Định lượng đồng thời l carnitin và acid alpha lipoic trong thuốc viên bằng sắc ký lỏng khối phổ (LC MS) Định lượng đồng thời l carnitin và acid alpha lipoic trong thuốc viên bằng sắc ký lỏng khối phổ (LC MS) Định lượng đồng thời l carnitin và acid alpha lipoic trong thuốc viên bằng sắc ký lỏng khối phổ (LC MS) Định lượng đồng thời l carnitin và acid alpha lipoic trong thuốc viên bằng sắc ký lỏng khối phổ (LC MS) Định lượng đồng thời l carnitin và acid alpha lipoic trong thuốc viên bằng sắc ký lỏng khối phổ (LC MS) Định lượng đồng thời l carnitin và acid alpha lipoic trong thuốc viên bằng sắc ký lỏng khối phổ (LC MS) Định lượng đồng thời l carnitin và acid alpha lipoic trong thuốc viên bằng sắc ký lỏng khối phổ (LC MS) Định lượng đồng thời l carnitin và acid alpha lipoic trong thuốc viên bằng sắc ký lỏng khối phổ (LC MS) Định lượng đồng thời l carnitin và acid alpha lipoic trong thuốc viên bằng sắc ký lỏng khối phổ (LC MS) Định lượng đồng thời l carnitin và acid alpha lipoic trong thuốc viên bằng sắc ký lỏng khối phổ (LC MS) Định lượng đồng thời l carnitin và acid alpha lipoic trong thuốc viên bằng sắc ký lỏng khối phổ (LC MS) Định lượng đồng thời l carnitin và acid alpha lipoic trong thuốc viên bằng sắc ký lỏng khối phổ (LC MS) Định lượng đồng thời l carnitin và acid alpha lipoic trong thuốc viên bằng sắc ký lỏng khối phổ (LC MS) Định lượng đồng thời l carnitin và acid alpha lipoic trong thuốc viên bằng sắc ký lỏng khối phổ (LC MS) Định lượng đồng thời l carnitin và acid alpha lipoic trong thuốc viên bằng sắc ký lỏng khối phổ (LC MS) Định lượng đồng thời l carnitin và acid alpha lipoic trong thuốc viên bằng sắc ký lỏng khối phổ (LC MS) Định lượng đồng thời l carnitin và acid alpha lipoic trong thuốc viên bằng sắc ký lỏng khối phổ (LC MS) Định lượng đồng thời l carnitin và acid alpha lipoic trong thuốc viên bằng sắc ký lỏng khối phổ (LC MS) Định lượng đồng thời l carnitin và acid alpha lipoic trong thuốc viên bằng sắc ký lỏng khối phổ (LC MS)
Trang 1BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
VŨ THỊ HẠNH YẾN
ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI L-CARNITIN VÀ
ACID ALPHA LIPOIC TRONG THUỐC VIÊN BẰNG SAC KY LONG KHOI PHO LC-MS (KHOA LUAN TOT NGHIEP DUGC SY DAI HOC KHOA 2003-2008)
Người hướng din : TS Trần Việt Hùng
Trang 2
-ĐƠ2 @c#/ Œ
2 hồn thành được khố luận tốt nghiệp này, trước hết em xin bày tỏ
lòng biết ơn sâu sắc tới TS Trần Việt Hùng, người đã trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo cho em trong suốt thời gian qua
#m xin chân thành cảm ơn PGS.TS Thái Duy Thìn, người đã định hướng và luôn nhiệt tình giúp đỡ em trong suốt thời gian em học tập tại trường và làm
khoá luận này
#m xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban giám đốc Viện Kiểm Nghiệm Thuốc Trung Ương và toàn thể cán bộ Khoa Vật lý đo lường-Viện Kiểm Nghiệm
Thuốc Trung Ương đã luôn giúp đỡ và tạo điều kiện cho em trong quá trình thực hiện luận văn
#m cũng xin chân thành gửi lời cảm ơn Ban giám hiệu, các thầy cô trường Đại học Dược Hà Nội, các thầy cô và cán bộ Bộ môn Hóa Dược, Bộ môn Hóa phân tích đã dạy dỗ, đìu dắt, giúp đỡ em rất nhiều trong quá trình học tập và
nghiên cứu
#m xin cảm ơn DS Lê Phương Chi người đã giúp đỡ em rất nhiệt tình trong thời gian làm khoá luận tốt nghiệp
Cuối cùng em vô cùng biết ơn gia đình, bạn bè đã luôn ở bên động viên và
giúp đỡ em trong thời gian học tập tại trường và hoàn thành tốt nhất khoá luận
`
này
Hà Nội, ngày 21 tháng 05 năm 2008
Trang 3MỤC LỤC TRANG PHỤ BÌA LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC DANH MỤC CÁC CHU VIET TAT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH Trang TT No Brii=-.==>.-=" Ố I NHÀN T, TỔ NG Ga eieiiaaesaaocleenksauTn 3
1.1 Tổng quan về L-Carnitin và Acid Alpha-lipoic - s 3
ki 1 1 li suugu gái cdvasxeecsseebsvadogebi tu Eeeaesose ri 3
1,1 z2 Acid Alpina Lote iv csssisisssncavssincasnunsnnasensonacagieasarstepnebeps ectsuaseesousavas 7
1.2 Tổng quan vé sdc ky long KhOi PlhO ccccccsccsescesecsesessesessesssacevens 12 1.2.1 Một số nét sơ lược về sắc ký lỏng khối phổ .- -. 12 122,2, THIẾT Dị 850 ký lòng Khối phổ osvacoeaeoiuelEiol GA, 13
Ue te) EW SOE Lok oe WS da aeeeeieaae Co ra 7“ 17
PHAN 2 THUC NGHIEM VÀ KẾT QUẢ 18
2.1 Nguyên vật liệu nghiên cứu và phương phap thuc nghiém 18 eo Lc PN RUVER VEE HỆU NGHIÊN CỮU 5 sisscvsesocesesaccoscatesnsniees lacheceoveeecevdcncsiosi 18 Be eee k UCTS PRIAD THATCH CUO cán eo eeeeesdEveeee 19
2.2 Két quả thực nghiệm và nhận xét 22
PRA a RIAN Wh SAE tuaccgaoaxxeriiresnaeuznnilS =ecixaeai 22 2.2.2 Tối ưu hoá điều kiện khối phổ đối với L-Carnitin và Acid Alpha
Trang 42.2.3 Xây dựng chương trình sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS) để định tính
và định lượng L-Carnitin và Acid Alpha LIpoIc - «5: 25
2.2.4 Đánh giá sự phù hợp của hệ thống LC-MS .- 28 áo Bàn THỆ tán b1 ga tac ko bia kxcessseksiaoessaucoosrE TC eae 35 2.3.1 Về phương pháp phân ch LMS cceeeieooice 35
2.3.2 Kết quả khảo sát một số mẫu thuốc có chứa L-Carnitin, Acid
Alpha Lipoic bằng sắc ký lỏng khối phổ - 2 + 2s szss=xz 39
PHAN 3 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤTT -ccvcccrzrrrrrte 40
TT ïjnÏ —_ =.e====.ẽ.: 40
TT TƯ Hán iiiiiesendiessex=svyadiTiTEn 41
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Trang 5AAL ADN AMU APCI CAT CoA CTSK DD ESI FAD FID GC-MS HDL - HPLC HPLC-CEAD: LC-MS LOD LOQ NAD' SCD SIM SKĐ TIC TPP USP
DANH MUC CAC CHU VIET TAT
Acid Alpha Lipoic
Acid Deoxyribo Nucleotid Atomic Mass Unit
(Don vị nguyên tử lượng)
Atmospheric pressure chemical iozonization (Kỹ thuật ion hóa hóa học ở áp suất thường) Carnitin acetyltransferase Coenzym A Chuong trinh sac ky Dung dich Electrospay ionization
(Kỹ thuật ion hóa bằng phun điện tử)
Flavin Adenin Dinucleotid Flame Ionization Detector (Detector ion hoá ngọn lửa)
Gas Chromatography-Mass Spectrometry
(Sắc ký khí ghép khối phổ)
High Density Lipoprotein
