So sánh phương pháp định lượng itraconazol trong chế phẩm viên nang bằng phương pháp vi sinh và sắc ký lỏng hiệu năng cao So sánh phương pháp định lượng itraconazol trong chế phẩm viên nang bằng phương pháp vi sinh và sắc ký lỏng hiệu năng cao So sánh phương pháp định lượng itraconazol trong chế phẩm viên nang bằng phương pháp vi sinh và sắc ký lỏng hiệu năng cao So sánh phương pháp định lượng itraconazol trong chế phẩm viên nang bằng phương pháp vi sinh và sắc ký lỏng hiệu năng cao So sánh phương pháp định lượng itraconazol trong chế phẩm viên nang bằng phương pháp vi sinh và sắc ký lỏng hiệu năng cao So sánh phương pháp định lượng itraconazol trong chế phẩm viên nang bằng phương pháp vi sinh và sắc ký lỏng hiệu năng cao So sánh phương pháp định lượng itraconazol trong chế phẩm viên nang bằng phương pháp vi sinh và sắc ký lỏng hiệu năng cao So sánh phương pháp định lượng itraconazol trong chế phẩm viên nang bằng phương pháp vi sinh và sắc ký lỏng hiệu năng cao So sánh phương pháp định lượng itraconazol trong chế phẩm viên nang bằng phương pháp vi sinh và sắc ký lỏng hiệu năng cao So sánh phương pháp định lượng itraconazol trong chế phẩm viên nang bằng phương pháp vi sinh và sắc ký lỏng hiệu năng cao So sánh phương pháp định lượng itraconazol trong chế phẩm viên nang bằng phương pháp vi sinh và sắc ký lỏng hiệu năng cao So sánh phương pháp định lượng itraconazol trong chế phẩm viên nang bằng phương pháp vi sinh và sắc ký lỏng hiệu năng cao So sánh phương pháp định lượng itraconazol trong chế phẩm viên nang bằng phương pháp vi sinh và sắc ký lỏng hiệu năng cao So sánh phương pháp định lượng itraconazol trong chế phẩm viên nang bằng phương pháp vi sinh và sắc ký lỏng hiệu năng cao So sánh phương pháp định lượng itraconazol trong chế phẩm viên nang bằng phương pháp vi sinh và sắc ký lỏng hiệu năng cao So sánh phương pháp định lượng itraconazol trong chế phẩm viên nang bằng phương pháp vi sinh và sắc ký lỏng hiệu năng cao So sánh phương pháp định lượng itraconazol trong chế phẩm viên nang bằng phương pháp vi sinh và sắc ký lỏng hiệu năng cao So sánh phương pháp định lượng itraconazol trong chế phẩm viên nang bằng phương pháp vi sinh và sắc ký lỏng hiệu năng cao So sánh phương pháp định lượng itraconazol trong chế phẩm viên nang bằng phương pháp vi sinh và sắc ký lỏng hiệu năng cao So sánh phương pháp định lượng itraconazol trong chế phẩm viên nang bằng phương pháp vi sinh và sắc ký lỏng hiệu năng cao So sánh phương pháp định lượng itraconazol trong chế phẩm viên nang bằng phương pháp vi sinh và sắc ký lỏng hiệu năng cao So sánh phương pháp định lượng itraconazol trong chế phẩm viên nang bằng phương pháp vi sinh và sắc ký lỏng hiệu năng cao So sánh phương pháp định lượng itraconazol trong chế phẩm viên nang bằng phương pháp vi sinh và sắc ký lỏng hiệu năng cao So sánh phương pháp định lượng itraconazol trong chế phẩm viên nang bằng phương pháp vi sinh và sắc ký lỏng hiệu năng cao So sánh phương pháp định lượng itraconazol trong chế phẩm viên nang bằng phương pháp vi sinh và sắc ký lỏng hiệu năng cao So sánh phương pháp định lượng itraconazol trong chế phẩm viên nang bằng phương pháp vi sinh và sắc ký lỏng hiệu năng cao So sánh phương pháp định lượng itraconazol trong chế phẩm viên nang bằng phương pháp vi sinh và sắc ký lỏng hiệu năng cao So sánh phương pháp định lượng itraconazol trong chế phẩm viên nang bằng phương pháp vi sinh và sắc ký lỏng hiệu năng cao So sánh phương pháp định lượng itraconazol trong chế phẩm viên nang bằng phương pháp vi sinh và sắc ký lỏng hiệu năng cao So sánh phương pháp định lượng itraconazol trong chế phẩm viên nang bằng phương pháp vi sinh và sắc ký lỏng hiệu năng cao So sánh phương pháp định lượng itraconazol trong chế phẩm viên nang bằng phương pháp vi sinh và sắc ký lỏng hiệu năng cao So sánh phương pháp định lượng itraconazol trong chế phẩm viên nang bằng phương pháp vi sinh và sắc ký lỏng hiệu năng cao So sánh phương pháp định lượng itraconazol trong chế phẩm viên nang bằng phương pháp vi sinh và sắc ký lỏng hiệu năng cao So sánh phương pháp định lượng itraconazol trong chế phẩm viên nang bằng phương pháp vi sinh và sắc ký lỏng hiệu năng cao So sánh phương pháp định lượng itraconazol trong chế phẩm viên nang bằng phương pháp vi sinh và sắc ký lỏng hiệu năng cao So sánh phương pháp định lượng itraconazol trong chế phẩm viên nang bằng phương pháp vi sinh và sắc ký lỏng hiệu năng cao So sánh phương pháp định lượng itraconazol trong chế phẩm viên nang bằng phương pháp vi sinh và sắc ký lỏng hiệu năng cao So sánh phương pháp định lượng itraconazol trong chế phẩm viên nang bằng phương pháp vi sinh và sắc ký lỏng hiệu năng cao So sánh phương pháp định lượng itraconazol trong chế phẩm viên nang bằng phương pháp vi sinh và sắc ký lỏng hiệu năng cao So sánh phương pháp định lượng itraconazol trong chế phẩm viên nang bằng phương pháp vi sinh và sắc ký lỏng hiệu năng cao So sánh phương pháp định lượng itraconazol trong chế phẩm viên nang bằng phương pháp vi sinh và sắc ký lỏng hiệu năng cao So sánh phương pháp định lượng itraconazol trong chế phẩm viên nang bằng phương pháp vi sinh và sắc ký lỏng hiệu năng cao So sánh phương pháp định lượng itraconazol trong chế phẩm viên nang bằng phương pháp vi sinh và sắc ký lỏng hiệu năng cao So sánh phương pháp định lượng itraconazol trong chế phẩm viên nang bằng phương pháp vi sinh và sắc ký lỏng hiệu năng cao So sánh phương pháp định lượng itraconazol trong chế phẩm viên nang bằng phương pháp vi sinh và sắc ký lỏng hiệu năng cao So sánh phương pháp định lượng itraconazol trong chế phẩm viên nang bằng phương pháp vi sinh và sắc ký lỏng hiệu năng cao
