GIỚI THIỆU LUẬN ÁN Đặt vấn đề Viêm phổi thở máy (VPTM) là một vấn đề lâm sàng quan trọng không chỉ ở Việt Nam mà còn trên thế giới vì tần suất mắc bệnh và tử vong tăng cao. Nghiên cứu ở các nước Âu – Mỹ cho thấy tỉ lệ VPTM là 10%. Tại Canada, VPTM là 18 ca trên 1000 ngày thở máy. Các quốc gia Á Châu VPTM là 18%. Tại Việt Nam, VPTM dao động từ 20% - 52%. VPTM là nguyên nhân hàng đầu gây tăng tỉ lệ tử vong (26% - 72%), kéo dài thời gian nằm viện (41 so với 23 ngày ở nhóm có và không VPTM) và tăng chi phí điều trị (5 – 10 lần). VPTM được định nghĩa là viêm nhu mô phổi xảy ra sau 48 giờ thở máy qua nội khí quản hoặc qua khai khí quản. Chẩn đoán VPTM được thiết lập dựa trên chứng cứ lâm sàng và vi sinh. Việc xác định vi khuẩn gây bệnh thông qua cấy định lượng hoặc bán định lượng đàm hút qua nội khí quản đơn thuần hoặc qua nội soi phế quản. Việc định danh vi khuẩn bằng nhuộm Gram, nuôi cấy, đặc tính mọc và các phản ứng sinh hóa là chuẩn mực. Tuy nhiên phương pháp vi sinh kinh điển này không thể áp dụng trong các trường hợp sau. Vi khuẩn Gram âm khó mọc, mọc chậm; vi khuẩn hiếm hoặc chỉ biểu hiện một vài đặc tính về sinh hóa. Cũng như các vi khuẩn yếm khí, vi khuẩn không cấy được và bệnh lý nhiễm khuẩn có kết quả cấy âm tính, nhất là trên bệnh nhân sử dụng kháng sinh trước đó. Chẩn đoán phân tử, ngày nay, đã trở thành phương pháp tham chiếu để chẩn đoán vi sinh học của nhiều bệnh lý hô hấp. Vai trò của giải trình tự gene 16S-rRNA trong định danh vi khuẩn càng được chứng tỏ và được áp dụng rộng rãi trên lâm sàng. Phương pháp giải trình tự gene 16S-rRNA có thể phát hiện được hệ vi sinh trên đường hô hấp của người khỏe và bệnh nhân. Tại Việt Nam số liệu từ các nghiên cứu về định danh vi khuẩn dựa trên sinh học phân tử ở các bệnh nhân VPTM chưa nhiều và chưa được hệ thống đầy đủ. Ngày nay, vi khuẩn đa kháng kháng sinh là một thách thức toàn cầu. Đặc biệt là các quốc gia Á Châu, kể cả Việt Nam. Tỉ lệ A. baumannii kháng Carbapenem tăng lên nhanh chóng 6,7% (2001); 8% (2004); 80% (2010); 90% (2012). Tuy nhiên, kháng sinh đồ định lượng MIC bằng que E-test chưa được áp dụng rộng rãi và số liệu chưa được hệ thống đầy đủ. Các vi khuẩn mang gene SHV, TEM, IMP, OXA, NDM thủy phân phổ rộng các cephalosporin là thường gặp. Trong nước, việc tiếp cận có hệ thống gene kháng thuốc của vi khuẩn chính yếu gây VPTM chưa được ghi nhận và hệ thống hóa đầy đủ. Ở Việt Nam, chưa có nghiên cứu nào áp dụng giải trình tự thế hệ mới trong việc xác định vi khuẩn gây VPTM trên các mẫu dịch rửa phế quản phế nang. Chúng tôi đặt ra 3 câu hỏi nghiên cứu: (a) Có sự khác biệt nào trong định danh vi khuẩn gây VPTM giữa hai phương pháp định danh vi khuẩn dựa vào kiểu hình và giải trình tự gene 16S-rRNA; (b) Giá trị MIC và tỉ lệ đề kháng kháng sinh ở các nhóm vi khuẩn gây VPTM phân bố như thế nào?; (c) Tỉ lệ vi khuẩn chính yếu gây VPTM mang gene kháng thuốc là bao nhiêu và có mối liên quan giữa các vi khuẩn mang gene kháng thuốc với MIC hay không? Trả lời những câu hỏi nghiên cứu trên sẽ cung cấp những kiến thức quan trọng về qui mô đề kháng kháng sinh và xác lập được những tác nhân liên quan đến VPTM, giúp cho việc điều trị bệnh nhân tốt hơn. Mục tiêu nghiên cứu: 1. Xác định đặc điểm vi khuẩn gây viêm phổi thở máy bằng kỹ thuật giải trình tự gene 16S-rRNA, có so sánh với phương pháp định danh vi khuẩn dựa vào nhuộm Gram, nuôi cấy và các phản ứng sinh hóa.
