_ — "ồ" BÀI NGHIÊN CỨU * ^ TÀI LIỆU THAM KHÀO M, N., (1987), Orgơnic-chemicol drugs and their synonyms Berlin: Akademie-Verlag Todeschini, R and V Consonni (2000), Hondbook of Molecular Descriptors 1St ed Methods and Principles in Medicinal Chemistry, ed R Mannhold, H Kubinyi (2002), and H Timmerman Vol 11., D-69469 Weinheim, Federal Republic of Germany: WILEY-VCH Verlag GmbH 667 Marrero-Ponce, Y and V Romero (2002), TOMOCOMD software (TOpologicơl Molecular COMputer Design) for Windows: Central University of Las Villas Villa Clara Cuba p (http://tomocomd.com/) Marrero-Ponce,Y.(2004),Total and local (atom and atom type) molecular quadratic indices: significance interpretation, comparison to other molecular descriptors, and QSPR/QSAR applications Bioorg Med Chem 12 (24): p 6351-69 Marrero-Ponce, Y., et al (2005), Non-stochastic and Stochastic Linear Indices of the"Molecular Pseudograph's Atom Adjacency Matrix": Application to'in silico'Studies for the Rational Discovery of New Antimalarial Compounds Bioorg Med Chem 13 (4): p 1293-304 Marrero-Ponce, Y and F.Torrens (2008), Novel 2D TOMOCOMD-CARDD Descriptors: Atom-based Stochastic and non-Stochastic Bilinear Indices and their QSPR Applications J/Wứf/7 Chem 44 (3): p 650-673 STATISTICA (data analysis software system) V 9.2009, Tulsa,OK:: StatSoft Inc OECD Principles for the Validation, for Regulatory Purposes, of (Quantitative) Structure-Activity Relationship Models, in 37^^ Joint Meeting of the Chemicals Committee and Working Party on Chemicals, Pesticides ond Biotechnology 17-19 November 2004 Paris OECD, in Guidance Document on the Validation of (Quantitative) structure-Activity Relationship [(Q)SAR] Models, Series on Testing and Assessment No 692007: Poris p 154pp 10 Alvarez-Ginarte, Y.M., et al (2008), Chemometric and Chemoinformatic Analyses of Anabolic and Androgenic Activities ofTestosterone and Dihydrotestosterone Analogues Bioorg Med Chem 16 (12): p 6448-6459 11 Paul, S.M., et al (2010), How to improve R&D productivity: the pharmaceutical industry's grand challenge Nature Reviews Drug Discovery, March 9: p 203-214 Xây dựng quy trình xác định bufalin sản phẩm có chứa bột cóc LC-MS/MS Lê Đình Chi', Lê Thị Hổng Hảo^ Irường Đại học Dược Hà Nội, ^Viện Kiểm nghiệm an toàn Vệ sinh thực phẩm quốc gia SUMMARY A selective LC-MS/MS method has been developed to determine the residue of bufalin, a toxin of Vietnamese toad, in products containing toad powder In this method, bufolin was extracted from sample with methanol, the methanol extraction was then centrifuged twice at 6000 rpm and gone through the Supm-poly® HLB SPE column for pre-treatment before anolysing by LC-MS/MS The chromatographic procedure using C IS column as stationary phase with a gradient elusion using