Nghiên cứu tác nhân vi khuẩn gây viêm phổi thở máy và gene kháng thuốc bằng kỹ thuật sinh học phân tử

Viêm phổi thở máy là nguyên nhân hàng đầu gây tử vong ở những bệnh nhân ICU. Nghiên cứu này nhắm đến 3 mục tiêu chính: (1) Xác định đặc điểm vi khuẩn gây viêm phổi thở máy bằng kỹ thuật giải trình tự gene 16S-rRNA, có so sánh với phương pháp định danh vi khuẩn dựa vào nhuộm Gram, nuôi cấy và các phản ứng sinh hóa; (2) đánh giá nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) và tỉ lệ đề kháng kháng sinh ở các nhóm vi khuẩn gây viêm phổi thở máy và (3) xác định gene kháng thuốc của vi khuẩn gây viêm phổi thở máy bằng kỹ thuật PCR và mối liên quan với MIC. Qua phân tích dữ liệu thu thập trên 220 bệnh nhân viêm phổi thở máy, những kết luận sau đây được rút ra: Ở bệnh nhân viêm phổi thở máy, vi khuẩn rất đa dạng, và có sự khác biệt đáng kể giữa kết quả giải trình tự gen và phân tích vi sinh kinh điển. Kết quả giải trình tự gen 16S-rRNA phát hiện 388 vi khuẩn thuộc 109 loài. Tuy nhiên, kết quả phân tích vi sinh nhận dạng 177 vi khuẩn thuộc 11 loài. So sánh kết quả giữa hai phương pháp phân tích cho thấy sự đồng thuận cao được ghi nhận ở các vi khuẩn Gram âm hoặc Gram dương dễ mọc (như A. baumannii, P. aeruginosa, S. aureus, B. cepacia và H. influenzae). Lấy kết quả cấy làm tiêu chuẩn vàng, độ nhạy của phương pháp 16S-rRNA khá cao (~94%), nhưng tỉ lệ dương tính giả cũng rất cao (94%). Dựa trên tiêu chuẩn định lượng MIC bằng E-test và 6 loại kháng sinh (amikacin, colistin, imipenem, levofloxacin, meropenem, và sulbactam), chúng tôi đã thiết lập được kháng sinh đồ cho K. Pneumoniae, P. aeruginosa, E. coli, B. cepacia, Enterobacter spp, S. maltophilia, H. influenza, và C. indologens. Kết quả cho thấy tỉ lệ đa kháng lên đến 85%, kể cả kháng cephalosporin thế hệ ba và bốn từ 63% đến 88%, kháng levofloxacin và ciprofloxacin là 72% và 77%. Tỉ lệ kháng colistin được ghi nhận là gần 2%. Gần 80% A. baumannii có MIC < 0,125 µg/ml đối với colistin.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRẦN MINH GIANG NGHIÊN CỨU TÁC NHÂN VI KHUẨN GÂY VIÊM PHỔI THỞ MÁY VÀ GENE KHÁNG THUỐC BẰNG KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ NGÀNH: HỒI SỨC CẤP CỨU VÀ CHỐNG ĐỘC MÃ SỐ: 62720122 LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS TRẦN VĂN NGỌC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH - NĂM 2019 LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi, kết nghiên cứu trình bày luận án trung thực, khách quan chưa công bố nơi Tác giả luận án Trần Minh Giang MỤC LỤC Trang Trang phụ bìa Lời cam đoan Bảng từ viết tắt đối chiếu thuật ngữ Anh – Việt Danh mục bảng Danh mục biểu đồ, sơ đồ Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Định nghĩa………………………………………………………………………3 1.2 Tỉ lệ mắc viêm phổi thở máy 1.3 Tỉ lệ tử vong 1.4 Bệnh nguyên 1.5 Các yếu tố nguy 25 1.6 Chẩn đoán 28 1.7 Thực kháng sinh đồ vi khuẩn phân lập từ VPTM 29 1.8 Ứng dụng sinh học phân tử phát gene kháng thuốc 30 Chương ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 32 2.1 Thiết kế nghiên cứu 32 2.2 Địa điểm nghiên cứu 32 2.3 Thời gian nghiên cứu 32 2.4 Đối tượng nghiên cứu 32 2.5 Cỡ mẫu cơng thức tính cỡ mẫu 32 2.6 Tiêu chuẩn