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRẦN MINH GIANG NGHIÊN CỨU TÁC NHÂN VI KHUẨN GÂY VIÊM PHỔI THỞ MÁY VÀ GENE KHÁNG THUỐC BẰNG KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ Ngành: Hồi sức cấp cứu chống độc Mã số: 62720122 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC Thành phố Hồ Chí Minh - Năm 2019 GIỚI THIỆU LUẬN ÁN Đặt vấn đề Viêm phổi thở máy (VPTM) vấn đề lâm sàng quan trọng khơng Việt Nam mà giới tần suất mắc bệnh tử vong tăng cao Nghiên cứu nước Âu – Mỹ cho thấy tỉ lệ VPTM 10% Tại Canada, VPTM 18 ca 1000 ngày thở máy Các quốc gia Á Châu VPTM 18% Tại Việt Nam, VPTM dao động từ 20% - 52% VPTM nguyên nhân hàng đầu gây tăng tỉ lệ tử vong (26% - 72%), kéo dài thời gian nằm viện (41 so với 23 ngày nhóm có khơng VPTM) tăng chi phí điều trị (5 – 10 lần) VPTM định nghĩa viêm nhu mô phổi xảy sau 48 thở máy qua nội khí quản qua khai khí quản Chẩn đốn VPTM thiết lập dựa chứng lâm sàng vi sinh Việc xác định vi khuẩn gây bệnh thông qua cấy định lượng bán định lượng đàm hút qua nội khí quản đơn qua nội soi phế quản Việc định danh vi khuẩn nhuộm Gram, ni cấy, đặc tính mọc phản ứng sinh hóa chuẩn mực Tuy nhiên phương pháp vi sinh kinh điển áp dụng trường hợp sau Vi khuẩn Gram âm khó mọc, mọc chậm; vi khuẩn biểu vài đặc tính sinh hóa Cũng vi khuẩn yếm khí, vi khuẩn khơng cấy bệnh lý nhiễm khuẩn có kết cấy âm tính, bệnh nhân sử dụng kháng sinh trước Chẩn đốn phân tử, ngày nay, trở thành phương pháp tham chiếu để chẩn đoán vi sinh học nhiều bệnh lý hơ hấp Vai trò giải trình tự gene 16S-rRNA định danh vi khuẩn chứng tỏ áp dụng rộng rãi lâm sàng Phương pháp giải trình tự gene 16S-rRNA phát hệ vi sinh đường hô hấp người khỏe bệnh nhân Tại Việt Nam số liệu từ nghiên cứu định danh vi khuẩn dựa sinh học phân tử bệnh nhân VPTM chưa nhiều chưa hệ thống đầy đủ Ngày nay, vi khuẩn đa kháng kháng sinh thách thức toàn cầu Đặc biệt quốc gia Á Châu, kể Việt Nam Tỉ lệ A baumannii kháng Carbapenem tăng lên nhanh chóng 6,7% (2001); 8% (2004); 80% (2010); 90% (2012) Tuy nhiên, kháng sinh đồ định lượng MIC que E-test chưa áp dụng rộng rãi số liệu chưa hệ thống đầy đủ Các vi khuẩn mang gene SHV, TEM, IMP, OXA, NDM thủy phân phổ rộng cephalosporin thường gặp Trong nước, việc tiếp cận có hệ thống gene kháng thuốc vi khuẩn yếu gây VPTM chưa ghi nhận hệ thống hóa đầy đủ Ở Việt Nam, chưa có nghiên cứu áp dụng giải trình tự hệ việc xác định vi khuẩn gây VPTM mẫu dịch rửa phế quản phế nang Chúng đặt câu hỏi nghiên cứu: (a) Có khác biệt định danh vi khuẩn gây VPTM hai phương pháp định danh vi khuẩn dựa vào kiểu hình giải trình tự gene 16S-rRNA; (b) Giá trị MIC tỉ lệ đề kháng kháng sinh nhóm vi khuẩn gây VPTM phân bố nào?; (c) Tỉ lệ vi khuẩn yếu gây VPTM mang gene kháng thuốc có mối liên quan vi khuẩn mang gene kháng thuốc với MIC hay không? Trả lời câu hỏi nghiên cứu cung cấp kiến thức quan trọng qui mô đề kháng kháng sinh xác lập tác nhân liên quan đến VPTM, giúp cho việc điều trị bệnh nhân tốt Mục tiêu nghiên cứu: Xác định đặc điểm vi khuẩn gây viêm phổi thở máy kỹ thuật giải trình tự gene 16S-rRNA, có so sánh với phương pháp định danh vi khuẩn dựa vào nhuộm Gram, ni cấy phản ứng sinh hóa Đánh giá MIC tỉ lệ đề kháng kháng sinh nhóm vi khuẩn gây viêm phổi thở máy Xác định gene kháng thuốc vi khuẩn gây viêm phổi thở máy kỹ thuật PCR mối liên quan với MIC Tính cấp thiết đề tài Viêm phổi thở máy nguyên nhân hàng đầu gây tăng tỉ lệ tử vong, kéo dài thời gian nằm viện tăng chi phí điều trị Việc xác định xác, nhanh tác nhân vi khuẩn gây viêm phổi thở máy mang tính tiên lượng Giải trình tự gene 16S-rRNA đặc hiệu định danh vi khuẩn, ngày nay, áp dụng phổ biến Phương pháp sinh học phân tử khơng thơng qua cấy, khắc phục hạn chế vi sinh truyền thống Vi sinh kinh điển định danh vi khuẩn dựa vào kiểu hình gặp khó khăn trong trường hợp sau: vi khuẩn Gram âm khó mọc, mọc chậm; vi khuẩn biểu vài đặc tính sinh hóa, vi khuẩn yếm khí Các vi khuẩn khơng cấy bệnh lý nhiễm khuẩn có kết cấy âm tính, bệnh nhân sử dụng kháng sinh trước Đề kháng kháng sinh thách