acetonitrile -0.1% (m/v) formic odd mixture The ESI(-\-)-MS/MS detection using the primary ion (m/z = 387) and secondary ions (m/z = 351 and 255) to identify bufalin and the secondary ion (m/z = 351) for quantitative determination of bufalin The limit of quantification (LOQ) and limit of detection (LOD) for bufolin of the established method were 4.16 ng/ml and 1.25 ng/ml, respectively The method was also validated in terms of specificity, linearity, accuracy and precision, and has been proved to be reliable enough for identification and quantitative determination ofbufalin in products containing toad powder Từ khóa: bufalin, độc tố cóc, sốc ký lỏng, khối phổ, LC-MS/MS Đặt Vấn để Bufalin, tên khoa học (sp, 5(ỉ)-3, 14-dihydroxỵbufa-20, 22-dienolide (công thức phân tử: khối lượng phân tử: 386,52, công thức cấu tạo trình bày hình chất thuộc nhóm bufadienolid xác định thành phần 10 Nghiên cứu duợcThông tin thuõc i Số 1/2015 nhựa cóc Việt Nam (Bufo melơnostictus) [4] Các hợp chất nhóm bufadienolid thành phẩn chủ yếu tạo thành độc tố cóc (bufotoxin) gây nên nhiều trường hợp tử vong án thịt cóc bị nhiễm độc Việt Nam [2] Thịt cóc từ lâu sử dụng để tăng cường dinh dưỡng [1] có A nhiều loại chế phẩm chế biến từ Cóc lưu hành thị trường bột đạm cóc (Viện Dinh dưỡng), bột cóc Royal Baby (Công ty cổ phẩn Dược Hải Phòng) Song thực tế Việt Nam, chưa có quy định phương pháp phân tích thức để kiểm soát giới hạn bufadienolid, có bufalin, chế phẩm có chứa bột cóc Trên giới, bufadienolid (trong có bufalin) phân tích nhiều kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang [8], sắc ký lớp mỏng [7], sắc ký lỏng với detector PDA [9], song phổ biến sắc ký lỏng kết nối khối phổ [5], [6], Trước nhu cầu thực tế kể trên, để góp phẩn kiểm soát an toàn nhóm chế phẩm có thành phẩn từ Cóc, nghiên cứu nhằm mục tiêu xây dựng quy trình để phân tích bufalin chế phẩm kỹ thuật sắc ký lỏng kết nối khối phổ hai lần (LC-MS/MS) nhằm hướng tới chuẩn hóa giới hạn bufalin nói riêng độc tố cóc nói chung chế phẩm có chứa bột cóc Hình Công thức cổu too buUn Nguyên vật liệu phưcAig pháp nghiên cứu Nguyên tìẹu - Chất đối chiếu bufalin mã số B0261 (hàm lượng 98,0% nguyên trạng, số lô: 0001445062) hãng Sigma - Adrich, Mỹ - Mẳu chế phẩm có thành phẩn bột cóc không nhiễm bufalin để làm nển mẫu trắng (mã hóa; mẫu MI) (có thành phần bột cóc 50% (kl/kl) lysin, kẽm, vitamin D3) - Mẫu chế phẩm có thành phẩn bột cóc (mã hóa: mẫu M2, M3) (Thành phẩn: M2 gồm bột cóc (50% kl/ kl), bột đậu xanh (50% kl/kl); M3 bột cóc) - Methanol, acetonitril loại dùng cho HPLC; methanol, ethanol, ethyl acetat, cloroform, acetonitril, acid formic, acid acetic băng loại tinh khiết phân tích (Merck, Đức) - Nước cất lẩn lọc qua thiết bị lọc siêu - Các dung dịch, trừ nói rõ dung môi, đểu chuẩn bị nước