Góp phần nghiên cứu phương pháp định lượng artesunat trong chế phẩm viên nén

Góp phần nghiên cứu phương pháp định lượng artesunat trong chế phẩm viên nén Góp phần nghiên cứu phương pháp định lượng artesunat trong chế phẩm viên nén Góp phần nghiên cứu phương pháp định lượng artesunat trong chế phẩm viên nén Góp phần nghiên cứu phương pháp định lượng artesunat trong chế phẩm viên nén Góp phần nghiên cứu phương pháp định lượng artesunat trong chế phẩm viên nén Góp phần nghiên cứu phương pháp định lượng artesunat trong chế phẩm viên nén Góp phần nghiên cứu phương pháp định lượng artesunat trong chế phẩm viên nén Góp phần nghiên cứu phương pháp định lượng artesunat trong chế phẩm viên nén Góp phần nghiên cứu phương pháp định lượng artesunat trong chế phẩm viên nén Góp phần nghiên cứu phương pháp định lượng artesunat trong chế phẩm viên nén Góp phần nghiên cứu phương pháp định lượng artesunat trong chế phẩm viên nén Góp phần nghiên cứu phương pháp định lượng artesunat trong chế phẩm viên nén Góp phần nghiên cứu phương pháp định lượng artesunat trong chế phẩm viên nén Góp phần nghiên cứu phương pháp định lượng artesunat trong chế phẩm viên nén Góp phần nghiên cứu phương pháp định lượng artesunat trong chế phẩm viên nén Góp phần nghiên cứu phương pháp định lượng artesunat trong chế phẩm viên nén Góp phần nghiên cứu phương pháp định lượng artesunat trong chế phẩm viên nén Góp phần nghiên cứu phương pháp định lượng artesunat trong chế phẩm viên nén

Trang 1

BỘ GIÂO DỤC VĂ ĐĂO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HĂ NỘI ae ok ak ok sk ok ok ok 3 ok ĐÔ THỊ THẢO GÓP PHẦN NGHIÍN CỨU

PHƯƠNG PHÂP ĐỊNH LƯỢNG ARTESUNAT

TRONG CHE PHAM VIEN NEN

8

LUẬN VAN THAC SY DUOC HOC

Trang 2

Lei cam on

Trubĩ hĩt tăi xin cha tranh eam oa su quan tin, gìn đó ⁄4

eau Ban yiam hita, Qhĩong die tac sau dai hee, câc phòng ban, oa thie hitn luda van nag ata tĩi tai trabug

câc bộ trđn trubag Dai hoe Duce Ma agi trong qua teinh hoe tap

Foi xin bay to long biĩt- on sua sae ahat lới 2Ý Fran Due

€

frischi aghiĩn eta od thee hits lid wait

Mau, nguet thủy trực tiếp habag dan, da dank ahiĩu cĩng sie

giip đê nă truyín đạt nhưng kùtft Hgitttt gu bâu trang suaĩt qua

ôi aingy xin aim on ode thay 66 trong B6 win Fod Due - Frudug Datihoe Duce Ja Gi da giip Ti; tae moi Tita kiĩu de

tôi hoan lanh tưận oan ea ahda tai cade dou of trĩn,

hin dip aay t6i xin bay to lòng biĩt ow (60 at ca lap thĩ oa

Hay,

at ¬ we ^ oo 5 vs 8

Cudt cong, t6ĩ 06 vang can ou gia dith, bau bỉ va uguoi than da ding oiĩu va hĩt long gitp dĩ dĩ tĩĩ hoaua thaah ladu eau

Ha Noi, thang |! nam 2001

Trang 3

MUC LUC

ĐẶT VẤN ‡ ĐỀ 3-

PHẦN I- TỔNG QUAN 5

1.1 Tĩng quan vĩ cay thanh‘hao hoa-vang,va.cac‘hoat chat cua no ”

1.l.1, Cđy thanh hao hoa văng 5

1.1.2 Thanh phan hoâ học của cđy thanh hao hoa văng 6

1.2 Đại cương về driesunalt 8 1.2.1 Công thức Sa 1.2.2 Phương phâp điều chế 8 3 1.2.3 Tính chất của artesunat Ili |.2.4 Co chế tâc dụng II; 1.2.5 Được động học Lae II.2.6 Độc tính 12; II.2.7 Chế phẩm 133

1.3 Câc phương phap dinh luong artesunat nguyĩn liệu 13;

3.1 Phương phâp đo quang phổ hấp thụ vùng tử ngoại 13:

1.3.2 Phuong phap HPLC voi Detector UV 141

I.3.3 Phươiig phâp HPL€ với detector khúc xạ kế, 15:

II.3.4 Phương phâp HPL€ với deteetor điện hoâ 15;

II.3.5 Phương phâp đe kiểm trong môi trường nude 15 II.3.6 Phương phâp đo kiểm trong môi trường khan 16;

3.7 Phương phâp đo phổ hấp thụ vùng khả kiến đưới dạng muối

hydroxamat sắt 16°

I.3.8 Câc phương phâp định lượng khâc: 16:

1.4 Câc phương phâp định lượng ariesunat trong viín nĩn (lang úp

dụng ở nước fq 17:

1.4.1 Phương phâp quang phô 17;

[.4.2 Phương phâp đo kiềm trong môi trường nước 18:

5, Nhận xĩt vă lựa chọn đê;

PHẦN 2 - ĐỐI TƯỢNG, PHƯƠNG TIỆN VĂ PHƯƠNG PHÂP

NGHIÍN CỨU 12

24 Đối tượng nghiín cứu 12

2.2 Phương tiện, dụng cụ, hoâ chât: : ọ

2.2.1 Dụng cụ, mây móc:

2.2.2, Hoâ chất 12

2.3, Phương phâp nghiín: cứu 2

PHAN 3 - THUC NGHIEM VA KET QUA 21

3.41 Khao sât tính đặc hiệu của một số phương phúp hiện dang sử |

dụng để định lượng artesunat 2i

3.1.1 Khảo sât tính đặc hiệu của phương phâp HPLC detector DV

Trang 4

3.1.2 Khảo sât tính đặc hiệu của phương phâp đo quang phổ hấp thụ vùng tử ngoại ở 28§9nm 3.1.3 Khảo sât tính đặc hiệu của phương phâp đo quang phô hấp thụ ở vùng khả kiến, 3.1.4 Khảo sât tính đặc hiệu của phương phâp đo kiểm trong môi trường nước

3.2 Khảa sât lượng DHA vă qebll sueeHie có mai iron

artesunat cua mot 86 cơ sở sản xuút

3.2.1 Khảo sât lượng DHA có mặt trong viín nĩn artesunat của một số cơ sở sản xuất-

3.2.2 Khảo sât lượng acid succimc có mặt trong viín nĩn artesunat của một số cơ sở sản xuất

3.2.3 Định lượng artesunat trong viín nĩn theo phương phâp ghi trong tiíu chuẩn cơ sở

3.3 Cải tiín phương phâp dịnh lượng artesunat bằng do quang phố tt ngoại ở 289nm 3.3.1 Cải tiến phương phâp định lượng artesunat nguyín liệu bang do quang phổ tử ngoại ở 289nm 3.3.2 Cải tiến phương phâp định lugng aftesunat trong viĩn nĩn bằng đo quang phổ tử ngoại ở 289nm 3.3.3 Đânh giâ phương phấp 3.3.3.] Xâc định tính chính xâc của phương phâp 3.3.3.2 Xâc định tính đúng của phương phâp

3.3.3.3 Xâc định tính tuyến tính của phương phâp

3.3.4 Xâc định tính đặc hiệu của phương phâp

hap thu vùng khả kiến

3.4.1 Câi tiến phương phâp định lượng artesunat nguyín liệu bằng đo quang phổ hấp thu vùng khả kiến

3.4.2 Cải tiến phương phâp định lượng artesunat trong viín nĩn bằng đo

quang phổ hấp thu vùng khả kiến 3.4.3 Đânh giâ phưỡng phấp

3.4.3.1 Xâc định tính chính xâc của phương phâp

3.4.3.2 Xẩ định tính đúng của phương phâp 3.4.3.3 Xâc định tính tuyín tính của phương phâp 3.4.3.4 Xâc định tính đặc hiệu của phương phâp 3.5, Biĩn ludn kĩt qua

KET LUAN

TAI LIEU THAM KHAO

Trang 5

3

DAT VAN DE

Sốt rĩt lă một bệnh xê hội, dễ bị lđy nhiễm, gđy ra bởi ký sinh trùng sốt rĩt, ky sinh tring nay thuộc chỉ Plasmodium Những loăi gđy bệnh cno người

chủ yếu gồm:

Plasmodium faiciparun

- Plasmodium matariae - Plasniodium vivax

Trong đó, tỷ lệ mắc bệnh do P falciparum la 70%, do P.vivax la 20 - 30%, còn Ð_miariae chiễm tỷ lệ rất nhỏ, chỉ khoảng [-2%

Do đặc điểm tâc nhđn truyền bệnh lă muỗi, bệnh có tính chất dịch tế rất

quan trọng lă có thể lan trăn thănh dịch nếu không phât hiện vă ngăn chặn kịp thời

Bệnh phât triển ở nhiều nước trín thể giới, đặc biệt lă những nước nhiệt

đới có khí hậu ẩm thấp (nóng, ẩm, mưa nhiều) Theo số liệu của Tổ chức Y tế thế

giới (WHO) có khoảng 100 đến 200 triệu ca sốt rĩt với mức tử vong từ L tới L,5

triệu ca mỗi năm [14],[2!] Theo Bộ Y tế, ở nước ta hăng năm có trín Ì triệu ca

sốt rết, trong đó có trín 30000 ca sốt rĩt âc tính [1Š]

Việc kiểm soât bệnh sốt rĩt rất khó khăn, có tới l!,7 ty người hiện đang

sinh sống trong những vùng mă trước đđy sốt rĩt đê bị đấy lùi, nhưng giờ đđy

đang phât triển mạnh trở lại Hiện nay ký sinh trùng sốt rết đê khâng lại hđu hết

câc loại thuốc quen thuộc: Quinin, Cloroquin, Quinacrin, Mefloqum., !lăm:cho việc điều trị sốt rếi ngảy căng trở nín khó khăn hơn [2L] Do vay, ngăy nay việc

nghiín cứu tìm ra vă sản xuất ra thuốc mới chữa sốt rĩt đê trở thănh một yíu cầu

cấp bâch

Văo đđu thập niín 70, câc nhă khoa học Trung Quốc đê chiết xuất được từ

lâ cđy Thanh hao hoa văng một chất có tâc dụng điều trị bệnh sốt rĩt gọi lă

Quinghaosu (QHS) hay lă artemisinin, Ở Việt Nam, cđy Thanh hao hoa văng

Trang 6

4 '

có hiệu lực chống sốt rĩt tối kể cả với những bệnh nhđn mắc chủng khâng

thuốc, hơn thế nữa, artemisinin vă câc dẫn chất của nó có khả năng vượt qua

hăng răo mâu nêo nín rất có hiệu lực trong điều trị sốt rĩt thể nêo [9] Tuy nhiín,

đo độ tan của artemisinin trong nước kĩm vă tỷ lệ tâi phât sau khi dùng còn cao

nín tâc dụng điều trị của artemisinin phần năo còn bị hạn chế Để hoăn thiện khả

năng điều trị của artemisinin, câc nhă khoa học đê tiếp tục nghiín cứu vă bân tổng hợp ra một số dẫn chất mới như: artesunat, arterether vă artermether có tâc dụng điều trị cao hơn artemisinin, đồng thời có thể sử dụng cả đường tiím, Trong số câc chất đó thì artesunat được đùng phổ biến nhất hiện nay

Nước ta hiện nay cũng đê sản xuất được artesunat vă đang đưa văo sản

xuất với quy mí lớn Việc kiểm tra chất lượng viền nĩn artesunat (dạng băo chế

phố biến nhất) lă rất quan trọng Tuy nhiín, trong thực tế, việc định lượng artesunat trong viĩn nĩn ở câc cơ sở cho thấy còn nhiều điíu bất cập, thường cho

kết quả rất cao, phụ thuộc người định lượng

Đề lăm sâng tỏ câc kết quả định lượng nói trín, đồng thời góp phần lăm

cơ sở xđy dựng tiíu chuẩn Dược điển Việt Nam, trong đề tăi năy, chúng tôi tiến hănh đề tăi: "Góp phần nghiín cứu phương phâp định lượng artesunat trong chế

phẩm viín nĩn" với thững mục tiíu sau:

«_ Xâc định tính đặc hiệu của câc phương phâp định lượng artesunat trong

viín nến ở nước ta hiện nay vă một số phương phâp định lượng

arfesunat khâc

® Tìm được câch tiến hănh định lượng mới để có được phương phâp đặc

Trang 7

1,1, Tủng quan về cđy thanh bao họa văng vă câc hoạt chất của nó

1d Cay thanh hao hoa văng

Thanh hao hoa văng lă ^ thuốc cổ truyền của Trung quốc đê được sử

dụng lđu đời Trong câc tăi Hệu Y học cổ truyễn của Trung Quốc có nói đến cđy

Quinghao lă cđy đê được ghi chĩp sớm nhất chữa được tới 52 loại bệnh, trong đó có bệnh sốt rĩt Từ đời Hân, những năm I6ô trước Công nguyín, người ta đê

dùng cđy Quinghao để chữa bệnh Người Trung Quốc đê để xuất câch ha sốt như sau: dùng một nắm lâ Quinghao ngđm trong một lít nước, lọc lấy nước uống Sau đó, Lý Thời Trđn đê viết trong “Bản thảo cương mục” năm LŠ95 lă dùng câc chẽ

phẩm của cđy Quinghao để chữa câc cơn lạnh vă cơn sốt của sốt rĩt Ngăy nay,

câc nhă khoa học đê xâc định được cđy Quinghao có tâc dụng chữa sốt rĩt chính lă cđy Thanh hao hoa văng vă tín khoa học 1a: Artemisia annua L Asteraceae

Theo Tổ chức Y tế thế giới (WHO), ở Trung Quốc vă Mỹ cổ khoảng 40 loăi thực vật thuộc chỉ Artemisia, nhưng chỉ có loăi Artemisia annua L lă chứa hoạt chất có tâc dụng chữa sốt rĩt Œ Việt Nam đê biết có 15 loăi, trong đó có 4

loaj st dĩ nham lan yor nhau 1a: Artemisia eapillaris, Artemisia campestric,

Artemisia apiaceae Hance va Artemisia annua L.; 3 !oai Artemisia capillaris,

Artemisia campestric, Artemisia apiaceae Hance khong chita artemisinin [10] Đặc điểm hình thâi của cđy Thanh hao hoa văng:

Thanh hao họa văng lă loại cđy thảo sống lđu năm, mọc hoang thănh

từng đâm ở vùng đổi núi ven suối, ven sông Cđy eao từ Í,5 - 2m Lâ xẻ lông

Trang 8

6

hoa câi Hoa chỉ có kích thước 0,5- Imm Quả bể hình trứng, đăi Ìmm, Mặt vỏ có tuyến chứa tỉnh dầu TYín thị trường tại Trung Quốc, thường bị trộn một

cđy khâc gọi lă hoăng cao hay xú cao cũng hợ Cúc nhưng lâ quanh năm mău

văng lục vă có mùi hôi, còn cđy thanh hao hoa văng thật thì chỉ về mùa thu lâ mi văng, cồn trướe đồ c6 mầu hụe (l Ì]

Thanh hao hơa văng phđn bế ở nhiều nơi trín thế giới như Trung Quốc,

Nhật Bản, Mông Cổ, Ấn Độ, lran, Bắc Mỹ, Đông Đu [10]J[11]

Tại Việt Nam, Thanh hao hoa văng eòn có một số tín khâc như; Thanh

cao hoa văng, ngải sĩ, ngải đại, ngải đắng, ngải hôi, ngải hoa văng, cđy lâ ngăi, " , cđy mọc hoang đại thănh rừng eụm đọc ven sông, suối, chđn đồi nơi ầm thấp ânh sâng nhiều Cđy mọc nhiều ở câc tỉnh phía Bắc như: Lạng Sơn, Quảng

Ninh, Cao Bằng, Bắc Kạn, Thâi Nguyín, Hă Bắc, Vĩnh Phú, Tuyín Quang, Hoă

Thời gian thu hâi tốt nhất văo thâng 8, lúc cđy chuẩn bị ra hoa [LH]

1.1.2 Thănh phần hoâ hoc của cđy Thanh hao hoa văng:

Tất cả câc bộ phận trong cđy Thanh hao hoa văng đều có chứa tỉnh đầu vă hăm lượng tĩnh đầu trong Thanh hao lă rất khâc nhau, nó phụ thuộc văo giống vă nơi trồng, dao động từ khoảng Ô,5 - 0,6% Tình dầu có mău văng nhạt vă có mùi

long nêo với thănh phđn chủ yếu lă camphor, l,8-cineol, B farnesen,

caryophyllen, B cubeben, ariernisia ceton, | myrcerr [Ì II

Ngoăi thănh phần tinh đầu thì hoạt chất chính có tâc dụng điều trị sốt rĩt lầ artemisinin mă câc nhă khoa học Trung Quốc đê chiết tâch vă xâc định cấu trúc từ nêm 1972, đó lă một secquiterpen lacton có cầu nối peroxyd nội phần tử Ngoăi artemisinin, người ta còn xâc định được một loạt hop chat seequiterpen