thức toàn cầu, đặc biệt quốc gia Á Châu có Việt Nam A baumannii, P aeruginosa K pneumoniae vi khuẩn hàng đầu gây viêm phổi thở máy gây đa kháng kháng sinh Việc thực kháng sinh đồ định lượng MIC que E-test dựa vi khuẩn phân lập từ bệnh nhân viêm phổi thở máy chưa áp dụng thường qui Hơn tỉ lệ vi khuẩn mang gene kháng thuốc mối liên quan với MIC chưa thống kê cách đầy đủ Hiện Việt Nam chưa có cơng trình nghiên cứu áp dụng giải trình tự gen 16S-rRNA hệ thống PGM Ion Torrent cho định danh vi khuẩn gây viêm phổi thở máy Chính chúng tơi tiến hành thực nghiên cứu Những đóng góp luận án Cơng trình nghiên cứu chúng tơi phát lồi vi khuẩn diện đường hô hấp bệnh nhân viêm phổi thở máy mà chưa công bố trước đây, đặc biệt vi khuẩn yếm khí Bênh cạnh cơng trình nghiên cứu chúng tơi cung cấp MIC sáu loại kháng sinh chủ lực thường sử dụng lâm sàng tất vi khuẩn gây viêm phổi thở máy Đặc biệt nồng độ MIC colistin A baumannii Ngồi cơng trình nghiên cứu chúng tơi cung cấp tranh chung cho bác sĩ lâm sàng gene kháng thuốc vi khuẩn yếu gây viêm phổi thở máy mối liên quan với MIC Từ giúp cho bác sĩ lâm sàng nhận định mức tác nhân vi khuẩn gây viêm phổi thở máy nhận biết gene kháng thuốc vi khuẩn gây viêm phổi thở máy Đồng thời giúp cho bác sĩ lâm sàng dễ dàng lựa chọn kháng sinh liều lượng cách sử dụng cho bệnh nhân viêm phổi thở máy có hiệu tốt Bố cục luận án Luận án có 108 trang Ngồi phần đặt vấn đề (2 trang), kết luận kiến nghị (4 trang), luận án gồm chương Chương - Tổng quan tài liệu (29 trang), chương - Đối tượng phương pháp nghiên cứu (16 trang), chương - Kết nghiên cứu (28 trang), chương - Bàn luận (29 trang) Luận án có 33 bảng, biểu đồ, sơ đồ, 117 tài liệu tham khảo (22 tiếng Việt 95 tiếng Anh) Chương 1: Tổng quan tài liệu 1.1 Định nghĩa: Viêm phổi thở máy (VPTM) viêm nhu mô phổi xảy sau 48 thở máy qua nội khí quản qua khai khí quản 1.2 Tỉ lệ mắc: dao động từ 10% đến 52% 1.3 Tỉ lệ tử vong: Có thể lên tới 76% 1.4 Bệnh nguyên: 1.4.1 Định danh vi khuẩn dựa vào kiểu hình: Có nhiều yếu tố khác ảnh hưởng đến tác nhân gây VPTM Tùy thuộc vào dân số nghiên cứu ICU khác nhau, thời gian nằm viện thời gian nằm ICU phương pháp chẩn đoán chuyên biệt sử dụng cho kết vi sinh gây VPTM khác Ở nhiều nghiên cứu cho thấy nhiễm khuẩn hô hấp vi khuẩn Gram âm Các nghiên cứu nước cho thấy ba tác nhân vi khuẩn gây VPTM hàng thường gặp A baumannii, K pneumoniae P aeruginosa 1.4.2 Định danh vi khuẩn dựa sinh học phân tử: Các phương pháp áp dụng dựa a-xít nucleic tiếp tục sử dụng phổ biến chẩn đoán bệnh lý nhiễm khuẩn Chúng trở thành phương pháp tham chiếu để chẩn đoán vi sinh học nhiều bệnh lý hô hấp Các phương pháp vượt trội phương pháp vi sinh kinh điển Các kỹ thuật phân tử chẩn đốn nhiễm khuẩn hơ hấp tập trung vào hệ thống phát đa mồi PCR giải trình tự gene 16S-rRNA cho thấy tính hữu dụng chuyên biệt định danh vi khuẩn thường gặp, vi khuẩn yếm khí, vi khuẩn hiếm, vi khuẩn mọc chậm, vi khuẩn cấy bệnh lý nhiễm khuẩn cho kết cấy âm tính Áp dụng kỹ thuật cao chẩn đoán vi khuẩn học khơng cung cấp chẩn đốn bệnh ngun bệnh truyền nhiễm mà hỗ trợ chọn lựa thời gian dùng kháng sinh công tác kiểm soát nhiễm khuẩn thật hiệu Hơn nữa, sinh học phân tử giúp hiểu biết tốt dịch tễ bệnh học vi khuẩn vi khuẩn định danh xét nghiệm kiểu hình 1.5 Các yếu tố nguy cơ: Có thể xuất phát từ bệnh nhân can thiệp như: tuổi, bệnh nền, bỏng, chấn thương thuốc dùng 1.6 Chẩn đoán: Theo khuyến cáo hiệp hội bệnh lý truyền nhiễm Hoa Kỳ Hội Lồng Ngực Hoa Kỳ 2016 Các tiêu chuẩn bao gồm thâm nhiễm phổi xuất kèm theo chứng lâm sàng Thâm nhiễm phổi có nguồn gốc từ phổi gồm có khởi phát sốt, khởi phát tiết đàm mủ, khởi phát tăng bạch cầu máu khởi phát giảm oxy hóa máu bệnh nhân thở máy sau 48 1.7 Thực kháng