cất lẩn lọc qua thiết bị lọc siêu sạch, sau chuẩn bị lọc lại qua màng lọc 0,45 |amtrước sử dụng với hệ thống sắc ký n iế t bị - Hệ thong sắc ký lỏng kết nối hai lần khối phổ (LC/ MS-MS): máy HPLC 20 AXL (Shimadzu, Nhật), khối phổ ABI5500 QQQ (Aplied Biosystem, Mỹ) - Cột sắc ký c Symmetry Waters (250 mm X 4,6 mm; |jm) (Waters, Mỹ) -Tiển cột c,g Symmetry Waters (20 mm X 3,9 mm; |jm) (Waters, My) - Cột chiết pha rắn Supra-poly® HLB (Hydrophilic/ Lipophilic Balanced), cỡ hạt 30 (Perkin Elmer, Mỹ) Phương pháp nghiên cứu - Dựa vào cấu tạo, tính chất hóa lý bufalin nghiên cứu thực nghiệm để xây dựng, thẩm định phương pháp xác định bufalin chế phẩm gổm giai đoạn: Xử lý mẫu để chiết bufalin phân tích bufalin hệ thống LC/MS-MS - Xử lý kết phương pháp thống kê có sử dụng phần mềm Microsoft Excel ,3 Kết nghiên cúu Xâỵ dựng quỵ trình chiết bufalin từ mẫu chế phẩm Để thu quy trình xử lý mẫu cho phép chiết hết bufalin từ mẫu chế phẩm có bột cóc, dung môi chiết điểu kiện khác trình chiết bao gồm thể tích dung môi sử dụng, thời gian chiết, điểu kiện lỵ tâm sau chiết khảo sát vể dung môi chiết, trình khảo sát sơ thực với methanol, ethanol, acetonitril, ethyl acetat cloroform Kết thực nghiệm cho thấy methanol cho phép chiết bufalin với hiệu suất tốt (trên 80%, xem thêm phẩn thẩm định quy trình), đó, methanol dùng làm dung môi chiết bufalin từ nển mâu Sau đó, thông số: thể tích methanol đem chiết, loại cột SPE sử dụng khảo sát để chọn điểu kiện thích hợp Từ kết thực nghiệm, quy trình chiết bufalin từ nển chế phẩm có bột cóc thiết lập gổm bước sau: - Cân xác khoảng 1,00 gam mẫu vào ống ly tâm 50 ml, thêm vào ống 10 ml methanol - Lắc xoáy ống ly tâm phút, sau lắc siêu âm 15 phút nhiệt độ phòng - Ly tâm phút, tốc độ 6000 vòng/phút - Gạn lấy phần dịch, cô quay 40°c tới cắn, hòa tan cắn 1,0 ml methanol Pha loãng nước thành 10,0 ml, cho vào ống ly tâm - Ly tâm phút, tốc độ 6000 vòng/phút Lọc phần dịch qua giấy lọc Số 1/20151 Nghiên cứu duợcf hòng tin thuốc 11 BÀI NGHIÊN CỨU * m/z = 351 m/z = 255 Hình Kết quở bân phá ion mẹ (m /z=387) củơ buíơlin (Hơi ion có cường độ mợnh nhâtcó íĩìứ lân lượt 351 255) Bâng Chương trinh grơdientdung môi Thời gian (phút) 0,0 4,0 7,0 7,1 10,0 ĩỷ lệ p h a « iig (% ) ta ig acid formic 0,1 % 80 20 20 80 80 Acetonitril 20 80 80 20 20 - Cho dịch lọc qua cột chiết pha rắn Supra-poly® bufalin cho mảnh mẹ có m/z = 387 hai mảnh HLB hoạt hóa trước ml methanol ml có m/z lẩn lượt 351 255 (hình 2) Sử dụng ba nước mảnh để định danh bufalin cho phép đạt số điểm -Thu dịch lọQ cô cách thủy lấy cắn, hòa tan định danh (Identification point - IP) 4, phù hợp với 1,00ml methanol tiêm vào hệ thống sắc kí quy định EC định danh khối phổ hai lẩn Xây dựng quy trình phân tích bufalin LC/ [3] Mảnh ion m/z = 351 có cường độ mạnh MS-MS sử dụng