Để kiểm soát dư lượng thuốc kháng sinh, đã có nhiều phương pháp phân tích được nghiên cứu và ứng dụng. Nhưng với những đặc điểm ưu việt và độ chính xác cao nên các phương pháp phân tích sắc ký khối phổ (GC-MS, LC-MS) được coi là phương pháp phân tích khẳng định, có giá trị pháp lý để phát hiện và định lượng nồng độ các chất tồn dư ở lượng vết hay siêu vết.
Trường Đại học Y Dược Thái Nguyên Bản tin Y Dược học miền núi số năm 2016 PHÂN TÍCH DƢ LƢỢNG KHÁNG SINH β –LACTAM TRONG THỰC PHẨM BẰNG PHƢƠNG PHÁP SẮC K LỎNG HIỆU NĂNG CAO VỚI DETECTOR KHỐI PHỔ (LC-MS/MS) Nguyễn Ngọc Minh Trường Đại học Y Dược Thái Nguyên MỞ ĐẦU An toàn vệ sinh thực phẩm vấn đề quan tâm tồn xã hội Nguồn thực phẩm khơng đảm bảo vệ sinh ngày khó kiểm sốt ảnh hưởng mạnh mẽ đến sức khỏe người… Trong khoảng 10 năm trở lại đây, ngành nghề chăn nuôi mở rộng, suất sản lượng sản phẩm chăn nuôi ngày cao Tuy nhiên, thiếu kiểm sốt chặt chẽ quy trình chăn ni, với thiếu hiểu biết nên người chăn ni coi hóa chất thuốc thú y giải pháp để tăng suất sản lượng Điều đó, đồng nghĩa với việc hóa chất thuốc thú y sử dụng thường xuyên hơn, chí lạm dụng mức cần thiết Việc lạm dụng, sử dụng bất hợp pháp sử dụng sai nguyên tắc thuốc gây tượng nhờn thuốc, gây tồn dư thực phẩm, ảnh hưởng xấu đến sức khỏe cộng đồng, môi trường hiệu điều trị bệnh Để kiểm sốt dư lượng thuốc kháng sinh, có nhiều phương pháp phân tích nghiên cứu ứng dụng Nhưng với đặc điểm ưu việt độ xác cao nên phương pháp phân tích sắc ký khối phổ (GC-MS, LC-MS) coi phương pháp phân tích khẳng định, có giá trị pháp lý để phát định lượng nồng độ chất tồn dư lượng vết hay siêu vết Xuất phát từ tính cấp thiết xã hội tính ưu việt phương pháp phân tích, chúng tơi xây dựng phương pháp nghiên cứu: "Phân tích dư lượng kháng sinh β – lactam thực phẩm phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao Detector khối phổ (LC-MS MS)” Mục tiêu thực đề tài nghiên cứu là: - Xây dựng phương pháp xác định hàm lượng số kháng sinh nhóm β - lactam thực phẩm bao gồm: + Khảo sát điều kiện xử lí mẫu phân tích + Thẩm định phương pháp xây dựng - Áp dụng phương pháp xác định dư lượng kháng sinh nhóm β - lactam thực phẩm địa bàn Hà Nội ĐỐI TƢỢNG, MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tƣợng, mục tiêu nội dung nghiên cứu 2.1.1 Đối tƣợng mục tiêu nghiên cứu Hiện nay, tiêu chất lượng, dư lượng chất độc hại vấn đề cấp thiết quan tâm Trong tiêu dư lượng kháng sinh thực phẩm mảng đề tài thực tế quan trọng Như đề cập đề tài này, vấn đề lạm dụng không hàm lượng kháng sinh đem lại nhiều tác hại ảnh hưởng đến sức khoẻ người Trong đề tài này, chất phân tích mà chúng tơi chọn để nghiên cứu kháng sinh nhóm β-Lactam penicillin (PENG), cloxacillin (CLO), oxacilin (OXA) ampicillin (AMP), amoxicillin (AMO), cephalexin (CEP), cefixim (CEF) thực phẩm phương pháp sắc ký lỏng khối phổ LC-MS/MS 2.1.2 Nội dung nghiên cứu - Khảo sát phương pháp bao gồm: + Điều kiện tách chiết mẫu + Điều kiện vận hành máy LC-MS/MS -Thẩm định phương pháp: + Giới hạn phát LOD, giới hạn định lượng LOQ Trường Đại học Y Dược Thái Nguyên Bản tin Y Dược học miền núi số năm 