nghiên cứu phân tích đồng phân quang học lansoprazol sử dụng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH NGUYỄN THẢO HẠNH NGÂN NGHIÊN CỨU PHÂN TÍCH ĐỒNG PHÂN QUANG HỌC LANSOPRAZOL SỬ DỤNG KỸ THUẬT SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC Chuyên ngành: Kiểm nghiệm thuốc – Độc chất Mã số: 8720210 Thành phố Hồ Chí Minh – Năm 2020 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH NGUYỄN THẢO HẠNH NGÂN NGHIÊN CỨU PHÂN TÍCH ĐỒNG PHÂN QUANG HỌC LANSOPRAZOL SỬ DỤNG KỸ THUẬT SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC Chuyên ngành: Kiểm nghiệm thuốc – Độc chất Mã số: 8720210 NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS Phan Thanh Dũng TS Lê Thị Thu Cúc Thành phố Hồ Chí Minh – Năm 2020 ii LỜI CAM ĐOAN Tơi cam đoan cơng trình nghiên cứu Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực chưa công bố cơng trình khác Người cam đoan Nguyễn Thảo Hạnh Ngân iii Luận văn Thạc sĩ – Khóa 2017 – 2019 Ngành: Kiểm nghiệm thuốc độc chất – Mã số: 8720210 NGHIÊN CỨU PHÂN TÍCH ĐỒNG PHÂN QUANG HỌC LANSOPRAZOL SỬ DỤNG KỸ THUẬT SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO Nguyễn Thảo Hạnh Ngân Hướng dẫn khoa học: PGS TS Phan Thanh Dũng, TS Lê Thị Thu Cúc Từ khóa: HPLC, lansoprazol, phân tách đồng phân, đồng phân quang học Mở đầu Lansoprazol định điều trị nhiều bệnh dày bao gồm loét dày tá tràng điều trị nhiễm Helicobacter pylori Lansoprazol có hai đồng phân đối quang (R)lansoprazol (dexlansoprazol) (S)-lansoprazol Tuy nhiên, có dạng (R) có hoạt tính sinh học, cịn dạng (S) có nhiều tác dụng phụ Phần lớn chế phẩm thị trường dạng racemic Tuy nhiên, để cải thiện tính an tồn hiệu quả, lansoprazol sản xuất dạng đồng phân (R)-lansoprazol đưa thị trường vài năm trước Trong nghiên cứu này, giới thiệu kết phân tích đồng phân quang học (R)-lansoprazol kỹ thuật HPLC Đối tượng phương pháp nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu: hoạt chất lansoprazol (R)-lansoprazol (dexlansoprazol) Phương pháp nghiên cứu: Khảo sát số điều kiện quan trọng ảnh hưởng trình tách nhằm chọn điều kiện phân tích đáp ứng thơng số: hai pic đồng phân phải tách hoàn toàn với độ phân giải Rs > 1,5; hệ số bất đối As nằm khoảng 0,8 - 1,5 Sau tìm điều kiện thích hợp, tiến hành thẩm định quy trình phân tích bao gồm: khảo sát tính phù hợp hệ thống, tính đặc hiệu, tính tuyến tính, giới hạn phát hiện, độ xác độ Quy trình phân tích sau thẩm định áp dụng để định lượng hoạt chất dexlansoprazol xác định tạp (S)-lansoprazol chế phẩm chứa hoạt chất dexlansoprazol thị trường Kết Xây dựng quy trình để phân tích đồng phân quang học lansoprazol sử dụng pha động chứa tác nhân đối quang sau: sử dụng cột sắc ký Gemini NX C18 (150 x 4,6 mm; µm) với pha động acetonitril – dung dịch đệm NaH2PO4 10 mM có chứa 10,0 mM SBE-β-CD, pH 2,5 (20:80, tt/tt) Tốc độ dòng ml/phút, nhiệt độ 30oC, thể tích tiêm mẫu 10 µl bước sóng phát 285 nm Xây dựng quy trình để phân tích đồng phân quang học lansoprazol sử dụng cột bất đối Lux cellulose sau: sử dụng cột sắc ký Lux Cellulose-1 (250 x 4,6 mm; µm) với pha động n-hexan: IPA: acid formic (80:20:0,1, tt/tt/tt) Tốc độ dịng: ml/ phút, thể tích tiêm mẫu: 10 µl, nhiệt độ cột: 30oC bước sóng phát hiện: 285 nm Độ phân giải đồng phân lớn 1,5 Độ lệch chuẩn tương đối (RSD) 2% (n = 6), độ phục hồi 98 - 102%, phương pháp phù hợp kiểm tra chất lượng Kết luận Đã xây dựng hai quy trình phân tách đồng phân quang học lansoprazol kỹ thuật HPLC sử dụng pha động có chứa tác nhân đối quang sử dụng cột bất đối Lux cellulose Cả hai quy trình có tính chọn lọc, giới hạn phát thấp, cho kết xác độ lặp cao Quy trình áp dụng để định lượng dexlansoprazol, xác định tạp đồng phân (S)-lansoprazol chế phẩm chứa dexlansoprazol iv Master’s Thesis – Academic course: 2017 – 2019 Specialty: Drug Quality Control & Toxicology – Code: 8720210 CHIRAL SEPARATION OF LANSOPRAZOL ENANTIONMER BY USING HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY Nguyen Thao Hanh Ngan Supervisor: Assoc Dr Phan Thanh Dung, Dr Le Thi Thu Cuc Keywords: HPLC, lansoprazol, chiral separation, enantiomers Introduction Lansoprazole, a proton pump inhibitor that is indicated for the treatment of many stomach diseases including peptic ulcer and Helicobacter pylori infection Lansoprazole has two enantiomers: (R)-lansoprazole (dexlansoprazole) and (S)-lansoprazole However, only (R) form is bioactive, while (S) form has many side effects Therefore, to improve safety and efficacy, lansoprazole is produced as an isomer (R)-lansoprazole In this study, we present the analysis results of optical isomers (R)-lansoprazole by HPLC technique Material and methods The subject of this study was lansoprazole and (R)-lansoprazole (dexlansoprazole) A high performance liquid chromatographic (HPLC) method was developed for the chiral separation of lansoprazole in two different approaches using chiral stationary phase in normal phase and using chiral mobile phase additive in reversed phase In normal phase, the enantiomer separation of lansoprazole is studied on different chiral stationary phases Another HPLC method using chiral mobile phase additive on a Gemini C18 column (150 mm × 4.6 mm, µm) was developed by studying the influences of type and concentration of cyclodextrins and buffer pH of mobile phase The detection wavelength was set at 285 nm at 20°C Results The two enantiomers were separated on a Lux Cellulose-1 column in chiral stationary phase study The mobile phase was n-hexane-isopropanol-acid formic (80:20:0.1) (v/v/v) A baseline resolution of lansoprazole enantiomers was achieved using ACN and 10 mM phosphate buffer (pH 2.5) containing 10 mM SBE‐β‐CD (20:80) (v/v) as mobile phase with a flow rate of 1.0 mL/min The resolution of the enantiomers in two methods were more than 1.5 The methods were extensively validated following the International Conference on Harmonisation (ICH) guidelines The range of quantification for both enantiomers was 1501500 µg/mL with r2 > 0.999 for dexlansoprazole Relative standard deviation of the method was below 2% (n=6), the percentage recovery ranged from 98% to 102% Conclusion The methods are suitable in quality control and capable of determine impurity limit of (S)enantiomer in dexlansoprazole v MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN iii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT ix DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ, ĐỒ THỊ x DANH MỤC CÁC BẢNG xiii MỞ ĐẦU CHƯƠNG – TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 ĐẠI CƯƠNG VỀ LANSOPRAZOL .3 1.1.1 Tính chất vật lý 1.1.2 Tính chất hóa học 1.1.3 Tác dụng dược lý .4 1.1.4 Chỉ định .5 1.1.5 Tương tác thuốc 1.1.6 Định tính định lượng 1.2 ĐẠI CƯƠNG VỀ ĐỒNG PHÂN ĐỐI QUANG .6 1.2.1 Khái niệm đồng phân đối quang 1.2.2 Sắc ký lỏng hiệu cao phân tích đồng phân đối quang .7 1.2.3 Điện di mao quản phân tích đồng phân đối quang 1.2.4 Một số phương pháp phân tích đồng phân đối quang khác .8 1.3 PHA ĐỘNG ĐỐI QUANG TRONG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (CHIRAL ADDITIVE MOBILE PHASE) 10 1.3.1 Khái niệm 10 1.3.2 Các tác nhân quang hoạt 11 vi 1.4 MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG DEXLANSOPRAZOL 12 1.4.1 Nghiên cứu nước 15 1.4.2 Nghiên cứu nước 15 CHƯƠNG – ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU .18 2.1.1 Đối tượng 18 2.1.2 Hóa chất 18 2.1.3 Trang thiết bị, dụng cụ 19 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 2.2.1 Xây dựng thẩm định quy trình phân tích đồng phân quang học lansoprazol HPLC sử dụng pha động có chứa tác nhân đối quang 20 2.2.2 Xây dựng thẩm định quy trình phân tích đồng phân quang học lansoprazol HPLC sử dụng cột bất đối Lux cellulose 26 2.2.3 Ứng dụng quy trình để định lượng chế phẩm chứa dexlansoprazol thị trường 28 2.2.3.1 Định lượng dexlansoprazol 28 2.2.3.2 Xác định tạp đồng phân (S)-lansoprazol 28 CHƯƠNG – KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 29 3.1 XÂY DỰNG VÀ THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH PHÂN TÍCH ĐỒNG PHÂN QUANG HỌC LANSOPRAZOL BẰNG HPLC SỬ DỤNG PHA ĐỘNG CÓ CHỨA TÁC NHÂN ĐỐI QUANG 29 3.1.1 Khảo sát điều kiện sắc ký phân tích đồng phân quang học lansoprazol HPLC sử dụng pha động có chứa tác nhân đối quang 29 3.1.2 Thẩm định quy trình phân tích dexlansoprazol HPLC sử dụng pha động có chứa tác nhân đối quang 39 vii 3.1.3 Dự thảo quy trình phân tích đồng phân quang học lansoprazol phương pháp HPLC sử dụng pha động có chứa tác nhân đối quang 50 3.2 XÂY DỰNG VÀ THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH PHÂN TÍCH ĐỒNG PHÂN QUANG HỌC LANSOPRAZOL