để định lượng bufalin Để phân tích bufalin mẫu chế phẩm, Thẩm định quy trình phân tích bufalin điểu kiện hệ thống sắc ký, điểu kiện phân tích MS- chế phẩm MS thông tin sửdụng để định danh, định lượng Độ đặc hiệu bufalin khảo sát ỉựa chọn Hệ thống sắc ký Độ đặc hiệu quy trình đảm bảo nhờ tính gồm cột Symmetry Waters (250 mm X 4,6 mm; đặc hiệu detector MS-MS Bufalin định danh |JIT|) với tiền cột c^g Symmetry Waters (20 mm X 3,9 nhờ kết hợp mảnh ion mẹ m/z = 387 hai ion mm; |jm), cột tiền cột để điểu kiện nhiệt độ có m/z = 255 m/z = 351 tạo thành bắn phá phòng thí nghiệm Pha động hỗn hợp acetonitrỉl dung dịch acid formic 0,1 % (thành phần theo chương ion mẹ Sự xuất mảnh cho phép xác trình gradient dung môi bảng 1), tốc độ dòng trì định có mặt bufalin với số điểm định danh (IP) 1,0 ml/phút Detector khối phổ hai lần với nguồn ion 4, phù hợp với quy định EC [3] Khi phân tích hóa phun điện tử (ESI (+)-MS/MS) sử dụng mẫu trắng (mẫu MI bufalin), mẫu trắng nguồn ion hóa (ESI) 5500 V Thể tích tiêm mẫu thêm chuẩn mẫu M2 có nhiễm bufalin, kết 10 ịllL Để xây dựng đường chuẩn phân tích, sử dụng thực nghiệm sắc ký đổ cho thấy mẫu trắng dung dịch chuẩn bufalin pha methanol có thêm chuẩn mẫu chế phẩm nhiễm bufalin, pic bufalin tách riêng khỏi thành phẩn khác nồng độ khoảng từ 10 đến 1000 ng/ml (ppb) mẫu, mẫu trắng không xuất Kết phân tích thực nghiệm hệ thống LC/ MS-MS cho thấy phân tích điểu kiện chọn, pic thời điểm thời gian lưu bufalin (hình 3) Nghiên cứu duợcThông tin thuõc I Số 1/2015 A ^muÊrnU arfitSfma Ĩ i Hình Khởo sát độ đặc hiệu củũ quy trình (A: nên mẫu trâng (chếphẩm không chỨQ buíũlin), B: nên mẫu trâng thêm buíơlin chuẩn, C: mău chếphẩm có chứa buíolin) Độ thích hợp hệ thống Độ thích hợp hệ thống đánh giá qua độ lặp lại vé thời gian lưu diện tích pic buíalin tiêm lẩn dung dịch chuẩn buíalin 20 ng/ml Kết thực nghiệm cho thấy hệ thống sắc ký có điểu kiện chọn thích hợp cho việc phân tích định lượng buíalin, qua độ dao động thấp vể thời gian lưu (RSD = 0,1 %) diện tích pic (RSD = 0,6%) với buíalin Độ tuyến tỉnh Độ tuyến tính đánh giá khoảng nồng độ buíalin từ 10 ng/ml đến 1000 ng/ml Đáp ứng diện tích pic buíalin nồng độ khác trình bày bảng Bâng Quan hệ tuyển tính giữơ diện tích pic nông độ buíũlin Nổng độ bufolin (ng/ml) 10,0 20,0 50,0 100,0 200,0 500,0 1000,0 Diện tích pic bufalin ( cps.s) 267Ì2 51500 78311 111023 214167 462054 899143 Phương trình hồi quy ỵ= 870,03x + 29610 Hệ số tương quan r= 0,9997 Như vậy, khoảng nồng độ khảo sát có tương quan tuyến tính chặt chẽ diện tích pic nồng độ bufalin Độ lặp lợi, độ Độ lặp lại quy trình đánh giá thông qua kết phân tích độc lập lần mẫu M2 xác định sơ có phát thấy bufalin Độ đánh giá qua việc xác định độ thu hổi thêm chuẩn bufalin vào mẫu M2 ba mức khối lượng khác Kết đánh giá độ lặp