2016 + Khoảng tuyến tính + Độ chụm (độ lặp lại) + Độ (độ lệch, độ thu hồi) 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu Chúng chọn phương pháp phân tích sắc ký lỏng hai lần khối phổ (LC-MS MS) kết hợp với phương pháp xử lí mẫu chiết pha rắn (SPE) để xác định dư lượng số kháng sinh nhóm β-Lactam thực phẩm Các bước tiến hành trình chiết pha rắn + Hoạt hoá chất hấp phụ pha rắn + Mẫu chất phân tích chảy qua cột + Loại bỏ chất gây ảnh hưởng khỏi cột + Giải hấp chất phân tích dung mơi thích hợp 2.3 Hóa chất thiết bị 2.3.1 Hóa ch t Các loại hóa chất sử dụng thuộc loại tinh khiết phân tích Chất chuẩn β – lactam gồm: Phenoxymethylpenicillin (PenV), Penicillin G (Pen G), Ampicillin (Ampi), Oxacillin (Oxa), Cloxacillin (Clox) cung cấp Sigma (USA) + Acetonitrile cung cấp Merck (Đức) + Methanol cung cấp Merck (Đức) + Axit acetic, Amoni acetate cung cấp Merck (Đức) + KH2PO4, K2HPO4, NaCl, Na2SO4 cung cấp Merck (Đức) 2.3.2 Thiết bị - Hệ thống sắc ký lỏng HPLC Shimazu (Nhật Bản) gồm: phận bơm dung môi, loại khí, phận điều nhiệt, cột sắc ký C18 Dionex (150mm × 2,1mm × 3μm) ghép nối với detector khối phổ MS/MS Triple Quad 5500 AB Sciex (Hoa Kì) máy tính + Cột chiết pha rắn SPE Polymeric, C18, HLB Oasis + Máy lắc vortex + Máy đồng mẫu + Máy li tâm MIKRO 22R + Cân phân tích (độ đọc 0,1mg, 0,01mg) + Cân kĩ thuật (độ đọc 0,01g) + Máy cô quay chân không Eyela + Máy đo pH KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Khảo sát điều iện ch detector hối phổ Khảo sát điều iện ắn phá ion mẹ Tiến hành khảo sát bắn phá ion mẹ, kết sau: β – lactam Khối lƣợng phân tử M Ion mẹ (M+1) 349,4 350,0 Ampicillin 334,4 335,0 Penicillin G 350,4 351,0 Penicillin V 401,4 402,0 Oxacillin 435,8 436,0 Cloxacillin 3.2 Chọn pha tĩnh Cột tách góp phần quan trọng việc định q trình tách chất Các chất nhóm β – lactam chất phân cực vừa phải, cột tách nên sử dụng cột tách pha đảo Trong điều kiện phòng thí nghiệm cho phép, chúng tơi chọn cột pha đảo Trường Đại học Y Dược Thái Nguyên Bản tin Y Dược học miền núi số năm 2016 C18 để tách chất β – lactam Để bảo vệ cột, sử dụng thêm tiền cột Thông số cột tách tiền cột: + Cột Acclaim C18 Dionex (150mm x 2,1mm x 3μm) + Tiền cột Acclaim C18 Dionex 3.3 Chọn pha động Trong phương pháp sắc kí lỏng khối phổ, pha động khơng ảnh hưởng tới q trình tách chất mà ảnh hưởng tới q trình ion hóa tín hiệu chất phân tích Dùng dung dịch chuẩn hỗn hợp β – lactam 50 ppb để khảo sát thành phần pha động có thêm chất trên, điều kiện chạy máy cố định sau: - Cột Dionex C18 tiền cột - Detector: MS/MS - Tốc độ dòng: 0,4 ml/phút - Pha động: kênh B ACN, MeOH; kênh A acid acetic 0,1%, CH3COONH4 0,1% nước Dung môi Thôngsố Ampi Pen G Pen V Oxa Clox Tỷ lệ 1:1 1,58 / / / / tr (ph t) ACN – H2O 1,82e+5 Pic tù Pic tù Pic tù Pic tù S Pic 1,23 1,31 1,26 1,33 1,34 tr (ph t) ACN Amoniacetat 6,71e+4 1,40e+5 1,62e+5 6,19e+4 4,82e+4 S Pic 1,18 2,43 2,59 2,78 3,00 ACN –Axit tr (ph t) acetic S Pic 4,32e+5 5,33e+5 6,78e+5 3,51e+5 2,75e+5 / / / / / tr (ph t) MeOH - H2O Pic tù Pic tù Pic tù Pic tù Pic tù S Pic / / / / / MeOH - Axit tr (ph t) acetic Pic tù Pic tù