Mục tiêu nghiên cứu của bài viết nhằm phát triển phương pháp định lượng capsaicin và dihydrocapsaicin để lựa chọn nguyên liệu ớt có hàm lượng hoạt chất cao nhất. Mời các bạn cùng tham khảo nội dung chi tiết của tài liệu.
TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2014 NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƢỢNG CAPSAICIN VÀ DIHYDROCAPSAICIN TRONG QUẢ ỚT BẰNG PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO Hoàng Văn Lương*; Nguyễn Văn Long*; Chử Văn Mến* Nguyễn Thị Thanh Hương*; Phạm Thị Thanh Hương* TÓM TẮT Tiến hành định lượng capsaicin dihydrocapsaicin ớt phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) kết hợp với quang phổ UV-Vis Tiến hành phân tích cột pha đảo C18 (5 μm; 4,6 mm x 150 mm), với chương trình gradient sử dụng dung mơi A (nước) dung mơi B (acetonitril), bước sóng 222 nm, tốc độ dòng 0,6 ml/phút Giới hạn phát capsaicin dihydrocapsaicin tương ứng 11 ng/mL Giới hạn định lượng capsaicin dihydrocapsaicin tương ứng 24 33 ng/g Phương pháp áp dụng cho 20 mẫu ớt thu mua thị trường Kết quả: hàm lượng capsaicin dihydrocapsaicin biến động nhiều mẫu * Từ khóa: Capsaicin; Ớt; Sắc ký lỏng hiệu cao Quantitation of Capsaicin and Dihydrocapsaicin in Fructus Capsici using HPLC-UV/Vis method summary We quantitated capsaicin and dihydrocapsaicin in Fructus Capsici using HPLC-UV/Vis method The separation was carried out on a reversed phase C18 (5 μm; 4.6 mm x 150 mm) by gradient elution with water and acetonitrile, the wave length was set at 222 nm, the flow rate water was set at 0.6 ml/min The limit of detection (LOD) of the method was and 11 ng/g for capsaicin and dihydrocapsaicin, respectively The limit of quantification (LOD) was 24 and 33 ng/mL The developed method was applied to the quantitation of 20 sample of different Fructus Capsici samples purchased from markets The results showed that the contents of capsaicin and dihydrocapsaicin were different between samples * Key words: Capsaicin; Capsicum; HPLC ĐẶT VẤN ĐỀ Ớt thuộc chi Capsicum, họ Cà (Solanaceae), có nguồn gốc vùng nhiệt đới châu Mỹ, ngày trồng nhiều nước nằm vùng nhiệt đới cận nhiệt đới châu Á [1] Ở Việt Nam, có gần 10 loại ớt sử dụng chữa đau lưng, thấp khớp, đau dây thần kinh, viêm quản, viêm họng… [2] Nghiên cứu thành phần hóa học tác dụng sinh học ớt cho thấy nhóm hoạt chất capsaicinoid (capsaicin, dihydrocapsaicin ), sắc tố carotenoid capsanthine, adenine, betaine cholien vitamin B1, B2, C… có tác dụng giảm đau, * Học viện Quân y Người phản hồi (Corresponding): Chử Văn Mến (chuvanmen@gmail.com) Ngày nhận bài: 28/03/2014; Ngày phản biện đánh giá báo: 08/05/2014 Ngày báo đăng: 26/05/2014 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2014 tác dụng da niêm mạc, tác dụng giảm tích lũy lipid gan… Gần đây, số tác giả nước chứng minh capsaicin có tác dụng giảm đau, chống đau viêm khớp viêm [3, 4] Một số nghiên cứu capsaicin có hiệu chống ung thư [5], chống lại cholesterol cao béo phì [6, 7] chuẩn cho HPLC Các hóa chất khác đạt tiêu chuẩn phân tích - Máy HPLC Alliance Water 2695D, gồm hệ bơm kênh dung môi, autosampler, buồng