Nghiên cứu phương pháp định lượng cephalexin trong nước tiểu nhằm đánh giá sinh khả dụng của viên nang cephalexin 500mg sản xuất trong nước

BỘ Y TÊ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘIi ì "ểtaểkaể* NGUYỄN THỊ PHƯƠNG THẢO NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG CEPHALEXIN TRONG NƯỚC TIỂU NHẰM ĐÁNH GIÁ SINH KHẢ DỤNG CỦA VIÊN NANG CEPHALEXN 50

BỘ Y TÊ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI

i ì "ểtaểkaể*

NGUYỄN THỊ PHƯƠNG THẢO

NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG CEPHALEXIN TRONG NƯỚC TIỂU NHẰM ĐÁNH GIÁ SINH KHẢ DỤNG CỦA VIÊN NANG CEPHALEXN 500mg SẢN XUẤT TRONG NƯỚC

(KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP Dược s ĩ KHOÁ 1998 - 2003)

N GƯ Ờ I HƯỚNG DẪN

N Ơ I THỰC HIỆN

THỜI GIAN THỰC HIÊN

: PGS TS TRẦN TỬ AN Th.s NGUYỄN THỊ KIỂU ANH : B ộ MÔN HOÁ PHÂN TÍCH

: 0 3 - 06/2003

HÀ NỘI - 06/2003

LÒI CẢM ON

Trong suốt quá trình thực hiện khoá luận tố t nghiệp em đã nhận được

sự giúp đõ hết sức quý báu vả chân tình của các thầy GÔ, gia đình và bè bạn

Qua đây em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tối:

PG&TỔ Trần Tử An Th.ô Nguyễn Thị Kiéu Anh

đã tận tình hướng dẫn em hoàn thầnh luận văn này

Em cũng xin bảỵ tỏ lòng cảm ơn sâu sắc tối các thầy cô trong BỘ MÔNHOÁ PHÂN TÍCH đã tận tình giúp đõ và tạo mọi điểu kiện thuận lợi cho em trong quá trình thực hiện khoá luận tố t nghiệp nầỵ

Em xin chân thảnh cảm ơn!

Hà Nội, ngảỵ 25 tháng 5 năm 200 3

ổinh viênNGUYỄN THỊ PHƯƠNG THAO

MỤC LỤC

Trang

Đặt vấn đề

PHẦN 1: TỔNG QUAN

1.1 Đại cương về cephalexin 2

1.1.1 Công thức và tính chất lý hoá 2

1.1.2 Tính chất dược lý và dược động học 2

1.1.3 Chỉ định 3

1.1.4 Chống chỉ định 3

1.1.5 Tác dụng không mong muốn 3

1.1.6 Liều dùng 4

1.1.7 Dạng bào chế 4

1.1.8 Các phương pháp định lượng 4

1.2 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 6

1.2.1 Phân loại các phương pháp sắc k ý 6

1.2.2 Đặc điểm phương pháp 7

1.2.3 Nguyên tắc của phương pháp 8

1.2.4 Một số thông số đặc trưng của HPLC 8

1.2.5 Cách tính kết quả trong phương pháp HPLC 10

1.3 Sinh khả dụng của thuốc 10

1.3.1 Khái niệm về sinh khả dụng 10

1.3.2 Cách đánh giá sinh khả dụng in vivo 11

PHẦN 2: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 2.1 Nguyên yật liệu và phương pháp nghiên cứu 13