sinh đồ 1.7.1 Kháng sinh đồ khuếch tán: Trên đĩa giấy có tẩm kháng sinh nồng độ định áp dụng rộng rãi 1.7.2 Kháng sinh đồ định lượng MIC: Kỹ thuật định lượng đo nồng độ ức chế tối thiểu vi khuẩn một, cho nồng độ định kháng sinh Kết cho biết xác độ nhạy cảm kháng sinh vi khuẩn 1.8 Ứng dụng sinh học phân tử phát gene kháng thuốc: Men β – lactamase vi khuẩn Gram âm tiết ra, thủy phân hệ kháng sinh β – lactam chế thường gặp gây đề kháng kháng sinh lâm sàng Sự diện đặc tính men đóng vai trò quan trọng việc lựa chọn điều trị kháng sinh thích hợp Do trước việc tiếp cận cấu trúc phân tử men β – lactamase phức tạp, gây khó khăn lớn việc xếp loại men β – lactamase, chí bị trùng lắp nhóm Ngày nay, với phát triển công nghệ sinh học phân tử, việc tiếp cận dễ dàng đến trình tự a xít amin, xác định gene mã hóa men lâm sàng Chương 2: Đối tượng phương pháp nghiên cứu 2.1 Thiết kế nghiên cứu: Nghiên cứu tiến cứu mô tả cắt ngang 2.2 Địa điểm nghiên cứu: Khoa ICU nội, ICU ngoại phòng Đột quị khoa Nội Thần Kinh bệnh viện Nhân Dân Gia Định 2.3 Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 11/2014 đến 9/2015 2.4 Đối tượng nghiên cứu: Dân số mục tiêu: Bệnh nhân nằm khoa bệnh nặng có thở máy Dân số chọn mẫu: Bệnh nhân nằm điều trị khoa kể 2.5 Cỡ mẫu cơng thức tính cỡ mẫu Cơng thức tính cỡ mẫu: n = Z2(1-α/2)p(1-p)/d Sau tính tốn làm tròn n = 220 2.6 Tiêu chuẩn chọn mẫu 2.6.1 Tiêu chuẩn chọn vào nghiên cứu: Sau 48 thở máy, bệnh nhân có thâm nhiễm mới, lan tỏa tiến triển X-quang ngực kèm ≥ tiêu chuẩn: T0 ≥ 38oC, ≤ 36oC; tăng tiết đàm đàm đổi màu; tăng tiêu thụ oxy: tăng FiO2 ≥ 20%/ngày ≥ ngày liền, tăng PEEP ≥ cmH2O/ngày, ≥ ngày liền; bạch cầu máu ≥ 12.000/mm3 hay ≤ 4.000/mm3 2.6.2 Tiêu chuẩn loại ra: < 18 tuổi, xảy viêm phổi trước 48 giờ, Bệnh nhân bị nhồi máu tim 24 đầu, rối loạn nhịp thất nguy hiểm chưa kiểm sốt được, phụ nữ có thai, ghép tạng 2.7 Phương pháp tiến hành: bệnh nhân nội soi phế quan ống mềm Dịch rửa phế quản chia làm hai Một gởi phòng vi cấy định lượng kháng sinh đồ khuếch tán MIC Phần hai gởi phòng sinh học phân tử Trung Tâm Pháp Y TP Hồ Chí Minh định danh vi khuẩn giải trình tự Ion Torrent PGM tìm gene kháng thuốc Chương 3: Kết nghiên cứu Trong thời gian lấy mẫu nghiên cứu từ ngày 3/11/2014 đến ngày 30/9/2015, tuyển chọn 220 bệnh nhân thở máy Các bệnh nhân tuyển chọn từ khoa Hồi Sức Tích Cực Chống Độc (ICU nội), Phẫu Thuật Gây Mê Hồi Sức (ICU ngoại) phòng Đột quị khoa Nội Thần Kinh BV NDGĐ Tất bệnh nhân thỏa tiêu chuẩn VPTM lâm sàng nội soi phế quản giường Trong có 12 bệnh nhân tuyển chọn vào nghiên cứu hai lần (do bệnh nhân tái nhập viện nhập vào khoa ICU thời gian lấy mẫu) 3.1 Đặc điểm chung Trong mẫu nghiên cứu nam giới chiếm gần 50% Tuổi trung bình 71 ± 16,7 Phần lớn bệnh nhân tuyển chọn từ khoa ICU nội (79%) (Bảng 3.1) Bảng 3.1: Đặc điểm lâm sàng bệnh nhân nghiên cứu (n = 220) Đặc điểm Thống kê Tuổi (năm; trung bình (± độ lệnh chuẩn)) 70,7 (± 16,7) Số ca (tỉ lệ %) Giới (nam) 109 (49,5) Phân loại khoa Hồi Sức Tích Cực Chống Độc 174 (79,1) Phẫu Thuật Gây Mê Hồi Sức 43 (19,5) Phòng Đột quị Khoa Nội Thần Kinh (1,4) Lý nhập viện Khó thở 92 (41,8) Rối loạn tri giác 39 (17,7) Tai nạn giao thông 14 (6,4) Đặc điểm Thống kê Đau bụng 13 (5,9) Sốt (3,2) Tai nạn sinh hoạt (3,2) Ngưng tim ngưng thở (2,3) Trung vị (khoảng tứ phân vị) Số ngày thở máy trước NSPQ (6 – 11,5) Thang điểm APACHE II 22 (18 - 28) Thời gian nằm ICU 16 (11 - 25) 3.2 Định danh vi khuẩn dựa vi sinh kinh điển Có 164 mẫu (trong 220 mẫu) dịch rửa phế quản phế nang thỏa tiêu chuẩn ≥104 cfu/ml Trong có 13 mẫu cấy dương tính đồng thời với hai lồi vi khuẩn khác Bao gồm A baumannii K pneumoniae; A baumannii P aeruginosa; Klebsiella spp P aeruginosa có ba mẫu Còn lại E