chọn mẫu 33 2.7 Phương pháp tiến hành 34 2.8 Phương pháp phát gene kháng thuốc…………………………………….45 2.9 Thu thập số liệu phân tích liệu 45 2.10 Đạo đức nghiên cứu……………………………………………………46 2.11 Liệt kê định nghĩa biến số (phụ lục 11) 46 2.12 Sơ đồ nghiên cứu…………………………………………………………… 47 Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 48 3.1 Đặc điểm chung 48 3.2 Định danh vi khuẩn dựa vi sinh kinh điển 50 3.3 Định danh vi khuẩn dựa giải trình tự gene 16S-rRNA 51 3.4 Tổng số loài vi khuẩn phát mẫu dịch rửa phế quản phế nang 55 3.5 So sánh giải trình tự gene 16S-rRNA vi sinh kinh điển định danh vi khuẩn 56 3.6 Tính độ nhạy độ đặc hiệu PGM 58 3.7 Thời gian nằm ICU tác nhân vi khuẩn gây viêm phổi thở máy 59 3.8 Kết kháng sinh đồ 60 3.9 Kết kháng sinh đồ MIC dựa E-test 66 3.10 Kết PCR tìm gene kháng thuốc 73 3.11 Kết điều trị 75 Chương 4: BÀN LUẬN 76 4.1 Định danh vi khuẩn 77 4.2 Kết kháng sinh đồ 91 4.3 Xác định gene kháng thuốc mối liên quan với đề kháng kháng sinh 98 KẾT LUẬN 105 KIẾN NGHỊ 108 DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH NGHIÊN CỨU TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC BẢNG VIẾT TẮT VÀ ĐỐI CHIẾU THUẬT NGỮ ANH - VIỆT Từ viết tắt Thuật ngữ tiếng Anh Thuật ngữ tiếng Việt APACHE Acute Physiology and Chronic Health Evaluation Thang điểm lượng giá bệnh lý cấp tính mạn tính ARDS ATS Acute Respiratory Distress Syndrome American Thoracic Society Hội chứng nguy ngập hô hấp cấp Hội Lồng Ngực Hoa Kỳ BA Blood agar Đĩa thạch máu BAL Bronchial-alveolar lavage Rửa phế quản phế nang CDC Chocolate agar Haemophilus influenzae Centers for Disease Control and Bệnh nhân Cặp base Bệnh viện Chợ Rẫy Bệnh viện Nhân Dân Gia Định Thạch chocolate cho Haemophilus influenzae Trung tâm kiểm soát bệnh CFU Prevention Colony-Forming Unit tật Hoa Kỳ Đơn vị tạo khuẩn lạc Cytomegalovirus Chronic Obstructive Pulmonary Disease Clinical pulmonory infection score Virus cytomegalovirus Bệnh phổi tắc nghẽn mạn tính Thang điểm viêm phổi lâm sàng Protein C phản ứng Dịch rửa phế quản phế nang Thạch eosin methylene blue BN Bp BVCR BVNDGĐ CAHI CMV COPD CPIS Base pair CRP DRPQPN EBM C - reactive protein EPIC The European Prevalence of Infection in Intensive Care ESBL Extended-Spectrum BetaLactamase Eosin methylene blue agar Tỉ lệ mắc nhiễm khuẩn ICU bệnh nhân Châu Âu Men β-lactamase phổ rộng Từ viết tắt Thuật ngữ tiếng Anh Thuật ngữ tiếng Việt FiO2 Fraction of inspired oxygene Phân suất oxy khí thở vào HIV Human immunodeficiency virus ICU Intensive care unit Virus gây suy giảm miễn dịch người Khoa săn sóc đặc biệt IDSA Infectious Diseases Society of Hội bệnh lý truyền nhiễm America Hoa Kỳ Interquartile range Infection-related ventilator - Khoảng tứ phân vị Biến chứng liên quan nhiễm associated complication Kligler iron agar khuẩn bệnh nhân thở máy Thạch kligler iron Confidence interval MacKonkey agar Mueller Hinton agar Minimal inhibitory concentration Medical intensive care unit Methycillin-Resistant Kháng sinh đồ Khoảng tin cậy Thạch MacKonkey Thạch Mueller Hinton Nồng độ ức chế tối thiểu Khoa ICU nội Tụ cầu vàng kháng Staphylococcus aureus methycillin Methycillin-Sensitive Staphylococcus aureus Tụ cầu vàng nhạy methycillin