2.1.1 Nguyên vật liệu và hoá chất 13

2.1.2 Phương pháp thực nghiệm 14

2.2 Kết quả thực nghiệm và nhận x é t 16

2.2.1 Khảo sát và lựa chọn điều kiện sắc ký 162.2.2 Xây dựng phương pháp định lượng cephalexin trong nước

CHÚ GIẢI CHỮ VIẾT TẮT

ĐẶT VẤN ĐỂ

Trong những năm trở lại đây, song song với sự phát triển của nhiều ngành khoa học khác, ngành công nghệ dược phẩm đã và đang thu hút được sự quan tâm chú ý và đầu tư của nhiều nước, trong đó có Việt Nam Thị trường dược phẩm trở nên phong phú và vô cùng đa dạng với sự ra đời của nhiều chế phẩm thuốc mới, dưới nhiều tên biệt dược khác nhau Cephalexin là kháng sinh cephalosporin thế hệ 1, được hấp thu gần như hoàn toàn qua đường tiêu hoá, đào thải qua đường niệu dưới dạng không biến đổi

Ở Việt Nam, cephalexin là kháng sinh đã được đưa vào sản xuất khá phổ biến, với giá thành rẻ, hiệu quả điều trị tốt Tuy nhiên do tâm lý người tiêu dùng luôn đánh giá thuốc ngoại tốt hơn thuốc sản xuất trong nước mặc dù giá thành đắt hơn và hiệu quả điều trị của hai thuốc có thể là tương đương Hiện vẫn chưa có tài liệu nào nghiên cứu đánh giá sinh khả dụng của viên nang

cephalexin sản xuất trong nước vì vậy chúng tôi thực hiện đề tài “Xây dựng phương pháp định lượng cephalexin trong nước tiểu nhầm đánh giá sinh khả dụng của viên nang cephalexin 500mg” với mục tiêu :

- Xây dựng một chương trình định lượng cephalexin trong nước tiểu bằng kỹ thuật HPLC

- Áp dụng phương pháp xây dựng được để định lượng cephalexin trong mẫu nước tiểu người sau khi uống viên nang cephalexin 500mg nhằm đánh giá sinh khả dụng của viên nang cephalexin 500mg sản xuất trong nước (so sánh với viên đối chiếu của nước ngoài)

S aureus tiết penicillinase kháng penicillin (hay ampicillin) Cephalexin cũng

có hoạt tính lên đa số E coli đề kháng ampicillin.

Cephalexin được hấp thu gần như hoàn toàn ở đường tiêu hoá, đạt nồng

độ tối đa trong máu sau uống khoảng 1 giờ Thức ăn làm chậm khả năng hấp thu cephalexin nhưng tổng lượng thuốc hấp thu không thay đổi Thuốc liên kết

protein huyết tương 15% Thời gian bán thải là 0,5 - 1,2 giờ, dài hơn ở trẻ sơ

sinh và tăng khi chức năng thận giảm Cephalexin không bị chuyển hoá, thuốc được đào thải với nồng độ cao trong nước tiểu, sau khi uống 6 giờ khoảng 80% liều dùng được thải trừ qua nước tiểu ở dạng không biến đổi, với liều 500mg nồng độ cephalexin trong nước tiểu cao hơn lmg/lml Cephalexin được đào thải qua lọc máu và thẩm phân màng bụng (20%-50%).

- Nhiễm khuẩn hô hấp: viêm phế quản cấp và mãn, giãn phế quản bội nhiễm

- Nhiễm khuẩn tai mũi họng: viêm tai giữa, viêm xoang, viêm amidan, viêm họng

- Nhiễm khuẩn sản phụ khoa

- Nhiễm khuẩn da, mô mềm và xương

- Bệnh lậu (khi penicillin không phù hợp)

- Trong nha khoa: điều trị dự phòng thay penicillin cho người bệnh mắc bệnh tim phải điều trị răng

1.1.4 Chống chỉ định [4]

- Dị ứng với kháng sinh khóm cephalosporin

- Bệnh nhân có tiền sử choáng phản vệ do penicillin hoặc phản ứng trầm trọng khác qua trung gian globulin miễn dich IgE

1.1.5 Tác dụng không mong muốn [4], [8]

- Trên tiêu hoá: rối loạn tiêu hoá như buồn nôn, nôn, tiêu chảy

- Toàn thân: đau đầu, chóng mặt, phản ứng phản vệ, mệt mỏi

- Phản ứng quá mẫn ở da: ngứa, mề đay, phát ban

- Máu: giảm bạch cầu trung tính có hồi phục.