(Lipoprotein ti trong cao)
High Performance Liquid Chromatography
(Sắc ký lỏng hiệu nang cao)
High Performance Liquid Chromatography- - Coulometric Electrode Array Detector
(Sắc ký lỏng ghép detector đo điện tích mảng điện cực)
Liquid chromatography- Mass spectrometry (Sắc ký lỏng ghép khối phổ) Limit of detection (Giới hạn phát hiện) Limit of quantitation (Giới hạn định lượng)
Nicotinamid Adenin Dinucleotid Primary Systemic Carnitin Deficiency
(Thiếu hụt Carnitin nguyên phát trong tuần hoàn)
Trang 6DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1 Quá trình vận chuyển Acyl CoA qua màng ty thể bởi Carnitin 4
Hình 1.2 Quá trình khử carboxyl oxy hoá œ-cetoglutarat thành Succinyl CoA VI S0 FAN đi Ga loi Nga eeeeeeieeesireeeaeoll E1 8
Hình 1.3 KY thuat Electrospray Íonization: .- - «5< <ss << zzzse 15
Hình 2.4 Máy sắc ký lỏng kh6i phé (LC-MS) Thermo-Finnigan 18
LCQ PVA ARS MOR a ccss caccvansctaconcassnccsuctsenesweteaniousins +sssýcS5<ES04066603054c9Xi5asisrei 18
Hình 2.5 SKĐ của dung dịch thử L-Carnitin 10 kig/mlH <5 - 26 Hình 2.6 SKĐ của dung dịch Acid Alpha Lipoic 10 kg/m]l 27 Hình 2.7 SKĐ của dung dịch L-Carnitin 10 g/ml va Acid Alpha Lipoic 5
Hình 2.5 Tương quan hồi qui tuyến tính giữa điện tích píc và nồng độ của các dung dịch chuẩn L-Carnitin (1-20 tug/ml) phân tích theo CTSK 1 30
Hình 2.6 Tương quan hồi qui tuyến tính giữa diện tích píc và nồng độ của các
dung dich chudn L-Carnitin (1-20 pg/ml) phan tích theo CTSK 3 31
Hinh 2.7 Tuong — hồi quy tuyến tính giữa điện tích píc và nding độ của các dung dich chuan Acid Alpha Lipoic (1-20 pg/ml) phan tich theo CTSK 2
Trang 7
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2.1 Kết quả khảo sát độ lặp lại và độ tuyến tính của L-Carnitin kiểm tra
sĩ phù hợp của hệ thống thÐo CS c0 0aecsoedcaeiopes 29
Bảng 2.2 Kết quả khảo sát độ lặp lại và độ tuyến tính của L-Carnitin kiểm tra
sự phù hợp của hệ thống theo TS 3 - «5< sssssxs.xeseeeeesezezxe 30
Bảng 2.3 Kết quả khảo sát độ lặp lại và độ tuyến tính của Acid Alpha Lipoic
kiểm tra sự phù hợp của hệ thống theo CTSK 2 < -c<c<csces 31
Bảng 2.4 Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp theo CTSK 3 (mẫu
Vi or RIND) dao iễcc gu bnssadzeeceesnassarEe 33
Trang 8ĐẶT VẤN ĐỀ
Khoa học công nghệ hiện đại đã mang lại cho nên Y học thế giới nhiều
thành tựu, giúp con người chữa trị nhiều căn bệnh nguy hiểm đe doạ sức khoẻ
và cuộc sống của họ Cuộc sống càng phát triển, nhu cầu của con người ngày
càng lớn, cơ thể con người càng cần nhiều năng lượng để tiêu tốn cho những hoạt động lao động trí óc, lao động chân tay, hoạt động thể dục thể thao Một
trong các nguồn năng lượng sống này được lấy từ sự thoái hoá acid béo trong
cơ thể Khi các hormon báo hiệu cần năng lượng cho cơ thể, triglycerid dự trữ
ở các tổ chức mỡ được thoái hoá và vận chuyển tới các tổ chức (cơ, xương,
tim, thận ), ở đó các acid béo có thể được oxy hoá tạo năng lượng
Tuy nhiên, chính môi trường sống hiện đại và chế độ sinh hoạt bất hợp lý cũng là nguyên nhân gây ra nhiều căn bệnh cho con người Các gốc tự do
sinh ra trong quá trình sản xuất năng lượng của tế bào, nhưng cũng có thể là sản phẩm tạo ra từ sự ô nhiễm môi trường, dùng rượu bia, hút thuốc lá, dùng
thuốc, tiếp xúc với tia cực tím, thậm chí do cả những chấn thương tâm lý
Theo nghiên cứu, mỗi tế bào trong cơ thể chúng ta phải hứng chịu khoảng
10.000 gốc tự do tấn công mỗi ngày Rất nhiều trong số đó nhằm vào ADN và các chất liệu di truyền Thêm vào đó, màng tế bào, protein và mỡ cũng bị tấn
công Trải qua 70 năm cuộc đời, cơ thể hình thành ước chừng đến 17 tấn gốc
tự do Đây chính là thủ phạm làm sai lệch cấu trúc và rối loạn thông tin trên
những phân tử sinh học, vật chất di truyền và tế bào Từ đây là nguyên nhân
của các quá trình bệnh lý, ung thư, lão hoá, và cái chết theo chương trình
Vì mục tiêu sức khoẻ con người, các nhà khoa học đã không ngừng nghiên cứu và tìm ra những hợp chất có vai trò quan trọng trong sản sinh năng lượng sống, trung hoà và loại bỏ các gốc tự do, giúp con người chống lại quá
trình lão hoá, bệnh lý, chống lại mệt mỏi và tăng cường thể lực L-Carnitin và
Trang 9chuyển hoá chất béo bằng cách giúp oxy hoá acid béo trong tế bào để tạo ra năng lượng Acid Alpha Lipoic là chất chống oxy hoá, ngăn ngừa sự tổn hại tế
bào gây ra bởi các gốc tự do, chống viêm, chống khối u, chống lão hoá
Trên thị trường dược phẩm hiện nay đã bắt đầu xuất hiện nhiều sản
phẩm chứa L-Carnitin hoặc Acid Alpha Lipoic hoặc đồng thời cả hai thành
phần này như: VIMESOL”, METABOSOL (Invenmed Group); CARNITIN TA” (Công ty Thiên Niên Kiện); TOPLIFE FAT REMOVE” (Công ty Dược
phẩm OPV) Các chế phẩm này có thành phần hết sức phức tạp Để định tính
và định lượng riêng từng hoạt chất, một số phương pháp đã được đề nghị Tuy
nhiên trên thực tế chưa có một phương pháp thực sự tối ưu để định lượng đồng thời hai chất này Trong khi đó, sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS) là một phương
pháp có độ nhạy, độ chính xác cao, đã được khảo sát phân tích riêng từng
thành phần
Xuất phát từ những lý do trên, nhằm góp phần đảm bảo chất lượng
thuốc, chúng tôi thực hiện đề tài: “Định lượng đồng thời L-Carnitin và Acid
Alpha Lipoic trong thuốc viên bằng sắc ký lỏng khối phổ LC-MS" với ba mục
tiêu chính:
@ Xây dựng phương pháp định lượng đồng thời L-Carnitin và Acid Alpha
Lipoic bằng sắc ký lỏng khối phé LC-MS
© Đánh giá phương pháp đã xây dựng
Trang 10PHẦN 1 TỔNG QUAN
1.1 TỔNG QUAN VỀ L-CARNITIN VÀ ACID ALPHA-LIPOIC
1.1.1 L-Carnitin
a Dac điểm hoá lý [24], [26], [27] [30]
Tên hoá học: (R) - (3 - carboxy - 2 - hydroxy - N,N,N - trimethyl)- 1- propaminium hydroxyd Tên khác: Vitamin Br[24] Cơng thức hố học: CH; lea O | Set | — N— a — 0 — oa, Ce CH; CTPT: C;H,.NO, Phân tử lượng: 161,2 g/mol Tính chất vật lý: Trạng thái: Bột kết tính hoặc tỉnh thể màu trắng Dễ hút ẩm Nhiệt độ nóng chảy: 210°C - 212°C Năng suất quay cực:[ œ]p = - 23,90 Ty trong: 0,64 g/cm?