Trang 1BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
HOÀNG THỊ NHƯ QUỲNH
SO SÁNH PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG ITRACONAZOL TRONG CHE PHAM VIEN NANG
BẰNG PHƯƠNG PHÁPVI SINH VÀ
SẮC KI LONG HIEU NANG CAO
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
Trang 2trong suốt quá trình em nghiên cứu thực hiện khóa luận tốt nghiệp
Em cũng xin trân trọng cảm ơn các thầy cô giáo cùng các anh chị kĩ thuật viên
trong Bộ môn Vi sinh , trường Đại học Dược Hà Nội đã giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi để
em có thê hoàn thành khóa luận của mình
Em xin cảm ơn Ban giám hiệu, Phòng đào tạo, các phòng ban và bộ môn trong trường Đại học Dược Hà Nội đã tạo mọi điều kiện cho em trong quá trình học tập tại trường và thực hiện khóa luận tốt nghiệp
Cuối cùng em xin phép được dành lời cảm ơn tới cha mẹ, anh chị em, bạn bè, những người đã luôn bên cạnh, ủng hộ động viên khích lệ em trong học tập, cuộc sống và hết lòng giúp đỡ em thực hiện khóa luận này
Hà Nội, thăng 5 năm 201 1
Sinh viên
Trang 3MỤC LỤC
DANH MUC CHU VIET TAT DANH MUC CAC HINH DANH MUC CAC BANG ĐẶT VẤN ĐP LH Tnhh CHƯƠNG I : TỐNG QUAN c 2c c 11 Một số nét chính về Itraconazol -<< <<<<- 1.1.1 Tính chất vật lý -2- ke +s+E+EE£kEESEkEEEEEEEEErkerrkrerrees 1.1.2 Tác dụng dược lý - cà 1.13 Dược động học và chuyển hOiä cà 1.1.4 Chỉ định c Sen 1.2 Định lượng kháng sinh bằng phương pháp vi sỉnh 1.2.1 Phương pháp đo độ đục - nà sành ehhe 1.2.2 Phương pháp khuêch tán -.<-
1.3 Một số công trình nghiên cứu định lượng kháng sinh bằng
Bloassay HH Hàn HH hen nh kh như chà CHUONG II : ĐÔI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CUU
2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị -
2.1.1 Chât chuân và hoá chât -. 2.1.2 Thiết bị - dụng CỤ ch kêu 2.1.3 Mẫu nghiên CỨU c Ăn sài
2.2 Nội dung nghiên cứu
2.3 Phương pháp nghiên cứu 2.3.1 Phuong phap vI sinh - << 2.3.2 Phương pháp HPLC -<- <<: CHUONG III : THUC NGHIEM, KET QUA VA BAN LUAN “5g À a8) 3.1.1 Xây dựng phương phấp - . -<- 3.1.2 Thâm định phương pháp - cc-Scc S2 3.2 Phương pháp HPLC - - - ( Ă S531 9851151153
3.2.1 Xây dựng phương pháp định lượng HPLC 3.2.2 Thâm định phương pháp định lượng 1traconazol
3.3 So sánh kết quả định lượng của 2 phương pháp
Bioassay và HPLC .
Trang 4C albicans CFU CV DK DMSO HIV HPLC ITZ R.S.D SD SDA STT Candida albicans Colony Forming Unit Coefficient of variation Dimethylsulfoxid
Human immunodeficiency virus High performance liquid
chromatography Itraconazol
Relative standard deviation Standard deviation
Sabouraud Dextrose Agar
Don vi hinh thanh khuẩn lạc Hệ số thay đổi Đường kính Virus suy giảm miền dịch ở nguodi
Sắc kí lỏng hiệu năng cao
Độ lệch chuẩn tương đối
Độ lệch chuẩn
Thạch Sabouraud
Trang 5STT Hinh 1 Hinh 2 Hinh 3 Hinh 4 Hinh 5 Hinh 6 Hinh 7 Hinh 8 DANH MUC CAC HINH TRONG KHOA LUAN Tén hinh So dé thir 5x1
Đường kính vòng ức chế thử theo sơ đồ 5x1 của ITZ
Đường chuẩn biểu diễn tương quan giữa đường kính vòng ức chế (mm) va logarit néng d6 (ug/ml) cua ITZ
Sắc kí đồ dung dịch mẫu chuẩn
Sắc kí đồ dung dịch mẫu thử
Sắc kí đồ dung dịch mẫu trắng Phé hap thu tử ngoại itraconazol
Trang 6Bảng 2 Ham lượng của ITZ trong các mẫu viên nang Sporal
xác định bằng phương pháp Bioassay (n=6) 19 Bảng 3 Độ tìm lại của ITZ trong thực nghiệm bỗ sung chuẩn
Trang 7ĐẶT VẤN ĐÈ
Itraconazol (LTZ) là một tác nhân kháng nắm thuộc nhóm triazol, được
dung nạp tốt và có hoạt tính phổ rộng Hiệu quả điều trị cao của ITZ là do chất chuyển hóa chính của nó là hydroxy-ITZ, cũng có hoạt tính kháng nẫm đáng kế [6] Chế phẩm viên nang ITZ uống, hàm lượng 100mg, có sẵn trên thị trường Việt Nam: sporal (Janssen, Thái Lan), itcon (Sản xuất tại Ấn Độ), Fungex (Liên doanh sản xuất tại Việt Nam), .Khi hàm luong ITZ thap hon
so với phi trên nhãn, hóa trị liệu sẽ không đạt hiệu quả điều trị, gây hại cho
sức khỏe bệnh nhân
Phương pháp định lượng ITZ bằng phương pháp vi sinh (Bioassay) có thể cho chúng ta biết các thay đôi nhỏ, tinh vi của được chất, không thể chứng minh được bằng phương pháp hóa lý Bioassay cho phép đánh giá hoạt lực không chỉ của chất mẹ mà cả các chất chuyển hóa có hoạt tính và các được chất khác có trong thành phân, một yếu tố quan trọng trong việc kiểm nghiệm kháng sinh Ngoài ra Bioassay không cần đòi hỏi các trang thiết bị đắt tiền như HPLC Các nghiên cứu định lượng ITZ bằng phương pháp vi sinh (Bioassay) trước đây chủ yếu là xây dựng và thâm định phương pháp định lượng ITZ trong huyết thanh bằng Bioassay và HPLC, chưa thấy có ở chế phẩm viên nang
Để xác định hoạt lực kháng sinh bằng phương pháp khuếch tán trên thạch có thê áp dụng mô hình đường thẳng song (Parallel-line model) [1, 4, 5, 6ó, 8] và mô hình đường chuẩn Trong phạm vi nghiên cứu này chúng tôi sử dụng thử nghiệm theo mô hình đường chuẩn [2, 3]