ổn định nhiệt cột Water 996 PDA Detector Thực phân tích cột pha đảo C 18 (4,6 mm x 150 mm, µm) Dihydrocapsaicin có tác dụng chống lại Phƣơng pháp nghiên cứu hình thành mảnh xơ vữa động mạch - Mẫu chuẩn: dung dịch chuẩn gốc [8] Ngồi ra, capsaicin chất khác nhóm capsaicinoid có tác dụng pha cách hòa tan capsaicin dihydrocapsaicin chuẩn methanol sinh lý dược lý đường ruột - với nồng độ mg/ml Từ dịch gốc capsaicin dày, hệ tim mạch hô hấp, dihydrocapsaicin, pha dung dịch giác quan hệ điều hòa nhiệt chuẩn làm việc thích hợp Hàm lượng hoạt chất ớt phụ - Mẫu thử: cân xác g mẫu bột thuộc nhiều vào lồi, thổ nhưỡng, khí ớt, cho vào bình định mức 25 ml, thêm hậu, cách trồng, chăm sóc thu hoạch methanol 100% đến vạch Chiết siêu âm Do vậy, việc đánh giá chất lượng ớt thu 60 phút 25oC, lọc qua màng 0,45 µm mua thị trường cần thiết Trong Dịch lọc dùng để tiêm mẫu nghiên cứu này, phát triển phương pháp định lượng capsaicin dihydrocapsaicin để lựa chọn nguyên liệu ớt có hàm lượng hoạt chất cao NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Nguyên liệu thiết bị - Mẫu ớt mua khu vực khác Việt Nam mã hóa thành mẫu C01 đến C20 - Hóa chất: capsaicin dihydrocapsaicin chuẩn (Sigma), độ tinh khiết > 98% Acetonitril, methanol, nước cất đạt tiêu KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN Khảo sát điều kiện sắc ký Tiến hành khảo sát với điều kiện sắc ký: cột Water C18 (4,6 mm x 150 mm; μm); pha động gồm nước:acetonitril với điều kiện rửa giải khác Chúng tơi tìm điều kiện sắc ký tối ưu gồm chương trình chạy đẳng dòng, tỷ lệ pha động nước:acetonitril = 50:50; tốc độ dòng 0,6 ml/phút, thể tích tiêm 10 μl; detector UV bước sóng phát 222 nm TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2014 Hình 1: Sắc ký đồ hỗn hợp chuẩn (a) mẫu bột ớt (b); 1: capsaicin, 2: dihydrocapsaicin Sắc ký đồ thu cho píc tách rõ ràng, nhiễu thấp thể qua sắc ký đồ mẫu bột ớt chuẩn capsaicin dihydrocapsaicin Trên sắc ký đồ, píc mẫu thử có thời gian lưu trùng với thời gian lưu píc capsaicin dihydrocapsaicin chuẩn với thời gian lưu 6,97 8,93 phút Tại thời gian lưu píc capsaicin dihydrocapsaicin sắc đồ mẫu thử mẫu chuẩn, so sánh phổ hấp thụ UV thu píc, kết quả: phổ mẫu thử mẫu chuẩn trùng khít lên với hệ số phù hợp 0,9998 (hình 2) Chứng tỏ, píc thu sắc ký đồ mẫu thử tinh khiết thành phần khác có mẫu thử khơng ảnh hưởng đến q trình phân tích capsaicin dihydrocapsaicin Hình 2: Phổ UV chuẩn capsaicin dihydrocapsaicin (a) píc capsaicin dihydrocapsaicin xác định mẫu bột ớt (b) TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2014 Thẩm định phƣơng pháp định lƣợng * Lựa chọn bước sóng: Từ phổ UV capsaicin dihydrocapsaicin, chúng tơi thấy: capsaicin dihydrocapsaicin có đỉnh cực đại 222 nm 278,7 nm Kết đánh giá tỷ lệ tín hiệu nhiễu (S/N) capsaicin dihydrocapsaicin bước sóng thể bảng Bảng 1: BƯỚC SÓNG 222 nm 738147,6 419017,6 278,7 nm 53482,2 15865,6 Tại bước sóng 222 nm, píc capsaicin dihydrocapsaicin có tỷ lệ tín hiệu/nhiễu cao Vì vậy, chúng tơi lựa chọn bước sóng để phân tích capsaicin dihydrocapsaicin mẫu bột ớt * Tính tương thích hệ thống sắc ký: Khảo sát tính tương thích hệ thống sắc ký dựa vào phân tích lần mẫu chuẩn capsaicin máy HPLC với điều kiện nêu Đánh giá dựa vào sai số tương đối độ lệch chuẩn tương đối phép thử song song thời gian lưu, diện tích píc - Phương trình đường chuẩn, giới hạn phát (LOD) giới hạn định lượng (LOQ): Hòa tan capsaicin dihydrocapsaicin methanol tới nồng độ 1.000 µg/ml dung dịch chuẩn gốc Từ dung dịch gốc, pha dung dịch chuẩn có nồng độ thích hợp để thiết lập đường chuẩn mối liên hệ diện tích píc capsaicin dihydrocapsaicin với nồng độ Phương trình tuyến tính xây dựng dạng y = ax + b Trong đó, y x tương ứng với diện tích píc nồng độ capsaicin dihydrocapsaicin Đối với giới hạn phát (LOD) giới hạn định lượng (LOQ), hòa lỗng dung dịch chuẩn gốc tới nồng độ thích hợp với methanol tiêm vào hệ thống HPLC để phân thích Đánh giá LOD dựa píc thấp phát sắc đồ có giá trị tỷ lệ tín hiệu/nhiễu Đánh giá LOQ dựa nồng độ thấp định lượng có giá trị tín hiệu/nhiễu 10 Bảng 2: Tính tương thích hệ thống sắc ký 10 THỜI GIAN LƯU (phút) DIỆN TÍCH PÍC (10 µg/ml) 6,979 2597147 6,975 2642635 6,974 2613104 6,976 2596175 6,978 2632009 (mAU x min) X 6,976 2616214 SD 0,002 20750 RSD (%) 0,0430 0,793 Hình 3: Đường chuẩn capsaicin (a) dihydrocapsaicin (b) TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2014 Bảng 3: Giới hạn phát giới hạn định lượng capsaicin dihydrocapsaicin THAM SỐ Hệ số góc 4,86 2,58 Giao trục tung 0,73 0,58 0,9997 0,9994 11,0 8,0 Hệ số tuyến tính LOD (ng/ml) LOQ (ng/ml) Khoảng tuyến tính (ug/ml) 33,0 24,0 0,05 - 20 0,05 - 20 * Độ thu hồi: Thí nghiệm độ thu hồi để đánh giá mức độ xác phương pháp cách thêm lượng xác định chuẩn vào mẫu biết trước nồng độ Hỗn hợp chiết phân tích Chất chuẩn thêm vào chuẩn bị nồng độ khác Tại nồng độ, tiến hành lặp lại lần Bảng 4: Độ thu hồi capsaicin dihydrocapsaicin CHẤT NỒNG ĐỘ THÊM (ng/ml) Capsaicin Dihydrocapsaicin NỒNG ĐỘ PHÁT HIỆN (ng/ml) TỶ LỆ THU HỒI TRUNG BÌNH (%) 0,0 80,88 - - 50,0 128,84 95,92 2,01 100,0 178,89 98,01 1,97 200,0 276,31 97,715 3,27 0,0 55,91 - - 50,0 104,82 97,82 2,03 100,0 153,85 97,94 1,87 200,0 252,31 98,20 3,11 * Độ độ xác (độ lặp): Độ độ lặp lại ngày thực cách phân tích dung dịch chuẩn lần/ngày Độ độ lặp lại ngày thực cách phân tích dung dịch chuẩn ngày liên tiếp Bảng 5: Độ độ lặp lại capsaicin dihydrocapsaicin CHẤT Capsaicin Dihydrocapsaicin NỒNG ĐỘ BAN ĐẦU (ng/ml) TRONG NGÀY (n = 5) GIỮA CÁC NGÀY (n = 5) Nồng độ phát Nồng độ phát Độ (%) Độ lặp (%) Độ (%) Độ lặp (%) (µg/ml) (µg/ml) 100 98,80 ± 1,64 98,80 1,64 98,60 ± 2,61 98,60 2,61 200 199,60 ± 3,91 99,80 1,96 200,20 ± 3,70 100,10 1,85 500 500,98 ± 4,71 100,20 0,94 501,18 ± 5,04 100,24 1,00 100 99,58 ± 2,85 99,58 2,85 99,78 ± 3,16 98,60 3,16 200 201,18 ± 4,13 100,59 2,07 200,78 ± 4,41 100,39 2,20 500 501,18 ± 5,04 100,24 1,01 501,58 ± 5,73 100,32 1,15 11 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2014 Kết định lƣợng capsaicin dihydrocapsaicin mẫu bột ớt Định lượng capsaicin dihydrocapsaicin mẫu bột ớt thu mua khu vực khác dihydrocapsaicin mẫu bột ớt thu mua thị trường Kết cho thấy hàm lượng capsaicin dihydrocapsaicin biến