Độ tan: Tan hoàn toàn trong nước, tan trong cồn nóng Không tan trong Aceton, Ether ethylic, Benzen Dung dịch 5% trong nước có pH 5,5 - 9,5 b Vai tro va tac dung cua L-Carnitin [3], [16], [25], [30]
Carnitin được phát hiện ra vào năm 1905, từ đó đến nay, các nhà khoa học đã không ngừng có những nghiên cứu về nó Ngày càng nhiều những tác
Trang 11
dụng và vai trò của nó đối với sức khoẻ con người đã được chứng minh Một
số tác dụng kinh điển của L-Carnitin đã được biết đến là:
- Carnitin tham gia vào quá trình chuyển hoá của các acid béo:
+ Các acid béo chuỗi dài thoái hoá theo con đường j-oxy hoá Quá trình B-oxy hoá xẩy ra trong ty thể vì các enzym cần thiết cho sự P-oxy hoá
tập trung ở Matrix của ty thể, trái lại acyl CoA lại có nhiều ở tế bào chất.Các
acyl CoA lại không vượt qua được màng ty thể, như vậy sẽ có sự trở ngại cho
sự -oxy hoá Vấn đề được sáng tỏ khi ta biết sự B-oxy hoá acid béo được kích thích bởi Carnitin thông qua phản ứng ester hoá:
CH; Acyl carnitintransferase CH;
CH;—N—CH,—CH —COOH + RCOSCoA CH;—N—CH;-CH—CH;-COOH _+ CoASH
Hạ H Hạ O—R
Carnitin Acyl carnitin
Chiéu | xay ra 6 mat ngoai cla mang trong ty thé tức khu vực giữa hai màng của ty thể
Chiều 2 xảy ra ở mặt trong của màng trong ty thể (tức trong Matrix)
Acyl CoA chuỗi đài không qua được màng trong ty thể, trong khi đó
Acyl Carnitin có thể qua được dễ dàng Sau khi vào trong ty thể, Acyl Carnitin
giải phóng Carnitin và Acyl CoA Acyl CoA lúc này mới bắt đầu quá trình
B-oxy hoá
Trang 12
MATRIX
oO CPTI (Carnitine Palmitoy!Transferase 1) D> Translocase
© CPTI (Carnitine Palmitoy!Transferase II)
aT
Hình 1.1 Quá trình vận chuyển Acyl CoA qua màng ty thể bởi Carnitin + Ngoài ra, Carnitin còn tham gia vào quá trình tổng hợp acid béo: Quá trình tổng hợp acid béo xảy ra ở bào tương, trong khi đó Acetyl - CoA lại được tạo thành phân lớn ở ty thể do quá trình thoái hoá Glucid hoặc
Lipid Mang ty thể khong cho Acetyl - CoA đi qua, do đó nó cần có trung
gian vận chuyển là Carnitin thông qua phản ứng:
ị
Carnitin acety]
W transferase
AcetylCoA + Carnitin ——» Acetyl carnitin + CoASH
- Bổ sung L-Carnitin có thể giúp bảo vệ hoạt động của tim và những
chức năng có lợi cho tim L-Carnitin làm giảm tỷ lệ Triglycerid và nâng cao tỷ
lệ HDL - Cholesterol, khi lượng HDL - Cholesterol càng cao thì nguy cơ bị xơ vữa động mạch càng thấp
- Theo nhiều nghiên cứu đã được tiến hành, L-Carnitin có tác dụng làm tăng độ đáp ứng với Insulin ở những bệnh nhân đái tháo đường đã kháng Insulin, do đó cải thiện được tình trạng Glucose trong máu cao ở những bệnh
nhân đái tháo đường typ II
- L-Carnitin cũng được dùng trong những trường hợp thiếu hụt Carnitin
nguyên phát trong tuần hoàn (primary systemic Carnitin deficiency - SCD)
hoặc thiếu hụt Carnitin thứ phát
Trang 13
Chế phẩm VIMESOL? (Do Invenmed Group sản xuất theo bản quyền
Fuma Natural Co., USA; Garden Grove CA 92841 Số chứng nhận: 45139) Có chứa các thành phần L-Carnitin fumarat, Acid Alpha Lipoic , Nicotinamid,
Đông trùng hạ thảo Sự kết hợp các thành phần trong VIMESOL bổ trợ cho nhau, giúp kích thích các cơ chế tự nhiên để ổn định quá trình chuyển hoá của cơ thể và hạn chế tối đa tác dụng phụ
c Phương pháp phân tích L-Carnitin [1], [5], [14], [18], [20], [21], [27]
- Phương pháp phân tích acid amin: Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
sử dụng kỹ thuật tạo dẫn xuất trước cột (Thiết bị AMINOQUANT)
Nguyên tắc: Dẫn xuất hoá L-Carnitin bằng thuốc thử FMOC (9
fluorenyl methyl chlorofomate) Sau đó được cho qua cột sắc ký, L-Carnitin sẽ được rửa giải và đi ra khỏi cột, được phát hiện bởi detector Tín hiệu này được
chuyển tới máy ghi, ta có được sắc ký đồ Dựa vào độ lớn của pic (chiéu cao
hay diện tích pic), ta xác định được nồng độ của L-Carnitin trong mẫu thử
- Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), sử dụng detector huỳnh quang
Phương pháp này thường được áp dụng để định lượng Camitin trong
dịch sinh học (huyết tương hoặc nước tiểu) Dùng thuốc thử tạo huỳnh quang
để tạo dẫn chất hoá trước cột với Carnitin, thuốc thử được sử dụng ở đây có
thể là 6°-methoxynaphthacyl trifuoromethansulfonat hoặc 2°-phenanthrenacy]
trifuoromethansulfonat (triflat) Điều kiện sắc ký như sau: + Cot: c6t nh6m (Merk Aluspher 250-4, 5um, Darmstadt)
+ Pha động: Phân tích Carniin trong huyết tương: 1,5 mmol/L
trietylamin, 4,0 mmol/L acid succinic và 39,0 ml/L nước cất, bổ sung acetomtril vừa đủ I1 lít Phân tích Carnitin trong nước tiểu, lượng nước giảm
xuống còn 34,0 ml/L
+ Tốc độ dòng: 1 ml/phút
+ Thời gian phân tích: 45 phút
Trang 14
+ Thể tích tiêm mẫu: 50 pL
+ Nhiệt độ cột: 40°C
+ Detector huynh quang RFIOAXL:
Néu ding thudéc thir 6’- methoxynaphthacyl trifuoromethansulfonat: bước sóng kích thích là 247 nm, bước sóng phát xạ là 431 nm
Nếu dùng thuốc thử 2 -phenanthrenacyl triflat: bước sóng kích thích là
260 nm, bước sóng phát xạ là 433 nm
Ưu điểm của phương pháp là độ tin cậy và độ lặp lại tốt; giới hạn phát
| hiện Carnitin trong huyết tương là 30 + 130 tưmol/L, trong nước tiểu là
80 + 180 pmol/L, thé tích mẫu cần lấy nhỏ (15 4Ì), rất thích hợp phân tích
Carnitin trong huyết tương trẻ sơ sinh; sử dụng detector huỳnh quang cho độ nhạy cao
- Phương pháp đo quang phổ, sử dụng phản ứng xúc tác enzym
Nguyên tắc: Carnitin phản ứng với Acetyl CoA, xúc tác bởi Carnitin
acetyltransferase, tao ra CoA tu do
L-Carnitin + Acetyl-CoA —“*, Acetylcarnitin + CoA
CoA chứa hai nhóm thiol, phản ứng với 5,5-dithiobis-(2-nitrobenzoic
acid) (DTNB) tạo ra ion thiophenolat, tương ứng với tỷ lệ Carnitin Định lượng
bằng đo quang phổ tại bước sóng 412 nm
- Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS)
Đây là phương pháp đang được sử dụng phổ biến hiện nay Phương pháp này
có tính đặc hiệu và độ nhạy cao, định lượng L-Carnitin trong thuốc, dich sinh
học (máu, huyết tương, nước tiểu)
1.1.2 Acid Alpha Lipoic
a Đặc điểm hoá lý [24], [26], [27], [31]
Tên hoá hoc: 5 - (1,2 - dithiolan - 3 - yl) valeric acid
Tên khác: Acid thioctic
Trang 15Công thức hoá học: O H S—S CTPT: C,H, ,0,S, Phân tử lượng: 206,3 g/mol Tính chất vật lý: Năng suất quay cực: [ œ]p; = +104° Nhiệt độ nóng chảy: 60-62 °C Độ tan: Tan trong nước và chất béo pKa 5,4 b Vai trò và tác dụng được lý của Acid Alpha Lipoic [3], [9], [10],[11], [13], [L7], [31]
-Acid Alpha Lipoic là một hợp chất tự nhiên rất cần thiết cho việc cung cấp năng lượng cho hoạt động của ty thể Trong chu trình Krebs, quá trình khử carboxyl oxy hoá acid œ-cetoglutaric thành Succinyl CoA được xúc tác bởi phức hợp đa men a-cetoglutarat dehydrogenase có 5 coenzym tham gia là TPP, acid lipoic, CoA, EAD, và NAD” Cơ chế của phản ứng như sau [3]: [TPP] + : ì i HSCoA A.LIPOIC co -COOH _¢o, CHO : Ø S€SK _ —* €H¡ ——= | H ? CHạ—COOH 0 | Hạ-COOH 2 du, | CH;—COOH a-cetoglutaric | SuceinyICoA CH;-COOH — A.LIPOIC A.LIPOIC JN m= ; Ì s—s m— oe FADH; NAp*+ NADH+ H*
Hình 1.2 Qua trinh khit carboxyl oxy hoa a-cetoglutarat thanh Succinyl CoA véi su tham gia của Acid lipoic