Mục tiêu của phương pháp này là xây dựng và thâm định một phương pháp vi sinh để xác định hoạt lực của ITZ trong các chế phẩm viên nang thương mại Các kết quả của phương pháp này được so sánh với các kết quả
Trang 81.1.1 Tinh chat vat ly
Theo USP33-2010, itraconazol (ITZ) 14 mét hén hop racemic cua 4 đối
quang với tỷ lệ 1:1:1:1, có céng thirc phan tir C35H3gCl.N3O, va trọng lượng
phân tử 705,63 Itraconazol ở dạng bột trắng hơi vàng, nhiệt độ nóng chảy: 166-170°C, và phải bảo quản ở nhiệt độ phòng, trong lọ kín, tránh ánh sáng N \ aS sah N Z M “cy | ` x Ha ( N er oO CHs a M ~ J { —
Công thức cầu tạo của ITZ,
Tên khoa học: (#) cis-4-[4-[4-[4-[[2-(2.4-dichlorphenyl)-2-(1H-1,2,4-triazol- 1-ylmethyl)-1,3-dioxolan-4-yl]methoxy ]phenyl]-1-piperazinyl]pheny1]-2,4- dihydro-2-(1-methylpropyl)-3H-1,2,4-triazol-3-one hoặc (+)-1-[(RS)-sec-butyl]-4-[p-[4-[p-[[(2R,4S)-2-(2,4-dichlorophenyl])-2- (1H-1,2,4-triazol-1-ylmethyl)-1,3-dioxolan-4-yl]methoxy ]Jpheny]]-1- pIperazinyl]pheny]] v 1,2,4-triazolin-5-one)
Trang 91.1.2 Tac dung duoc ly
Nghiên cứu in vitro cho thấy itraconazol ức chế hệ isoenzym cytochrom P450 3A4 (CYP3A4), là enzym xúc tác quá trình tổng hợp ergosterol, hợp
phần quan trọng của màng tế bào nấm
Itraconazol có hoạt tính phổ rộng ¡n vitro chống lại các nấm lưỡng hình: Blastomyces dermatitidis, Histoplasma capsulatum, Histoplasma duboisii, một số loài cua chi Aspergillus nhu Aspergillus flavus, Aspergillus fumigatus, các loài nấm men Candida albicans, va Cryptococcus neoformans Ngoai ra,
Itraconazol cũng có tác dụng chống lại Sporothrix schenckii, va các loài của
chi Trichophyton, Candida krusei, va cac loai khác của Candida
Itraconazol dùng đường uống có tác dụng kháng nấm trên các động vật
thực nghiệm khác nhau bị nhiễm các chủng nấm chuẩn ở các phòng thí
nghiệm Hoạt tính kháng nấm thể hiện rõ đối với các trường hợp nhiễm nấm lan toả gồm: Blastomyces dermatitidis, Histoplasma duboisii, Aspergillus fumigatus, Coccidioides immitis, Cryptococcus neoformans, Paracoccidioides brasiliensis, Sporothrix schenckii, Trichophyton rubrum va Trichophyton mentagrophytes
Itraconazol dùng đường uống với liều 2,5 mg/kg và 5 mg/kg đã tăng ty
lệ sống sót ở lợn Guinea bình thường và lợn bị ức chế miễn dịch nhiễm Aspergillius fumigafus lan toà Cũng sử dụng 1traconazol đường uống hàng
ngày với liều 40 mg/kg và 80 mg/kg đã làm tăng tỷ lệ sống ở thỏ bình thường và chuột miễn dịch bị nhiễm Aspergillus fumigafus phối Itraconazol cũng có hoạt tính kháng nấm trên các mô hình động vật khác nhau bị nhiễm Candida albicans va cac loài khác của chi nấm này [Š]
1.1.3 Dược động học và chuyển hoá
Trang 10Sporanox cho bệnh nhân nhiễm HIV ở giai đoạn tiến triển cho thấy nồng độ huyết tương ổn định đã đạt được sau 4 liều đối với itraconazol và 7 liều đối với hydroxy-itraconazol (chất chuyển hoá của itraconazol) Nồng độ huyết tương
én định đã được duy trì khi uống Sporanox 200mg/2 lần/ngày Thời gian bán thải trung bình của itraconazol ở trạng thái ổn định (sau khi uống hàng ngày với liều 100-400mg/ngày) là 30-40 giờ Có khoảng 93-101% hydroxypropyl- B-cyclodextrin đã được thải qua nước tiểu ở dạng không chuyển hoá, trong
vòng 12 giờ sau khi uống [5]
Liên kết protein huyết tương cua itraconazol 14 99,8% và của hydroxy- itraconazol là 99,5% Thể tích phân bố của itraconazol trung bình là 796 + 185
lí kg
Itraconazol được chuyển hoá chủ yếu bởi hệ isoenzym cytochrom P450 3A4 (CYP3A4) và hình thành một số chất chuyển hoá, trong đó chủ yếu là hydroxy-itraconazol Các kết quả lâm sàng cho thấy itraconazol có thể chuyển hoá tối đa khi dùng liều cao Bài tiết qua phân dưới dạng ban đầu thay đổi từ
3-18% liều, qua thận nhỏ hơn 0,03% Khoảng 40% liều được bài tiết dưới dạng các chất chuyển hố khơng hoạt tính qua nước tiểu Không một chất chuyển hoá nào được bài tiết vượt tỷ lệ 5% của 1 liều Độ thanh thải huyết
tương toàn phần của itraconazol trung bình 381 + 95 ml/phút Khoảng 80-90% của hydroxypropy]-B-cyclodextrin được thải qua thận [Š]
1.1.4 Chỉ định
Sản phẩm Sporanox dạng tiêm hoặc dung dịch uống được chỉ định cho các bệnh nhân giảm bạch cầu đa nhân trung tính bị sốt do nhiễm nấm Nhưng cần lưu ý rằng trong một thực nghiệm so sánh, tý lệ đáp ứng tổng thể của các
đối tuợng được điều trị bằng itraconazol là cao hơn đối với các bệnh nhân được điều trị bằng amphotericin B Tuy nhiên khi so sánh với các đối tượng được điều trị bằng ạmphotericin B, một số lượng lớn hơn các đối tượng được
Trang 1111
thuốc điều trị Trái lại một số lượng lớn hơn bệnh nhân điều trị bằng amphotericin B phải ngừng điều trị do không dung nạp thuốc
Dạng tiêm itraconazol do hãng Sporanox sản xuất cũng được chỉ định điều trị các trường hợp nhiễm nấm ở các bệnh nhân bị suy giảm và không suy
giảm hệ thống miễn dịch gồm:
- Bệnh do Blastomyces dermatitidis (blastomycosis) 6 phéi và ngoài phổi - Bệnh do Histoplasma capsulatum (histoplasmosis) 6 cdc hang phéi m4n tinh và phát tán, nhưng không chỉ định cho trường hợp bệnh ở não do 1traconazol không vượt qua được màng não
- Bệnh do Aspergillus (aspergillosis) ở phổi, ngoài phổi ở các bệnh nhân