coli K pneumoniae; K pneumoniae Burkholderia cepacia; Staphylococcus aureus A baumannii; Staphylococcus aureus P aeruginosa có mẫu Như phân lập 177 vi khuẩn, chia thành 11 loài (Bảng 3.2) Ba loài vi khuẩn phân lập phổ biến Acinetobacter spp 75 (42%), Klebsiella spp 39 (23%) P aeruginosa 29 (16%) Các lồi vi khuẩn lại phân lập chiếm 5% Bảng 3.2: Phân bố vi khuẩn phân lập định danh truyền thống (n = 177) Vi khuẩn Số ca (tỉ lệ %) Acinetobacter baumannii 55 (31) 11 Biểu đồ 3.1 Phân tích cụm 99 lồi VK định danh giải trình tự 16S-rRNA 12 3.5 So sánh giải trình tự gene 16S-rRNA vi sinh kinh điển định danh VK Bảng 3.3 So sánh hai phương pháp định danh vi khuẩn dựa vào nuôi cấy giải trình tự hệ thống PGM Đồng thuận nuôi cấy Trực khuẩn gr (-) yếm khí PGM tùy nghi Acinetobacter spp Actinobacillus lignieresii Klebsiella spp Aeromonas spp Pseudomonas spp Calothrix desertica Staphylococcus aureus Chroococcidiopsis thermalis Burkholderia spp Erwinia psidii Haemophilus spp Shigella spp Các loài định danh Trực khuẩn gr (+) yếm khí PGM Trực khuẩn gr (-) yếm khí Atopobium rimae Alloprevotella rava Bacillus coagulans Bacteroides pyogenees Trực khuẩn gr (+) hiếu khí Catonella morbi Bacillus amyloliquefaciens Fusobacterium spp Corynebacterium striatum Pectobacterium spp Cầu khuẩn gr (+) yếm khí tùy nghi Porphyromonas spp Gemella spp Prevotella spp Granulicatella adiacens Serratia liquefaciens Rothia mucilaginosa 13 Shewanella profunda Vagococcus entomophilus Tannerella forsythia Cầu khuẩn gr (+) yếm khí Trực khuẩn gr (-) hiếu khí Peptostreptococcus stomatis Aureimonas glaciistagni Liên cầu gr (+) yếm khí tùy nghi Diaphorobacter spp Streptococcus spp Elizabethkingia spp Cầu trực khuẩn gr (+) yếm khí tùy nghi Neisseria spp Lactobacillus spp Novosphingobium spp Cầu trực khuẩn gr (-) yếm khí tùy nghi Psychrobacter spp Gallibacterium anatis Sphingomonas spp Pasteurella spp Xoắn khuẩn gr (-) yếm khí tùy Cầu khuẩn gr (-) yếm khí nghi Rhodospirillum oryzae Veillonella parvula 3.8 Kết kháng sinh đồ 3.8.1 Kết kháng sinh đồ khuếch tán chung Gần 85% VK phân lập đa kháng (Bảng 3.5) Bảng 3.5 Kết kháng sinh đồ khuếch tán chung Kháng sinh Tỉ lệ đề kháng (n, %) Cefoperazone 14 (63,6) Ceftazidime 132 (80) Ceftriaxone 68 (88,3) 14 Cefoperazon-Sulbactam 20 (16,8) Cefepime 105 (75) Piperacillin-Tazobactam 97 (64,2) Imipenem 114 (70,8) Meropenem 105 (63,2) Ertapenem 15 (39,4) Amikacin 87 (53,7) Genetamycin 73 (70,1) Ciprofloxacin 86 (77,4) Levofloxacin 120 (71,8) Colistin (1,6) Ghi chú: phần trăm tính theo dòng 3.8.8 Các dạng đề kháng kháng sinh Acinetobacter baumannii, Klebsiella pneumoniae Pseudomonas aeruginosa Khuynh hướng đề kháng kháng sinh A baumannii, K pneumoniae P aeruginosa hình thành mạng lưới đa kháng kháng sinh Mỗi đường nối hai kháng sinh đại diện cho tối thiểu trường hợp bị đề kháng hai loại kháng sinh Độ dầy đường nối hai kháng sinh biểu cho mức độ đề kháng hai kháng sinh Đường nối hai kháng sinh dầy hai kháng sinh bị kháng cao Mỗi nốt tròn đại diện cho tối thiểu bệnh nhân Kích thước nốt lớn tương ứng với số lượng bệnh nhân sử dụng hai loại kháng sinh nhiều (Biểu đồ 3.4) 15 3.9 Kết kháng sinh đồ MIC dựa E-test 3.9.1 Kháng sinh đồ MIC A baumannii: Bảng 3.9 Kết kháng sinh đồ MIC A baumannii (n = 74) Kháng sinh Amikacin Sulbactam Colistin Nhạy n (%) Trung gian n (%) Kháng n (%) MIC≤16 µg/ml MIC=32 µg/ml MIC≥64µg/ml 12 (16,2) 10 (13,5) 52 (70,3) MIC≤4 µg/ml MIC=8 µg/ml MIC≥16 µg/ml (9,5) 26 (35,1) 41 (55,4) MIC≤2µg/ml MIC≥4 µg/ml 73 (98,6) (1,4) 16 MIC ≤ 0,125 µg/ml Colistin MIC > 0,125 µg/ml 59 (80) 15 (20) MIC≤2 µg/ml MIC=4 µg/ml MIC≥8 µg/ml Levofloxacin (5,4) (5,4) 66 (89,2) Imipenem (4) Meropenem (4) 71 (96) (2,7) 69 (93,2) Ghi chú: tỉ lệ phần trăm