Trang 16
- Bên cạnh đó, Acid Alpha Lipoic còn được biết đến với vai trò là một
chất chống oxy hoá mạnh tổng hợp Acid Alpha Lipoic tác dụng qua 4 khả
năng sau [9], [10], [11], [13]:
I- Gắn và gdp cdc kim loại nặng Hơn nữa, Acid Alpha Lipoic có khả
năng xâm nhập qua hàng rào máu não và qua màng tế bao dé dang Do đó, nó
có thể được sử dụng trong những trường hợp nhiễm độc các kim loại nặng như
thuỷ ngân
2- Chọn lựa các gốc tự do Gốc tự do là sản phẩm của quá trình biến dưỡng trong cơ thể nhưng cũng có thể là sản phẩm tạo ra từ sự ô nhiễm môi
trường, hút thuốc lá, dùng rượu bia, dùng thuốc , thậm chí cả do chấn thương
tâm lý Hậu quả của các gốc tự do đó chính là hàng loạt những căn bệnh nguy
hiểm như ung thư, xơ vữa mạch, các biến chứng về mắt, sự lão hoá Do khả
năng trung hoà các gốc tự do, các chất chống oxy hoá (Vitamin C, Vitamin E,
Ubiquinone, Glutathion, Acid Alpha Lipoic ) da duoc khuyén ding trong
những trường hợp này Ta có thé dễ dàng nhận thấy được tính ưu việt của
AAL, so với những chất chống oxy hoá khác, đó là khả năng trung hoà các gốc tự do trong nước và trong cả chất béo
3- Tái tạo các chất chống oxy hoá nội sinh.Cơ thể chúng ta luôn có
những cơ chế bảo vệ để hạn chế tác hại của các gốc tự do, đó là quá trình
chống oxy hố, thơng qua các chất chống oxy hoá Hệ thống bảo vệ chống gốc tự do trong cơ thể gồm 3 hệ chất: | |
* Các enzym nội bao nhu Mn SOD, CuZn SOD, glutathion peroxydase
* Các chất phi enzym phân tử nhỏ (bây gốc tự do): vitamin E, vitamin
C, Coenzym Q10
* Các phối tử tạo phức khoá các ion kim loại như: Transferin,
Trang 17
AAL trực tiếp tăng cường tái tạo Vitamin C, Glutathion, Coenzym Q10 và gián tiếp phục hồi Vitamin E Chính khả năng này đã góp phần tăng cường hệ
thống bảo vệ chống gốc tự do của cơ thể
4- Khả năng sửa chữa những tổn hại tế bào do gốc tự do gây ra Do
nguyên nhân của những tổn hại này là khi các oxy phản ứng lấy đi một điện tử
và phá huỷ mô, tổ chức sống, các chuỗi ADN, các thành phần khung của tế bào, Protein và màng tế bào đều bị ảnh hưởng
- Acid Alpha Lipoic còn có tác dụng tăng cường sự hấp thu glucose 6
cơ và tăng sự nhạy cảm của cơ thể đối với Insulin, cải thiện các triệu chứng thoái hoá thần kinh gây ra do đái tháo đường
Chế phẩm METABOSOL”” (Do Invenmed Group sản xuất theo bản
quyền Euma Natural Co., USA; Garden Grove CA 92841 Số chứng nhận:
45139) là sự kết hợp của Acid Alpha Lipoic va cac loai thao dược như Kỳ tử, Sơn thù, Hoài sơn, Nhàu Bên cạnh tác dụng của Acid Alpha Lipoic, cdc
nghiên cứu y học hiện đại cũng đã chứng minh tác dụng và lợi ích của các
thảo được phối hợp vừa nêu
b Các phương pháp phân tích Acid Alpha Lipoic [12], [19], [22], [27]
- Sử dụng sắc ký khí:
Phân tích Acid Alpha Lipoic sử dụng sắc ký khí với detector ion hoá ngọn lửa (FID - Flame lonization Detector) Khí mang từ cột cùng với không khí và Hydro đã được đốt cháy ở đầu đốt kim loại, Acid Alpha Lipoic cố trong
khí mang được đốt cháy Quá trình oxy hoá trong ngọn lửa phát ra electron cùng với ion Sản phẩm đốt electron và ion làm tăng độ dẫn điện của ngọn lửa
Các electron và ion này được tập hợp ở điện cực góp, cho nên dòng điện tạo ra
tỷ lệ thuận với nồng độ ion có mặt trong khí mang đến ngọn lửa Detector có khoảng tuyến tính rộng, rất nhạy và đáp ứng với hầu hết các chất hữu cơ
Sắc ký khí kết hợp detector khối phổ (GC-MS) cũng là một phương
pháp được sử dụng
Trang 18- Sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC:
Theo SP 30, phương pháp định lượng Acid Alpha Lipoic trong thuốc
viên là sử dụng sắc ký hiệu năng cao pha đảo với detector UV ở 220 nm Tuy nhiên, nhược điểm của phương pháp này là có độ đặc hiệu và độ nhạy thấp
Trong phân tích Acid Alpha Lipoic sử dụng sắc ký lỏng hiệu năng cao,
có nhiều loại detector khác cũng đã được sử dụng như: detector huỳnh quang, đetector điện hoá:
+ Trong sắc ký lỏng sử dụng detector huỳnh quang, ta đùng một thuốc thử tạo huỳnh quang để làm dẫn chất hoá của AAL Phương pháp này rất thích
hợp để phân tích AAL trong huyết tương và nước tiểu Tuy nhiên nhược điểm
của phương pháp là xử lý mẫu rất phức tạp
+ Sắc ký lỏng sử dụng đetector điện hoá được coi là phương pháp khá
nhạy để phân tích AAL Có thể dùng detector đo độ dẫn (Conductivity
detector) hoac detector do dong (Amperometric detector) VGi detector do độ
dẫn, ta sử dụng điện cực kép Hg-Au để phân tích, giới hạn phát hiện có thể lên
đến nồng độ nanoMol Nhưng khi số lần tiêm là 30-50 lần thì độ nhạy của
phương pháp bị mất đi
- Phương pháp HPLC-CEAD:
Sử dụng sắc ký lỏng kết hợp với detector đo điện tích của mảng các
điện cực (CEAD - coulometric electrode array detector) Cột sắc ký sử dụng là cột ACE 3-C-I§ (150 mm x 3,0 mm, kích thước hạt 3um); pha động
Acetonitril/Methanol/Kali dihdro photphat 50mM pH 3 - 350/65/585, v/VW;
tốc độ dòng 0,45 ml/phút; điện cực palađi, điện thế của điện cực được đặt ở +300, +400, +450, +500, +550, +600, +650 va +700 mV
- Phuong pháp sắc ký lỏng khối phổ HPLC - MS
Đây là phương pháp có độ nhạy và độ đặc hiệu cao để phân tích Acid
Alpha Lipoic Hiện nay trên thế giới, phương pháp này đang ngày càng được
11
Trang 19áp dụng rộng rãi để phân tích Acid Alpha Lipoic có trong nhiều sản phẩm như: các thuốc, dịch sinh học, thực phẩm chức năng
1.2 TONG QUAN VE SAC KY LONG KHOI PHO [2], [4], [7] [8], [15],
[23].{28] [29]
1.2.1 Một số nét sơ lược về sắc ký lỏng khối phổ [7], [23]
Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) và kỹ thuật phân tích khối phổ (MS)
là hai kỹ thuật phân tích đã ra đời khá lâu Tuy nhiên, không phải ngay từ đầu,
các nhà phân tích đã nhận ra được hiệu quả to lớn của việc kết hợp HPLC-MS
Nguyên nhân chủ yếu của sự chậm trê này là vấn đề kỹ thuật khi đưa dòng chất lỏng vào hệ thống có độ chân không cao (hệ thống phân tích khối
phổ) Vì vậy, mặc dù kỹ thuật sắc ký lỏng ra đời trước sắc ký khí nhưng kỹ -_ thuật sắc ký khí ghép khối phổ (GC-MS) được thực hiện trước kỹ thuật sắc ký
lỏng ghép khối phổ
Sau quá trình thử nghiệm dài, mãi đến năm 1970, việc kết nối này mới thành công
Sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS) là sự kết nối giữa sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) và detector khối phổ (MS)
Trong kỹ thuật LC-MS, hỗn hợp các chất trong pha động sau khi được
tách qua cột sắc ký sẽ được phát hiện bằng detector khối phổ
Trong phân tích được phẩm, người ta thường sử dụng phương pháp LC- MS cho:
- Các hợp chất tương đối phân cực đến phân cực nhiều, khó bay hơi
- Phân tích thuốc trong dịch sinh hoc
- Phân tích các hợp chất tự nhiên trong cây thuốc
- Trường hợp không sử dụng được các detector khác: Không phát
hiện được bằng detector khác hoặc trong phân tích khẳng định
Chính vì vậy, phân tích khối phổ ngày càng được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khoa học công nghệ Đặc biệt, nét nổi bật của phân tích
12
Trang 20
khối phổ là tính chọn lọc và độ nhạy, độ đặc hiệu cao Giới hạn phát hiện có thể đến 10” gam Do vậy thường dùng kỹ thuật này để phân tích hàm lượng siêu vết trong mẫu thành phần phức tạp