BẰNG HPLC SỬ DỤNG CỘT BẤT ĐỐI LUX CELLULOSE .52 3.2.1 Khảo sát điều kiện sắc ký phân tích đồng phân quang học lansoprazol HPLC sử dụng cột bất đối Lux cellulose 52 3.2.2 Thẩm định quy trình phân tích lansoprazol HPLC sử dụng cột bất đối Lux Cellulose-1 55 3.2.3 Dự thảo quy trình phân tích đồng phân quang học lansoprazol phương pháp HPLC sử dụng cột bất đối Lux Cellulose-1 66 3.3 ỨNG DỤNG HAI QUY TRÌNH ĐÃ XÂY DỰNG ĐỂ ĐỊNH LƯỢNG CHẾ PHẨM CHỨA DEXLANSOPRAZOL TRÊN THỊ TRƯỜNG 68 3.3.1 Ứng dụng hai quy trình xây dựng để định lượng chế phẩm chứa dexlansoprazol thị trường 68 3.3.2 Xác định tạp đồng phân (S)-lansoprazol 69 CHƯƠNG – BÀN LUẬN .71 CHƯƠNG – KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .77 5.1 KẾT LUẬN 77 5.2 KIẾN NGHỊ 78 TÀI LIỆU THAM KHẢO 79 PHỤ LỤC Error! Bookmark not defined viii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Từ viết tắt Từ nguyên Nghĩa tiếng Việt ACN Acetonitril AS Asymmetry Factor CE Capillary electrophoresis CM-β-CD Carboxymethyl-beta-cyclodextrin CSPs Chiral stationary phases Pha tĩnh bất đối DEX Dexlansoprazol Dexlansoprazol EMEA European Medicines Evaluation Agency Cơ quan Dược phẩm châu Âu FDA Food and Drug Administration Cục quản lý Thực phẩm Dược Hệ số bất đối phẩm Hoa Kỳ HPLC High performance liquid chromatography Sắc ký lỏng hiệu cao HP-β-CD Hydroxypropyl-beta-cyclodextrin KQ Kết IR Infrared IPA Isopropyl alcohol LAN Lansoprazol Lansoprazol LOD Limit of detection Giới hạn phát LOQ Limit of quantification Giới hạn định lượng M-β-CD Methyl-beta-cyclodextrin MeOH Methanol MS Mass spectrometry Khối phổ N Plate number Số đĩa lý thuyết PPI Proton Pump Inhibitor Thuốc ức chế bơm proton RP Reversed phase Pha đảo RS Resolution Factor Độ phân giải Phổ hồng ngoại Diện tích đỉnh S SBE-β-CD Sulfo butylether- beta-cyclodextrin SKĐ Sắc ký đồ Sắc ký đồ (S)-LAN Đồng phân (S)-lansoprazol Đồng phân (S)-lansoprazol tR Retention time Thời gian lưu ix DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ, ĐỒ THỊ Hình 1.1 Cơng thức cấu tạo lansoprazol Hình 1.2 Cơng thức cấu tạo dexlansoprazol Hình 1.3 Sơ đồ tách đồng phân quang học phương pháp hóa học .9 Hình 3.1 SKĐ khảo sát thay đổi loại cột sắc ký khác .30 Hình 3.2 Đồ thị ảnh hưởng cột sắc ký HPLC lên phân tách đồng phân lansoprazol 31 Hình 3.3 SKĐ khảo sát thay đổi tác nhân đối quang khác 32 Hinh 3.4 SKĐ khảo sát thay đổi nồng độ tác nhân đối quang 33 Hình 3.5 Đồ thị ảnh hưởng nồng độ tác nhân đối quang SBE-β-CD lên phân tách đồng phân lansoprazol .33 Hình 3.6 SKĐ khảo sát tách đồng phân thay đổi pH pha động 35 Hình 3.7 Đồ thị ảnh hưởng pH pha động lên phân tách đồng phân lansoprazol 35 Hình 3.8 SKĐ khảo sát tách đồng phân thay đổi nồng độ đệm NaH2PO4 36 Hình 3.9 Đồ thị ảnh hưởng nồng độ đệm NaH2PO4 lên phân tách đồng phân lansoprazol 37 Hình 3.10 SKĐ khảo sát tách đồng phân thay đổi tỷ lệ pha động 38 Hình 3.11 Đồ thị ảnh hưởng tỷ lệ pha động lên phân tách đồng phân lansoprazol 39 Hình 3.11 SKĐ mẫu chuẩn lansoprazol 41 Hình 3.12 SKĐ mẫu chuẩn dexlansoprazol .41 Hình 3.13 SKĐ mẫu dung mơi 41 Hình 3.14 SKĐ mẫu trắng 41 Hình 3.15 SKĐ mẫu thử lansoprazol .41 Hình 3.16 SKĐ mẫu thử dexlansoprazol 41 Hình 3.18 Độ tinh khiết pic dexlansoprazol mẫu thử 41 Hình 3.19 Phổ UV thời gian lưu pic dexlansoprazol mẫu chuẩn .42 Hình 3.20 Phổ UV thời gian lưu pic (S)-lansoprazol mẫu chuẩn .42 Hình 3.21 Phổ UV thời gian lưu pic dexlansoprazol mẫu thử 42 Hình 3.22 Phổ UV thời gian lưu pic (S)-lansoprazol mẫu thử 42 x Tiến hành sắc ký lần dung dịch chuẩn dexlansoprazol dung dịch thử Lấy giá trị diện tích pic dexlansoprazol (S)-lansoprazol để tính hàm lượng 3.2.3.4 Tính tốn kết Hàm lượng dexlansoprazol viên tính theo cơng thức X% = #$ #% × &$ &% × '% '$ × ( ) * × + , × (, ./) , × 100 Trong đó: St: diện tích pic dexlansoprazol mẫu thử Sc: diện tích pic dexlansoprazol mẫu chuẩn Dt: độ pha loãng mẫu thử Dc: độ pha loãng mẫu đối chiếu Mc: khối lượng cân chuẩn đối chiếu (mg) Mt: khối lượng cân mẫu thử (mg) P: khối lượng trung bình viên (mg) HLN: hàm lượng hoạt chất nhãn (mg) C: hàm lượng chuẩn đối chiếu (%) Φ: hàm lượng ẩm chuẩn đối chiếu (%) 3.3 ỨNG DỤNG HAI QUY TRÌNH ĐÃ XÂY DỰNG ĐỂ ĐỊNH LƯỢNG CHẾ PHẨM CHỨA DEXLANSOPRAZOL TRÊN THỊ TRƯỜNG 3.3.1 Ứng dụng hai quy trình xây dựng để định lượng chế phẩm chứa dexlansoprazol thị