đổi nhiều mẫu thu mua thị trường Bảng 6: Hàm lượng capsaicin dihydrocapsaicin (mg/100 g) bột ớt TÀI LIỆU THAM KHẢO MẪU C01 4,22 2,82 C02 4,17 2,67 C03 4,21 2,82 C04 3,97 2,61 C05 4,15 2,74 C06 4,31 2,88 C07 4,02 2,64 C08 3,95 1,57 C09 4,20 2,81 C10 3,88 1,55 C11 3,75 1,52 C12 4,39 2,89 C13 3,26 1,84 C14 3,92 1,67 C15 3,25 1,84 C16 4,84 2,51 C17 3,11 1,79 C18 4,91 2,61 C19 3,23 1,88 C20 3,81 1,56 Hàm lượng capsaicin dihydrocapsaicin thay đổi nhiều mẫu Hàm lượng biến đổi khoảng 3,25 - 4,84 mg/g capsaicin 1,55 - 2,88 mg/g dihydrocapsaicin mẫu bột ớt khô Kết phù hợp với nhiều nghiên cứu trước [9] KẾT LUẬN Phương pháp HPLC để định lượng capsaicin dihydrocapsaicin bột ớt (Capsicum sp, họ Cà - Solanaceae) phát triển thẩm định đầy đủ, áp dụng vào phân tích hàm lượng capsaicin 12 Đỗ Huy Bích CS Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam, tập NXB Khoa học Kỹ thuật 2004, tr.504-508 Đỗ Tất Lợi Những thuốc vị thuốc Việt Nam NXB Y học 2004, tr.382-384 Menéndez L, Lastra A, Hidalgo A, Baamonde A The analgesic effect induced by capsaicin is enhanced in inflammatory states Life Sci 2004, May 14, 74 (26), pp.3235-3244 Kim CS, Kawada T, Kim BS, Han IS, Choe SY, Kurata T, Yu R Capsaicin exhibits antiinflammatory property by inhibiting IkB-a degradation in LPS-stimulated peritoneal macrophages Cell Signal 2003, Mar, 15 (3), pp.299-306 Oyagbemi AA, Saba AB, Azeez OI Capsaicin: a novel chemopreventive molecule and its underlying molecular mechanisms of action Indian J Cancer 2010, Jan-Mar, 47 (1), pp.53-58 Joo JI, Kim DH, Choi JW, Yun JW Proteomic analysis for antiobesity potential of capsaicin on white adipose tissue in rats fed with a high fat diet J Proteome Res 2010, Jun 4, (6), pp.2977-2987 Negulesco JA, Young RM, Ki P Capsaicin lowers plasma cholesterol and triglycerides of lagomorphs Artery 1985, 12 (5), pp.301-311 Yan-Wei Hu, Xin Ma, Jin-Lan Huang, Xin-Ru Mao, Jun-Yao Yang, Jia-Yi Zhao, ShuFen Li, Yu-Rong Qiu, Jia Yang, Lei Zheng mail, Qian Wang Dihydrocapsaicin atenuates paque fomation through a PPARγ/LXRα pathway in apoE−/− mice fed a high-fat/high-cholesterol diet Plos One 2013, June, (6),p.66876 Zeid Abdullah Al Othman, Yacine Badjah Hadj Ahmed, Mohamed Abdelaty Habila, Ayman Abdel Ghafar Determination of capsaicin and dihydrocapsaicin in capsicum fruit samples using high performance liquid chromatography Molecules 2011, 16, pp.8919-8929 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2014 13 ... Kết định lƣợng capsaicin dihydrocapsaicin mẫu bột ớt Định lượng capsaicin dihydrocapsaicin mẫu bột ớt thu mua khu vực khác dihydrocapsaicin mẫu bột ớt thu mua thị trường Kết cho thấy hàm lượng capsaicin. .. Hình 1: Sắc ký đồ hỗn hợp chuẩn (a) mẫu bột ớt (b); 1: capsaicin, 2: dihydrocapsaicin Sắc ký đồ thu cho píc tách rõ ràng, nhiễu thấp thể qua sắc ký đồ mẫu bột ớt chuẩn capsaicin dihydrocapsaicin. .. thiết Trong Dịch lọc dùng để tiêm mẫu nghiên cứu này, phát triển phương pháp định lượng capsaicin dihydrocapsaicin để lựa chọn nguyên liệu ớt có hàm lượng hoạt chất cao NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ VÀ