tính theo dòng 3.9.2 Kháng sinh đồ MIC K pneumoniae: Bảng 3.10 Kết kháng sinh đồ MIC Klebsiella (n=39) Kháng sinh Nhạy n (%) Trung gian n (%) Kháng n (%) MIC ≤16µg/ml MIC = 32µg/ml MIC ≥64µg/ml 37 (94,9) (5,1) MIC ≤ 4µg/ml MIC = µg/ml MIC≥16µg/ml 0 38 (100) MIC ≤ 2µg/ml MIC = 4µg/ml MIC ≥ 8µg/ml Colistin 38 (100) 0 Levofloxacin 16 (41) 23 (59) MIC ≤ 1µg/ml MIC = 2µg/ml MIC ≥ 8µg/ml Imipenem 26 (67) (10) (23) Meropenem 30 (79) (13,1) (7,9) Amikacin Sulbactam Ghi chú: tỉ lệ phần trăm tính theo dòng 3.9.3 Kháng sinh đồ MIC P aeruginosa (n = 29) 17 Bảng 3.11 Kết kháng sinh đồ MIC P aeruginosa Kháng sinh Nhạy n (%) Trung gian n (%) Kháng n (%) MIC≤16µg/ml MIC=32µg/ml MIC≥64µg/ml 10 (34,5) (6,9) 17 (58,6) MIC≤2µg/ml MIC=4µg/ml MIC≥8µg/ml 28 (96,5) (3,5) Levofloxacin (17,2) (6,9) 22 (75,9) Imipenem (20,7) (3,4) 22 (75,9) Meropenem (17,2) Amikacin Colistin Sulbactam 24 (82,8) MIC≤4µg/ml MIC=8µg/ml MIC≥16µg/ml 0 29 (100) Ghi chú: tỉ lệ phần trăm tính theo dòng 3.10 Kết PCR tìm gene kháng thuốc 3.10.1 Phân bố gene kháng thuốc phát từ VK Acinetobacter baumannii, Klebsiella pneumoniae Pseudomonas aeruginosa Đối với Acinetobacter, ba gene kháng thuốc phát nhiều TEM, SPM, SHV Đối với Klebsiella, gene BIC phát nhiều (Bảng 3.14) Bảng 3.14 Phân bố gene kháng thuốc phát Gene kháng thuốc Acinetobacter Klebsiella Pseudomonas N (%) TEM (964bp) 23 (39,6) (13,9) SPM (271 bp) 14 (22.4) (20,9) 18 SHV (790bp) (15,5) (13,9) (20) BIC (537 bp) (5,1) 15 (34,9) IMP (232bp) (5,1) (9,3) (40) KPC (798 bp) (5,1) 0 NDM (621 bp) (3,4) (40) OXA (438 bp) (1,7) (6,9) 3.10.2 Mối liên quan gene kháng thuốc đề kháng kháng sinh: Bảng 3.15 Mối liên quan gene kháng thuốc đề kháng kháng sinh Ghi chú: NA: not applicable: không áp dụng 19 Chương 4: Bàn luận VPTM thách thức toàn cầu, quốc gia Á Châu có Việt Nam VPTM nguyên nhân hàng đầu gây tăng tỉ lệ tử vong, kéo dài thời gian nằm viện tăng chi phí điều trị VPTM chẩn đoán dựa vào lâm sàng chứng vi sinh Nội soi phế quản ống mềm cách tốt để tiếp cận đường hô hấp cách xác hiệu 4.1 Định danh vi khuẩn 4.1.1 Dựa vi sinh kinh điển Qua 11 tháng (từ 11/2014 đến 9/2015), cấy định lượng dịch rửa phế quản phế nang 220 bệnh nhân Kết cho thấy có 164 bệnh nhân dương tính với mẫu đàm thỏa tiêu chuẩn ≥ 104 cfu/ml Chúng phân lập 177 vi khuẩn chia thành 11 lồi Trong có 13 trường hợp phân lập hai loài VK khác bệnh nhân Acinetobacter spp tác nhân gây VPTM phân lập nhiều gần phân nửa trường hợp (n = 75) Kế đến Klebsiella spp chiếm gần phần tư trường hợp (n = 39) P aeruginosa gần phần sáu trường hợp (n = 29) Số liệu cần đặt bối cảnh nghiên cứu trước Số liệu nghiên cứu nước cho thấy có quán số liệu tác giả Nguyễn Gia Bình, Nguyễn Hữu Thơng, Nguyễn Thị Khánh Như Vũ Đình Phú thực Bệnh Viện Bạch Mai, Bệnh Viện Bệnh Nhiệt Đới TP Hồ Chí Minh 15 Trung Tâm ICU tồn quốc Ba tác nhân vi khuẩn phân lập chiếm tỉ lệ cao A baumannii, K pneumoniae P aeruginosa 4.1.2 Định danh vi khuẩn dựa sinh học phân tử Kết giải trình tử 76 mẫu dịch rửa phế quản, định danh 388 VK chia thành 99 loài Số loài phát nhiều mẫu dịch rửa phế quản phế nang 32 loài Bảy loài VK phổ biến Acinetobacter spp, Pseudomonas spp, 20 prevotella spp, Staphylococcus spp, Klebsiella spp Haemophilus spp Burkholderia spp Trong Acinetobacter spp chiếm tỉ lệ cao nhất, hai mươi phần trăm trường hợp Điều tái khẳng định lần Acinetobacter spp, phải nói tác nhân đáng quan tâm việc xác định vi khuẩn gây VPTM lâm sàng Có đồng thuận vi sinh truyền thống giải trình tự vi khuẩn Gram âm, hiếu khí, dễ mọc Ngồi ra, giải trình tự định danh trực khuẩn Gram âm yếm khí, yếm khí tùy nghi hiếu khí khó mọc; cầu – trực khuẩn Gram dương hiếu yếm khí tùy nghi; liên cầu Gram dương yếm khí tùy nghi, cầu khuẩn Gram âm yếm