trường Căn vào dự thảo quy trình phân tích đồng phân quang học lansoprazol phương pháp HPLC sử dụng cột bất đối Lux Cellulose-1 dự thảo quy trình phân tích đồng phân quang học lansoprazol phương pháp HPLC sử dụng pha động có chứa tác nhân đối quang, tiến hành định lượng mẫu viên nén Dexilant lưu hành thị trường 68 Bảng 3.35 KQ định lượng dexlansoprazol chế phẩm quy trình phân tích đồng phân quang học lansoprazol phương pháp HPLC sử dụng cột bất đối Lux Cellulose-1 Dexlansoprazol Mẫu Nồng độ (µg/ml) Diện tích Mẫu chuẩn dexlansoprazol 608,15 18194756 Viên nén Dexilant 60mg 636,49 18409279 Hàm lượng (%) 101,25 Bảng 3.36 KQ định lượng dexlansoprazol chế phẩm quy trình phân tích đồng phân quang học lansoprazol phương pháp HPLC sử dụng pha động có chứa tác nhân đối quang Dexlansoprazol Mẫu Nồng độ (µg/ml) Diện tích Mẫu chuẩn dexlansoprazol 608,15 18463759 Viên nén Dexilant 60mg 598,23 18098726 Hàm lượng (%) 101,67 Nhận xét: Kết định lượng mẫu chế phẩm hai phương pháp xây dưng cho thấy hàm lượng hoạt chất dexlansoprazol nằm khoảng từ 95% đến 105% so với hàm lượng ghi nhãn 3.3.2 Xác định tạp đồng phân (S)-lansoprazol Bảng 3.37 KQ khảo sát tạp đồng phân (S)-lansoprazol chế phẩm Diện tích dexlansoprazol Diện tích (S)-lansoprazol (%) Tạp đồng phân Phương pháp HPLC sử dụng cột bất đối Lux Cellulose-1 18409279 0 Phương pháp HPLC sử dụng pha động có chứa tác nhân đối quang 18098726 0 69 Hình 3.32 SKĐ viên nén Dexilant 60mg định lượng phương pháp HPLC sử dụng cột bất đối Lux Cellulose-1 Hình 3.33 SKĐ mẫu chuẩn dexlansoprazol định lượng phương pháp HPLC sử dụng cột bất đối Lux Cellulose-1 Hình 3.34 SKĐ viên nén Dexilant 60mg định lượng phương pháp HPLC sử dụng pha động có chứa tác nhân đối quang Hình 3.35 SKĐ mẫu chuẩn dexlansoprazol định lượng phương pháp HPLC sử dụng pha động có chứa tác nhân đối quang Nhận xét: Kết xác định tạp (S)-lansoprazol chế phẩm Dexilant 60mg chứa hoạt chất dexlansoprazol hai phương pháp xây dựng cho thấy chế phẩm viên nén khơng có lượng tạp đồng phân 70 CHƯƠNG – BÀN LUẬN Chế phẩm lansoprazol sản xuất công ty dược nước, phân phối rộng khắp Việt Nam Nhóm thuốc ức chế bơm proton (PPI) sử dụng điều trị loét dày- tá tràng có nhiều thành tựu bên cạnh nhóm thuốc kháng acid, thuốc bao phủ niêm mạc dày, thuốc kháng thụ thể histamin H2 kháng sinh diệt vi khuẩn Helicobacter pylori Những năm gần đây, nhóm thuốc có hoạt chất biết đến nhiều như: omeprazol, pantoprazol, lansoprazol, rabeprazol,… Nhóm thuốc ngồi định cho bệnh lt dày- tá tràng cịn sử dụng cho bệnh nhân mắc bệnh trào ngược dày thực quản (GERD), hội chứng Zollinger-Ellison Bên cạnh việc nghiên cứu hoạt chất mới, nhóm thuốc tập trung vào tổng hợp dạng đối quang hoạt chất có esomeprazol, dexlansoprazol, dexrabeprazol,… ưu điểm liều dùng giảm, tác dụng chuyên biệt receptor độc tính giảm so với dạng thuốc racemic Hiện nay, chế phẩm thuốc dexlansoprazol, dạng đối quang hoạt chất lansoprazol chưa sản xuất nhiều Việt Nam, thành phẩm nhập có giá thành lại đắt Với nhu cầu thị trường ngày lớn, công ty dược Việt Nam nghiên cứu sản xuất chế phẩm thuốc đối quang kể Vì vậy, cần phải xây dựng quy trình tách đồng phân đối quang hoạt chất để từ kiểm độ tinh khiết đối quang đồng phân dexlansoprazol Đã có nhiều nghiên cứu phân tích đồng phân quang học lansoprazol áp dụng phương pháp phân tích đại sắc ký lỏng ghép đầu dò khối phổ, điện di mao quản, Tuy nhiên, có số nghiên cứu thực phương pháp thông thường sắc ký lỏng hiệu cao đầu dò UV sử dụng cột pha tĩnh bất đối, kỹ thuật có tính ứng dụng cao với nguyên tắc hoạt động đơn giản đạt yêu cầu độ nhạy, độ ổn định phổ biến phịng thí nghiệm Trong đề tài này, q trình phân tích đồng phân quang học hoạt chất lansoprazol kỹ thuật HPLC thực theo hai hướng tiếp cận khác nhau: sử dụng pha động có chứa tác nhân đối quang nhóm cyclodextrin sử dụng cột pha tĩnh bất đối 71 Lux cellulose Dựa vào chất hai hướng tiếp cận này, đề tài nghiên cứu yếu tố khác ảnh hưởng đến khả phân tích đồng phân lansoprazol để từ xây dựng hai quy trình định lượng Quy trình phân tích đồng phân sử dụng pha động có chứa tác nhân đối quang chịu ảnh hưởng nhiều yếu tố khác khảo sát nghiên cứu: - Loại cột sắc ký: Trong nghiên cứu, khảo sát loại cột Gemini C8 (150 x 4,6 mm; µm), Gemini NX C18 (150 x 4,6 mm; µm) Gemini C18 (150 x 4,6 