Nghiên cứu Trung tâm quốc gia thông tin công nghệ sinh học Hoa Kỳ Giải trình tự hệ Nội khí quản IQR IVAC KIA KSĐ KTC MA MH MIC MICU MRSA MSSA NC NCBI National center for biotechnology information NGS NKQ Next generation sequencing NNIS National Nosocomial Infections Surveillance System NSPQ NTNT Hệ thống khảo sát nhiễm khuẩn bệnh viện quốc gia Hoa Kỳ Nội soi phế quản Ngưng tim ngưng thở Từ viết tắt Thuật ngữ tiếng Anh Thuật ngữ tiếng Việt OR Odds ratio Tỷ số số chênh PCT PEEP PGM Procalcitonin Positive end-expiratory pressure Personal genome machine Procalcitonin Áp lực dương cuối thở Máy gene cá thể PK/PD pharmacokinetic/pharmacodynamic Dược động/dược lực Possible possible ventilator - associated Có thể viêm phổi thở máy VAP PPI pneumonia Proton pump inhibitors Ức chế bơm proton Probable VAP PSB Probable ventilator - associated pneumonia Protected Specimen Brush Có thể có khả viêm phổi thở máy Chải phế quản có nòng bảo SSĐB vệ Tỷ số nguy Độ bảo hòa oxy động mạch Khoa hồi sức ngoại Độ bão hòa oxy theo mạch đập Săn sóc đặc biệt TBMMN Tai biến mạch máu não THA T0 VAC Tăng huyết áp Nhiệt độ Biến chứng liên quan thở máy Biến cố liên quan thở máy Vi khuẩn Viêm phổi Viêm phổi thở máy RR SaO2 SICU SpO2 VAE VK VP VPTM Risk ratio Arterial oxygene Saturation Surgical intensive care unit Pulse oximetric saturation Ventilator - associated condition Ventilator-associated event DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Tử suất thô theo điều trị kháng sinh ban đầu:…………………………….7 Bảng 1.2 Bệnh nguyên viêm phổi thở máy:……………………………………8 Bảng 1.3 Tần suất vi khuẩn phân lập từ ICU bệnh viện Fatmawati:……… 11 Bảng 1.4 Tần suất vi khuẩn phân lập từ bệnh nhân viêm phổi khoa ICU Việt Nam:…………………………………………………………… 12 Bảng 1.5.1 Tác nhân vi khuẩn phân lập từ bệnh nhân thở máy ICU bệnh viện Bệnh Nhiệt Đới thành phố Hồ Chí Minh:……………………… 13 Bảng 1.5.2 Tác nhân vi khuẩn phân lập từ bệnh nhân thở máy ICU bệnh viện Bệnh Nhiệt Đới thành phố Hồ Chí Minh (tiếp theo):…………… 14 Bảng 1.6 Tính đa dạng vi khuẩn phát giải trình tự gene:…….25 Bảng 1.7 Các yếu tố nguy VPTM:……………………………………… 26 Bảng 2.1 Thành phần phản ứng tạo amplicon - phản ứng tạo “bản sao” vùng V3, V6, V7 V9 gen 16S-rRNA:………………………………38 Bảng 2.2 Thành phần hóa chất thêm vào dung dịch rửa việc tinh phản ứng PCR khuếch đại vùng V3, V6, V7 V9 gene 16S-rRNA:… 39 Bảng 2.3 Thành phần phản ứng tạo amplicon hoàn chỉnh - tạo “đầu bằng” cho vùng V3, V6, V7 V9 gene 16S-rRNA:……………… 40 Bảng 2.4 Thành phần phản ứng tạo “thư viện” - phản ứng gắn Adapter trP1 vào đầu “đầu bằng” vùng V3, V6, V7 V9 gene 16SrRNA:……………………………………………………………………… 40 Bảng 2.5 Thành phần phản ứng tạo “bản sao” thư viện:………….………41 Bảng 2.6 Thành phần dung dịch sử dụng cho việc gắn “thư viện” gene vào hạt ISP: …………………………………………………………………………………… 42 Bảng 2.7 Thành phần phản ứng chuẩn bị gắn “thư viện” gene vào hạt ISP:…… 43 Bảng 2.8 Thành phần phản ứng tách mạch “thư viện” gene khỏi gắn hạt SP:….