1.2.2 Thiết bị sắc ký lỏng khối phổ [2], [4], [7], [8], [23] [28], [29]
a Pha động
Pha động trong sắc ký lỏng là một trong những yếu tố ảnh hưởng đến sự tách
Pha động thường là hai dung môi (hữu cơ hoặc dung dịch nước) hoà tan vào
nhau để có khả năng tách với độ phân giải phù hợp Có hai cách dùng pha động để rửa giải:
* Đẳng dòng: Thành phần pha động không thay đổi trong suốt quá trình sắc ký
* Gradient: Pha động là hỗn hợp của nhiều dung môi, thường là 2 đến 4 loại được đựng trong các bình khác nhau Tỷ lệ các thành phần thay đổi trong
quá trình sắc ký theo chương trình đã định (chương trình dung môi) b Hệ thống bơm
Bơm HPLC có chức năng tạo áp suất cao để đẩy pha động từ bình dung
môi qua hệ thống sắc ký Hệ thống bơm trong sắc ký lỏng cần đáp ứng các yêu cầu sau:
* Phải đẩy được dung môi rửa giải thành dòng qua cột tách, dòng không liên tục sẽ gây nhiêu đường nền
* Không có xung ở áp suất cao
* Có thể chịu được tác động của nhiều loại dung môi (không bị ăn
mon)
c Cột tách và pha tĩnh
Cột HPLC thường được chế tạo bằng thép không gỉ, thuỷ tỉnh hoặc chất
dẻo có chiều đài 10-30 cm, đường kính trong 4-10 mm Kích thước của hạt
13
Trang 21nhồi trong cột thường là 5-10 tưn Các chất nhồi thường được sử dụng là Silica gel, nhôm oxyd, polyme xốp hoặc các loại pha đảo C2, C§, C18
Cột tách sắc ký lỏng yêu câu phải trơ, có thành phẳng, đồng nhất trên bề mặt và có thể chịu được áp suất cao
đ Hệ tiêm mâu
Mẫu lỏng hoặc dung địch được tiêm thẳng vào pha động cao áp ngay ở
đầu cột mà không cần dừng dòng bằng một van tiêm có vòng chứa mẫu Vòng chứa mâu có dung tích khác nhau: thường dùng loại 0,50 + 20 4L
e Detector khối phổ [7], [23] [29]
Một trong những bộ phận quan trọng nhất trong HPLC là detector Việc
chọn đetector để sử dụng phải dựa trên tính chất lý hoá của chất cần phân tích Việc sử dụng khối phổ kế làm detector cho sắc ký đem lại một số ưu điểm
sau:
® Có thể đưa ra những thông tin đặc hiệu về cấu tạo hoá học của chất
phân tích
¢ Có tính chọn lọc, phân tích đúng và chính xác đối tượng phân tích $ Có độ nhạy cao (phân tích được hàm lượng siêu vết trong mẫu thành
phần phức tạp) vì dòng khối phổ nhạy ® Nguyên tắc hoạt động
Khối phổ là kỹ thuật đo trực tiếp tỷ số khối lượng và điện tích của ion
(m/2) được tạo thành trong pha khí từ phân tử hoặc nguyên tử của mẫu
Các ion được tạo thành trong buồng ion hoá, được gia tốc và tách riêng
nhờ bộ phân tích khối trước khi đến detector Tất cả các quá trình này diễn ra
trong hệ thiết bị chân không: áp suất trong hệ dao động từ 10? Pa đến 10 Pa Tín hiệu tương ứng với các ion sẽ được thể hiện bằng một số vạch (pic) có
cường độ khác nhau tập hợp lại thành một khối phổ đồ hoặc phổ khối Nó
14
Trang 22
cung cấp thông tin định tính (khối lượng phân tử, nhận dạng các chất) xác
định cấu trúc và định lượng các chất
#& Nhiệm vụ của detector khối phổ
- Trong phân tích định tính: Khi ghép với thiết bị sắc ký lỏng, chất phân
tích được xác nhận bằng:
+ Sắc ký đồ ở thời gian lưu xác định t„ đặc trưng cho chất phân tích
+ Phổ khối tương ứng của hoá chất phân tích hoặc phổ khối biểu diễn
cường độ các 1on sinh ra từ một ion xác định của chất phân tích
Như vậy việc nhận danh thông qua vừa thời gian lưu, vừa phổ khối sẽ chắc chắn hơn là chỉ dựa vào thời gian lưu
- Trong phân tích định lượng: Do đặc thù của detector như đã nêu, giúp cho
định lượng đúng đối tượng và có độ nhạy cao
% Các bộ phận của detector khối phổ [2] [7],[23] [28], [29]
-Bộ nạp mâu: Đưa mẫu vào máy Trong máy sắc ký lỏng khối phổ, bộ nạp mẫu là đầu ra của máy sắc ký lỏng được kết nối với khối phổ
- Bộ phận ion hoá + Nhiệm vụ:
® lon hố chất cần phân tích
¢ Chuyển ion từ pha dung dịch vào pha hơi
® Khử dung môi để đưa tiếp ion vào bộ phân tích khối
$ Cách ly phần tạo ion ở áp suất khí quyển với bộ phận nằm trong chân
khơng sâu
® Rút ra ngoài các phân tử trung hoà và ion khác dấu có thể ảnh hưởng đến phép đo
+ Kỹ thuật ion hoá: Hiện nay chủ yếu sử dụng hai kỹ thuật: phun điện tử
(ESD va ion hoa bang hod học ở áp suất thường (APC])
15
Trang 23
Kỹ thuật sử dụng trong khoá luận này là kỹ thuật ESI, kỹ thuật được sử
dụng phổ biến nhất trong LC-MS Kỹ thuật này được mô tả như sau: Evaporation *Rayteigh Coulomb Evaporation * Analyte lon Lirmet Exptosion a 99 tree Gan =< ~> —_™~ “ON sa e> 4 <> ~® 8 a» Cứ See" a Gre 37" 2 7 @ mà
Hình 1.3 Kỹ thuật Electrospray Ionization
Các phân tử hoá chất và dung môi ra khỏi cột sắc ký được đưa vào một ống
mao quản bằng kim loại cao thế 3-5 KV (điện thế dương ở đầu kim tạo ion
dương, điện thế âm ở đầu kim tạo ion âm và được quyết định tuỳ chất khảo
sát) và sau đó được phun mịn bằng khí nitơ thoát ra xung quanh ống mao
quản Dưới tác dụng của điện thế cao và luồng khí phun nitơ, có sự tạo thành những hạt nhuyễn mang điện thoát ra từ đầu ống mao quản
Trong khí nóng, các phân tử dung môi từ từ bốc hơi, các hạt mang điện tích
có thể tích nhỏ dần và do sự đẩy nhau giữa các điện tích cùng dấu sẽ vỡ dần
thành những hạt nhỏ mang điện tích Sau đó, các ion dương hoặc âm tạo thành
được đưa vào bộ phận tách ion qua một cửa rất nhỏ, dung môi và khí nitơ bị bơm hút ra ngoài
- Bộ phận phân tích khối
Bộ phân tích khối được coi là quả tìm của máy khối phổ, có nhiệm vụ tách
các ion có trị số m/z khác nhau thành từng phân riêng biệt Các ion được gia
tốc và tách riêng nhờ tác dụng của từ trường, điện trường để đi đến detector
- Bộ phận phát hiện ion
Trang 24
Có nhiệm vụ chuyển các ion đã đến thành tín hiệu điện đo bằng hệ điện tử
của máy khối phổ
1.2.3 Một số kỹ thuat LC-MS [7]
a Kỹ thuật phân tích toàn thang (Full scan)
Với một hỗn hợp nhiều chất, sau khi được tách ra qua cột sắc ký lỏng
và đưa vào detector khối phổ, khối phổ kế ghi nhận tổng cường độ các ion sinh ra từ môi chất Ta có một sắc đồ toàn ion TIC (Total lon Chromatogram) và phổ khối được lấy toàn bộ các ion (FULL SCAN)
FULL SCAN cho day đủ thông tin về chất phân tích hơn, tuy nhiên phương
pháp này có độ nhạy không cao, nhiễu đường nền có thể lớn
b Xỹ thuật phân tích chon loc ion (SIM, Selected Ion Monitoring)
Kỹ thuật này chỉ cho khối phổ kế nhận diện một ion và ghi sắc đồ theo
thời gian Kỹ thuật SIM có tác dụng làm giảm bớt nhiễu đường nền và do đó tăng độ nhạy, tức tăng tỷ lệ tín hiệu S/nhiễu đường nền N
Ky thuat SIM nhay hon FULL SCAN
c Kỹ thuật MS/MS
Đối với kỹ thuật MS/MS, một ion chọn lọc ở chế độ MS lần 1 được phân
tích tiếp bằng cách sử dụng năng lượng bẻ gãy tạo ra một hoặc vài ion con đặc trưng ở chế độ phân tích MS lần 2
Kỹ thuật MS/MS được sử dụng để tăng độ chọn lọc và tăng độ nhạy do làm
giảm nhiễu đường nền rất đáng kể
Trang 25
PHAN 2 THUC NGHIEM VÀ KẾT QUA
2.1 NGUYEN VAT LIEU NGHIEN CUU VA PHUONG PHAP THUC
NGHIEM
2.1.1 Nguyên vật liệu nghiên cứu
a Hoá chất - thuốc thử
- Chất chuẩn L-Carnitin fumarat đối chiếu hoá học (Chất chuẩn làm việc của
khoa Vật lý Đo lường, Viện Kiểm nghiệm thuốc T.Ư.)