mm; µm) Kết thực nghiệm cho thấy cột Gemini NX C18 (150 x 4,6 mm; µm) tách pic với thời gian lưu ngắn độ phân giải cao lựa chọn để tiếp tục khảo sát Điều lý giải cấu trúc lansoprazol có nhóm phân cực amin sulfoxid nên tương tác với hạt pha tĩnh cột C8 nhiều so với hạt pha tĩnh cột C18 Vì vậy, thời gian lưu lansoprazol cột C8 dài so với thời gian lưu lansoprazol cột C18 Hình 4.1 Cấu tạo hạt pha tĩnh cột Gemini NX C18 (150 x 4,6 mm; µm) cột Gemini C8 (150 x 4,6 mm; µm) Giữa cột Gemini NX C18 (150 x 4,6 mm; µm) cột Gemini C18 (150 x 4,6 mm; µm) nhận thấy thời gian lưu lansoprazol cột Gemini C18 (150 x 4,6 mm; µm) kéo dài Kích thước hạt cột Gemini C18 (3 µm) nhỏ so với kích thước hạt cột Gemini NX C18 (5 µm) làm tăng diện tích tiếp xúc chất phân tích với hạt pha tĩnh, làm tăng khả tương tác chất phân tích hạt pha tĩnh dẫn đến kéo dài thời gian lưu chất phân tích cột 72 - Tác nhân đối quang: Đề tài thử nghiệm khả phân tích lansoprazol cách khảo sát tác nhân đối quang nhóm cyclodextrin Khi cho loại tác nhân vào dung dịch đệm nhằm mục đích kết hợp với hai đồng phân đối quang hoạt chất để hình thành hai sản phẩm đối quang, dẫn đến khác biệt tính chất vật lý hóa học nhiều hơn, tách chúng khỏi điều kiện sắc ký lỏng bình thường Với tác nhân đối quang khảo sát β-CD, HP-β-CD ¸ M-βCD, SBE-β-CD có SBE-β-CD (anion CD) phù hợp cho phân tách đồng phân lansoprazol Điều lý giải khơng có khác biệt lớn số tạo phức (S)-lansoprazol dexlansoprazol ((R)-lansoprazol) với tác nhân đối quang β-CD dẫn chất bao gồm β-CD, HP-β-CD¸ M-β-CD Các tác nhân β-CD, HPβ-CD¸ M-β-CD tương tác với lansoprazol chủ yếu thơng qua tương tác kỵ nước liên kết hydro rìa phân tử CD Mặt khác, cấu trúc lansoprazol lại cồng kềnh, vòng benzimidazol vòng pyridin bên cạnh trung tâm bất đối gây cản trở không gian làm cho lansoprazol khó tương tác với tác nhân Chỉ có tác nhân SBE-β-CD phù hợp để phân tích đồng phân lansoprazol tạo thành phức bao không nhờ tương tác kỵ nước liên kết hydro tác nhân lại mà chủ yếu liên kết tĩnh điện Do đó, tạo nên khác biệt lớn số tạo phức SBE-β-CD với (S)-lansoprazol dexlansoprazol dẫn đến khác biệt thời gian lưu hai phức tạo thành SBE-β-CD-(S)-lansoprazol SBE-β-CD-dexlansoprazol - Nồng độ tác nhân đối quang: Khi gia tăng nồng độ tác nhân đối quang SBE-β-CD từ 2,5 mM đến 15,0 mM độ phân giải hai đồng phân quang học lansoprazol tăng lên Có thể giải thích, nồng độ SBE-β-CD thấp 2,5 mM 5,0 mM độ phân giải thấp nồng độ tác nhân thấp không đủ tương tác tạo phức bao với hoạt chất lansoprazol Ngoài ra, nghiên cứu nhận thấy thời gian phân tích kéo dài tăng nồng độ SBE-β-CD Nguyên nhân tăng tương tác lansoprazol với SBE-β-CD, tăng nồng độ phức bao SBE-β-CD-lansoprazol dẫn đến tăng tương tác phức bao SBE-β-CD-lansoprazol với pha tĩnh nên phức di chuyển chậm Mặt khác, tăng nồng độ SBE-β-CD làm tăng độ nhớt dung dịch, góp phần gia tăng thời gian phân tích Vì vậy, tăng SBE-β-CD q nhiều 73 khơng tốt cho cột nên khơng thể tối ưu hóa hệ số phân giải cách tăng nồng độ tác nhân đối quang SBE-β-CD cao Trong đó, tăng từ nồng độ 7,5 mM lên nồng độ 10,0 mM, hai pic đồng phân tách hoàn toàn tăng từ 10,0 mM lên 15,0 mM thấy thời gian phân tích tăng đáng kể (gần phút) xuất hiện tượng dỗn pic Vì lý trên, nghiên cứu lựa chọn tác nhân sulfobutyl ether-βcyclodextrin (SBE-β-CD) với nồng độ 10,0 mM cho phân tích - pH pha động: thông số quan trọng phân tách đồng phân pH ảnh hưởng đến độ phân giải thời gian di chuyển pic đồng phân Tại pH thấp, nhóm amin lansoprazol bị proton hóa tạo thành cation tương tác mạnh với nhóm sulfat SBE-β-CD mức độ phân ly bị ảnh hưởng đáng kể độ pH dung dịch nước Tuy nhiên, dung dịch nước với pH thấp có ảnh hưởng bất lợi cột hệ thống sắc ký sử dụng Trong nghiên cứu này, giá trị pH chọn 2,5 cho cơng việc phân tích - Nồng độ đệm NaH2PO4: Natri dihydrophosphat ảnh hưởng đến hình thành tạo phức tác nhân đối quang lansoprazol, ảnh hưởng đến độ phân giải thời gian phân tích Ảnh hưởng đệm NaH2PO4 khảo sát với nhiều nồng độ khác nhau, kết nồng độ 10,0 mM tốt nhất, tạo độ phân giải thời gian phân tích hợp lý - Tỷ lệ pha động: ảnh hưởng tỷ lệ pha động lên phân tách đồng phân tương tự ảnh hưởng nồng độ tác nhân đối quang Tỷ lệ pha động ACN: dung dịch đệm SBE-β-CD (30:70, tt/tt) (25:75, tt/tt) không tách đồng phân lansoprazol