không dung nạp hoặc không hiệu quả khi điều trị bằng amphotericin B [5] 1.2 Định lượng kháng sinh bằng phương pháp vỉ sinh
Phương pháp vị sinh vật xác định hoạt lực của một kháng sinh bằng cách so sánh khả năng ức chế sự phát triển của một loại vi sinh vật (được gọi là chủng chỉ thị) bởi những độ pha loãng đã biết của kháng sinh thử (chưa biết hoạt lực) với khả năng ức chế bởi nồng độ đã biết của kháng sinh đối chiếu (chất chuẩn đã biết rõ hoạt lực) Sự tăng hay giảm hoạt tính sinh học của
kháng sinh được thê hiện trên chủng chỉ thi, nén rất khó có thê phát hiện bằng
phương pháp hóa học Vì vậy định lượng kháng sinh bằng phương pháp vi sinh có một vai trò quan trọng trong việc kiêm nghiệm kháng sinh
Hai phương pháp thường được sử dụng trong kiểm nghiệm kháng sinh là phương pháp khuếch tán dùng môi trường thạch và phương pháp đo độ đục dùng môi trường lỏng
1.2.1 Phương pháp do quang
Trang 12nghiệm theo mô hình đường thẳng song song hoặc theo mô hình đường chuẩn Với mô hình đường thăng song song phải pha 3 nồng độ chuẩn và 3 nồng độ thử Với mô hình đường chuẩn phải pha 5 nồng độ chuẩn va 1 nồng độ thử (còn được gọi là mô hình thử 5x1)
- Pha hỗn dịch để cây truyền: tùy theo từng kháng sinh mà chọn chủng chỉ thị để nuôi cây và pha hỗn dịch cấy truyên cho thích hợp
- Tiến hành: Các ống nghiệm được xếp thành từng nhóm, mỗi nhóm 3-5 ống, thêm vào mỗi ống Iml của các nồng độ dung dịch chuẩn hoặc thử Đặt các ống nghiệm vào giá theo qui tắc ngẫu nhiên theo khối hoặc hình vuông latinh
Trong mỗi giá có 2 ống nghiệm dùng kiểm tra, một ống cho 1ml hỗn hợp
dung môi và đệm phosphat pha loãng kháng sinh (mẫu trăng) và một ống cho 1ml hỗn hợp trên và 0,5 ml formaldehyd 12% (tt/tt)
Thêm vào mỗi ống 9ml môi trường canh thang đã cấy truyền hỗn dịch
vi sinh vật chỉ thị Đặt giá ống nghiệm đã chuẩn bị xong vào tủ âm hoặc nồi
đun cách thủy ở nhiệt độ thích hợp (tùy thuộc vào kháng sinh và chủng chỉ thị) trong thời gian 3-4h Sau khi ủ, làm ngừng sự phát triển của vi vi sinh vật bằng cách thêm vào mỗi ống 0,5ml dung dịch formaldehyd (trừ ông kiểm tra đã thêm formaldehyd từ trước), hoặc nhúng giá ống nghiệm đã ủ vào nước sôi Xác định độ truyền qua hoặc độ hấp thụ của các nồng độ kháng sinh bằng máy đo quang ở bước sóng 530 nm,
- Đánh giá hoạt lực: tùy vào mô hình thiết kế thực nghiệm để đánh giá hoạt
lực của mẫu thử theo phụ lục 13.10 [2]
1.2.2 Phương pháp khuếch tán
Trang 1313
nhau của chất chuẩn mang so sánh với 3 liều khác nhau của mẫu thử, có hoạt
lực được coi như chất chuẩn Nông độ các dung dịch được pha theo cấp số
nhân
- Chuẩn bị dụng cụ và môi trường thử: thử nghiệm được tiễn hành trên các đĩa Petri hoặc khay phẳng Lớp môi trường có độ dày 2-5 mm Thạch dinh đưỡng có thê đô thành một lớp hoặc 2 lớp (gồm lớp nền và lớp chủng vi sinh vật chỉ thi) Can chon nồng độ hỗn dịch cây vào môi trường sao cho tạo được vùng ức chế sắc nét nhất tương ứng với các liều lượng của kháng sinh Với chủng vi sinh vật không sinh bào tử, thường phải cây vào môi trường thạch đã đun
chảy hoàn toàn và để nguội 45-50°C Trường hợp hỗn dịch chủng là bào tử,
nhiệt độ cho phép cấy tối đa là 65-70°C Dùng một lượng thích hợp môi trường đã cây chủng chỉ thị, rót một cách vô khuẩn vào đĩa Petri hoặc khay kính (đã có lớp thạch nền hoặc không tùy theo yêu câu của từng kháng sinh) để được một lớp môi trường có độ dày thích hợp Khay kính hoặc đĩa Petri được giữ ở nhiệt độ phòng 30 phút trước khi sử dụng
Trang 14- Đánh giá hoạt lực: Tiến hành kiểm tra tính có giá trị của định lượng, tính
hoạt lực và giới hạn tin cậy của hoạt lực kháng sinh theo phụ lục 10.13 [2]
1.3 Một số công trình nghiên cứu định lượng kháng sinh bằng Bioassay - Vaucher L C và Cs (2006) đã nghiên cứu xây dựng và thấm định được phương pháp định lượng telithromycin bằng phương pháp vi sinh Bằng việc áp dụng phương pháp khuếch tán, sử dụng các ống trụ đặt trên các đĩa thạch, theo thiết kế thử nghiệm 3 liều, dải nồng độ nghiên cứu 0,25-1,0ug/ml và ching vi sinh vat kiém dinh 14 Micrococcus luteus ATCC 9341 da cho thay: các đồ thị đáp ứng của dung dịch chuẩn và dung địch thử đều song song và tuyến tính với hệ số tương quan r = 0,9987, độ chính xác khác ngày - 2,67%, các giá trị tìm lại dao động trong khoảng 96,75-100,91% Bước đầu nghiên cứu độ ôn định cho thấy, phương pháp vi sinh là đặc hiệu đối với việc xác định telithromycin trong sự có mặt các sản phẩm phân hủy của dược chất này Phương pháp cho phép định lượng telithromycin trong các chế phẩm được và có thê được dùng cho việc phân tích được chất trong kiểm soát chất lượng thuốc thường qui [15]
Trang 1515
phương pháp thích hợp cho cả các phòng thí nghiệm nghiên cứu và sản xuất
chế phẩm fluconazol [9]
- Với thiết kế thử nghiệm 3 liều, áp dụng phương pháp khuếch tán trên thạch, sử dụng chủng chỉ thi Candida albicans ATCC 10231, Staub I va cong su (2005) da xay dung va thâm định được việc định lượng ketoconazol trong các chế phẩm dược và dầu gội bằng phương pháp vi sinh Kết quả thâm định cho thấy phương pháp đạt yêu cầu về độ tuyến tính (r = 0,9982), độ chính xác (R.S.D = 2,57%) và độ đúng Các kết quả đạt được bằng 2 phương pháp (Bioassay & HPLC) đã được đánh giá thống kê, bằng việc phân tích biến ANOVA, cac két qua dat duoc cho thay khéng có sự khác nhau có ý nghĩa giữa 2 phương pháp này [12]