- Gan: tăng transaminase có hồi phục

1.1.6 Liều dùng [8]

- Người lớn và trẻ em trên 12 tuổi: 500mg/lần X 31ần/ngày

- Trẻ em từ 5-12 tuổi: 250mg/lần X 31ần/ngày

- Trẻ em từ 1-5 tuổi: 125mg/lần X 31ần/ngày

- Trẻ em dưới 1 tuổi: 125mg/lần X 21ần/ngày

Lưu ý [4]: thời gian điều trị nên kéo dài ít nhất từ 7-10 ngày, nhưng trong các nhiễm khuẩn đường niệu phức tạp, tái phát, mạn tính, nên điền trị 2 tuần (lg X 2 lần mỗi ngày) Cũng như đối với những kháng sinh đào thải chủ yếu qua thận, cephalexin có thể có tích tụ trong cơ thể khi chức năng thận giảm dưới một nửa mức bình thường, do đó nên giảm liều tối đa cho phù hợp với những bệnh nhân này Ở người cao tuổi cần đánh giá mức độ suy thận Khi phối hợp với các thuốc khác cũng độc với thận như aminoglycosid hay thuốc lợi tiểu mạnh, liều cao cephalexin có thể ảnh hưởng xấu tới chức năng thận

Oxy hoá dung dịch cephalexin bằng dung dịch iod 0,02N trong môi trường natri hydroxyd, định lượng iod thừa bằng dung dịch natri thiosulfat0,02N với chỉ thị là dung dịch hồ tinh bột (CT) Song song làm một mẫu chuẩn trong cùng điều kiện.

Hàm lượng cephalexin trong mẫu thử được tính theo công thức:

VT

Cị = - X Cc

vc

Trong đó: Cp là nồng độ cephalexin trong mẫu thử (mg/ml)

Cclà nồng độ cephalexin trong mẫu chuẩn (mg/ml)

v x là thể tích dung dịch iod 0,02N dùng cho dung dịch thử (ml)

v c là thể tích dung dịch iod 0,02N dùng cho dung dịch chuẩn (ml)

1.1.8.2 Phương pháp đo quang [3]: định lượng cephalexin trong nguyên liệu

và chế phẩm

Dung dịch cephalexin trong nước có cực đại hấp thụ ở 262 nm Đo độ hấp thụ của dung dịch cephalexin thử ở bước sóng 262 nm Tính hàm lượng cephalexin trong mẫu thử bằng cách so sánh với chuẩn

Hàm lượng cephalexin trong mẫu thử được tính theo công thức sau:

Dt

Cp = — — X Cc

DcTrong đó: DT là mật độ quang của dung dịch thử

Dc là mật độ quang của dung dịch chuẩn

1.1.8.3 Phương pháp vi sinh vật [3]

- Chủng chỉ thị: Staphylococcus aureus ATCC 19737.

- Phương pháp định lượng: phương pháp khuyếch tán (phiến kính phẳng)

1.1.8.4 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

Trong HPLC, sắc ký phân bố pha đảo với cột c 8, C18 hay phenyl và pha động

là các dung môi hữu cơ như methanol, acetonitril là phương pháp được sử dụng phổ biến để định lượng cephalexin trong nguyên liệu chế phẩm và dịch

sinh học Riêng đối với dịch sinh học, cephalexin trong mẫu thử thường được loại protein bằng một số dung môi như acid tricloroacetic, acid percloric, acid phosphoric Một số điều kiện định lượng cephalexin bằng HPLC được trình bày ở bảng 1.1.