lại độ (bảng 3) cho thấy phân tích bufalin quy trình cho độ lặp Ịại tốt (RSD = 4,6% mẫu có hàm lượng bufalin thấp, khoảng 14 ng/g) độ phù hợp (tỷ lệ thu hổi từ 81,0 - 88,2% cho ba mức thêm chuẩn) Số 1/2015 Nghiên Cứu duợcĩhỏngtln thuốc 13 BÀI NGHIÊN CỨU ' Bảng Kồ đánh gió độ lặp lại Chỉ tiêu Độ lặp lại (n = 6) Độ (3 mức, mức phân tích lẩn) LOD LOQ Kết thẩmđịnh - Hàmlượng buíalỉn (Trung bình ± SD): 14,3 ng/g ± 0,7 ng/g -RSD:4,6% - Tỷlệthuhổi chung trêncả3mứcsau9lánphântích: 81,0- 88,2% - Kết quảtìmlại cụthểởmỗi mức: •Mức1(thêm10,0ngbuíalỉn): 8,1 - 8,4ng (81,0-84,0%) Mức2(thêm50,0ng buíalỉn); 41,3 - 42,9 ng (82,6- 85,8%) •Mức3(thêm100,0ng buíalin): 86,6- 88,2ng {86,6- 88,2%) -Tính theonồng độbuíalỉntiêmsắc ký: 1,25 ng/ml - Kết quảđápứng pictại nồng độLOD(tiêmlặplại 6lẩn); •Diệntích pic (Trung bình± SD) (cps.s): 6479± 869 (RSD: 13,4%) •Chiềucaopic (Trung bình± SD) (cps): 684± 93 (RSD: 13,6%) -Tính theonồng độbuíalintiêmsắc ký: 4,16 ng/ml Giới hạn định lượng, giới hạn phát Giới hạn phát (LOD) giới hạn định lượng (LOQ) quy trình xác định cách pha loảng dẩn dung dịch chuẩn buíalin, so sánh đáp ứng pic buíalin với dao động đường mức nổng độ buíalin 1,25 ng/ml, đáp ứng pic buíalin gấp lẩn dao động nển (hình 3) Như vậy, LOD quy trình 1,25 ng/ml, tính theo nồng độ buíalin tiêm vào hệ thống sắc ký Từ suy LOQ = 3,3LOD = 4,16 ng/ml Kết phân tích tiêm lặp lại lẩn LOD (bảng 5) cho thấy đáp ứng pic buíalin lặp lại tương đối tốt (RSD = 13,4% theo diện tích pic 13,6% theo chiểu cao pic) Như vậy, nồng độ phát buíalin mức định tính cách tin cậy I XIC (7 pal4>:XĨXìOOíyí^ỉXtO ữt H>; B«lt2 inm Samolt 17 (BC-SM1.: iSETI oMCrvAo 5pf 10 |ig/kg đến 100 |ig/kg) [3] Tương tự, độ quy trình (với độ thu hồi từ 81,0 đến 88,2% nồng độ chuẩn bufalin thêm vào mẫu từ 10 - 100 ng/ml) đạt quy định EC (cho phép dao động độ 80 - 110% với khoảng nồng độ, hàm lượng > 10|Lig/kg (10 ng/g) [3] Như vậy, quy trình xây dựng cho kết đủ tin cậy áp dụng phân tích bufalin mẫu chế phẩm có thành phần từ Cóc So sánh với nghiên cứu khác công bố, có nhiều nghiên cứu phân tích bufalin bufadienolid khác nọc loại Cóc [5], [6], nhóm nghiên cứu chưa tìm thấy công bố phân tích bufalin tổn dư bột cóc hay chế phẩm thời gian xây dựng phương pháp Như vậy, phương pháp ứng dụng làm quy trình để đánh giá bufalin tổn dư chế phẩm có thành phẩn bột cóc Kết luận Trong nghiên cứu này, kỹ thuật LC/MS-MS, kỹ thuật phân tích có độ nhạy, độ đặc hiệu cao, thích hợp cho phân tích vi lượng áp dụng để thiết lập quy trình phân tích bufalin chế phẩm có chứa bột cóc Quy trình phân tích thẩm định vể độ đặc hiệu, độ thích hợp hệ thống, độ đúng, độ xáQ xác định khoảng tuyến tính, LOD, LOQ Kết thẩm định cho thấy quỵ trình phù hợp để phân tích bufalin chế phẩm có thành phẩn từ Cóc với độ đặc hiệu định tính