- Souza M J E và cộng sự (2007) đã xây dựng và thâm định được phương pháp định lượng thuốc bột tiêm natri ceftiofur (một kháng sinh cephalosporin phố rộng thế hệ 3) bằng Bioassay Sử dụng phương pháp khuếch tán (dùng các ống trụ đặt trên bề mặt thạch), với chủng chỉ thị Micrococcus lufeus ATCC 10240, thiết kế theo thử nghiệm 3 liều (với khoảng nồng độ khảo sát 2,0-8,0ug/mI) Kết quả thâm định đã cho thấy phương pháp đạt độ tuyến tính tốt (r= 0,999§8), độ chính xác cao (R.S.D trong ngày đạt 0,8%; khác ngày 1,0%) Phân tích phương sai và đánh giá S/wdenf”s t-test cho thay két qua 2 phương pháp Bloassay và HPLC không khác nhau có ý nghĩa [I I]
- Bằng việc áp dụng phương pháp khuếch tán trên thạch (các ống trụ đặt trên
mặt thạch), thiết kế thử nghiệm theo mô hình song song (trên dải nồng d6 8,0-
Trang 16xác khác người phân tích là 1,41% Đồng thời phương pháp đã đáp ứng tốt yêu cầu về độ đúng Độ đặc hiệu của Bioassay cũng được đánh giá bằng việc phân tích các mẫu phân hủy ở 50°C và các kết quả được so sánh với một phương pháp sắc ký lỏng của được điển ở các mốc thời gian 0, 24, và 48h Kết quả đã cho thấy tính hợp lý của phương pháp xây dựng, cho phép định lượng chính xác ceftazidim trong chế phẩm dược, và có thể sử dụng như một phương pháp thay thế hữu ích để phân tích ceftazidim trong việc kiểm sốt chất lượng thơng thường [10]
- Để tối ưu hóa định lượng terbinafin (một kháng sinh khang nam) bang phương pháp vi sinh, Cardoso S G và cộng sự (2000) đã áp dụng phương pháp khuếch tán, bằng việc sử dụng các ống trụ đặt trên bề mặt thạch, với thiết kế theo thử nghiệm 3 liều (khoảng nồng độ khảo sát 0,125-0,5Iip/m]) và chủng vi sinh vật chỉ thị là Aspergillus flavus ATCC 15546 Kết quả các tác giả đã xây dựng và thâm định được phương pháp định lượng terbinafin trong chế phẩm viên nén và kem (tablets and creams): phương pháp đạt yêu câu về độ tuyến tính (r= 0,9999), độ chính xác (trong ngày: CV = 0,48% đối với viên nén, và 0,43% đối với dạng kem; khác ngày: CV = 0,98% đối với viên nén, và 0,64% đối với dạng kem) và độ đúng Phương pháp cũng cho thấy các kết quả xác nhận độ chính xác, khác nhau không có ý với các kết quả của phương pháp HPLC và phương pháp đo quang Nhóm các tác giả đã kết luận: Bioassay là phương pháp thích hợp cho việc định lượng hoạt tính kháng nấm
in vitro của terbinafin [3]
Trang 1717
Trang 18Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị
2.1.1 Chất chuẩn và hóa chất
- Itraconazol: Chuan nha san xuat, ham lượng: 99,53%; Độ âm: 0,21%
- Acetonitril (HPLC), Kali dihydrophosphat, Dikali hydrophosphat, Kali hydroxyd Nuéc cat 2 lan, Dimethylsulfoxid (DMSO) tiéu chuan phan tich, Trung Quéc
- Ching nam kiém dinh: Candida albicans ATCC 10231, mua tại Viện kiém nghiệm thuốc Trung ương
- Môi trường SDA 2% với thành phân cho một lít như sau: = Peptone nam 10g = Dextrose 20g "m- Thạch l5g = pH cudi cing: 5,6 + 0,2 & 25°C (sau tiét trùng ở 121°C, 15 phút) 2.1.2 Thiét bi - dung cu - May sac ky long hiéu nang cao (HPLC) véi detector PDA - C6t RP18, 250 x 4 mm, 5 um (Phenomenex)
- Can phan tich: Mettler — Toledo AB204; d 0,1 mg - Cân kỹ thuật: Sartorius TE412; d 0,01g
- Máy đo pH, máy lắc siêu âm, máy lọc nước, các loại bình định mức và pipet loại A
2.1.3 Mẫu nghiên cứu
- Viên nang Sporal (100 mg 1traconazol/viên)
Trang 1919
2.2 Nội dung nghiên cứu
Đề tài được thực hiện với 3 nội dung sau:
- Xây dựng và thâm định phương pháp định lượng itraconazol trong chế phẩm viên nang sporal bằng phương pháp vi sinh
- Xây dựng và thâm định phương pháp định lượng itraconazol trong chế pham viên nang sporal bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao
- So sánh kết quả định lượng của 2 phương pháp 2.3 Phương pháp nghiên cứu
2.3.1 Phuong phap vi sinh (Bioassay) Pha dung dịch chuẩn:
Dung dịch chuân gốc 160ug/ml: cân chính xác 8,0mg chất chuẩn tham chiếu, pha vào bình định mức 50ml bằng DMSO Pha tiếp bằng DMSO để được dung dich 16 pg/ml Từ dung dịch này pha loãng bằng nước cất tiệt trùng để có dung dịch 1,6 ug/ml, được dùng để pha lỗng gấp đơi kế tiếp tới 0,1 ug/ml
Cac dung dich chuẩn có nồng độ: 1,6 (S1); 0,8 (52); 0,4 (R: nồng độ tham chiếu); 0,2 (S4) và 0,1 (S5) ug/ml
Pha dung dịch thử gốc của viên nang 160 ug/ml tương tự chuẩn tới nồng độ 0,4 ug/ml (tương tự nồng độ tham chiếu R) Các nồng độ chuẩn va thử được pha ngay trước khi thử
Trang 20[2, 9] Pha loãng tiếp hỗn dịch trong 15ml SDA (được đun chảy ở 45°C), dé đạt được nồng độ cuối cùng 1-5 x 10° CFU/ml
Dụng cụ và mô hình thực nghiệm: Các đĩa Petri kích thước 100 x 20mm, gồm một lớp nên (8ml môi trường SDA) được cho vào các đĩa trước khi thử đề tạo sự quan sát đễ dàng vùng ức chế Sau khi lớp nền đông răn, lớp chủng (15ml) được rót lên bề mặt của lớp nên Cho thạch đông rắn ở nhiệt độ phòng 10-15 phút Sau đó đục các giếng đường kính 6mm ở 6 điểm trên đĩa Petri theo sơ đồ thử 5x1 (hình 1) [2, 3] Năm đĩa Petri được dùng trong phép thử, tiễn hành thử đồng thời nồng độ tham chiếu R với mỗi nồng độ chuẩn hoặc các nông độ thử 60ul của mỗi nồng độ chuẩn hoặc thử được cho vào các giếng riêng biệt Các đĩa được ủ ở 37°C, 24h Ðo vòng ức chế bằng thước kẹp caliper (độ chính xác 0,01 mm) Các đĩa thử được lặp lại 3 lần (tương ứng với 15 đĩa trong mỗi lần thử), cho 9 kết quả đo của các nồng độ chuẩn S¡, S;, Sx, S; và mẫu thử T Nong độ R được thử 45 lần để hiệu chỉnh các số liệu trong tất cả các đĩa —— i ak TT * Nf NT 2 \ \ \ À = De dN, aX, aw at Hinh 1: So d6 thir 5x1 Các điều kiện thực nghiệm đã nêu trên với các thông SỐ sau: - Thoi gian u: 24h - Nhiệt độ ủ: 37C - _ Nồng độ chủng 1-5x10° CFU/ml