- Chất chuẩn Acid Alpha Lipoic đối chiếu hoá học (Chất chuẩn làm việc của
khoa Vật lý Đo lường, Viện Kiểm nghiệm thuốc T.Ư.)
Trang 26- Cột sắc ký Beta Basic C18 (5cm x 2,1mm, 5pm) - Máy lắc siêu âm Branson 5200
- Cân phân tích Mettler AB204 (Thụy Sỹ)
- Bình nón, bình định mức, pipet và các dụng cụ thuỷ tinh khác c Đối tượng nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu là Acid Alpha Lipoic và L-Carnitin trong thuốc viên
Để tiến hành, chúng tôi sử dụng một số chế phẩm sau:
s® Viên nang VIMESOL do Invenmed Group cung cấp
Công thức viên nang: L-Carnitin fumarat 200mg, Acid Alpha Lipoic 100ng,
Nicotinamid 50mg, Đông trùng hạ thảo, Tá dược v.d — l nang s Viên nang METABOSOL do Invenmed Group cung cấp
Công thức viên nang: Acid Alpha Lipoic 100mg, Ky tử, Nhàu, Hoài Sơn, Quế
Chi, Son Thu, Cát Căn, Hoàng Bá, Tá được v.ả — Ì nang
e Vién nang CARNITIN TA L-Carnitin fumarat 350 mg của công ty TNHH
Thién Nién Kién
e Viên nang TOPLIFE FAT REMOVE của công ty Dược phẩm OPV
Công thiic vién nang: L-Carnitin tatrat 60mg, DL-Methionin 50mg, Ta duoc v.d Tnang
2.1.2 Phương pháp nghiên cứu
a Chuẩn bị mẫu
- Bao gồm mẫu chuẩn và mẫu thử
b Tối ưu hóa điều kiện khối phổ đối với L-Carnitin và Acid Alpha Lipoic Sử dụng phương pháp điều chỉnh tự động (Autotune) của máy LC-MS
c Xây dựng chương trình sắc ký lỏng khối phé (LC-MS) dé dinh tính và
dinh luong L-Carnitin va Acid Alpha Lipoic
Khảo sát để tìm điều kiện sắc ký như cột, pha động, tốc độ dòng, điều kiện
khối phổ cho các chương trình sắc ký sau:
19
Trang 27- Chương trình sắc ký LC- MS định tính và định lượng L-Carnitin
- Chương trình sắc ký LC- MS định tính và định lượng Acid Alpha Lipoic
- Chương trình sắc ký LC- MS định tính và định lượng đồng thời L-Carnitin và
Acid Alpha Lipoic
d Đánh giá phương pháp - Độ tuyến tính:
Độ tuyến tính biểu thị sự tương quan hồi qui giữa diện tích pic và nồng
độ chất phân tích Chuẩn bị dãy các dung dịch chuẩn có nồng độ trong khoảng nồng độ phân tích để khảo sát, phân tích mẫu xác định phương trình hồi qui
(y=ax+b) và hệ số tương quan r - Độ lặp lại:
+ Độ lặp lại của hệ thống: Xác định bằng độ lệch chuẩn tương đối (RSD) diện tích pic cùng mẫu chuẩn tiêm 6 lần
+ Độ lặp lại kết quả phân tích: Đánh giá thông qua sai số tương đối của kết quả phân tích
- Độ đúng:
Bằng phương pháp thêm chất chuẩn và định lượng để xác định khả năng
tìm lại
- Giới hạn phát hién LOD va giới hạn định lượng LOO
Giới hạn phát hiện (LOD) của mỗi chất được xác định bằng 3 lần tỈ số
giữa độ lệch tín hiệu nền lân cận và độ nhạy của chất đó Độ nhạy được xác định bằng hệ số góc của đường hồi qui giữa tín hiệu (Y, mV) và nồng độ (X, Hg/mL hoặc ug/8)
Giới hạn định lượng (LOQ) được tính bằng 3,3 lần giới hạn phát hiện
Ngoài ra, giới hạn định lượng còn được xác định bằng nồng độ chất cho đáp ứng có tỉ số S/N = 10
20
Trang 28e Phương pháp xử lý số liệu Các đặc trưng thống kê được tính dựa vào các công thức hoặc dựa vào
các hàm số trong Microsoft Excel
Tiến hành thí nghiệm n lần, thu được các kết quả x, là Xị, X;, Xạ X, Khi đó: Trung bình các kết quả: a n x=—) x, H ¡=4 > (Xi _Y" Độ lệch chuẩn : S= 1J-#————— n—Ì
Độ lệch chuẩn tương đối: RSD (%) = xx100
Tương quan hồi qui tuyến tính:
- Phương trình hồi qui tuyến tính bậc nhất thể hiện quan hệ giữa diện tích pic sắc ký và nồng độ chất phân tích:
Y=ax+b Trong đó:
+ Hệ số góc (a) được tính dựa vào hàm Slope trong Microsoft Excel
Trang 29
2.2 KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ NHẬN XÉT
2.2.1 Chuẩn bị mẫu
- Mẫu chuẩn:
+ Dung dich chuén L-Carnitin 10 pg/ml trong Methanol (Pha dong 1) và trong
Methanol: 0,1% acid acetic trong nudéc (1:1) (Pha động 2) dùng để khảo sát
phổ khối của L-Carnitin
+ Dung dịch chuẩn Acid Alpha Lipoic 10 pg/ml trong pha dong 2 để khảo sát phổ khối của Acid Alpha Lipoic
+ Day cdc dung dịch chuẩn L-Carnitin có nồng độ: 1 ug/ml, 2 tg/ml, 5tg/ml, 10 ug/ml và 20 pg/ml trong pha động 1 và pha động 2 để khảo sát độ lặp lại và độ tuyến tính đánh giá sự phù hợp của hệ thống sắc ký lỏng khối phổ
+ Day cdc dung dich chudn Acid Alpha Lipoic c6 néng dé: 1 pg/ml, 2 pg/ml,
5 g/ml, 10 g/ml va 20 g/ml trong pha dong 2 để khảo sát độ lặp lại và sự phù hợp của hệ thống sắc ký lỏng khối phổ
- Mâu thử:
Lấy 20 viên nang, cân chính xác và tính khối lượng trung bình thuốc trong nang, trộn đều, nghiền mịn và làm đồng nhất bột thuốc trong nang Cân chính
xác một lượng bột thuốc để pha được dung dịch có nồng độ khoảng: L-
Carnitin: 10 kg/ml; Acid Alpha Lipoic: 5 ng/ml Tiến hành lọc qua giấy lọc
thường, sau đó lọc qua mang 0,45 um Với các lưu ý cụ thể sau:
** Với những mẫu thử chỉ chứa L-Carnitin: Tiến hành pha mẫu
trong pha động |
s* Với những mẫu thử chỉ chứa Acid Alpha Lipoic: Tiến hành pha mẫu trong pha động 2
s* Với những mẫu thử chứa đồng thời cả hai thành phần trên: Tiến hành pha mẫu thử trong pha động 2
22
Trang 30
2.2.2 Tối ưu hoá điều kiện khối phổ đối với L-Carnitin và Acid Alpha Lipoic
Để xác định điều kiện khối phổ, trước tiên chúng tôi pha dung dịch
chuẩn của từng chất trong pha động, sau đó bơm trực tiếp bằng syringe và
chạy chương trình Tune để điều chỉnh các thông số khối phổ
a Tối ưu hoá điều kiện bắt ion phân tích đối với L-Carnitin, mảnh m/z 162
- Với pha động 1
+ Pha dung dich L-Carnitin 10 pg/ml trong pha dong 1 bơm trực tiếp vào máy