Trang 9

* qk Artemisinin Deoxyartemisinin » CHg HạC Arteannuin B Epideoxyarteannuin B (Quinghaosu I) 4, ots {ots HO ¬- I I bal Hc `GOOH Acid artemisinic Quinghae Su I Quinghao Su 1V (Arteanuin A) Hs en: -Q~ HạC HạC HC O CH: CH, QO 0

Quinghao Su V Quinghao Su III Arteannuin F

(Arteannuin B) Deoxy artemisinin

Trang 10

1.2 Pai cướng về artesunat: ! 2.1 Công thức:

Artesunat

Hình 1.2: Cong thitc artesunat

Cĩng thie phan tr cua artesunat: C,,H.,O,-

Trọng lượng phđn từ: 384,4222

Tín khoa học; œ - dihydro artemisinin succinat, Ì:2:2 Phương phâp điều chế:

Sự phât hiện vă phđn lập artemisinin từ Artermmisia annua lă một thănh công

lớn trong việc sử dụng dược liệu để điều trị sốt rết Artemisinin có hiệu lực mạnh vă có tâc dụng nhanh ngay cả đổi vĩi ching Plasmodium da khang Cloroquin

Tuy nhiín, câc thí nghiệm lđm săng cho thấy rằng, khi điều trị bằng artemisinin

thì tâi phât xảy ra sớm hơn se với khi đùng Cloroquin, mặc dù bệnh nhđn sạch

ký sinh trùng trong mâu Nhằm tăng độ tan vă tầng hiệu lực điều trị của artemisinin, người ta đê nghiền cứu bân tổng hợp ra một số câc dẫn chất của nó, trong đó quan trọng nhất lă artesunat

Artesunat được bân tổng hợp từ nguyín liệu bạn đầu 1a artermisinin qua

giai đoạn trung gian lă dihydroartemisinin (ĐHA) Trín cơ sở phương phâp của câc nhă khoa học Trung Quốc, D.L.Klayman, P.Brossi vă cộng sự, trường Đại học Dược Hă Nội đê bân tổng hợp được artesunat qua hai giai đoạn với hiệu suất

Trang 11

`

e Giai đoan: T1:

Artemisinin được khử hoâ nhóm lacton thănh dihydro artemisinin bởi

Natri borohydrid (NaBH,) trong môi trường methane] vă ở nhiệt do 0 = 5°C, So

đồ phản ứng như sau:

H ŸT5 Artemisinin (DHA)

Hinh 1.3: So dĩ phan tng khu artemisinin thanh DHA

Kết quả thu được DHA ở hai dạng đồng phđn lă z vă 8 Trín thực tế DHA

cũng có tâc dụng điều trị sốt rĩt mạnh hon artemisinin hai lan, nhung việc sử dụng cũng còn hạn chế, do vậy người ta tiếp tục bân tổng hợp ra artesunat

e Giai doan 2:

Trang 12

19

Ngăy nay, từ DHA, ngoăi artesunar, người ta còn có thể bân tổng hợp ra

nhiều chất khâc có hoạt lực tâc dụng tương tự như artesunat như arteether (AE) vă artemether (AM) băng câch cho DHA tâc dụng với ethanel hoặc methanol với

xúc tấc lă acid Lewls, AE vă AM bín vững hơn artesunat đo artesunat có chức este đễ bị thuỷ phđn, hơn nữa AM vă AE lại tan tốt trong dầu vă cũng có hoạt tính chống sốt rết ngang với artesunat [13]

CH,

C—(CH,CH,

Artemether Arteether

Hinh 1.5: Cong thite cua artemether v@ arteether

Ngoăi tạo ra DHA, AE, AM, artesunat từ artemisinin, ngăy nay, người ta

Trang 13

I1

1.2.3, Tinh chat cua artesunat {7], [29]:

Tỉnh thể không mău hay bột kết tĩnh mău trắng, không mùi, không vi, dĩ

tan trong ethanol, aceton, cloroferm, benzen, khĩ tan trong nước, kĩm bền vững

trong mo} truong acid hay kiĩm Dang mudi Na eua nĩ dĩ tan Wong nude, do vay

có thể dùng để pha thuốc tiím

Năng suất quay cực của artesunat: [œ]¿“ = (+10) đến (+14°)

1.2.4 Cơ chế tâc dụng:

Qua nghiín cứu lêm săng người ta thấy rằng tâc dụng điều trị sốt rết của

artesunat manh gap 5,2 lần artemisinin Thuốc có tâc dụng mạnh trín cả ký sinh

tring di khang Cloroquin, Mefloquin, Fansidar [18] Thuốc có tâc dụng tốt đối

với sốt rĩt âc tính vă thể nêo

Theo Ớu vă cộng sự, tâc dụng diệt ký sinh trùng của artesunat lă do cầu

peroxyd nd} phan tr da tao ra cde gôc tự do của Oxy, Cac gốc tự do năy đê tấn

công văo những thănh phđn cơ bản trong tế băo của ký sinh trùng vă tiíu diệt nó:

Chính vì vậy nín khi cầu nối peroxyd bị phâ huỷ thì thuốc không còn tâc dụng Cơ chế năy khâc hẳn với câc thuốc tổng hợp trước đđy Bằng phương phâp đânh

dấu dùng Triti, câc nhă khoa học nhận thấy rằng nồng độ thuốc ở hồng cầu nhiễm Plasmodium cao hơn hẳn sơ với hồng cầu bình thường Cơ chế cụ thể lă

artesunat tan cĩng vao mang Plasmodium,

Artestinat ttc chĩ hoat tinh ela cytocrom oxydase va hĩ van chuyĩn

glufamin trong hồng cđu Cj pH cao, artesunat tạo ra tức thì câc đạng oxy hoại

động

Câc loại thuốc như mieonazol có tâc dụng lăm tăng hiệu lực của artesunal,

Trang 14

2.5 Dược đóng học:

- Artesunat ding 'thĩo duong uủống-đưộc:hấp thú từ 24-64%; 1Hời giar.bân- - -

thải t;z = 41 phút Thuốc bị giảm hoạt tính do bị chuyín hoâ tại gan Thuốc qua được hăng răo mâu - thai nhi nín trânh đùng ehõ phụ nữ có thai Attesiifiat thai

(từ qua đường nước tiểu, câc chất được thải trừ bao gồm: deoxy artemisinin,

dihydro deoxyartemisinin

1.2.6 Đóc tính:

Được thử tại bộ môn Dược lý, trường Đại học Y Hă Nội |6]

Độc tính cấp: LD5O trín chuột nhắt = 1206 (1081 - 1331) mg/kg bang

đường uống

Khi cho chuột nhắt trắng uống artesunat liều 4mg/ø thể trọng trong 5 ngăy

liĩn không thấy hình ảnh ton thương cấu trúc tế băo ở mô gan vă than, cấu trúc chung của gan vă thận không thay đổi, có hiện tượng xung huyết câc mạch trong thận

Độc tính bân cấp: Cho thỏ uống qua xông văo dạ dăy dung dịch natri

artesunat 2ml/kg/24h với liều 20mg/kg/24h văo giờ nhất định trong ngăy, cho

uống liín tục trong 3Ó ngăy chưa thấy có độc tính bân cấp

Về khả năng gđy đột biến của artesunat được thử tại bộ môn Được lý, trường Đại học Y Hă Nội cho thấy rằng: artesunat không lăm tăng tần sẽ rối loạn nhiễm sắc thể ở tế băo ruỷ xương hoặc tế băo tỉnh hoăn, không lăm xuất hiện câc rối loạn nhiễm sắc thể, không gđy nín câc rồi loạn về sinh sản Câc chuột con được đẻ ra không có đị tật bẩm sinh: quan sắt được cả ở Fl vă F2 số lượng cũng

như trọng lượng của chuột con được để ra bình thường, khi chuột chửa uống

artesunat không gđy nín bất thường ở thế hệ con

Năm 1994, Viện Y học lđm săng câc bệnh nhiệt đới đê tiến hănh thí

nghiệm artesunat trín người khoẻ mạnh vă trín bệnh nhđn nhiễm F.falciparum

không biến chứng [6] Kết quả khi thử trín người khoẻ mạnh không có sự thay

Trang 15

13

phản ứng, không đỏ, không mẩn ngứa Thuốc khuyếch tân nhaiih Dấu hiệu chủ quan: Người tình nguyện không thấy có cảm giâc gì đặc biệt sau khi tiím