nồng độ tác nhân SBE-β-CD thấp, không đủ để tạo phân tách phức bao SBE-βCD-(S)-lansoprazol SBE-β-CD-dexlansoprazol Ba tỷ lệ lại phân biệt hai dạng đồng phân Trong tỷ lệ pha động pha động ACN: dung dịch đệm SBE-βCD (20:80, tt/tt) có thời gian lưu hợp lý độ phân giải cao nên lựa chọn Bên cạnh đó, q trình phân tích đồng phân sử dụng cột pha tĩnh bất đối Lux cellulose khảo sát ảnh hưởng yếu tố khác gồm: 74 - Loại cột cellulose: Trong loại cột Lux cellulose (Lux cellulose-1, Lux cellulose-2, Lux cellulose-3) khảo sát có cột Lux cellulose-1 nhận thấy phân tách đồng phân lansoprazol Lux Cellulose-1 loại cellulose carbamat (cellulose tris(3,5-dimethylphenyl carbamat), dẫn xuất phenylcarbamat hóa từ cellulose nghiên cứu dùng phân tích đồng phân Sự phân tách đồng phân lansoprazol cột Lux cellulose-1 có độ phân giải cao thời gian phân tích nhanh nên chọn khảo sát để so sánh với phương pháp sử dụng cột pha đảo có chứa tác nhân đối quang - Tỷ lệ pha động: Khảo sát nhiều tỷ lệ pha động n-hexan: IPA khác Bốn tỷ lệ khảo sát n-hexan: IPA (95:5); n-hexan: IPA (90:10); n-hexan: IPA (95:5) nhexan: IPA: acid formic (80:20:0,1) phân biệt hai dạng đồng phân, tỷ lệ n-hexan: IPA: acid formic (80:20:0,1) có độ phân giải cao, thời gian lưu hợp lý hệ số đối xứng phù hợp Khi thêm acid formic vào pha động, nhận thấy hệ số bất đối cải thiện đáng kể Do đó, tỷ lệ pha động lựa chọn n-hexan: IPA: acid formic (80:20:0,1) So sánh quy trình sắc ký lỏng sử dụng pha động có chứa tác nhân đối quang SBE-βCD quy trình sử dụng cột sắc ký Lux cellulose-1 Bảng 4.1 So sánh thông số sắc ký sử dụng pha động có chứa tác nhân đối quang SBE-β-CD quy trình sử dụng cột sắc ký Lux cellulose-1 Quy trình Thời gian lưu (phút) Rs As Sử dụng pha động chứa tác nhân đối quang 23,28 1,654 0,980 Cột sắc ký Lux cellulose-1 11,33 3,880 1,450 LOD (µg/ml) 0,10 µg/ml 0,10 µg/ml Cả hai quy trình phân tích xây dựng có phần thẩm định phương pháp đạt tính phù hợp hệ thống, có tính đặc hiệu, có khoảng tuyến tính rộng hệ số tương quan cao, độ xác đạt yêu cầu, độ với tỷ lệ phục hồi cao Xét thời gian phân tích, phương pháp sử dụng cột pha tĩnh bất đối cho thời gian lưu cúa pic đồng phân lansoprazol ngắn (khoảng 10-12 phút) so với phương pháp sử dụng pha động chứa 75 tác nhân đối quang (khoảng 22-25 phút) Tuy nhiên, phương pháp sử dụng pha động chứa tác nhân đối quang thực loại cột sắc ký phổ biến phịng thí nghiệm C8, C18; phương pháp sử dụng cột pha tĩnh bất đối đòi hỏi loại cột sắc ký chuyên biệt với giá thành cao sử dụng phân tích thường quy Do đó, tùy theo điều kiện trung tâm nghiên cứu, viện khoa học trường đại học, lựa chọn phương pháp phân tích phù hợp với đơn vị Đề tài mở rộng cách nghiên cứu ứng dụng quy trình phân tích đồng phân lên loại cột pha tĩnh bất đối khác (bên cạnh cột Lux cellulose) để phù hợp với điều kiện sở vật chất sẵn có đơn vị nghiên cứu Đề tài tiến hành thêm hướng phân tích đồng phân lansoprazol phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao sử dụng pha động chứa tác nhân đối quang khác nhóm β-cyclodextrin Bên cạnh đó, thử nghiệm phân tích đồng phân quang học lansoprazol phương pháp điện di cột mao quản phủ silica Từ phương pháp phân tích khác có so sánh ưu, nhược điểm phương pháp để vận dụng công tác kiểm tra quản lý chất lượng thuốc Mỗi phương pháp có điều kiện phân tích khác với độ nhạy, giới hạn phát hiện, giới hạn phân tích, khoảng tuyến tính khác Tùy theo loại mẫu phân tích khác lựa chọn phương pháp phù hợp 76 CHƯƠNG – KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 KẾT LUẬN Sau thời gian thực đề tài, thu kết sau: - Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến tách đồng phân quang học lansoprazol phương pháp HPLC hai hướng tiếp cận: sử dụng pha động có chứa tác nhân đối quang sử dụng cột pha tĩnh bất đối Lux cellulose - Xây dựng hai quy trình định lượng đồng phân quang học lansoprazol tương ứng - Thẩm định hai quy trình định lượng xây dựng - Ứng dụng quy trình để định lượng chế phẩm lưu hành thị trường Bằng phương pháp HPLC sử dụng pha động có chứa tác nhân đối quang, tiến hành xây dựng thẩm định quy trình phân tích đồng phân quang học lansoprazol với điều kiện sau: cột sắc ký Gemini NX C18, chiều dài 150 mM, đường kính 4,6 mm, kích thước hạt µm Pha động acetonitril – dung dịch đệm NaH2PO4 10 