Pic tù Pic tù Pic tù S Pic 1,80 / / / / t (ph t) MeOH r Amoniacetat 9,18e+4 Pic tù Pic tù Pic tù Pic tù S Pic Nhƣ vậy, thông số tối ƣu cho trình chạy sắc ký nhƣ sau: + Cột Symestry C18 Dionex (150mm x 2,1 mm x 3μm) + Tiền cột C18 Dionex + Thành phần pha động: Kênh A dung dịch acid acetic 0,1% nước, kênh B dung môi ACN + Chương trình chạy gradient bảng 3.6 + Tốc độ dòng 0,4ml/phút + Detector MS/MS 3.2 Đánh giá phƣơng pháp phân tích 3.2.1 Khảo sát lập đƣ ng chuẩn pha dãy dung dịch chuẩn có nồng độ từ ppb đến 500 ppb từ dung dịch chuẩn gốc chuẩn trung gian ppm Các dung dịch chuẩn pha ACN:H2O 1:1 Sau đem đo điều kiện khảo sát trên, kết thu bảng Từ kết đó, ta xây dựng đường chuẩn kháng sinh nhóm β – lactam Trường Đại học Y Dược Thái Nguyên Bản tin Y Dược học miền núi số năm 2016 3.2.2 iới hạn phát OD v giới hạn định lƣợng OQ Để xác định giới hạn phát LOD giới hạn định lượng LOQ, dùng chuẩn hỗn hợp 10 ppb tiến hành pha lỗng mẫu thực khơng chứa chất phân tích thu chiều cao chất phân tích gấp lần tín hiệu đường kháng sinh Penicillin V thịt nồng độ 0,1 ppb với giá trị S/N = 3,9 3.3 Phân tích mẫu thực tế Trường Đại học Y Dược Thái Nguyên Bản tin Y Dược học miền núi số năm 2016 Sau nghiên cứu điều kiện tách chiết β - lactam, chúng tơi tiến hành phân tích số mẫu thực Đối tượng mẫu số loại thịt thị trường Hà Nội như: thịt bò, thịt lợn, thịt gà … Các mẫu thịt trước đem phân tích cần phải xử lí sơ Các mẫu nghiền nhỏ đồng nhất, sau đem cân tiến hành phân tích qui trình Mỗi mẫu làm lặp lại lần lấy giá trị trung bình lần Bảng 3.3 Kết phân tích mẫu thịt Lượng LOD Lượng tìm STT Mẫu β - lactam R% thêm vào (ppb) thấy (ng) (ng) Ampicillin Penicillin G < LOD - 100 61,1 ± 1,3 61,1 < LOD - 0,5 0,5 100 Thịt gà (Xuất xứ: Chợ Hà Đông) Penicillin V 0 Penicillin G - 66,7 ±1,7 66,7 < LOD - 70,2 ±2,0 70,2 - 100 63,2 ± 1,2 63,2 < LOD - 0,5 69,1 ±1,7 69,1 < LOD - 0,1 63,4 ±1,5 63,4 < LOD - 0,1 100 Cloxacillin < LOD < LOD 100 Oxacillin 67,4 0 Penicillin V 67,4 ±1,5 0,5 100 Thịt lợn (Xuất xứ: Chợ Hà Đông) - 0,1 100 Ampicillin < LOD 0,1 100 Cloxacillin 71,2 0,1 100 Oxacillin 71,2 ±1,9 62,5 ±1,6 101,6 < LOD - 0,1 100 67,2 ±2,1 67,2 Trường Đại học Y Dược Thái Nguyên Ampicillin Penicillin G Bản tin Y Dược học miền núi số năm 2016 < LOD - 100 66,1 ± 1,2 66,1 < LOD - 0,5 0,5 100 Thịt bò (Xuất xứ: Chợ Hà Đơng) Penicillin V Ampicillin Penicillin G Ampicillin 68,4 100 72,1 ± 1,9 72,1 < LOD - 100 61,1 ± 1,3 61,1 < LOD - 0,5 0,5 71,2 ±1,9 < LOD 71,2 - 0,1 67,4 ±1,5 < LOD 67,4 - 0,1 100 Thịt lợn (Xuất xứ: Chợ Phùng Khoang) 68,4 ±1,7 - Cloxacillin - < LOD 100 Oxacillin < LOD 62,3 0 Penicillin V 62,3 ±1,5 0,1 100 Thịt gà (Xuất xứ: Chợ Nguyễn Cao) - 0,1 100 Cloxacillin < LOD 67,2 0,1 100 Oxacillin 67,2 ±1,4 66,7 ±1,7 66,7 < LOD - 100 70,2 ± 1,5 70,2 < LOD - 0,1 0,5 Nhận xét: Kết phân tích số mẫu thịt kiểm tra cho thấy: hầu hết mẫu thịt có hàm lượng kháng sinh mức giới hạn phát hiện, có mẫu thịt lợn chợ Phùng Khoang kiểm tra có dư lượng kháng sinh Penicillin V (12,3 ±0,1) ppb Kết luận Trường Đại học Y Dược Thái Nguyên Bản tin Y Dược học miền núi số năm 2016 - Xác định giới