Hiệu chính vùng ức chế (1Z,) bằng nông độ tham chiếu R:
Trang 2121
Đề hiệu chỉnh số liệu thu được, ứng dụng phương trình (Lima e¿ ai., 2009):
L¿ = L⁄ + (Ra - R,), trong đó:
- IZ,: gia tri vung uc chế được hiệu chỉnh
-_ LZ: giá trị trung bình của vùng ức chế của mẫu chuẩn hoặc mẫu thử trong đĩa nghiên cứu
- _ Rạ: trung bình của các giá trị vùng ức chế của nồng độ R trong tat cả các đĩa (45 giá trỊ)
- R,: trung bình của các giá trị vùng ức chế của nồng độ R, trong đĩa nghiên cứu (9 giá trị)
Phân tích số liệu băng việc xây dựng đường chuẩn tỷ lệ giữa logo nồng độ itraconazol và đường kính vùng ức chế; phương trình đường cong đạt được băng việc phân tích hồi qui
Các nồng độ của dung dịch thử được xác định bằng phương trình đường chuẩn
Tham định phương pháp: Phương pháp thử vi sinh đã được thâm định bằng việc đánh giá độ tuyến tính, độ chính xác và độ đúng theo các bước được mô tả trong các hướng dẫn Q2 (R1) của IHC [14]:
- Độ tuyến tinh: 5 nồng độ chuẩn tham chiễu đã được thử (1,6; 0,8; 0,4; 0,2 và
0,1 ug/ml) Đường chuẩn tỷ lệ giữa log10 nồng độ ITZ và ĐK (Đường kính) vùng ức chế đã được thiết lập Các số liệu thu được qua phân tích hồi qui bằng phương pháp bình phương tối thiểu
Trang 22- Độ đúng: Độ đúng: được xác định bằng việc thêm các lượng đã biết của chuẩn tham chiếu ITZ (0,1; 0,2 và 0,3 ug/ml) vào một dung dịch thử (0,2 ug/m]) vào đầu quá trình phân tích, tương đương với 75; 100 và 125% nồng độ thử (0,4 ug/ml) Mỗi mức độ thử được chuẩn bị 3 lần và được thử như mô tả ở trên Xác định phần trăm tìm lại của ITZ
2.3.2 Phuong phap HPLC:
- Khảo sát các điều kiện sắc ký và phương pháp xử ly mau dé dinh luong ITZ trong viên nang Tiến hành thâm định: độ chọn lọc — đặc hiệu, độ lặp lại, độ
đúng, độ chính xác, đường chuẩn , khoảng tuyến tính và độ ôn định của mẫu
Trang 2323
Chương 3 THỰC NGHIỆM, KÉT QUÁ VÀ BÀN LUẬN 3.1 Phương pháp vỉ sinh
3.1.1 Xây dựng phương pháp:
Trang 24Hình 2: Đường kính vòng ức chê thử theo sơ đô 5x1 của ITZ 3.1.2 Thẩm định phương pháp:
3.1.2.1 Do tuyén tinh: Phuong pháp đã đạt được yêu cầu về mối quan hệ tuyến tính (r = 0,9969) giữa các nông độ ITZ và ĐK vùng ức chế trong giải nông độ nghiên cứu y =7.4743x + 18.512 R? = 0.9939 @ Series —— Linear (Series 1) Dk vòng ức chế -1.2 -1 -0.8 -0.6 -0.4 -0.2 0 0.2 0.4 log nồng độ (ug/ml)
Hình 3: Đường chuẩn biểu điễn tương quan giữa đường kính
vòng ức chế (mm) và logarit nồng độ (ug/ml) của ITZ
Trang 2525 Bảng 1: Các số liệu tuyến tính thu được của itraconazol Thông sô Kết quả phân tích hồi qui Hệ số tương quan (r) 0,9969 D6 déc (slope) 7,4743 Hé s6 chan (intercept) 18,512 Dai néng d6 (ug/ml) 0,10 - 1,6 Sô điểm khảo sát 5
3.1.2.2 Độ chính xác: được thê hiện băng độ lệch chuân tương đôi (RSD) Trong phép thử độ chính xác trong ngày (n=6), hàm lượng trung bình của ITZ
là 103,38 % (RSD = 3,2 %) Độ chính xác khác ngày (n=12), hàm lượng
trung bình đạt được là 104,65% (RSD = 3,85%) Các giá trị RSD đạt được cho thấy phương pháp đạt độ chính xác yêu cầu (bảng 2)
Trang 263.1.2.3 Đó đúng: được khảo sát bằng thực nghiệm bé sung chat chuẩn, ở 3
mức nông độ, lặp lại 3 lần (n=9) Phần trăm tìm lại thay đổi từ 103,3%- 105,5% (bảng 3) Độ khám phá trung bình 104,4%% đã đảm bảo độ đúng của phương pháp
Bảng 3: Độ tìm lại của ITZ trong thực nghiệm bồ sung chuẩn đánh giá độ đúng của phương pháp
Mẫu |Nông độ bô sunglNông độ tìm lại| Độ tìm (ug/ml) (ug/ml)* | lai (%) 1 0,1 0,1055 105,5 2 0,2 0,209 104,5 3 0,3 0,310 103,3
* Trung bình của 3 lân xác định
Nhận xét: Mặc dù có sự khác biệt nhỏ ở nồng độ bô sung 0,1%, nhưng các kết quả đã cho thấy phương pháp bioassay có đủ độ tin cậy Các xí nghiệp được phẩm có thể tiến hành áp dụng đồng thời với HPLC, khi xác đỉnh ITZ Đây là
một bước quan trọng cho việc kiểm tra hoạt lực của các chất hóa trị liệu
Trang 2727
so sánh các kết quả thu được với một phương pháp có độ chính các cao hơn là
HPLC
3.2 Phương pháp HPLC
3.2.1 Xây dựng phương pháp định lượng HPLC
Qua tiễn hành tham khảo các tài liệu [1], [2], [4], [8], [13] và khảo sát thực nghiệm: bước sóng cho hấp thụ cực đại, thành phần và tỷ lệ pha động, pH dung dịch đệm, tốc độ dòng, nồng độ làm việc chúng tôi đã xác định được
điều kiện sắc ký và phương pháp xử lý mẫu trong viên nang như sau: 3.2.1.1 Điêu kiện sắc ký - Cột : RP18, 250 x 4mm, 5 um (Phenomenex) - Detector : 263 nm - Tốc độ dòng : 1,5 ml/phút - Nong độ làm việc : 50,0 mcg/ml -Thétichtiém :20 ki
- Pha động : Acetonitril - Dung dịch đệm phosphat pH 7,0 (70:30)
- Nhiệt độ phân tích: Nhiệt độ phòng
3.2.1.2 Phương pháp xử lý mẫu