khối phổ qua syringe chudn (Unimetrics 500 pL) véi tc d6 SpL/phut + Gọi phương pháp Tưne Plus để xác định điều kiện khối phổ:
Bước I1: Bật máy khối phổ, khởi động phần mềm và gọi phương pháp bằng cách: trên cửa sổ Ïwsfrumment Sefup, chọn biểu tượng máy khối phổ LCQ Advantage Max MS sẽ xuất hiện hình máy khối phổ
Bước 2: Nhắp chuột vào Tune Plus, xuất hiện cửa sổ Tune Plus, chọn chế độ Positive ESI (+ESI)
Bước 3: Bơm L-Carnitin vào hệ thống khối phổ với tốc độ dòng
5 uL/phút, sau một thời gian sẽ xuất hiện mảnh ion có m/z = 162 (Hình PLI -
Phụ lục 1)
Bước 4: Nhấp vào biểu tượng Tune trên màn hình sẽ xuất hiện cửa sổ
chạy chế độ Automatic Tune (Hình PL3 - Phụ lục 1)
Bước 5: Trong ô Mass (m/2), đánh số 162 dé Tune cho mảnh 162, máy sẽ tự động điều chỉnh và tối ưu hoá các thông số sao cho bắt ion m/z = 162 tốt
và nhạy nhất Quá trình này mất khoảng 5 phút Sau khi máy đã tự động điều chỉnh, sẽ quan sát thấy tín hiệu của ion m/z 162 lớn hơn ban đầu Lưu file
Tune lai dat tên là L-Carniin-I LCQTune
23
Trang 31- Với pha động 2
+ Pha dung dich L-Carnitin 10 pg/ml trong pha động 2 bơm trực tiếp vào máy
khối phổ qua syringe chuẩn (Unimetrics 500 HL,) với tốc độ 5ItL/phút
+ Quá trình xác định điều kiện khối phổ cho L-Carnitin trong pha động 2 cũng tương tự như với pha động 1 Luu lai file Tune, dat tén 1A L-Carnitin-2 LCQTune
b Tối ưu hoá điều kiện bắt ion phản tích đối với Acid Alpha Lipoic, mảnh
m/z 205
- Pha dung dich Acid Alpha Lipoic 10 g/ml trong pha dong 2 bơm trực tiếp
vào máy khối phổ qua Syringe chuẩn (Unimetrics 500 HL) với tốc độ 5
uL/phút
- Gọi phương pháp Tưne Plus để xác định điều kiện khối phổ:
Bước 1: Khởi động phần mềm và gọi phương pháp: tương tự như với L-
Carnitin
Bước 2: Nhắp chuột vào Tune Plus xuất hiện cửa sổ Tune Plus, chọn chế độ Negative ESI (-ESI)
Bước 3: Bơm Acid Alpha Lipoic vào hệ thống khối phổ với tốc độ 5
uL/phút, sau một thời gian sẽ xuất hiện mảnh ion có m/z = 205
Bước 4: Nhấp chuột vào biểu tượng Tune trên màn hình sẽ xuất hiện cửa sổ chạy chế độ Automatic Tune
Bước 5: Trong ô Mass (m/z), đánh số 205 để Tune cho mảnh 205, máy
Trang 32
O phan Instrument Setup, goi file L-Carnitin-1 LCQTune đối với
chương trình I
Chọn phân tích MS 1 lần, chế độ SIM, ion me m/z 162
Tương tự, gọi file L-Carnitin-2 LCQTune đối với chương trình 3 Chọn MS I lần, chế độ SIM ion me m/z 162
- Acid Alpha Lipoic:
Ở phan Instrument Setup, goi file Acid Alpha Lipoic LCQTune d6i vi
chuong trinh 2 va 3
Chon phan tich MS 1 lần, chế độ SIM, ion me m/z 205_
2.2.3 Xây dựng chương trình sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS) để định tính
va dinh luong L-Carnitin va Acid Alpha Lipoic
*Chương trình I: CTSK định tính và định lượng L-Carnitin - Cột sắc ký sử dụng: Cột Beta Basic C18 (5 cm x 2,1 mm; 5 um) - Pha động: Methanol (Pha động 1)
- Tốc độ dòng: 0,2 ml/phút
- Thể tích tiêm mẫu: 25 ul
- Thời gian phân tích: 3 phút
- Detector khối phổ: Sử dụng kỹ thuật phun điện tử ion dương (Positive
Electron Spray lonisation ký hiệu là + ESI) để ion hoá; khí Sheath Gas = 20, Auxylary Gas = 0; Chế độ chọn lọc ion (Selected lon Monotoring ký hiệu là
SIM) với mảnh m/z 162 + 1 amu để định lượng
Với chương trình sắc ký trên, sắc ký đồ của L-Carnitin được ghi ở hình 2.5
25
Trang 33re Aơ 02/06/2008 đâ 0O 23 A s4 “"T000-.409 944/0 mY 084 ^^ 33290733 BaF rf ‘i Tene (rein) L carnitin TAthu 241 RT: 0.00 AV 1 NL: 4.1963 T: + 6ESI SIMưms [ 161 20-183 20] 192.1 so— 163.0 TT ra fe te v.v tT Tae | 612 1614 1616 1618 162.0 1622 162.4 1626 162.8 163.0 mz
Hình 2.5 SKĐ của dung dịch thử L-Carnitin 10 g/ml
*Chương trình 2: CTSK định tính và định lugng Acid Alpha Lipoic
- Cột sắc ký sử dụng: Cột Beta Basic C18 (5 cm x 2,1 mm, 5 tim)
- Pha động: Methanol : 0,1% acid acetic trong nước (1:1) (Pha động 2)
- Tốc độ dòng: 0,2 ml/phút
- Thể tích tiêm mẫu: 25 Lll
- Thời gian phân tích: 5 phút
- Detector khối phổ : Sử dụng kỹ thuật phun điện tử ion âm (Negative Electron
Spray Ionization ky hiéu 1a - ESI) để ion hoá; khí Sheath Gas = 20, Auxylary
Trang 34
acid lipoic chuan 10ppm #9149 TY: 391 AV 1 PL: 1O7EG T: -oESI SIM ms ( 204 00-206 0O]
E 20468
Hình 2.6 SKĐ của dung dich Acid Alpha Lipoic 10 pg/ml
* Chuong trinh 3: CTSK dinh luong déng thoi L-Carnitin va Acid
Alpha Lipoic
- Cột Betabesic 18 (5 cm x 2,1 mm, 5 um)
- Pha dong: Methanol : 0,1% acid acetic trong nuéc (1:1)
- Thé tich bom mau: 25 pL
- Thời gian phân tích: 7 phút, trong đó:
+ Phút thứ 0 đến phút thứ 2: phân tích L-Carnitin
+ Từ phút thứ 2 đến phút thứ 7: phân tích Acid Alpha Lipoic - Tốc độ dòng: Từ phút 0 đến phút thứ 2: 0,2 mL/phút
Từ phút 2 đến phút thứ 7: 0,4 mL/phút
- Detector khối phổ : Sử dụng kỹ thuật phun điện tử ion (Electron Spray
lonization ký hiệu là ESI) để ion hoá; khí Sheath Gas = 20, Auxylary Gas = 10; Chế độ chọn lọc ion (Selected lon Monotoring ký hiệu là SIM), cụ thể:
+ Từ phút 0 đến phút thứ 2: Gọi file L-Carniin-2 LCQTune, kỹ thuật
+ ESI, chế độ SIM với mảnh m/z 162 + 1 để định lượng L-Camitin
27
Trang 35
+ Từ phút thứ 2 đến phút thứ 7: gọi file Acid Aipha Lipoic LCQTune, kỹ thuật - ESI, chế độ SIM với mảnh m/z 205 + 1 để định lượng Acid Alpha
Lipoic
Với chương trình sắc ký trên, sắc ký đồ của L-Carnitin và Acid Alpha
Lipoic được ghi ở hình 2.7