Bảng 1.1: Một số điều kiện định ỉượng cephalexin bằng HPLC

[10], [20]

MeOH : ACN : d2 KH2P04 1,36% :H 20 (2:5: 10: 83)

C18(5,10|-im)

250 X 4,5mm

Nguyên liệu, chế phẩm

1.2 PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography - HPLC) hay còn gọi là sắc ký lỏng cao áp hay sắc ký lỏng hiện đại đã ra đời vào những năm cuối của thập kỷ 60 Nó được xây dựng và phát triển không ngừng và ngày càng thể hiện rõ tính ưu việt, đặc biệt là trong lĩnh vực sinh dược học và kiểm nghiệm

1.2.1 Phân loại các phương pháp sắc ký [2]

Theo bản chất của quá trinh sắc ký, người ta chia làm 4 loại

- Sắc ký phân bố hiệu năng cao + sắc ký lỏng-lỏng (LLC)

+ Sắc ký phân bố pha liên kết (BPC)

- sắc ký hấp phụ hiệu năng cao (sắc ký lỏng rắn : LSC).

- Sắc ký trao đổi ion hiệu năng cao

- Sắc ký lỏng hiệu năng cao trên gel (sắc ký theo loại cỡ)

Trong đề tài này chúng tôi sử dụng phương pháp sắc ký lỏng phân bố pha liên kết (Bonded Phase Chromatography: BPC) Đây là phương pháp hay được sử dụng trong việc tách, định lượng các chất thuộc nhiều lĩnh vực như : Dược ( thuốc kháng sinh, thuốc giảm đau ), hoá sinh ( acid amin, protein, lipit ), thực phẩm , hoá chất công nghiệp , hoá pháp và môi trường

1.2.2 Đặc điểm của phương pháp [2], [6]

Bản chất chính của sự tách sắc ký là dựa trên sự phân chia khác nhau của các chất trong hai pha không hoà lẫn vào nhau và luôn tiếp xúc nhau: một pha tĩnh và một pha động

< Đặc điểm của pha tình

Trong sắc ký lỏng phân bố pha liên kết, pha tĩnh được gắn hoá học (liên kết) với chất mang (hạt silicagel) tạo nên hợp chất cơ Siloxan:

- Nếu R là một nhóm ít phân cực như octyl (C8), octadecyl (C18) hay phenyl và dung môi phân cực như methanol, acetonitril ta có sắc ký pha đảo (sắc ký pha ngược)

- Nếu R là nhóm khá phân cực như alkylamin -(CH2)n-NH2 hay alkylnitril

-(CH2)n-CN và dung môi ít phân cực như hexan —> ta có sắc ký pha thuận.

< Đặc điểm của pha động

Pha động là dung môi dùng để rửa giải các chất tan (chất phân tích) ra khỏi cột sắc ký Trong sắc ký pha đảo của sắc ký phân bố pha liên kết, pha

CH3Dẫn chất

Dẫn chất Siloxan

động là một hệ dung môi phân cực và được dùng khá phổ biến là các dung môi methanol, tetrahydrofuran, hay hỗn hợp của methanol, acetonitril với nước với đệm

Cách chọn pha: thường chọn pha tĩnh có tính phân cực giống các chất cần

tách và khác vói pha động

Hiện nay sắc ký pha đảo được dùng rất rộng rãi để tách nhiều hỗn hợp mẫu

từ vô cơ đến hữu cơ, từ chất phân cực đến chất không phân cực vì nó cho kết quả tách tốt với nhiều đối tượng tách khác nhau

1.2.3 Nguyên tắc của phương pháp [6]

Các chất trong hỗn hợp phân tích được tách khỏi nhau dựa trên khả năng phân bố khác nhau của chúng vào hai pha không hoà lãn vào nhau, luôn tiếp xúc nhau: một pha tĩnh và một pha động