mM có chứa 10,0 mM SBE-β-CD, pH 2,5 (80:20, tt/tt) Tốc độ dịng ml/phút, nhiệt độ 30oC, thể tích tiêm mẫu 10 µl, bước sóng phát 285nm Quy trình có tính đặc hiệu, độ xác độ lặp cao Bên cạnh đó, đề tài nghiên cứu phương pháp phân tích đồng phân quang học lansoprazol HPLC sử dụng cột Lux cellulose Quy trình phân tích xây dựng thẩm định với điều kiện phân tích sau: cột sắc ký Lux Cellulose-1, chiều dài 250 mM, đường kính 4,6 mm, kích thước hạt µm Pha động n-hexan: IPA: acid formic (80:20:0,1, tt/tt/tt) Tốc độ dịng: ml/ phút, thể tích tiêm mẫu: 10 µl, nhiệt độ cột: 30oC, bước sóng phát hiện: 285 nm Quy trình có tính đặc hiệu, độ xác độ lặp cao 77 5.2 KIẾN NGHỊ - Nếu có điều kiện tiếp tục nghiên cứu, đề nghị ứng dụng phương pháp HPLC để phân tích chế phẩm đồng phân hoạt chất khác lưu hành thị trường Từ đề cách thức để kiếm tra chất lượng thuốc đồng phân định lượng hàm lượng tạp đồng phân chế phẩm - Đồng thời, đề nghị thử nghiệm phương pháp điện di mao quản (CE) phân tích đồng phân lansoprazol Từ đó, ứng dụng quy trình phân tích đồng phân lansoprazol phương pháp điện di sở phân tích có trang bị thiết bị đưa nhận xét ưu, nhược điểm hai phương pháp phân tích HPLC CE điều kiện định 78 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Bộ Y Tế (2012), Dược thư quốc gia Việt Nam Hà Nội: Nhà xuất Y học, Hà Nội Bộ Y Tế (2017), “Lansoprazol”, Dược điển Việt Nam V, Nhà xuất Y học, Hà Nội Đặng Như Tại (2012), Hóa học hữu ( tập 1), Hà Nội: Nhà xuất Y học Hoàng Minh Châu, Từ Văn Mặc, Từ Vọng Nghi (2002), Cơ sở hóa học phân tích hóa lý, Nhà xuất khoa học kỹ thuật, Hà Nội, Chương 14 Nguyễn Đình Triệu (2001) Các phương pháp phân tích vật lý hố lý (tập 1), Nhà xuất khoa học kỹ thuật Phạm Thị Cúc, Vũ Tiến Chin (2005), Vật lý đại cương, Trường Đại học Dược Hà Nội, tr.247-253 Trương Thế Kỷ (2006), Hóa hữu cơ- Hợp chất hữu đơn chất đa chức, Nhà xuất Y học, Hà Nội Vĩnh Định, Võ Thị Bạch Huệ (2019), Hóa phân tích (tập 1), Nhà xuất Y học, TP Hồ Chí Minh Vĩnh Định, Võ Thị Bạch Huệ (2019), Hóa phân tích (tập 2), Nhà xuất Y học, TP Hồ Chí Minh 10 Vĩnh Định, Đặng Văn Hòa (2011), Kiểm nghiệm thuốc, Nhà xuất Giáo dục Việt Nam, TP Hồ Chí Minh 11 Thơng tư 32/2018/TT-BYT Kỹ thuật viên 12 tháng 11 năm 2018 Bộ Y tế Quy định việc đăng ký lưu hành thuốc, nguyên liệu làm thuốc, phụ lục “Bộ hồ sơ kỹ thuật chung Asean (ACTD) hướng dẫn kỹ thuật: Hướng dẫn Asean thẩm định quy trình phân tích”, Hà Nội 12 Bộ Y tế (2018), Thông tư 04/2018/TT-BYT ban hành ngày 09 tháng 02 năm 2018 Quy định Thực hành tốt phịng thí nghiệm, phụ lục 1, Hà Nội 13 Bộ Y tế (2018), Thông tư 11/2018/TT-BYT ban hành ngày 04 tháng 05 năm 2018 Quy định chất lượng thuốc, nguyên liệu làm thuốc, Hà Nội Tiếng Anh 14 A Van Eeckhaut, Y Michotte (2009), Chiral Separations by Capillary Electrophoresis, CRC Press, EEUU 15 Ana R Ribeiro et al., (2014), "Enantioseparation of chiral pharmaceuticals in biomedical and environmental analyses: An overvew", Journal of Chromatography B 16 Bezhan Chankvetadze, (1997), Capillary Electrophorensis in Chiral Analysis, Wiley 17 BP (2019), Validation of analytical procedure and chromatographic separation techniques 18 C García-Ruiz, M.L Marina, (2005), “Chiral analysis by capillary electrophoresis”, Analysis and detection by Capillary Electrophoresis, Elsevier, Amsterdam, pp 617692 19 Cayen MN (1991), “Racemic mixtures and single stereoisomers: Industrial concerns and issues indrug development”, Chirality, vol 3, pp 94- 98 20 Challener CA, (2001), "Overview of chirality”, Chiral drugs, Ashgate Publisher, pp 3-14 21 Corradini D et al (2010), “Chiral mobile phase additives”, Handbook of HPLC, 2(3), pp 677 22 Escuder-Gilabert L et al., "Cyclodextrins in capillary electrophorensis," Journal of Chromatography A, vol 1357, pp 2-23, 2014 23 European Medecines Agency (1997), "Investigation of chiral active substances European Union guidelines" 24 Food and Drug Administration (1992), "FDA's policy statement for the development of new stereoisomeric drugs", US Food and Drug Administration regulatory guidance 25 G Castaneda Penalvo, R.M Rodrıguez Dorado., J Berzas Nevado (2005), "Method development and validation for the separation and determination of omeprazol", Analytica Chimica Acta, vol 533, pp 127-133 26 G.K.E Scriba (2008), "Cyclodextrins