Đối với bệnh nhđn nhiễm P.falciparum không biến chứng: Thấy rắng

thuốc có hiệu quả điều trị trín mọi đối tượng bệnh (cả người lớn vă trẻ em), có tâc dụng mạnh đối với ký sinh trùng sốt rĩt, lầm giảm nhanh mật độ ký sinh trùng (đa số trong vòng 24h đầu), cắt cơn sốt nhanh, ngăn chặn được sốt rĩt nặng Thuốc không ảnh hưởng tới chức năng gan, thận, huyết học, không ảnh hưởng gì tới hệ tim mạch 1.2.7 Chế phẩm: Hiện nay trín thị trường Việt Nam có 1Ï loại chế phẩm artesunat vă ở hai đạng băo chế lă: Dạng viín nĩn

- Dang bot dĩ pha tiĩm

Chi dinh: diĩu tri s6t rĩt do P.faleiparum, P.vivax, P.malarie, kể cả sốt rĩt

do nhiễm P.falcIparum đê khâng câc loại thuốc khâc

1.3 Câc phương phâp đỉnh lương artesunaf nguyín liíu;

1.3.1 Phương phâp do quang phố hấp thụ vừng tứ ngoại [1]

Bản thđn artesunat chí hấp thụ ânh sâng ở vùng tử ngoại có bước sóng ngắn

Sau khi đun nóng trong môi trường kiểm, artesunat chuyển thănh Q289 lă sản phẩm có độ hấp thụ cực đại ở bước sóng 28§9nm, do đó có thể định lượng

artesunat trong chế phẩm vă nguyín liệu bằng phương phâp đo độ hấp thụ của ariesunat (sau khi đun nóng trong môi trường kiểm) trín mây đo quang phd 6 bước sóng 289mm Astersunat sau khi dun nong trong môi trường kiểm tạo thănh

Trang 16

14 GOO: -ạC ~ ot a KOH 1M Ch; ote x say 50°G Ms mn COG OCOCH;CH;COOH 4 Hình 1.7: Sơ đồ chuyển hoâ artesunat thănh Q289 Nhđn xĩt:

- Phương phâp có trong TƠN vă nhiều tiíu chuẩn cơ sở

- Phương phâp định lượng dễ thực hiện, trang thiết bị để định lượng câc cơ sở đều có thể eó được,

- Sản phẩm đo quang không phải trực tiếp lă artesunat mă lă sản phẩm chuyển hoâ của nó trong môi trường kiềm - Q289, Theo Nguyễn Mạnh Cường [5], điều kiện âp dụng lă phải khếng chế được lượng dihydro artemisinin trong

chế phẩm, khi đó phĩp định lượng mới có kết quả đúng Tuy nhiín trong chế phẩm viín nĩn, khó có thể khống chế được lượng đihydro artemisinin

1.3.2, Phuong phap HPLC voi detector UY

Định lượng artesunat với pha động lă acetonHril - đệm photphat pH = Š5,I

(tỷ lệ 38: 62) [20], hoặc với pha động acetonitril - đệm acetar pH = 5,I (ty lệ I:1)

[19], bước sóng phât hiện lă 235nm Hoặc để định lượng artesunat trong dược liệu, trong câc dịch sinh vật, người ta đê sử dụng phương phâp sắc ky long hiệu nang cao với chương trình sắc ký cột Lichrosorb Rp 60 - 5 um, 125 x:4 mm, pha

động: 48% CH;CN + 32% dung dịch KH;PO, 0.05M trong nước + 20% nước, tốc độ dòng Iml/phút, detector UV 2l0nm vă thể tích tiím 2Qul, với chương trình chạy sắc ký trín, artesunat có f„ = 2,Ì phút [25]

Nhân xĩt:

- Artesunat chỉ hấp ¡thụ ânh sâng: tử: ngoại: ở: vùng bước sóng.-tgăn.; frong: -: „:

phương phâp định lượng năy, bước sóng phât hiện lă 235nm, sản phẩm định

lượng có thể không phải lă artesunat, nín DHA (nếu có) có thể sẽ ảnh hưởng tới

Trang 17

l5

1.3.3 Phuong phap HPLC voi detector khitc xa kĩ [31]

Định lượng artesunat với pha tĩnh lă cột RP18 (12,5cm x 3,5mm), cỡ hạt Sum, pha đệng lă acetonitril - đệm pH3ô (dung địch đệm pH: 1,36g KH;:PO,

trong 1000ml H;O, điều chính 0H tới 3 bảng H;PO;) với tý lệ I:1 Tốc độ dòng

0,6 mi/phút, nồng độ dung dịch mẫu 4mg/1mi, thể tích tiím mẫu 2OHll, đetector khúc xạ kế

1.3.4 Phuong phap HPLC với đeiector điín hoâ |27, |28]

Dựa trín nguyín tắc: Trong phđn tử artemisinin vă câc dẫn chất của nó chứa cầu nối peroxyd nội phđn tử, cầu nối năy quyết định tâc dụng điều trị sốt

rĩt của riíng chúng Đồng thời, chính sự có mặt của cầu nối peroxyd mê người ta

đê sử dụng phương phâp HPLC với detector điện hoâ để định lượng artesunat

Quâ trình xảy ra trín bề mặt điện cực được mô tả như sau:

Hình 1,48: Sơ độ khử cực của arlesunat trín bề mất điện cực

Xhđn xĩt:

- Phương phâp, năy có độ nhạy, tính đặc hiệu cao nĩn thích ợpitrong việc: ::: định lượng với hăm lượng nhỏ như trong dịch sinh vật Tuy nhiín, phương phâp HEL€ với deteetor điện hô khơng phải cơ sở năo cũng có được

1.3.5, Phuong phap do-kiĩm trong: moi-truong nube::

Vì artesunat [a este cua acid succinic va dihydro artemisinin nĩn trong phđn tử còn một nhóm chức acid tự do, đo đó người ta có thể định lượng trực tiếp

Trang 18

16

hăm lượng artesunat Hoặc có thể định lượng artesunat bằng phương phâp chuẩn

độ giân tiếp Cho artesunat tâc dụng với một lượng dư KOH, rồi chuẩn độ KOH

du bang dung dich chuẩn acid [5],

Nhận xĩt: Theo Nguyễn Mạnh Cường [5]:

- Phương phâp chuẩn độ trực tiếp chi âp dụng khi aeid sueeinie tự đõ irong

chế phẩm < 0,2%, do đó khó có thể âp dụng cho định lượng viín nĩn

- Phương phâp chuẩn độ giân tiếp lă phương phâp chính xâc, đúng đặc

hiệu, ít phụ thuộc văo sự có mặt của tạp chất, đễ thực hiện Tuy nhiín, phương phâp năy mới chi được nghiín cứu âp dụng cho định lượng nguyín liệu

ariesunal, muốn âp dụng phương phâp năy trong định lượng câc dạng băo chế

artesunat thì cần được nghiín cứu thím

1.3.6 Phương phâp do kiím trong môi trường khan [31]:

Cũng dựa văo nhóm chức acid tự do còn lại trong phđn tử artesunar để tiến

hănh định lượng Chế phẩm (khoảng 0,20g) được hoă tan trong ethanol tuyệt đối

(50ml) Chuẩn độ bằng dụng dịch tetraburylammonium hydroxide trong 2-

propanol (9;Imol/1) Điểm kết thúc của phĩp định lượng được xâc định bằng chỉ

thi tim tinh thĩ trong acid acetic khan hoặc bằng kỹ thuật chuẩn độ đến điểm

dừng

1.3.7, Phuong phâp do phố hâp thu vùng khả kiến dưới dang muối

hydroxamat sắt [8]

Cho ariesupat tâe đụng với dung dich hydroxylamin hydroelerld trong môi trường kiềm Trung hoă, rồi acid hoâ dung dịch bang acid hydrocloric va cho phản ứng với dung dịch sắt (IH) clorid Sản phẩm tạo thănh có mău tím đỏ Tiến hănh đơ mật độ quang của dung dịch năy

Trang 19

17

miễn dịch đê được âp dụng để định lượng artemisinin va câc dẫn chất của nó

Câc nhă khoa học Trung Quốc còn miíu tả hai phương phâp khâc để định lượng

artemisinin vă câc dan chat của nó trong mẫu thử sinh học [22]:

- Phương phâp đo độ phóng xạ: Sau khi uống thuốc đê được đânh dấu

bang Tritium

- Phương phâp phđn tích đo mật độ quang trín sắc ký lớp mỏng

1.4 Câc phương phâp đỉnh lương cartesunat trong viĩn nĩn đang âp dung ở nước ta [2] [3]:

Cđn chính xâc một lượng bột viín tương ứng với khoảng 60 mg artesunat

cho văo bình định mức 5Ômi, thím 40ml ethanol tuyệt đối vă lắc kỹ cho tan hết

hoạt chất, thím ethanol tuyệt đế! tới vạch, lắc đều Lọc, Bỏ 1Oml dịch lọc đầu

Hút chính xâc 5m] dung địch lọc văo bình định mức 50ml, thĩm dung dich natri

hydroxyd 0,1N đến vạch, lắc đều rồi để trong câch thuỷ nhiệt độ 50% + I?C

trong Ì giờ Lăm nguội nhanh ở nhiệt độ phòng Đo độ hấp thụ của dung dịch

tăy ở bước sóng 289 + Inm trong vòng 20 phút kể từ Lúc lấy ra khỏi nồi câch

thuỷ, cốc do day tem, mau trắng lă dung dich natri hydroxyd 0,1N

Dung dịch chuẩn: Cđn chính xâc khoảng 60mg chuẩn artesunat văo bình:

định mức 50m], tiến hănh như mẫu thử,

Hăm lượng % artesunat trong viín sơ với nhên được tính bảng công thức Sau:

Trong dĩ: D, va De la dĩ hap thu cia dung dich thit va dung dich chuan

Trang 20

18

m,; la khĩi lugng trung binh cua viín

‘phap do kiĩm trong moi truong nudc :

Cđn chỉnh xâc một lượng bột viín tương ứng với 0,15Ö g artesunal văo

bình nón 100ml Hơă tan bằng cthanol tyuệt đối đê được trung tính với chỉ thị

phenolphtalein vă lắc kỹ Thím hai giọt chỉ thị phenolphtalein vă chuẩn độ bằng

dung địch natri hydroxyd 0,05N đến khi xuất hiện mầu hồng nhạt

[ml] dung dịch natri hydroxyd 0,05N tương ting voi 19,22mg artesunat

1.5 Nhđn xĩt vă lưa chon:

- Phương phâp HPL€ với đeteetor điện hoâ có khả năng phđn tícn rối, tính

đúng vă tính đặc hiệu cao, song hiện nay ở Việt Nam vẫn còn chưa âp dụng thực hiện được

- Câc phương phâp HPLC với detector 253nm đến 2]0nm có thể không phải trực tiếp định lượng artesunat nín sản phẩm phđn hủy có thể ảnh hưởng tới

kết quả

- Phương phâp đo quang phổ tử ngoại ở 28Ônm thực tế cũng không thể

đânh giâ được chính xâc khi artesunat đê bị phđn huỷ hoặc lẫn câc tạp chất khâc, bởi sản phẩm phđn huỷ của chúng cũng hấp thụ vùng tử ngoại, do đó dẫn đến sai SỐ,

- Phương phâp do kiểm lại chỉ cho kết quả đúng khi artesunat chưa bị thuỷ phan,

Vì vậy, trong công trình năy, một mặt chúng tòi nghiín cứu kiểm chứng tính đặc hiệu của câc phương phâp định lượng artesunat trong viín nến đang được sử dụng ở nước ta vă một số phương phâp khâc Nếu câc phươïg phâp đó

không đặc hiệu khi artesunat lần tạp phđn huỷ của nó, chúng tôi sẽ nghiín cứu

tìm ' kiím câch tiến hănh định lượng mới nhằm Hang t tính đặc hiệu của nó đề có

ne ee ee

Trang 21

[9 PHẦN 2 ĐỐI TƯỢNG, PHƯƠNG TIEN N VĂ PHƯƠNG PHÂP NGHIÍN CỨU 2.1 #)ối tượng nghiín cứu: - Viín nến artesunati 2.2, Phuong tiĩn, dung cu, hoa chat:

2.2.1, Dung cu, may moc:

- Binh dinh miic 25, 50, 100m) - Cĩe dong 50, 100, 500 ml - Pipet cde loai - Binh gan - Đũa thuỷ tĩnh - Giấy lọc - Mây quang phổ 6405 UV/VIS Spectrphotometer lenway - Tủ sấy

- Cđn phđn tích hiện số Metder AB 204 (Foledo-Thuy sỹ) độ chính xâc 0,1 mg

- Nồi đun câch thuỷ

2.2.2 Hoâ chất:

- Artesunat dạng nguyín liệu bột do bộ môn Công nghiệp [Dược — Trường đại học Được Hă Nội sản xuất

- Artesunat chuẩn: chất đối chiếu hoâ học hăm lượng 98,6% (SKS 019261) của

Viện Kiểm nghiệm

- Dihydreartemisinin (DHA) nguyĩn liệu do bộ môn Công nghiệp Dược —

Trường đại học Dược Hă Nội sản xuất

Trang 22

- Dung dich Natri hydroxyd 0,5N

- Dung dich sat (IIL) elorid 5%

- Dung dich hydroxylamin hydroelorid IN

- Dung dich acid hydroeloric 2N, 0.2N - Cloroform - Cồn tuyệt đổi - Acetonitril - Dung dich dĩm acetat pH=5,! Vă một số hoâ chất khâc

2.3 Phương phâp nghiín cứu:

- Tham khảo câc phương phâp định lượng artesunat đê công bỡ

- Tham khảo câc phương phâp định lượng viín nến artesunat đang âp dụng ở

Việt Nam,

- Khảo sât tính đặc hiệu của câc phương phâp hiện đang sử đụng để định lượng

artesunat trong viĩn nĩn ở nước 1a vă một số phương phâp khâc

- Dựa văo cấu tạo phđn tử của artesunat để nghiín cứu cải tiến phương phâp định

lượng ar†esunat:

Dùng cloroform để hòa tan arIesunat trong viín nĩn

Tâch artesunat ra khỏi câc hợp chất cùng tan trong dụng môi dựa văo tính acid của nó ( biến sang dạng mudi Natri để chuyển sang môi trường nước)

Dựa trín câc phương phâp định lượng sẵn có (phương phâp trong Tiíu

chuẩn ngănh, phương phâp tạo hydroxamat sắt) để tiến hănh định lượng

artesunat đê tach ra

- Bang thuc nghiĩm, nghiín cứu câc điều kiện tiến hănh để xây dựng câc phương

phâp đó

- Âp dụng câc phương phâp đê xđy dựng để đình lượng artesunat trong viín nĩn - Dựa văo câc tiíu chuẩn đânh giâ một phương phâp phđn tích để đânh giâ

Trang 23

21 PHẦN 3 THỰC NGHIỆM VĂ KẾT QUÂ 3.1 Khảo sât tính đâc hiệu của một số phượng phâp hiện đang su dun 3 dĩ đỉnh lương arfesunaf:

Câc tạp chất có lần trong artesunat nguyín liệu cũng như trong viín nĩn artesunat thường nhất 1a Dihydroartemisinin (DHA) va acid succinic DHA va acid succinic dugc tao ra do artesunat bi thuy phan trong quâ trình sản xuất, bảo quản hoặc chính lă nguyín liệu ban đầu để bân tổng hợp artesunat nhưng chưa phản ứng hết hay chưa loại hết

3.14 Khao sât tính đặc hiệu của phương phâp HPLC detector UV 235nm:

.— a mm xa

Dựa trín phương phâp HPLC được xđy dựng trong luận văn tốt nghiệp Thạc

sỹ Dược học của Hoăng Văn Thuỷ [19]: - Cột KP LS( 200x4,6mmxTĐuưm) - Detector UV: 235nm - Pha động: acetonitril - dung dich dĩm acetat pH 5,1 (1:1) - Tốc độ dòng: 1,3ml/phút - Thể tích tiím: 20QU1

- Dung môi hoă tan mẫu: acetonirril, nồng độ mẫu chính xâc khoảng Img/mI

- Thời gian lưu của artesunat: 3 phút

Chúng tôi Hiến hănh khảo sât như sau:

Can khoang 20mg artesunat va 20mg DHA Hoa tan mdi loại trong 2ml

acetonitril Lay 1mi m6i loai, thĩm 10m1 dung dich acetonitril:dĩm acetat pH 3,1 (1:1) Để 3 phút, đem quết phổ từ 200 — 400 nm Kết qua phổ tử ngoại của

Trang 24

fr tesuiiat 2? Sep ZHH1

4 HH4AG Gain 1490 | Suu 2H | 4HH HH

Trang 25

23

Theo kết quả ở hình 3.1 vă 3.2, chúng tôi thấy phổ hấp thụ tử ngoại của artesunat va DHA tương tự nhau, đều có cực đại hấp thụ giếng nhau vă tai