khí xoắn khuẩn Kết nghiên cứu chúng tơi có qn với kết nghiên cứu Fadi Bitta vi khuẩn yếm khí như: Gemella spp, Peptostreptococcus spp, Porphyromonas spp, Tannerella spp, Veillonella spp Tuy nhiên vi khuẩn Dialister pnemosintes, Lachnospiraceae geneomosp, Selenomonas spp phát bệnh nhân xơ nang phổi nghiên cứu Fadi Bitta Ngoài có khác tổng số lồi vi khuẩn phát mẫu dịch rửa phế quản phế nang, 32 lồi (chúng tơi) so với 14 lồi Khác biệt quần thể nghiên cứu khác 4.2 Kết kháng sinh đồ 4.2.1 Kháng sinh đồ khuếch tán: Kết nghiên cứu cho thấy 80% vi khuẩn phân lập đa kháng Kết cho thấy quán với kết nghiên cứu tác giả khác nước Bệnh Viện: Chợ Rẫy, Bạch Mai, Bệnh Nhiệt Đới TP Hồ Chí Minh 4.2.2 Kháng sinh đồ định lượng xác định MIC: 80% colistin có MIC ≤ 0,125 µg/ml A baumannii Kết đồng thuận với nghiên cứu Nguyễn Gia Bình Trần Văn Ngọc Bệnh Viện: Bạch Mai Chợ Rẫy 4.3 Xác định gene kháng thuốc mối liên quan với đề kháng kháng sinh: 81% vi khuẩn gây VPTM phân lập mang gene 21 kháng thuốc: IMP, KPC, OXA, NDM, SPM, BIC, TEM, SHV Tuy nhiên chưa tìm thấy có mối liên quan gene kháng thuốc MIC Tóm lại: nghiên cứu có đóng góp: áp dụng nội soi phế quản, cấy đàm định lượng, giải trình tự gene hệ mới, thực kháng sinh đồ MIC tìm gene kháng thuốc Tuy nhiên nghiên cứu tồn nhược điểm: sinh học phân tử chưa xem tiêu chuẩn vàng chẩn đoán vi sinh nay, cần đầu tư nhân lực thiết bị tốn giá thành cho lần vận hành máy Kết luận Qua mười tháng, thực đề tài “nghiên cứu tác nhân vi khuẩn gây viêm phổi thở máy gene kháng thuốc kỹ thuật sinh học phân tử” 220 bệnh nhân, đến kết luận sau: Định danh vi khuẩn gây VPTM: Dựa vào vi sinh kinh điển: Có 164 220 bệnh nhân dương tính với cấy định lượng dịch rửa phế quản phế nang Trong có 13 trường hợp dương tính với hai lồi vi khuẩn mẫu Chúng phân lập 177 vi khuẩn chia thành 11 lồi: nhóm trực khuẩn Gram âm khơng lên men đường A baumannii, P aeruginosa, B cepacia, C indologens, S maltophilia Nhóm trực khuẩn đường ruột Gram âm K pneumoniae, E coli, E cloace, S marcescens Cầu khuẩn Gram dương Staphylococcus aureus cầu khuẩn Gram âm H influenzae Ba loài VK gây VPTM thường gặp A baumannii, K pneumoniae P aeruginosa chiếm 81% Dựa vào sinh học phân tử: Trên 76 mẫu dịch rửa phế quản phế nang, giải trình tự gene 16S-rRNA, chúng tơi định danh 388 vi khuẩn chia thành 109 loài Trong có 99 lồi định danh dựa chuỗi trình tự có chiều dài ≥ 200 pb Số loài phát 22 nhiều mẫu dịch rửa phế quản phế nang 32 loài So sánh giải trình tự gene 16S-rRNA vi sinh kinh điển định danh vi khuẩn: Có đồng thuận cao giải trình tự gene 16S-rRNA vi sinh kinh điển vi khuẩn Gram âm Gram dương dễ mọc Đồng thuận cấy PGM A baumannii, K pneumoniae, P aeruginosa 91,2%, 35,7% 85,7% Đối với Staphylococcus aureus, B cepacia H influenzae đồng thuận 75%, 67% 100% E coli khơng có trường hợp đồng thuận cấy PGM Các loài định danh Ion Torrent PGM: cầu - trực khuẩn Gram âm Gram dương, khó mọc, hiếu khí hay yếm khí xoắn khuẩn Nếu dùng kết cấy tiêu chuẩn vàng, độ nhạy độ đặc hiệu PGM 93,5% 6% Kháng sinh đồ vi khuẩn gây VPTM: Kháng sinh đồ khuếch tán đĩa giấy tẩm kháng sinh: Gần 85% vi khuẩn phân lập đa kháng, kháng cephalosporin hệ ba bốn từ 63% đến 88% Kháng carbapenem nhóm hai từ 39% đến 71%; cefoperazone – sulbactam piperacillin – tazobactam 17% 64% Kháng levofloxacin ciprofloxacin 72% 77%; amikacin genetamycin 54% 70%; colistin 1,6% A baumannii nhạy colistin cefoperazone – sulbactam 98% 93%; kháng carbapenem nhóm hai, fluoroquinolone aminoglycoside từ 80% đến 90% K pneumoniae nhạy colistin 100%, nhạy carbapenem nhóm hai aminoglycoside từ 70% đến 95% Kháng cephalosporin hệ ba - bốn, piperacillin – tazobactam nhóm aminoglycoside từ 50% đến 80% P aeruginosa nhạy 23 colistin