- Dung dịch chuẩn: Cân chính xác khoảng 50,0 mg chất chuẩn itraconazol vào bình định mức 100 mi Thêm khoảng 70 ml pha động, lắc siêu âm 10 phút, thêm pha động vừa đủ đến vạch, trộn đều Hút chính xác 5 ml dung dịch trên cho vào bình định mức dung tích 50 ml, thêm pha động vừa đủ đến vạch, trộn déu duoc dung dich 50,0 ug/ml Lọc qua màng loc 0,45 um dé tiém sac ky - Dung dịch thử: Cân 20 viên, xác định khối lượng trung bình thuốc trong nang, nghiền thành bột mịn Cân chính xác một lượng bột viên đã nghiền mịn tương ứng với khoảng 50,0 mg itraconazol và tiến hành pha như dung dịch
Trang 28ảnh hướng đến việc định lượng ITZ Tiến hành tiêm dung dịch mẫu trắng, mẫu dung dịch chuẩn, mẫu dung dịch thử vào hệ thống sắc ký Các sắc ký đồ và phô hấp thụ tử ngoại của ITZ cho các kết quả ở các hình sau mAU (263nm,4nm (1.00) S về 200- 4 S N @ - 4 ư J © 100 š 0- | | | | | | | | | amt | | 2.5 5.0 min Hình 4: Sắc ký đồ dung dịch mẫu chuân mAU 10o-283nm,4nm (1.00) 2.5 5.0min Hình 6: Sắc ký đồ dung dịch mâu trăng mAU (263nm,4nm (1.00) o | 6 200- 4 S N Ø Cc | S 4 © 100, g 0- | | | | | | | | | | | — 2.5 5.0min Hinh 5: Sac ky dé dung dich mau thử APRA 7 sABiat00 5.0- : 262 2.5— '86 - 378 0.0— | | 1 | | | 1 | 1 | | 200 300 nm Hình 7: Phố hấp thụ tử ngoại itraconazol
Trang 2929
itraconazol đều cho 1 pIc ở thời gian lưu tạ = 5,l phút, như vậy phô hấp thụ
của dung dịch thử trùng với phô hấp thụ của dung dịch chuẩn và có cực đại hấp thụ ở bước sóng 262 nm Chứng tỏ phương pháp có độ chọn lọc - đặc hiệu cao
3.2.2.2 Xác định tính thích hợp của hệ thông sắc ky
Tiêm lặp lại 6 lần cùng một dung dịch chuẩn itraconazol có nồng độ khoảng 50,0 ug/ml vào hệ thống sắc ký theo chương trình đã chọn Tính thích hợp của hệ thống HPLC được biểu thị qua hệ số bất đối xứng, số đĩa lý thuyết, độ lệch chuân tương đối RSD (%) của thời gian lưu và diện tích pic Kết quả thực nghiệm được trình bày ở bảng 4:
Bảng 4: Kết quả khảo sát tính thích hợp của hệ thông HPLC STT Thời gian lưu Diện tích pic | Hệ sô (phút) (mAu.s) bất đối xứng (T) 1 5,101 1831577 1,14 2 5,104 1832428 1,15 3 5,097 1844358 1,14 4 5,102 1837665 1,14 5 5,104 1834437 1,15 6 5,102 1832095 1,13 TB 5,102 1835427 1,14 SD 0,00 4912.6 RSD (46) 0,1 0,3
Trang 30hệ thống sắc ký HPLC sử dụng đáp ứng được phép phân tích định tính và định lượng ITZ
3.2.2.3 Đường chuẩn và khoảng tuyến tính
Tiến hành khảo sát sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ và diện tíc pic cua itraconazol, bang cach pha mot day dung dich chuẩn có nồng độ từ 30,0- 70,1 ug/ml Kết quả khảo sát độ tuyến tính được trình bày ở bảng 5 và hình 7
Bảng 5: Kết quá khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính STT Nông độ Diện tích pic (mcg/ml) (mAu.s) 1 30,0 1093170 2 40,0 1463777 3 50,1 1831577 4 40.1 197892 5 70,1 2578533 A 37005,7 B -19431 R 1,0000 Đường chuẩn Itraconazol y = 37005.6522x - 19430.8200 ow Ss Ễ 2700000 R? = 1.0000 „= 2200000 5 1700000 a ‹8 1200000 70000 200000 + : i | 20.00 40.00 60.00 80.00 Nông d6 (mcg/ml)
Trang 3131
Nhận xét: Kết quả cho thấy trong khoảng nồng độ ITZ đã khảo sát (30,0 — 70,1 ug/ml) có sự phụ thuộc tuyến tính chặt chẽ giữa diện tích pic và nồng độ của chúng với hệ số tương quan r = 1,000
3.2.2.4 Độ đụng của phương pháp
Độ đúng của phương pháp được đánh giá bằng phương pháp thêm chuẩn: thêm một lượng chính xác chất chuân vào mẫu thử sao cho tông nồng độ ITZ vẫn nam trong khoảng tuyến tính đã khảo sát Kết quả khảo sát độ đúng được trình bày ở bảng 6: Bảng 6: Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp
STT Lượng Diện tích thử Lượng | Tỉ lệ thu hôi thêm vào (mg) (mAu.s) tìm lại (mg) (%) 1 0,503 1471922 0,500 99,3 2 0,503 1472111 0,500 99,4 3 0,503 1475874 0,505 100,4 4 1,005 1840903 1,003 99,8 5 1,005 1841639 1,004 99,9 6 1,005 1838343 0,999 99,4 7 1,508 2213884 1,517 100,2 8 1 508 2210067 1 506 0,9 9 1,508 2212812 1,516 100,1 TB 99,9 SD 0,3 RSD (%) 0,3
Nhận xét Kêt quả khảo sát cho thây lượng chất chuân thu hôi lại được năm
Trang 323.2.2.5 Độ lặp lại của phương pháp
Tiến hành sắc ký và ghi sắc đồ của 6 mẫu bột viên đồng nhất với lượng cân khác nhau Độ lặp lại của phương pháp được đánh giá bằng độ lệch chuẩn tương đối của 6 mẫu riêng biệt
* Độ lặp lại trong ngày
Kết quả khảo sát độ lặp lại trong ngày được trình bày ở bảng 7 Bảng 7: Kết quả khảo sát độ lặp lại trong ngày TT Lượng can Diện tích Hàm lượng (mg) (mAu.s) (%) 1 231,6 1835343 100,5 2 232,5 1828092 99,7 3 231,5 1830580 100,3 4 354 *242991 99,3 5 234,7 1847739 99,9 6 234.6 1832984 99,1 TB 99,8 SD 0,5 RSD (%) 0,5 * Độ lặp lại khác ngày
Kết quả khảo sát độ lặp lại khác ngày được trình bày ở bảng 8
Nhận xét: Kết quả khảo sát độ lặp lại trong ngày và khác ngày của phương pháp đều cho RSD < 0,5 % cho thấy sự thống nhất kết quả giữa một loạt phép
định lượng từ nhiều lần cân khác nhau trên cùng một mẫu thử đồng nhất
Trang 3333 Bảng 8: Kết quả khảo sát độ lặp lại khác ngày Ngày I Ngày 2
SIT| Lượng | Diện tích | Hàm lượng | Lượng cần | Diện tích | Hàm lượng
can (mg) | (mAu.s) (%) (mg) (mAu.s) (%) 1 231,6 1835343 100,5 230,1 1822672 100,6 2 232,5 1828092 99,7 232,9 1830932 99,9 3 231,5 1830580 100,3 229,8 1812921 100,2 4 235,4 1842991 99,3 231,4 1820325 99,9 5 234,7 1847739 99,9 233,1 1832009 99,8 6 234,6 1832984 99,1 230,8 1812932 99,8 TB 99,9 SD 0,4 RSD (%) 0.4 3.2.2.6 Độ ổn định
Tiến hành nghiên cứu độ ôn định của dung dịch chuẩn và thử được bảo quản ở nhiệt độ phòng thí nghiệm (25°C) Kết quả cho thấy sau 7 giờ dung