Dung dịch các chất phân tích được đưa vào hệ thống sắc ký qua van tiêm mẫu và được dung môi pha động kéo tới cột phân tích nhờ một bơm cao áp Tại cột xảy ra quá trình tách, những phân tử nào có ái lực thấp với pha tĩnh thì được rửa giải ra trước, còn những phân tử nào có ái lực mạnh với pha tĩnh thì được rửa giải ra sau Chất ra khỏi cột được phát hiện bằng detector gắn vói máy ghi, máy tính hay máy tích phân Thời gian lưu tR là đặc trưng định tính của chất Chiều cao hay diện tích pic là đặc trưng định lượng của chất, sắc ký được tiến hành so với chuẩn

1.2.4 Một sô thông sô đặc trưng của HPLC [2], [9]

Ví dụ ta có sơ đồ sau:

Hình 1.1: Một số thông số đặc trưng của HPLC

Thời gian lưu tR (phút) là thời gian cần để một chất di chuyển từ nơi tiêm mẫu, qua cột sắc ký, tới detector và cho pic trên sắc đồ (tính từ lúc tiêm mẫu vào hệ thống sắc ký đến lúc xuất hiện đỉnh của pic) So sánh thời gian lưu của mẫu thử và mẫu chuẩn làm trong cùng điều kiện ta sẽ định tính được chất đó.

- Thời gian chết tM (phút) là thời gian của một chất không bị lưu giữ tức

là bằng tốc độ di chuyển trung bình của các phân tử dung môi

Qs, Qm là lượng chất tan phân bố vào pha tĩnh và pha động

Với một chất k’ càng lớn, tốc độ di chuyển càng thấp, thường chọn k’ nằm trong khoảng từ 1 đến 8: k’ nhỏ hơn 1 pic sẽ xuất hiện quá sớm dễ lẫn với tạp chất, k’ lớn hơn 8 thời gian phân tích quá dài

- Thừa số chọn chọn lọc a: mô tả tốc độ di chuyển tỷ đối của hai chất

Trong đó: W B chiều rộng pic ở đáy pic.

w1/2 chiều rộng pic đo ở nửa chiều cao của đỉnh

- Độ phân giải Rs là đại lượng đo mức độ tách hai chất trên một cột sắcký

Để tách riêng hai chất, Rs >1,5 (khi 2 sắc đồ có độ lớn cùng cỡ)

so sánh chiều cao hay diện tích pic của mẫu thử và mẫu chuẩn trong cùng điều kiện phân tích ta tính được hàm lượng hoạt chất trong mẫu thử

1.2.5 Cách tính kết quả trong phương pháp HPLC.

Để tính kết quả trong phương pháp HPLC, người ta có thể dựa vào:

- Phương pháp đường chuẩn

- Phương pháp thêm

- Phương pháp so sánh

Đối với việc xác định nồng độ hoạt chất trong dịch sinh học, tính toán kết quả dựa vào đường chuẩn được xây dựng bằng cách chủ động cho chất chuẩn với nồng độ khác nhau vào dịch sinh vật Xử lý mẫu và đem chạy sắc ký

1.3 SINH KHẢ DỤNG CỦA THUỐC

1.3.1 Khái niệm về sinh khả dụng [1], [7]

Sinh khả dụng là khái niệm đặc trưng cho quá trình sinh dược học của dạng thuốc, nó phản ánh mức độ và tốc độ hấp thu của dược chất từ dạng bào chế vào hệ tuần hoàn và đưa đến nơi có tác dụng Trong đó, mức độ hấp thu được đánh giá bởi diện tích dưới đường cong nồng độ - thời gian (AUC), tốc

độ hấp thu dược chất được đánh giá bởi giá trị nồng độ cực đại (Cmax) và thời gian đạt nồng độ cực đại (Tmax)

Các thông số dược động học cần quan tâm khi đánh giá sinh khả dụng của thuốc được trình bày ở bảng 1.2

Bảng 1.2: Các thông số dược động học chính của thuốc.

c

Trong đó:

Tmax và Cmax: Xác định được nhờ quan sát trực tiếp dữ liệu nồng độ

dược chất trong dịch sinh học tại từng thời điểm

Xz được tính từ độ dốc của đường cong logarit nồng độ dược chất trong dịch

sinh học theo thời gian tại những điểm lấy mẫu cuối cùng của pha thải trừ

Thời gian bán thải:

Diện tích dưới đường cong AƯC có thể tính theo phương pháp tích phân hoặc có thể tính đơn giản theo quy tắc hình thang

Khi đánh giá SKD, phải xem xét đồng thời các yếu tố trên

1.3.2 Cách đánh giá SKD in vivo [7]

Sinh khả dụng in vivo đánh giá giai đoạn hấp thu dược chất từ chế phẩm bào chế Hiện nay, nhiều nước trên thế giới đã có các tiểu ban chuyên về đánh giá SKD và TĐSH và đã đưa ra các quy định hoặc các hướng dẫn về việc đánh giá SKD và TĐSH của thuốc:

- Thử in vivo ở người bằng cách xác định sự biến thiên nồng độ dược chất hoặc chất chuyển hoá trong máu, huyết tương, huyết thanh hoặc các dịch sinh học thích hợp khác theo thời gian

- Thử in vivo ở người bằng cách đo dược chất hoặc chất chuyển hoá bài

tiết trong nước tiểu theo thời gian

- Thử in vivo ở người bằng cách đo tác dụng dược lý của dược chất hoặc chất chuyển hoá theo thời gian nếu tác dụng đó có thể đo được một cách đủ chích xác, đủ nhạy và đủ lặp lại.

- So sánh tác dụng lâm sàng một cách thích hợp

Trong đề tài này, chúng tôi tiến hành đánh giá SKD tương đối của viên nang cephalexin 500mg sản xuất trong nước thông qua việc xác định lượng thuốc được bài tiết trong nước tiểu theo thời gian (so sánh với viên đối chiếu của nước ngoài)

AUC*ửSKD tương đối = -X 100(%)

AUCđối C|-|j£'u

Hai thuốc được coi là tương đương sinh học với nhau nếu chế phẩm thử

có SKD = 100 ± 20% so với chế phẩm đối chiếu

PHẦN 2: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ.

2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u

2.1.1 Nguyên yật liệu và hoá chất.

< Nguyên vật liệu.

- Cephalexin monohydrat (chất đối chiếu hoá học)

- Cefotaxim (chất đối chiếu hoá học)

- Cefazolin (chất đối chiếu hoá học)

- Theophyllin 99,95% (chất đối chiếu hoá học)

- Viên nang cephalexin 500mg (XNDF TW1)

- Viên nang cephalexin 500mg (Ospexin, Áo)

< Hoá chất.

- Acetonitril (HPLC grade-Merck)

- Methanol (HPLC grade-Merck)

- Natri acetat anhydrid (PA grade- Merck)

- Triethylamin (PA grade- Merck).

- Acid acetic băng (HPLC grade- Merck)

< Dụng cụ.

- Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao:

+ Bơm cao áp Merck Hitachi L-600

+ Detector Merck- Hitachi L-4000 u v

+ Máy tích phân Merck-Hitachi D-2500 chromato-integrator + Van tiêm mẫu Rheohyne 1725-USA

- Máy quang phổ uv-V IS

- Máy lọc nước siêu sạch Elga (Anh)

- Cân phân tích Satorius (Đức)

- Máy siêu âm Branson (Mỹ)

- Máy lắc Labinco

- Autopipet lO-lOOpl, 100-1000|il.