piperacillin – tazobactam 95% 68% Kháng cephalosporin hệ ba bốn, cefoperazon – sulbactam, piperacillin – tazobactam, carbapenem nhóm hai, aminoglycoside, fluoroquinolone 60% đến 86% E coli chưa ghi nhận kháng amikacin nhạy imipenem meropenem 63% 67 Chỉ có ba trường hợp Enterobacter spp kháng ceftazidime, ceftriaxone piperacillin - tazobactam H influenzae nhạy hoàn toàn piperacillin - tazobactam, meropenem levofloxacin S marcescens chưa ghi nhận kháng thuốc B cepacia kháng imipenem, amikacin ciprofloxacin 70% S maltophilia kháng imipenem, meropenem amikacin Chryseobacterium indologens kháng imipenem, meropenem amikacin S aureus chưa ghi nhận kháng vancomycin, nhạy clindamycin gần 70%; kháng doxycillin 50% Kháng sinh đồ định lượng MIC que E-test: A baumannii nhạy với colistin 98,6% 80% colistin có MIC ≤ 0,125 µg/ml; kháng carbapenem nhóm hai levofloxacin 95% K pneumoniae chưa ghi nhận kháng colistin amikacin, kháng với meropenem, imipenem levofloxacin 8%, 23% 59% P aeruginosa chưa ghi nhận kháng colistin, kháng amikacin, levoflaxacin, carbapenem nhóm hai 59%, 76% 76% E coli chưa ghi nhận kháng amikacin, kháng meropenem imipenem 10% 33% Khơng có trường hợp E coli nhạy levofloxacin Chưa ghi nhận trường hợp Enterobacter spp, H influenzae Serratia marcescens kháng amikacin, levofloxacin, imipenem meropenem B cepacia nhạy với meropenem 86% C indologens kháng amikacin, imipenem meropenem S maltophilia nhạy với colistin levofloxacin 24 Kháng sinh đồ Etest đĩa giấy có kết tương đương vi khuẩn gây VPTM phân lập Ngoại trừ trường hợp sulbactam: tỉ lệ nhạy cảm A baumannii sulbactam 9,5% (Etest) 93% (đĩa giấy) Các gene kháng thuốc phát mối liên quan với MIC: Có 81% vi khuẩn gây VPTM phân lập có mang gene kháng thuốc sau: IMP, KPC, OXA, NDM, SPM, BIC, TEM, SHV Trong 58 gene kháng thuốc phát từ A baumannii, ba gene phổ biến SMP, TEM SHV chiếm 77% Các gene KPC, IMP BIC chiếm tỉ lệ 5% Gene NDM chiếm 3,4% gene OXA chiếm 1,7% Trong 41 gene kháng thuốc phát được, K pneumoniae mang gene BIC, SPM, TEM SHV chiếm 84% Các gen IMP, OXA chiếm 9% 7% Có gene kháng thuốc phát từ P aeruginosa Trong gene IMP NDM có gene, gene SHV có gene Có mối liên quan vi khuẩn A baumannii, K pneumoniae P aeruginosa mang gene kháng thuốc đề kháng kháng sinh yếu lâm sàng Tuy nhiên mối liên quan chưa đủ mạnh (P > 0,05) Kiến nghị Thực thêm xét nghiệm định danh kháng sinh đồ vi khuẩn yếm khí mẫu dịch tiết đường hô hấp cho bệnh nhân nghi ngờ VPTM lâm sàng Xét nghiệm tìm nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) thường qui vi khuẩn gây VPTM Đặc biệt vi khuẩn nghi ngờ đa kháng kháng sinh Triển khai sinh học phân tử phát vi khuẩn gây bệnh tìm gene kháng thuốc bệnh viện Nhân Dân Gia Định bệnh viện khác thành phố Hồ Chí Minh Danh mục cơng trình nghiên cứu Trần Minh Giang, Trần Văn Ngọc (2016) Đề kháng Klebsiella pneumoniae gây viêm phổi thở máy bệnh viện Nhân Dân Gia Định Y học thành phố Hồ Chí Minh, 20(1): tr 58-65 Trần Minh Giang, Trần Văn Ngọc (2016) Acinetobacter baumannii đa kháng: kết từ nghiên cứu lâm sàng bệnh nhân viêm phổi thở máy Y học thành phố Hồ Chí Minh, 19(5): tr 96-103 ... sàng gene kháng thuốc vi khuẩn yếu gây vi m phổi thở máy mối liên quan với MIC Từ giúp cho bác sĩ lâm sàng nhận định mức tác nhân vi khuẩn gây vi m phổi thở máy nhận biết gene kháng thuốc vi khuẩn. .. Gram, ni cấy phản ứng sinh hóa 3 Đánh giá MIC tỉ lệ đề kháng kháng sinh nhóm vi khuẩn gây vi m phổi thở máy Xác định gene kháng thuốc vi khuẩn gây vi m phổi thở máy kỹ thuật PCR mối liên quan... nhân vi khuẩn gây vi m phổi thở máy gene kháng thuốc kỹ thuật sinh học phân tử 220 bệnh nhân, đến kết luận sau: Định danh vi khuẩn gây VPTM: Dựa vào vi sinh kinh điển: Có 164 220 bệnh nhân dương