235nm thi ca hai chất đều hấp thụ tử ngoại

Do artesunat vă DHA không hấp thụ ở bước sóng năy, vậy trong môi trường trín chúng đê biến đổi thănh sản phẩm khâc, những sản phẩm đó đều hấp thụ ở 235nm với phổ hấp thụ tử ngoại của chúng giống nhau, nín hai sản phẩm

đó có thể lă một Dĩ lăm rõ điều năy, chúng tôi tiến hănh sắc ký lớp mỏng như

sau:

Ban mong duge su dung 14 ban mong silicagel trang san, nhên hiệu

"MERCK - GERMANY", Ban mong được hoạt hoâ o L00°C trong 60 phit trước

khi sử dụng

Dung dịch chđm sắc ký:

- Dung dich 1: Dung dich artesunat |mg/ml trong aeetonitril

- Dung dich 2: Dung dich DHA Ime/ml trong acetonitril

= Dung dich 3; Dung dich artesunat img/ml treng acetonitril-dĩm acetat

pH 5,1 (1:1) (sau 3 phut cham sac ky)

- Dung địch 4: dung dịch DHA Img/ml trong acetonitril-đệm acetat pH 5,1 (1:1) (sau 3 phút chấm sắc ký)

Pha động: Toluen - Ethylacetat ty lĩ L:1,

- Chấm I0u] dung dịch 1 lí điểm”! của bản mỏng - =

- Chấm I0] dưng dịch 3 lín điểmn-3:của bản mỏng: - -

- Chấm |Ouldung dịch 4 lín điểm 4:của bản mông: - -

- Chấm I0] dụng dịch'2 lín điểm 2:của bản móng» -;

Sau khi tiến hănh chạy sắc ký vă phun thuốc thử, chúng tôi thu được sơ đồ

Trang 26

C) O (` Gg | 1 3 4 2 Hình 3.3: Sơ đồ sắc ky dung dich artesunat va DHA trong acetonitril vă acetonitril - dĩm acetat pH 5,1 (1:1)

Cae vĩt sac ky bat mau hĩng, Sau khi chay sade ky, dung dich 3 ya 4 cho I

vĩt cĩ Rf tuong duong va không cùng Rf vĩi vĩt lĩn cua dung dich | va 2

Như vậy, trong môi trường acetomitril - đệm acetat pH 5,1; ca artesunat

vă DHA có thể đều chuyển thănh I chất (phổ UV giống nhau, sắc ký lớp mỏng

ehe câc vết giống nhau về kích thước vă Rf), nín DHA có mặt sẽ ảnh hưởng tới

kết quả định lượng băng HPLC với detetor UV 235nm,

3.1.2 Khdo sât tính đặc hiệu của phương phâp do quang phố hấp thu vùng tử

ngoai & 289nm [16]

Khảo sât năy được tiến hănh cùng với Bùi Thị Thanh Phương, với câch

tiến hănh vă kết quả được ghi trong khoâ luận tốt nghiệp được si dai hoe của Bùi

Thị Thanh Phượng Khảo sât thu được một số kết quả như sau;

- Sản phẩm tạo thănh khi đun nóng ĐHA vă ariesunat irong môi trường kiểm đều hấp thu ở bước sóng 289nm

- Phố tử ngoại của sản phẩm tạo thănh từ artesunat vă DHA tương tự như

Trang 27

25 N

- Cùng một khốt lượng cđn thì.đệ ấp thụ của sản phẩm tạo thănhtừ DHA gấp I,4 lần độ hấp thụ của sản phẩm tạo thănh từ artesunat

Như vậy, khi định lượng artesunat theo phương phâp đo quang- phổ tử ngoại tlđ ở:2§9 nm; DHA: ảnh hướng- lớn tới kết qua: định lượng:,

——— ~ - ——_—— ~~~ RISPLAY DaTN _ 8 REE A Be wee ee ee ee ~ ~ + 2 :ĐB81 - ! k TN a g3a373 3 ‘ ¡.888n] — 2 \ — ‘\ _ N Se ~-= TT tÌ.ĐU08-†—=————r ag oy qn ey —t 2fIf 10g 240 0u 2008.8 3281.60) 460.08 40 Al8 -+: ,U0HH ¬> Z.50UU—_— HH 288 BH ->_ 498.00 -

Hình 3.4: Phổ hấp thụ tử ngoại của sẵn phẩm tạo thănh khi đun nóng

arlesunaf rong môi trường kiểm TT TT CC BHN8PIný BẤTR” TT TT TT nhọn 2 fữ1I ao} 1 6(I1f1 22 N ị \ | ' -_ 4 1 20900_ } \ : \ - 0.0600 po | NỘ 2 - ‹ NÓ on oy 4008 ; SỐ sa OX | ˆ TƯƠNG cu TS ST sen nh He củ ng na =——— 1 r t¬ ¿0 90 0ữ 2710 UB AL 1g) l 12H.HU 30f1.BH TBO

AMS — _ : U.8UUUI.:>, Z:UUUI —_ —_— # _ï 2ĐU,BỤ => _ 3ĐH.0U

Trang 28

26

3.1.3 Khao sât tính đăẽ liệu của phương:phâp đö-quang phổ hấp thụ ở vùng -

khả kiến [17]

Khảo sât năy được tiếu hănh cùng với Lí Ngọc Quỳnh, với câch tiến

hănh vă kết quả được ghi trong khoâ luận tốt nghiệp dược sĩ đại học của Lí Ngọc

Quỳnh Khảo sât thu được một số kết quả như sau:

- Khi thím 1% DHA( sơ với arfesunat) văo artesunat thì mật độ quang của

dung dịch mau tang 0,004 đơn vị, còn thím 1% artesunat thì kết quả đo lại tăng

thím 0,005 đơn vi

- Phổ hấp thụ của sđn phẩm từ artesunat vă DHA lă giống nhau

Trang 29

+7 H pane GÌ izes ống TƯ MI BI HH HH ADS - Wascline | ER _ Paqc _ 1 _ Ht oe = — BISPLAY Paton ~ hB.trann | 8 6T108 = 1 {f† 1:H11- 546 HỊ 2H00 CC —— eo - ¬~- - k Tome

ft! DU08-]— r - mp pee — pos Sessa ys

joa ti 111.11 Cae 68 ane HG 068.68

Hình 3.7: Phĩ hap thu etia sdn phdm mau tao thanh w DHA

3.I.4 Khảo sâi tính đặc liíu của phương phâp do kiểm trong mới trường Khảo sât năy đê được thực hiện trong luận văn tốt nghiệp dược sỹ của Nguyễn Thị Vĩnh Hồng [§], kết quả cho thấy, acid succinic ảnh hướng lớn tới kết quả định lượng arfesunat troũg viĩn uĩn, Ham lượng actd sueeinie có trong viín nến ar(esuiat lă I!% thì kết quả định lượng theo phương phâp chuẩn độ bằng

kiểm tăng 3,2%

Nhđn xĩt:

Câc phương phâp định lượng artesunal troug viín nến đang sử dụng Ở

nước ta đều không đặc hiệu Sự có mặt của DHA ảnh hưởng rất lớn đến kệt quả

định lượng theo phương phâp đo quang pha it ngoaj, su cĩ mat cua acid suceiic

ảnh hưởng rất lớn đến đếi với kết quả định lượng theo phương phâp chuẩn độ

Trang 30

28

Câc phương phâp khâc như phương phâp định lượng ở mục 3.1.1 vă 3.1.3,

tính đặc hiệu cũng không cao, chính DHA cũng ảnh hướng tới kết quả định

lượng

Vì vậy, chúng tôi tiến hănh khảo sât xem câc viín nến arTesunat do một số cơ SỞ trong nước sản xuất có chứa DHA hay acid succinic không?