đạt số điểm định danh theo quy định EC độ đúng, độ lặp lại khỉ định lượng thỏa mãn yêu cầu EC quỵ định [3] Quỵ trình bước đáu ứng dụng phân tích số mẫu chế phẩm xác định mẫu có dư lượng bufalin mức 20 ppb TÀI LIỆU THAM KHẢO Đỗ Tất Lợi (2004), Những thuốc vị thuốc Việt Nam, Nhà xuất Y học, 965-968 Trần Minh Hoàng (2010), Làm để ngăn chặn chết thương tâm Cóc, Thông tin - truyền thông ATTP, Mạng Thông tin Y tế Sởy tế Bình Dương (http://soyte.binhduong.gov.vn/soyte/index.php/ve-sinh-an-toan-thuc-pham/thong-tin-moi/618-lam-gi-ngnchn-nhng-cai-cht-thng-tam-do-coc) Commission of the European Communities (2002), Commission decision of 12 August 2002 implementing Council Directive 96/23/ EC concerning the performance of analytical methods and the interpretation of results (2002/657/EC), OfficialJournol of European Communities, L22V8 - L221/35 R.Verpoorte, Phan Quốc Kinh, A.B.Svendsen (1979), Chemical constituents of Vietnamese toad venom collected from Bufo meìanostịctu, Journal of Ethnophơrmơcoly, (2), 197-202 Y.Cao, LZhao, Q.Liang, et al (2007), study of the determination and pharmacokinetics of bufadienolides in dog's plasma after administration of Liu-Shen-Wan by high performance liquid chromatography time-of-flight mass spectrometry, Journal of Chromatography B, 853 (1-2), 227-233 Y.Hu, Z.Yu, ZJ.Yang, G.Zhu, W.Fong (2011), Comprehensive chemical analysis of Venenum Bufonis by using liquid chromatography/ electrospray ionization tandem mass spectrometry, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 56 (2), 210-220 H-J.Lee, F-RKoung, K-R.Kwon, et al (2012), Comparative Analysis of the Bufonis Venenum by Using TLC, HPLC, and LC-MSfor Different Extraction N\ethods, Journal of Pharmacopuncture, 15 (4), 52-65 M.Oda, M.Kurosawa, S.Numazawa, et al (2001), Determination of bufalin-like immunoreactivity in serum of humans and rats by timeresolved fluoroimmunoassay for using a monoclonal antibody Life Science, 68 (10), 1107-1117 Z.Yang, H.Luo, H.Wang, et al (2008), Preparative isolation of bufalin and cinobufagin from Chinese traditional medicine Chan Su, Journal of Chromatographic Sciences, 46 (1), 81 -85 SỐ1/2015 Nghiên cứu duợcf hống tin thuớc ỉ ... Mẳu chế phẩm có thành phẩn bột cóc không nhiễm bufalin để làm nển mẫu trắng (mã hóa; mẫu MI) (có thành phần bột cóc 50% (kl/kl) lysin, kẽm, vitamin D3) - Mẫu chế phẩm có thành phẩn bột cóc (mã... chế phẩm thời gian xây dựng phương pháp Như vậy, phương pháp ứng dụng làm quy trình để đánh giá bufalin tổn dư chế phẩm có thành phẩn bột cóc Kết luận Trong nghiên cứu này, kỹ thuật LC/ MS- MS,... 351 có cường độ mạnh MS- MS sử dụng để định lượng bufalin Để phân tích bufalin mẫu chế phẩm, Thẩm định quy trình phân tích bufalin điểu kiện hệ thống sắc ký, điểu kiện phân tích MS- chế phẩm MS