dich chuẩn và thử ồn định với sai số < 0,5 %
3.3 So sánh kết quả định lượng của 2 phương pháp Bioassay và HPLC So sánh kết quả định lượng đạt được của 2 phương pháp Bioassay va HPLC bang phan tich tích biến một chiều đã cho thấy sự khác biệt có ý nghĩa (p < 0,05) của 2 phương pháp
Ưu điểm chủ yếu của phương pháp vi sinh so với HPLC là ít phức tạp
Trang 34liên quan tới khả năng xác định các chất chuyển hóa của 2 phương pháp và điều này đã được Hostetler và Cs (1993) minh họa rõ ràng đối với itraconazol Dược chất ITZ được chuyển hóa qua hệ thống giải độc cytochrom P-450 cho một số sản phẩm Một trong số đó là chất chuyên hóa hydroxy-itraconazol, cũng có hoạt tính kháng nắm tương đương chất gốc ITZ [5] Phương pháp HPLC chỉ xác định được dược chất mẹ với cấu trúc hóa học đã biết mà không xác định được các loại chất hóa học khác (chưa biết rõ cầu trúc) do quá trình chuyên hóa tạo ra Với phương pháp Bioassay thì ngược lại có thể phát hiện được tất cả các chất có hoạt tính, không phân biệt đặc tính hóa học của chúng Điều này đã giải thích cho sự khác biệt thu được giữa hai phương pháp (HPLC và Bloassay) khi phân tích định lượng ITZ trong các mẫu huyết tương lâm sàng Nông độ ITZ xác định được bang phương pháp vi sinh cao hơn so với các nồng độ đạt được bằng HPLC [5]
Kết quả khảo sát định lượng đã cho thấy cả 2 phương pháp đều đáp ứng yêu cầu phân tích Phương pháp HPLC mặc dù vất vả hơn, phức tạp hơn nhưng có độ đúng, độ chính xác cao hơn, nên phù hợp hơn cho các nghiên cứu dược động học Mặc dù vậy phương pháp vi sinh đơn giản hơn, và vẫn
Trang 3535
KET LUẬN VÀ KIÊN NGHỊ
4.1 Đã xây dựng được phương pháp định lượng ITZ trong chế phẩm viên nang băng phương pháp vi sinh, bước đầu cho thấy có độ tin cậy (Độ đúng 103,3-105,5%; Độ lặp lại trong ngày RSD = 3,2%, khác ngày = 3,85%), khi sử dụng liều chủng 1-5 x 10° CFU/ml, ching C albicans ATCC 10231 và thoi gian U 24h, @ 37°C, trén gidi néng d6 0,1-1,6 pg/ml
4.2 Kết quả cho thấy, phương pháp sắc ký lỏng pha đảo với detector UV bước sóng 263 nm, chương trình sắc ký đẳng dòng, cho pic ITZ cân đối, tách rõ ràng: phương pháp có độ chọn lọc - đặc hiệu cao, có sự tương quan tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic với r > 0,99 trong đải nồng độ 30,0-70,1 ug/ml, độ đúng 99,3 — 100,4%, độ chính xác RSD < 2,0% Chúng tôi đề xuất sử dụng phương pháp HPLC đã được thâm định nêu trên để tiến hành định lượng chế phẩm viên nang có chứa [TZ
4.3 Kết quá định lượng itraconazol trong chế phẩm viên nang sporal (Sporanox) cho thấy phương pháp HPLC có độ đúng, độ chính xác cao hơn so với phương pháp vi sinh Phương pháp vi sinh đơn giản hơn, và vẫn đảm bảo độ đúng, độ chính xác trong việc xác định hàm lượng dược chất
4.4 Cần tiếp tục triển khai định lượng [TZ trong các mẫu viên nang khắc như
itcon (An D6), Fungex (Lién doanh san xuat tai Viét Nam), và đặc biệt là viên nang itraconazol tự bào chế bằng cả 2 phương pháp Bioassay và HPLC
Trang 36Tài liệu tham khảo
1 Cục quản lý được - Bộ Y tế (2010), “Các văn bản quy phạm pháp luật liên quan đến việc đăng ký thuốc - Hướng dẫn của ASEAN về thẩm định phương pháp phân tích”, tr 247 — 261
2 Dược điển Việt Nam IV, “Phụ lục 5: Các kỹ thuật tách sắc ký”, tr PL119
— PL124, PL127 — PL129 Phu lục 13, mục 13.9: Xác định hoạt lực thuốc
kháng sinh bằng phương pháp thử vi sinh vật, tr PL-271 & mưục 13.10: Phân
tích thống kê các kết quả thứ nghiệm sinh học, tr PL-283
3 Cardoso S.G et al (2000), Microbiological assay for terbinafine
hydrochloride in tablets and creams, International Journal of pharmaceutics
Vol 203, p 109-113
4 European pharmacopoeia, fifth Edition 2005, Volume 2, pp 1852 — 1853
5 Janssen Pharmaceutica Products, LP (2001), Sporanox® (Itraconazole)
Injection
6 Lima P.M et al (2009), Determination of ketoconazole in capsules by high-performance liquid chromatography and microbiological assay, J of
AOAC international, Vol 92, No 4
7 Odds F C., and Bossche H V (2000), Antifungal activity of itraconazole compared with hydroxy-itraconazole in vitro, J of antimicrobial chemotherapy, 45, 371-373
Trang 3737
9 Queiroz K.M et al (2009), Comparison of microbiological assay and HPLC-UV for determination of fluconazole in capsules, Brazilian J of Pharm
Sciences, Vol 45, No 4
10 Schmidt C.A et al (2008), Development and validation of an agar diffusion assay for determination of ceftazidime in pharmaceutical preparations, J of AOAC international vol 91, No.1
11 Souza M.J et al (2007), Development of a microbiological assay to determine the potency of ceftiofur sodium powder, J of AOAC international
vol 90, No 6
12 Staub I et al (2005), Microbiological assay of ketoconazole in shampoo,
Int J of Pharm., Vol 292, p 195-199
13 The United states pharmacopeia 30, “Analytical data — interpration and treatment”, pp 390 — 397
14 Validation of analytical procedures (2005): Text and methodology Q2 (R1)-CHR harmonized tripartite guideline International conference on harmonization of technical requirements for registration of Pharmaceuticals
for human use, p 1-13
15 Vaucher L.C et al (2006), Microbiological assay for the determination of