy trình được đánh giá thông qua kết quả phân tích độc lập 6 lần trên mẫu M2 xác định sơ
bộ có phát hiện thấy bufalin Độ đúng được đánh giá qua việc xác định độ thu hổi khi thêm chuẩn bufalin vào nền mẫu M2 ở ba mức khối lượng khác nhau Kết quả đánh giá độ lặp lại và độ đúng (bảng 3) cho thấy khi phân tích bufalin quy trình cho độ lặp Ịại tốt (RSD = 4,6% trên mẫu có hàm lượng bufalin thấp, khoảng 14 ng/g) và độ đúng phù hợp (tỷ lệ thu hổi từ 81,0 - 88,2% cho cả ba mức thêm chuẩn)
Số 1/2015 Nghiên Cứu duợcĩhỏngtln thuốc 13
Trang 5Độ lặp lại (n = 6) - Hàm lượng buíalỉn (Trung bình ± SD): 14,3 ng/g ± 0,7 ng/g
-RSD:4,6%
Độ đúng (3 mức, mỗi mức
phân tích 3 lẩn)
- Tỷ lệ thu hổi chung trên cả 3 mức sau 9 lán phân tích: 81,0 - 88,2%
- Kết quả tìm lại cụ thể ở mỗi mức:
• Mức 1 (thêm 10,0 ngbuíalỉn): 8,1 - 8,4 ng (81,0-84,0%) Mức 2 (thêm 50,0 ng buíalỉn); 41,3 - 42,9 ng (82,6 - 85,8%)
• Mức 3 (thêm 100,0 ng buíalin): 86,6 - 88,2 ng {86,6 - 88,2%)
LOD -Tính theo nồng độ buíalỉn tiêm sắc ký: 1,25 ng/ml
- Kết quả đáp ứng pic tại nồng độ LOD (tiêm lặp lại 6 lẩn);
• Diện tích pic (Trung bình ± SD) (cps.s): 6479 ± 869 (RSD: 13,4%)
• Chiều cao pic (Trung bình ± SD) (cps): 684 ± 93 (RSD: 13,6%)
LOQ -Tính theo nồng độ buíalin tiêm sắc ký: 4,16 ng/ml
Giới hạn định lượng, giới hạn phát hiện
Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) của quy trình được xác định bằng cách pha loảng dẩn dung dịch chuẩn buíalin, so sánh đáp ứng pic buíalin với dao động của đường nền ở mức nổng độ buíalin 1,25 ng/ml, đáp ứng pic của buíalin gấp 3 lẩn dao động nển (hình 3) Như vậy, LOD của quy trình là 1,25 ng/ml, tính theo nồng độ buíalin tiêm vào hệ thống sắc ký Từ đó có thể suy ra LOQ = 3,3LOD = 4,16 ng/ml Kết quả phân tích khi tiêm lặp lại 6 lẩn ở LOD (bảng 5) cho thấy đáp ứng pic buíalin lặp lại tương đối tốt (RSD = 13,4% theo diện tích pic và 13,6% theo chiểu cao pic) Như vậy, ở nồng độ này có thể phát hiện được buíalin ở mức định tính một cách tin cậy
I XIC (7 pal4>: XĨXìOOíyí^ỉXtO ữt H>; B«lt2 inm Samolt 17 (BC-SM1.: iSETI oMCrvAo 5pf<y)
ứng dụng phân tích buíalin trong một số mẫu chế phẩm
Trong khuôn khổ nghiên cứu này, đã có ba mẫu chế phẩm có thành phẩn bột cóc được phân tích buíalin bằng phương pháp LC/MS-MS được xây dựng Trong đó, có hai mẫu phát hiện thấy có dư lượng buíalin ở mức lẩn lượt là 14,3 ng/g và 19,0 ng/g (bảng 4)
Bỏng 4 Két quà phân tích bufền trên một số mẫu chếptìổm
tính theo ng/g(ppb)
14 I Nghiên CỨU duộclhôngtlnthuõc I SỐ1/2015
Trang 6s
Bàn luận
Những kết quả thực nghiệm khi thẩm định
phương pháp đã được so sánh với quy định vể náng
lực phương pháp phân tích của EC [3] vể độ đặc hiệu,
quy trình đã đáp ứng được yêu cầu tối thiểu về điểm
định danh (với IP = 4) vể độ lặp lại, trên nền mẫu
M2 có nồng độ bufalin khoảng 14 ng/g (14 |Lig/kg),
quy trình cho RSD = 4,6%, đạt quy định của EC (CV
= 20% với hàm lượng từ > 10 |ig/kg đến 100 |ig/kg)
[3] Tương tự, độ đúng của quy trình (với độ thu hồi
từ 81,0 đến 88,2% ở nồng độ chuẩn bufalin thêm vào
nền mẫu từ 10 - 100 ng/ml) cũng đạt quy định của EC
(cho phép dao động độ đúng 80 - 110% với khoảng
nồng độ, hàm lượng > 10|Lig/kg (10 ng/g) [3] Như vậy,
quy trình đã xây dựng cho kết quả đủ tin cậy khi áp
dụng phân tích bufalin trong mẫu chế phẩm có thành