in capillary electrophoresis enantioseparations - Recent developments and applications", Journal of Separation Science, vol 31, pp 1991-2011 27 Guo-Qiang Lin, Qi-Dong You, Jie-Fei Cheng (2011), Chiral Drugs: Chemistry and Biological Action, Wiley, pp 21-24 28 Health Canada, (2000), "Stereochemical issues in chiral drug development," Health Canada guidance document 29 Hua He, Chuong Pham Huy Lien Ai Nguyen (2006), “Chiral Drugs: An Overview”, International journal of Biomedical science, vol 2, pp 85-100 30 ICH Q2B (R1) Validation of Analytical Procedures (1996), ICH (International Conference on Harmonisation) 31 ICH Harmonised tripartite guideline (2005), “Validation of analytical procedures: text and methodology”, pp – 13 32 Indra K Reddy, Reza Medvar (2011), “Effects of crystal structure and physical properties on the release of chiral drugs”, Chirality in drug design and development, pp 13-18 33 Jin Guan et al., (2014), "Optimization and validation of a novel CE method for the enantioseparation of pantoprazole and related benzimididazole using a dual chiral selector system", Electrophorensis, pp 1-7 34 Jos Hoogmartens, Ann Van Schepdael, Pham Thi Thanh Ha, (2006), "Recent advances in pharmaceutical applications of chiral capillary electrophoresis," Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, vol 41, pp 1-11 35 Juon Jose et al., (2009), "Optimisation and validation of a new CE method for the determination of lansoprazole enantiomers in pharmaceuticals", Electrophorensis, pp 2940-6 36 L Escuder-Gilabert, Y Martin-Biosca, M.J Medina-Hernandez, S Sagrado (2014), “Cyclodextrins in capillary electrophoresis: Recent developments and new trends”, Journal of Chromatography A, vol 1357, pp 2-23 37 Lajos Attila Papp, Gabriel Hancu et al (2019), “Chiral separation of lansoprazole and rabeprazole by capillary electrophoresis using dual cyclodextrin systems”, Electrophorenis, vol 05, pp 1-7 38 Liu RH Liu JT, (2002), "Enantiomeric composition of abused amine drugs: chromatographic methods of analysis and data interpretation", Journal of Biochemical and Biophysical Methods, vol 54, pp 115-146 39 Marzo A (1993), “How incoming guidelines on chiral drugs could impact on the international scenery of drug development”, Boll Chim Farm, vol 132, pp 267 271 40 Miura M et al (2004), “Simultaneous determination of lansoprazole enantiomers and their metabolites in plasma by liquid chromatography with solid-phase extraction”, Journal Of Chromatography B-Analytical Technologies In The Biomedical And Life Sciences, 804(2), pp 389-95 41 Nuggehally R Srinivas et al (2001), “Enantiomeric drug development: issues, considerations and regulatory requirements”, Enantiomeric drug development, journal of pharmaceutical sciences, vol 90, pp 1205-1215 42 P Balamurugan et al (2015), “A simple RP-HPLC method for simultaneous estimation of organic impurities and assay of dexlansoprazole”, International Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, 7(9), pp 347-352 43 P Rezanka, K Navratilova, M Rezanka, V Kral, D Sykora (2014), “Application of cyclodextrins in chiral capillary electrophoresis”, Electrophoresis 35, pp 27012721 44 Rumiko Shimazawa, (2007), "Recent state of new chiral drugs development and review", Journal of Health Science, vol 54, pp 23-29 45 Sean C Sweetman, Ed., (2012), Martindale, 36th edion, Pharmaceutical Press, USA 46 Z.A Al-Othman, A Al-Warthan, S.D Alam, I Ali (2014), “Enantio-separation of drugs with multiple chiral centers by chromatography and electrophoresis”, Biomedical Chromatography, vol 28, pp 1514-152 capillary ... trình phân tích đồng phân quang học lansoprazol kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu cao sử dụng pha động chứa tác nhân đối quang ─ Xây dựng thẩm định quy trình phân tích đồng phân quang học lansoprazol kỹ thuật. .. quy trình phân tích đồng phân quang học lansoprazol với nhiều khả ứng dụng vào thực tiễn, đề tài ? ?Nghiên cứu phân tích đồng phân quang học lansoprazol sử dụng kỹ thuật sắc kí lỏng hiệu cao? ?? thực... nước nghiên cứu tách đồng phân quang học lansoprazol Cịn phạm vi nước chưa có đề tài thực phân tích đồng phân quang học hoạt chất lansoprazol, đặc biệt sử dụng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu cao với