acid pols ve L camniin chuan_08031 0371072008 04.25.30 PM ~ h ä Hi i ar oom * ws: fh - 40 450 4m 5915 S77 om ¬————=e==—e=rr=xr=—=—————————————— " + Tene men ack ipole ve | carntin cfvuan, 000310162920 01202 NT 111 AV: 1! Mu 34278 T' ~c 69! 984 rrụ ( 204 00.206 00) pom pes ve carnain chua O 00310162920 0310 NT @79 AV 1 04 3076 | T: *+ e ESI SA4em [ 161.20-183 20| | ———=h—m
Hình 2.7 SKĐÐ của dung dich L-Carnitin 10 g/ml và Acid Alpha Lipoic 5 pg/ml
Nhận xét: Kết quả khảo sát cho thấy, với điều kiện khối phổ như trên, hai chất tách nhau hoàn toàn, pic cân xứng Thời gian phân tích ngắn, trên thực tế, đến phút thứ 5, hai chất đã được phân tích xong
2.2.4 Đánh giá sự phù hợp của hệ thống LC-MS
a Độ tuyến tính của hệ thống
Để khảo sát độ tuyến tính của hệ thống, chúng tôi tiến hành như sau:
+ Với L-Carnitin:
Tiêm 5 dung dịch chuẩn có các nồng do | pg/ml; 2 pg/ml; 5 pg/ml; 10 ug/ml va 20 ug/ml trong pha động 1 đã chuẩn bị ở phần 2.2.1, ghi lại diện tích Kết quả được ghi trong bảng 2.1
28
Trang 36
Tiêm 5 dung dịch chuẩn có các nồng độ 1 pg/ml; 2 pg/ml; 5 pg/ml; 10 ug/ml va 20 pg/ml trong pha động 2 đã chuẩn bị ở phần 2.2.1, ghi lại diện
tích Kết quả được ghi trong bảng 2.2
+ Với Acid Alpha Lipoic: tiêm 5 dung dịch chuẩn có các nồng độ I g/ml; 2 ug/ml; 5 pg/ml; 10 pg/ml va 20 ug/ml trong pha động 2 như đã
chuẩn bị ở phần 2.2.1, ghi lại điện tích Kết quả được ghi trong bảng 2.3 b Độ lặp lại của hệ thống
CTSK 1: Tiêm 6 lần dung địch chuẩn L-Carnitin có nồng độ 10ug/ml
trong pha động | và ghi diện tích pic Kết quả được ghi trong bang 2.1
CTSK 3: Tiêm 6 lần dung dịch chuẩn L-Carnitin có nồng độ 10 ug/ml trong pha động 2 và ghi điện tích pic Kết quả được ghi trong bảng 2.2
CTSK 2: Tiêm 6 lần dung dịch chuẩn Acid Alpha Lipoic có nồng độ 10
ig/ml trong pha động 2 và ghi điện tích pic Kết quả được ghi trong bang 2.3
Trang 37Đường tuyến tính của L-Carnitin (pha động 1) y = 2959962,45x + 6788016,56 70000000 - R? = 0,9999 60000000 = 50000000 - £ 40000000 - & 30000000 + © 20000000 + 10000000 - 0 | : - 0 10 15 20 25 Néng d6 (ppm)
Hình 2.5 Tương quan hồi qui tuyến tính giữa diện tích píc và nông độ của các dung dich chudn L-Carnitin (1-20 ug/ml) phan tich theo CTSK 1
Kết quả khảo sát cho thấy có sự liên quan chặt chẽ giữa nồng độ và diện
Trang 38Đường tuyến tính của L-Carnitin (pha động 2) 30000000 - y = 1186909, 98x + 246735,68 R? = 0,9997 25000000 - § 20000000 4 15000000 đ 10000000 5000000 - 0+ =e : r wv 15 20 25 Nồng độ (ppm)
Hình 2.6 Tương quan hồi qui tuyến tính giữa điện tích píc và nồng độ của các dung
dịch chuẩn L-Carnitin (1-20 \ig/m]l) phân tích theo CTSK 3
Kết quả khảo sát cho thấy có sự liên quan chặt chẽ giữa nồng độ và diện tích pic của L-Carnitin, hệ số tương quan r = 0,9998 Độ tuyến tính tốt trong khoảng nồng độ khá rộng từ 1 - 20 tug/ml
Hệ thống sắc ký đáp ứng yêu cầu về độ lặp lại, độ lệch chuẩn tương đối
RSD của diện tích píc là 1,06 %
Bảng 2.3 Kết quả khảo sát độ lặp lại và độ tuyến tính của Acid Alpha Lipoic kiểm
Trang 39Đường tuyến tính của Acid Alpha lipoic (pha động 2) y = 21171618,17x + 12303170,30 500000000 R? = 0,9998 400000000 - 8 300000000 - $ 200000000 100000000 0 ——— T VỆ Ỷ 0 5 10 15 20 Nồng độ (ppm) 25
Hình 2.7 Tương quan hồi quy tuyến tính giữa diện tích píc và nồng độ của
các dung dịch chuẩn Acid Alpha Lipoic (1-20 g/m]) phân tích theo CTSK 2
Kết quả khảo sát cho thấy có sự liên quan chặt chẽ giữa nồng độ và diện tích pic của Acid Alpha Lipoic, hệ số tương quan r = 0,9999, Độ tuyến tính tốt trong khoảng nồng độ khá rộng từ 1 - 20 tug/ml
Hệ thống sắc ký đáp ứng yêu cầu về độ lặp lại, độ lệch chuẩn tương đối
RSD của diện tích píc là 1,56 % c Độ lặp lại của phương pháp
Các thử nghiệm này được tiến hành trên mẫu thử viên nang Vimesol và
viên nang Metabosol cùng với mẫu chuẩn được tiến hành chuẩn bị như mục
2.2.1 Lưu ý là mỗi dung dịch thử phải được tiến hành với 6 mẫu riêng biệt
Tiêm lần lượt từng mẫu thử và chuẩn vào hệ thống LC-MS Tiến hành sắc ký
trong điều kiện đã chọn, tính toán hàm lượng các hoạt chất trong mẫu thử theo công thức sau: X (mg/@iên) = Šr*€xÐxm, Trong đó: S+, S¿ _ Mp my Sco x My x 1000
: Là diện tích pic của mẫu thử và mẫu chuẩn : Nồng độ dung dịch chất chuẩn (Iig/ml)
: Lượng cân mẫu thử (mg)
: Khối lượng trung bình viên (mg)
Trang 40
+ Hệ số pha loãng của mẫu thử
Độ lặp lại của phương pháp được đánh giá dựa vào độ lệch chuẩn tương
đối RSD Khi RSD càng nhỏ thì độ lặp lại càng cao
Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp được ghi ở bảng 2.4 và bảng 2.5
Bảng 2.4 Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp theo CTSK 3
(mẫu viên Vimesol)
STT L-Carnitin Acid Alpha Lipoic
(% so với trên nhãn) (% so với trên nhãn) l 100,22 99,18 2 100,11 99,00 3 100,21 99,17 4 100,33 99,01 5 99,98 99,58 6 100,19 99,34 TB 100,17 99,21 S 0,12 0,22 RSD (%) 0,12 0,22
Bang 2.5 Két qua khao sat d6 lap lai cla phương pháp theo CTSK 2
(mẫu viên Metabosol) STT l 2 3 4 5 6 a teenies 99,58 | 99,70 | 99,15 | 99,46 | 99,34 | 99,49 TB = 99,45 S=0,19 RSD = 0,19
Kết quả khảo sát độ lặp lại cho thấy: Độ lệch chuẩn tương đối của L- Carnitin trong mẫu viên Vimesol là 0,12 %; của Acid Alpha Lipoic trong mau viên Vimesol 1a 0,22 %, trong mẫu viên Metabosol là 0,19 % Kết quả này
cho phép ta áp dụng chương trình để định lượng các thành phần hoạt chất