phần từ Cóc So sánh với các nghiên cứu khác đã công
bố, trong khi có nhiều nghiên cứu phân tích bufalin
và các bufadienolid khác trong nọc các loại Cóc [5],
[6], nhóm nghiên cứu chưa tìm thấy công bố nào về
phân tích bufalin tổn dư trong bột cóc hay chế phẩm
trong thời gian xây dựng phương pháp này Như vậy, phương pháp này có thể được ứng dụng làm quy trình để đánh giá bufalin tổn dư trong các chế phẩm
có thành phẩn bột cóc
Kết luận
Trong nghiên cứu này, kỹ thuật LC/MS-MS, một kỹ thuật phân tích có độ nhạy, độ đặc hiệu cao, thích hợp cho phân tích vi lượng đã được áp dụng để thiết lập một quy trình phân tích bufalin trong các chế phẩm có chứa bột cóc Quy trình phân tích đã được thẩm định
vể độ đặc hiệu, độ thích hợp hệ thống, độ đúng, độ chính xáQ xác định khoảng tuyến tính, LOD, LOQ Kết quả thẩm định cho thấy quỵ trình phù hợp để phân tích bufalin trong chế phẩm có thành phẩn từ Cóc với
độ đặc hiệu khi định tính đạt số điểm định danh theo quy định của EC và độ đúng, độ lặp lại khỉ định lượng thỏa mãn yêu cầu EC quỵ định [3] Quỵ trình đã bước đáu được ứng dụng phân tích trên một số mẫu chế phẩm và xác định được 2 mẫu có dư lượng bufalin ở mức dưới 20 ppb
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 Đỗ Tất Lợi (2004), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, Nhà xuất bản Y học, 965-968.
2 Trần Minh Hoàng (2010), Làm gì để ngăn chặn những cái chết thương tâm do Cóc, Thông tin - truyền thông ATTP, Mạng Thông tin Y
tế Sởy tế Bình Dương (http://soyte.binhduong.gov.vn/soyte/index.php/ve-sinh-an-toan-thuc-pham/thong-tin-moi/618-lam-gi-ngn- chn-nhng-cai-cht-thng-tam-do-coc).
3 Commission of the European Communities (2002), Commission decision of 12 August 2002 implementing Council Directive 96/23/
EC concerning the performance of analytical methods and the interpretation of results (2002/657/EC), OfficialJournol of European
Communities, L22V8 - L221/35.
4 R.Verpoorte, Phan Quốc Kinh, A.B.Svendsen (1979), Chemical constituents of Vietnamese toad venom collected from Bufo
meìanostịctu, Journal of Ethnophơrmơcoly, 1 (2), 197-202.
5 Y.Cao, LZhao, Q.Liang, et al (2007), study of the determination and pharmacokinetics of bufadienolides in dog's plasma after
administration of Liu-Shen-Wan by high performance liquid chromatography time-of-flight mass spectrometry, Journal of
Chromatography B, 853 (1 -2), 227-233.
6 Y.Hu, Z.Yu, ZJ.Yang, G.Zhu, W.Fong (2011), Comprehensive chemical analysis of Venenum Bufonis by using liquid chromatography/
electrospray ionization tandem mass spectrometry, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 56 (2), 210-220.
7 H-J.Lee, F-RKoung, K-R.Kwon, et al (2012), Comparative Analysis of the Bufonis Venenum by Using TLC, HPLC, and LC-MSfor Different
Extraction N\ethods, Journal of Pharmacopuncture, 15 (4), 52-65.
8 M.Oda, M.Kurosawa, S.Numazawa, et al (2001), Determination of bufalin-like immunoreactivity in serum of humans and rats by time-
resolved fluoroimmunoassay for using a monoclonal antibody Life Science, 68 (10), 1107-1117.
9 Z.Yang, H.Luo, H.Wang, et al (2008), Preparative isolation of bufalin and cinobufagin from Chinese traditional medicine Chan Su,
Journal of Chromatographic Sciences, 46 (1), 81 -85.
SỐ1/2015 Nghiên cứu duợcf hống tin thuớc ỉ 1 5