hạn phát LOD kháng sinh thịt sữa từ 0,1 ppb đến 0,5 ppb Giới hạn định lượng LOQ từ 0,3 ppb đến 1,5 ppb - Xây dựng đường chuẩn, phương trình hồi quy tuyến tính kháng sinh khoảng tuyến tính 1–300 ppb, hệ số tương quan tuyến tính R > 0,999 - Nghiên cứu đánh giá độ lặp lại độ thu hồi phương pháp: Với mẫu thịt: hiệu suất thu hồi đạt từ 53,1% đến 91,9%, hệ số biến thiên CV từ 2,45 đến 10,68% - Tiến hành áp dụng phương pháp phân tích mẫu thịt địa bàn Hà Nội phát mẫu thịt có chứa dư lượng Penicillin V Từ kết thu chúng tơi nhận thấy áp dụng phương pháp sắc kí lỏng hai lần khối phổ (LC-MS MS) phân tích hàm lượng kháng sinh β – lactam với độ tin cậy cao, phù hợp cho việc phân tích dư lượng kháng sinh thực phẩm Tài liệu tham khảo 1.Nguyễn Văn Đích (2005), "Khơng nên lạm dụng kháng sinh", Báo y học đời sống, số 27 Nguyễn Văn Ri (2007), Các phương pháp tách sắc ký, chuyên đề cao học trường ĐH KHTN - ĐHQG Hà Nội Đặng Thu Hiền (2011), Xác định hóa chất bảo vệ thực vật carbamat số loại rau phương pháp sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS, Luận văn thạc sĩ khoa học ĐHKHTN 3.Nguyễn Thị Ánh Tuyết, Nguyễn Đức Thanh, Nguyễn Văn Ri, Nguyễn T Vân Anh (2008),Xác định đồng thời enrofloxacin ciprofloxacin thực phẩm phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao.Tạp chí phân tích Hóa, Lý Sinh học số T.13,số 3,tr26 Nguyễn Văn Ri (2007), Các phương pháp tách sắc ký, chuyên đề cao học trường ĐH KHTN - ĐHQG Hà Nội Đàm Thị Minh Tâm (2006), Tách Xác định hàm lượng Tetracyclyn thực phẩm phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao- Luận văn thạc sĩ khoa học ĐHKHTN SUMMARY Aims: The study was conducted to build up the methodology to identify the amount of some certain antibiotics of B-lactam group in food, including: to investigate the conditions of processing and analysing the specimens + to assess the method built up in the process of analysing the specimens Results: LOD of the antibiotics in meat and milk was found to be from 0.1 ppb to 0.5ppb LOQ was between 0.3 ppb to 1.5 ppb Assess the degree of repeatability and recovery of the method:With meat specimens: recovery efficiency achieved from 53.1% to 91.9%, and the CV going from 2.45 to 10.68% Conclusions: From these results we found that we can apply liquid chromatography method twice mass spectrometry (LC-MS / MS) analysis of antibiotic concentrations β - lactam with high reliability, consistent for the analysis of antibiotics in foods Keywords: ... enrofloxacin ciprofloxacin thực phẩm phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao. Tạp chí phân tích Hóa, Lý Sinh học số T.13,số 3,tr26 Nguyễn Văn Ri (2007), Các phương pháp tách sắc ký, chuyên đề cao học trường ĐH... thịt có chứa dư lượng Penicillin V Từ kết thu chúng tơi nhận thấy áp dụng phương pháp sắc kí lỏng hai lần khối phổ (LC-MS MS) phân tích hàm lượng kháng sinh β – lactam với độ tin cậy cao, phù hợp... phương pháp phân tích sắc ký lỏng hai lần khối phổ (LC-MS MS) kết hợp với phương pháp xử lí mẫu chiết pha rắn (SPE) để xác định dư lượng số kháng sinh nhóm β-Lactam thực phẩm Các bước tiến hành