3.2._ Khảo sât lượng DHA va acid succinic co mat trong viín nĩn artesunat

của một số cơ sở sản xuất

3.2.1 Khao sat luwong BHA có mắt trong viín nĩn ariesunai của mỗi số cơ sở san xudt

Việc khảo sât được tiến hănh trín 3 loại viín nĩn do 3 cơ sở A, B,€C

trong nước sản xuất Chúng tôi dùng sắc ký lớp mỏng đề xâc định

Bản mỏng được sử dụng lă bản mỏng silieagel trâng sản, nhên hiệu "MERCK - GERMANY” Bản mỏng được hoạt hoâ ở 100°€ trong 60 phút trước

khi sử dụng

Dung dịch chấm sắc ký:- Dung dịch 1: Dung dịch artesunat 1% trong ethanol tuyệt đối Dung dịch năy được pha từ bột viín artesunat của co so A tinh theo hăm lượng trín nhên, lọc qua giấy lọc

- Dung địch 2: Dung địch artesunat 1% trong ethanol tuyệt đối Dung dịch năy được pha từ bội viín ariesunaf của cỡ sở B tính theõ hăm lượng riín

nhên, lọc qua giấy lọc

- Dung dịch 3: Dung dịch artesunat I% trong ethanol tuyệt đối Dung

địch năy được pha từ bột viín artesunat của cơ sở € tính theo hăm lượng tiín

nhên, lọc qua giấy lọc

- Dụng dịch 4; dụng dịch DHA 0,02% trong ethanol tuyệt đối,

- Dung dịch 5: Dung dịch DHA 0,03% trong ethanol tuyệt đối

- Dung dịch 6: dung địch DHA 0,04% trong ethanol tuyệt đối

Trang 31

29

Thuốc thử hiện mău: Vanilin 2% trong acid sulfuric đậm đặc 3.2.1.1 - Viín nĩn:của:cơ sở A:

- Chấm I0ui dung địch I lín điểm I của bản mỏng,

- Chấm TOul dung dich 4 lẽn điểm 4 của bản mỏng - Chấm tOul dung địch 5 lín điểm 5 của bản mỏng

- Chấm [Opi dung dịch 6 lín điểm 6 của bản mỏng

Sau khi tiến hănh chạy sắc ký vă phun thuốc thử, chúng tôi thu được so dĩ sắc ký sau: C2 G9 () Hình 3.8: Sơ đồ sắc ký xâc định sự có mặt của DHA trong viín nĩn artesunat cua co so A

Câc vệt sắc ký bắt mău hồng Sau khi chạy sắc ký, dung dịch 1 tâch thănh

3 vệt Vết dưới cùng lă artesunat Vết ở giữa có cùng RÝ với vết của dung dich

4,5,0 Vết trín cùng, chúng tôi vẫn chưa xâc định được, Vết ở giữa có cùng kích

thước vă mău sắc tương đương với vết của dung dịch 3

Trang 32

30 3.2.1.2 Viín nĩn của cơ sở B:

- Chấm 1OUil dung địch 2 lín điểm A của bản mỏng,

- Chấm IOH] dung địch 4 lín điểm B của bản mỏng - Chấm I0r\| dung địch 5 lín điểm € của bản mỏng,

- Chấm T0] dung dịch 6 lín điểm D của bản mỏng

Sau khi tiến hănh chạy sắc ký vă phun thuốc thử, chúng tôi thu được sơ để sắc ký sau: =— © O O 6.3 bh +> th on Hình 3.9: Sơ đồ sắc ký xâc định xâc định sự có mặt của DHA trong viĩn nĩn artesunat cua co sĩ B

Câc vệt sắc ký bắt mău hồng Sau khi chạy sắc ky, dung dịch 2 tâch thănh

3 vết Vết dưới cùng lă artesunat Vết ở giữa có cùng RÝ với vết của dung dịch

4,5,6 Vết.trín-cùng; chúng:tôi vđñ-chưa:xâc-định được: Vết ở“giữa.có:cùng-kích-

thước vă mău sắc tương đương với vết của dung dich 6

Như vậy, hăm lượng DHA trong mẫu viín nĩn của cơ sở B lă khoảng 4%

3.2.1.3 Viín nĩn của cơ sớở(C":

Trang 33

31

- Chĩm |0yil dung dịch 4 lín điểm 4 của bản mồng

- Chấm 10tl dụng dịch 5 lín điểm 5 của bản mỏng, - Chấm I0ul dụng dịch 6 lín điểm 6 của ban mong

Sau khi tiến hănh chạy sắc ký vă phun thuốc thử, chúng tôi thu được sơ đồ sắc ký sau: | | | o : © 5S S a 0 \X„ | | | 3 4 5 6

Hình 3.10: Sơ đồ sắc ký xâc định su cĩ mat cha DHA trong viĩn nĩn qrfesunat của cơ sở €

Câc vệt sắc ký bắt mău hồng Sau khi chạy sắc ký, dung dịch 3 tâch thănh

3 vết Vết dưới cùng lă artesunat Vết ở giữa có cùng RŸ với vết của dung dịch

4,5,6 Vết trín cùng; chúng-tôi vẫn chưa xâc-định được: Vết ở giữa có cùng: kích:

thước vă mău sắc tương đương với vết của dung dịch 6

Như vậy, hăm lượng DHA trong mẫu viín nĩn của cơ sở € tă khoảng 4% Qua những khảo sât trín, câc viín nến artesunat của 3 cơ sở trong nước

sản xuất đều chứa DHA với hăm lượng = 3%

3.2.2 Khdo sât lương'acid 'succiHiC: có: mêặi rong VIÍH: HH: aIÍ€SHHGE:CHH- HƠI :

SỐ CƠ SƠ SửH xudf

Bản mỏng được sử dụng lă bản mỏng silicagel trắng sẵn, nhên hiệu "MERCK - GERMANY” Bản mỏng được hoạt hoâ ở 100°C trong 60 phút trước

Trang 34

32

Dung dịch chấm sắc ký:

- Dung dịch I: Dung dịch artesunat 1% trong ethanol tuyệt đối Dung dịch năy được pha từ bột viín artesunat của cơ sở A tính theo hăm lượng trín nhên, lọc qua giấy lọc,

- Dung dịch 2: Dung dịch artesunat 1% trong cthanol tuyệt đối Dung

dịch năy được pha từ bột viín artesunat của cơ sở B tính theo hăm lượng trín

nhên, lọc qua giấy lọc

- Dung dich 3 : Dung dich artesunat 1% trong ethanol tuyệt đối Dung địch năy được pha từ bột viín artesunat của cơ sở C tính theo hăm lượng trín

nhên lọc qua giấy lọc

- Dung dich 4: dung dich acid succinic 0,01% trong ethanol tuyệt đối

Pha động: Chloroform -Ethanol -Nước cất (6:10:4) Thuốc thử hiện mau: dung địch xanh Bromothymol

Chấm dung dịch để chạy sắc ký:

- Chấm I0Hl dụng dịch L lín điểm l của bản mỏng,

- Chấm 1Oul dung dịch 2 lín điểm 2 cia ban mong

- Chấm IOull dung dịch 3 lín điểm 3 của bản mỏng

- Chấm I0Hl dung dịch 4 lín điểm 4 của bản mỏng

Trang 35

33

Sau khi chạy sắc ky, dung dịch I, 2, 3 tâch thănh 2 vết, vết ở dưới có cùng Rf với vết của dung dịch 4

Vết ở dưới của dung dịch L có cùng kích thước vă mău sắc như vết của dung dich 4 Nhu vay ham lượng của acid succinic trong mẫu viín nĩn của cơ sở

Đ lă khoảng 1%

Vết ở dưới của dung dịch 2, 3 có kích thước lớn hơn vết của dung dịch 4

Như vậy hăm Tượng của acid succinic trong mẫu viín nĩn của cơ sở B vă € lă lớn hơn 1%

Từ câc khảo sât trong mụe 3.1, chúng tôi thấy câc phương phâp định lượng

níu ở trín khóng thể âp dụng trong định lượng artesunat trong viín nĩn do câc cơ sở Ă, B,€ sản xuất Để chứng minh rõ hơn về kết luận năy, chúng tôi đê tiến

hănh định lượng artesunat trong viín nĩn của cơ sở A san xuất (loại viín nĩn có số lượng DHA vă acid succinic thấp nhất trong 3 loại viín được khảo sât) bảng

câc phương phâp ghi trong tiíu chuẩn cơ sở

3.3.3 Đứnh liững êrlesinat fong Viín nĩn leo phiững phâp chỉ trong Bín -

chudn co so

(Đối tượng: viín nĩn của cơ sở A)

3.2.3.1 Đỉnh lương artiesunat trong viín nến bảng phương phâp đo quang phổ

hap thụ vùng tử ngoại:

Câch tiến hănh:như níu ở I.4.1 Kết quả ghi ở bảng 3.1 (trang 34)

- Giâ trị trung bình: 02,26%

- Độ lệch chuẩn: 2,0]

- Độ lệch chuẩn tiởng Abi: 1.97%

(Câc đại lượng được thống kẻ với độ tin cậy 95%)