…………………………………………………………………… 43 Bảng 3.1 Đặc điểm lâm sàng bệnh nhân nghiên cứu:……………………… 49 Bảng 3.2 Phân bố vi khuẩn phân lập định danh truyền thống:……… 51 Bảng 3.3 So sánh hai phương pháp định danh vi khuẩn dựa vào nuôi cấy giải trình tự hệ thống PGM:……………… ………………… 57 Bảng 3.4 Độ nhạy độ đặc hiệu PGM:………………………………… .58 Bảng 3.5 Kết kháng sinh đồ khuếch tán chung:………………………………60 Bảng 3.6 Kháng sinh đồ khuếch tán Acinetobacter spp:………………….61 Bảng 3.7 Kháng sinh đồ khuếch tán Klebsiella spp:… .62 Bảng 3.8 Kháng sinh đồ khuếch tán Pseudomonas spp:………………….63 Bảng 3.9 Kết kháng sinh đồ MIC Acinetobacter baumannii:……… 66 Bảng 3.10 Kết kháng sinh đồ MIC K Pneumoniae:……………… 67 Bảng 3.11 Kết kháng sinh đồ MIC Pseudomonas aeruginosa:………68 Bảng 3.12 Kết kháng sinh đồ MIC Escherichia coli:……………… 69 Bảng 3.13 Kết kháng sinh đồ MIC Burkholderia cepacia:………… 70 Bảng 3.14 Phân bố gene kháng thuốc phát được:……………………………73 Bảng 3.15 Mối liên quan gene kháng thuốc đề kháng kháng sinh:……….74 Bảng 3.16 Kết người bệnh khỏi khoa chung:………………………………75 Bảng 3.17 Kết điều trị:……………………………………………………… 75 DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ, SƠ ĐỒ Sơ đồ 2.1 Sơ đồ tạo thư viện cho kỹ thuật NGS:………………………….………38 Sơ đồ 2.2 Sơ đồ nghiên cứu:………………………………………………………47 Biểu đồ 3.1 Phân tích cụm 99 lồi vi khuẩn định danh giải trình tự 16SrRNA:………………………………………………………………………………53 Biểu đồ 3.2 Số loài vi khuẩn phát mẫu DRPQPN: ………….55 Biểu đồ 3.3 Mối liên quan vi khuẩn phân lập số ngày nằm ICU:… 59 Biểu đồ 3.4 Mạng lưới đa kháng kháng sinh A baumannii, K pneumoniae P aeruginosa: ……………………………………………………65 Biểu đồ 3.5 Tỉ lệ số kháng sinh bị đề kháng:…………………………………… 72 8.Khác Thang điểm Biến Apache-II định 72 Từ o đến 71 lượng - Tính trực tiếp từ clincalc thông qua: tuổi, 15 yếu tố khác BIẾN SỐ ĐỘC LẬP Tên biến Loại biến Sử dụng thuốc Biến nhị giá Số giá trị an thần dãn Cách đo Nội dung 1: Có - Có: 0: khơng lần sử dụng sau đặt NKQ suốt thời gian thở máy - Không: không ghi nhận Cách dùng Biến nhị giá 1: có 1.Liên tục - Liên tục: 2.Ngắt quãng dùng bơm tiêm tự động kéo dài 0: không - Ngắt quãng: tiêm tĩnh mạch ống Loại dùng Biến nhị giá 1.Midazolam - Có: có sử dụng 1: có 2.Seduxen hay nhiều loại 0: không 3.Fentanyl - Không: không sử 4.Norcuron dụng loại thuốc 5.Propofol 6.Suxamethonium 7.Khác Dùng thuốc Biến nhị giá dày 1: Có - Có: có sử 0: Không dụng miệng đường tĩnh mạch - Không: khơng có sử dụng Biến nhị giá Loại dùng Đặt lại NKQ Biến nhị giá 1.Ức chế bơm - Có: có sử 1: có proton dụng 0: khơng 2.Ức chế H2 nhiều loại 3.Kháng axít - Khơng: khơng có 4.Sucralfate sử dụng 1: có - Có: có đặt lại 0: không NKQ do: tắc, gập, hay tuột, xì, bệnh nhân tự rút - Khơng: khơng đặt lại NKQ Số lần Biến thứ tự Nhỏ Lớn Ngày xuất Biến VPTM định 87 Từ đến 90 lượng Ngày xác định VPTM LÂM SÀNG Kháng dùng sinh Biến nhị giá 1: có 1.Cefo/Sul - Có: có sử 2.Levofloxacin dụng hay 0: khơng 3.Imipenem nhiều loại kháng 4.Ciprofloxacin sinh 5.Moxifloxacin - Khơng: khơng có 6.Cepha sử dụng 7.Meropenem 8.Aminoglycosid 9.Ticar/Clavu 10.Cefa 11.Colistin 12.Vancomycin 13 Am/Sul Số ngày dùng Định lượng 90 Từ 1-90 Tổng số ngày dùng kháng sinh kháng sinh nội viện chứng Biến nhị giá Biến NSPQ 1.Chảy máu 1: có 2.Tràn khí da 0: khơng 3.Tràn khí trung thất 4.Khác - Có: có xảy hay nhiều biến chứng - Không: không ghi nhận biến chứng BIẾN SỐ PHỤ THUỘC Kết cấy Biến nhị giá đàm định lượng 1.≥104 đơn vị tạo - Dương: ≥104 đơn 1: dương khuẩn lạc/ml 0: âm 2.