- Tủ siêu lạnh Frigor (Đan Mạch)

- Dụng cụ thuỷ tinh, bơm tiêm, ống nghiệm, bình định mức

2.1.2 Phương pháp thực nghiệm

2.1.2.1 Khảo sát điều kiện sắc ký.

Khảo sát tìm chất chuẩn nội và lựa chọn hệ dung môi (pha động) chạy sắc ký

Trong sắc ký pha đảo của sắc ký phân bố pha liên kết, pha động là một hệ dung môi phân cực, hay dùng là các dung môi methanol, acetonitril hay hỗn hợp của methanol, acetonitril với nước, với đệm Để khảo sát lựa chọn chất chuẩn nội chúng tôi sử dụng những chất có cấu trúc và tính chất gần giống với cephalexin cho vào mẫu trắng có chứa cephalexin chuẩn Tiến hành sắc ký với từng hệ dung môi, xác định thời gian lưu của cephalexin và chất chuẩn nội, tính thừa số chọn lọc a , tính Rs của từng hệ dung môi và thời gian phân tích, trên cơ sở đó lựa chọn hệ dung môi và chất chuẩn nội thích hợp để phân tích cephalexin trong nước tiểu Chất chuẩn nội sử dụng phải tách hẳn với cephalexin và tạp chất trong nước tiểu, bền vững và phát hiện dễ dàng ở điều kiện sắc ký khảo sát

2.1.2.2 Xây dựng phương pháp định lượng cephalexin trong nước tiểu.

< Khảo sát khoảng tuyến tính.

Chủ động cho cephalexin vào mẫu trắng (nước tiểu không có cephalexin)

để được các nồng độ 0,5 - 2 - 4 - 6 - 8 - 12 - 16 - 20mcg/ml Sau đó, cho vào các ống nghiệm cùng một lượng chất chuẩn nội (IS) là 10mcg/ml Tiến hành sắc ký, kết quả thu được là diện tích pic, từ đó xây dựng mối tương quan giữa nồng độ cephalexin và tỷ số diện tích pic giữa cephalexin và IS

< Xác định tính chính xác của phương pháp: trong cùng một ngày và giữa các

ngày phân tích

Tiến hành làm nhiều lần ở cùng một nồng độ, kết quả thu được là diện tích

pic, từ đó tính được tỷ số diện tích pic giữa cephalexin và IS Xác định sai số

của phương pháp (biểu thị bằng RSD%) Làm ở 3 nồng độ 4mcg/ml,

12mcg/ml, 16mcg/ml

< Xác định tính đúng của phương pháp: Bằng phương pháp thêm

Thêm chính xác một lượng chất chuẩn vào mẫu thử đã biết nồng độ cephalexin sao cho tổng nồng độ cephalexin trong mẫu phân tích nằm trong khoảng nồng độ đã khảo sát Tiến hành sắc ký, kết quả thu được biểu thị bằng diện tích pic của cephalexin và IS, từ đó tính được nồng độ cephalexin trong các mẫu phân tích và % cephalexin chuẩn tìm lại được

2.I.2.3 Bước đầu đánh giá sính khả dụng của viên nang cephalexin 500mg sản xuất trong nước.

< Xác định độ đồng đều hàm lượng.

Tiến hành thử trên 10 nang cephalexin riêng rẽ được lấy bất kỳ, xác định hàm lượng cephalexin trong mỗi nang bằng phương pháp đo quang Dung dịch cephalexin trong nước có cực đại hấp thụ ở 262nm

Với mỗi nang: cân chính xác một lượng bột thuốc đã nghiền nhỏ tương ứng với khoảng 0,250g cephalexin, lắc kỹ trong 30 phút với khoảng 100ml nước, thêm nước cho vừa đủ 250ml, trộn đều và lọc, bỏ khoảng 20ml dịch lọc đầu

Lấy chính xác 1,0 ml dịch lọc cho vào bình định mức 100ml, thêm nước

cho vừa đủ Trộn đều Đo độ hấp thụ của dung dịch thu được ở bước sóng

262nm Tính hàm lượng cephalexin trong mẫu thử bằng cách so sánh với chuẩn có nồng độ tương đương

Song song tiến hành với 10 nang Ospexin 500mg

< Đánh giá sinh khả dụng.

* Đối tượng thử

Chọn 6 người tình nguyện khỏe mạnh