Trang 36

34 Bảng 3.1 : Kết quả định luong artesunat trong viín nĩn bằng phương phâp đo quang phổ vùng tử ngoại,

khối Khối lượng hoạt Khối lượng hoạt

STT | lượng bột | chất tính theo hăm A chất tính theo C(%)

viĩn(g) lugng trĩn nhan(g) phuong phap (g) L 0,3679 0,0599 0,590 60,0614 102,39 2 0,3685 0,0600 0,606 , 0.0630 104,99 3 | 0.3686 0,060] 0596 | — 0,0619 ¡03,09 4 0.3691 0,0601 0,585 0,0607 I0I,19 5 0.3687 0,0601 0,576 - 0,0600 99,63 Chuẩn 0,0602 0571 | 0,0594 98,60

3.2.3.2, Dinh lương artesunat trong viín nĩn bảng phương phâp đo kiểm trong

THỒI trường nước: Câch tiến hănh:như níu ở 1.4.2 Kết quả ghi ở bảng 3.2 Bảng 3.2 : Kết quả định lượng artesunat trong viín nĩn bằng đo kiểm trong tôi [THỜING HHỚC

Khối Khối lượng hoạt V | Khối lượng hoạt

STT | lượng bột ¡ chất tính theo hăm | NaOH | chất tính theo C#) |

Trang 37

35

- Giâ trị trung bình: 103,56%

- Độ lệch chuẩn: I,45

- Khoảng tin cay của giâ trị tung bình: + 1,80

- Độ lệch chuẩn tượng đối: 1.40%

(Câc đại lượng được thống kí với dĩ tin cay 95%)

Như vậy, bằng phương phâp sắc ký lớp mỏng, viín nến artesunat do cơ sở A sản xuất chứa khoảng 3% DHA vă 1% acid succinic Băng câc phương phâp

ghi trong tiíu chuẩn cơ sở, hăm lượng artesunat định lượng được lă 102,26% vă

103,56% Điều đó chứng tỏ 2 phương phâp trín không đặc hiệu

3.3 Câi tiến phương:phâp đỉnh lương-artesunat băng: đó-quang-phổ - tử

ngoăi ở bước sóng 289nï:

3.3.1 Cửi tiến-phương phâp định lương artesunat nguyín liíu bảng dơ quang :

phổ từ ngodL ở bước sóng 289nm [16]:

Cùng với Bùi Thị Thanh Phương, chúng tôi đê nghiín cứu khảo sât vă

xđy dựng phương phâp định lượng như sau: Câc khảo sât: - Ảnh hưởng của ethanol đến kết quả định lượng artesunat theo phương phâp tiíu chuẩn ngănh - Xâc đinh lượng NaOH 0,1N vừa đủ để tạo muối với artesunat - Khảo sât thể tích cloroform sử dụng

- Khảo sât lượng nước rửa mỗi lần

- Khảo sât số lần rửa lớp cloroform

- Khảo sât ảnh hưởng của clorofoim đến kết quả định lượng

- Loại cloroform khỏi dịch chiết - Khao sât hiệu suất chiết artesunaI

Trang 38

36

Câch tiến hănh đừnh lượng arlesunat nguyín liệu:

Cđn chính xâc khoảng 0,lg artesunat, hoă tan bằng IŠ5ml cloroform

Chuyển văo bình gạn, thím T giọt chỉ thị phenolphtalein, Nho tr ttt dung dich

NaOH 0,1N., lắc đều, đến khi lớp nước chuyển mău hồng bền Để yín eho phđn

lớp Tâch riíng lấy lớp nước Rửa lớp clorofomm 2 lần, mỗi lần lŨmi nước Dịch chiết vă dịch rừa cho văo cốc có mỏ, đun sôi câch thuỷ 5 phút, để nguội Chuyển

văo bình định mức dung tích 100ml, bổ sung dung dịch NaOH 0,1N đến vạch, lắc đều Lấy chính xâc 5,0m] cho văo bình định mức dung tích 5Oml, thím NaOH 0,IN đến vạch, để ấm trong nồi câch thuỷ 50 +_1”C trong 35 phút Lăm nguội, đo độ hấp thụ dung dịch thu được ở bước sóng 289 + [| nm, cốc dăy lcm, mẫu trắng lă dung dich NaOH 0,1N Song song lăm với mẫu artesunat đối chiếu

Hăm lượng của artesunat được tính theo công thức: D,xm,xX % artesunal = De xm, D,: độ hấp thụ của dung dịch thử Ds: dĩ hap thu cia dung dịch chuẩn

: khối lượng (gam) artesunat của mẫu thử

mm

mì : khối lượng (gam) artesunat của mẫu chuẩn *

X: hăm lượng phần trăm của artesunat đối chiếu

Phương phâp đê được đânh giâ vă kết luận lă đúng, tuyín tính trong

khoảng nồng độ khảo sât vă phương phâp lă đặc hiĩu (2 tap la DHA va acid

succinic không ảnh hưởng gì tới kết quả định lượng)

3.3.2 Câi tiến phương phâp đính lương qriesunat trong viín nĩn bảng đo

guang pho ut ngoai ở bước sóng 289mm;

Dựa trín những khảo sât định lượng ôrfesunat trín nguyín liệu, chúng tôi

xđy dựng câch tiến hănh định lượng viín nĩn artesunat Việc nghiín cứu được

Trang 39

3°

Ban đầu chúng tôi cđn mmột lượng bột viín tương đương với khoảng

0,1600g artesunat, tiín hănh định lượng như đối với artesunat nguyín liệu Kết quả lă rất khó tiến hănh do lượng tâ dược có nhiều, nín khi thím NaQH văo để

chuyển artesunat sang dạng muối tan trong nước, lớp nước vă lớp cloroform

không phđn lớp Do vậy chúng tôi đê giảm lượng bột viín, việc tiến hănh định

lượng da dĩ dang hơn

Câch tiến hănh định lượng viĩn nĩn artesunat nhu sau:

Lấy 20 viín nĩn đem cđn Tính khối lượng trung bình viĩn, Nghiĩn 20

viín nĩn thănh bột mịn trong cối sứ, trộn đều Cđn chính xâc một lượng bột viín

tương ứng với khoảng 0,0200g artesunat (tính iheo hăm lượng ghi trín nhên)

trong cốc có mở Hoă bột băng I5ml cloroform Chuyển văo bình gạn, thím một

giọt chỉ thị phenolphtalein Thím từ từ NaOH 0,1N, lắc đều, đến khi lớp nước

chuyển mău hồng bền Để yín cho phđn lớp Tâch riíng lấy lớp nước Rửa lớp cloroformm 2 lần, mỗi lần LOml nước Dịch chiết vă dịch rửa cho văo cốc có mỏ, dun sôi câch thuỷ Ê phút, để nguội Chuyển văo bình định mức dung tích IU0,0ml, bổ sung dung địch NaOH 0,I1N đến vạch, lắc đều Lọc qua giấy loc, bo

khoảng 10ml dịch lọc đầu vă thu lấy dịch lọc còn lại

Lấy 25ml dịch lọc trín cho văo bình định mức 50,Oml, thím dung dich NaOH 0,1N đến vạch, để ấm trong nồi câch thuỷ 5Q + 1°€ trong 35 phút, Lăm

nguội, đo độ hấp thụ dụng dịch thu được ở bước sống 289 + Inm, cốc dăy lem,

mẫu trắng lă đung địch NaOH 0,1N

Trang 40

38

D,: độ hấp thụ của dung dịch thử

Ð;: độ hấp thụ của dung dịch chuẩn

m, : khối lượng (gam) bột viín nĩn đê cđn của mẫu thử (hoặc khối lượng

arfesunat của mẫu thử)

mí, : khối lượng (gam) artesunat đê cđn của mẫu chuẩn X: hăm lượng phần trăm của artesunat đối chiếu

M: khối lượng trung bình viín nĩn

A: ham lugng artesunat của mỗi viín ghi trín nhên

Âp dụng định lượng viín nĩn , kết quả ghi ở bảng 3.3

Bảng 3.3: Kết quả định lượng arlesunat ong viín nĩn

' STT | Khối lượng bột | Khối lượng hoạt chất tính A C(%)

viín(g) theo hăm lượng trín nhên(ø) | | I 0.1229 0.02002 0.430 97.67 2 0.1228 0.02000 0.420 95.+9 3 0.1230 0.02004 0.422 , 95/76 4 0.1234 0.02010 0.421 95.25 5 0.1235 0,02012 0.432 97.64 | Chuẩn 6.0202 0.438 98.6 3.3.3 Danh gia phuong phap: 3.3.3.1 Xâc định tính chính xâc của phương phâp: Từ kết quả bảng 3.3 cho thấy: - Giâ trị trung bình: 96,36% - Độ lệch chuẩn : 1,19

- Khoảng tin cậy của giâ trị trung bình: 1,48

- Độ lệch chuẩn tương đối: I,24%<2%