Bài viết Định lượng acid Homovanillic (Hva) và acid Vanillylmandelic (Vma) trong nước tiểu bằng sắc ký khí khối phổ xây dựng và hiệu chuẩn quy trình kỹ thuật định lượng đồng thời acid homovanillic (HVA) và acid vanillylmandelic (VMA) niệu bằng sắc ký khí khối phổ. Phương pháp định lượng đồng thời HVA và VMA niệu bằng sắc ký khí khối phổ (GCMS) được xây dựng dựa trên phương pháp phân tích acid hữu cơ,... Mời các bạn cùng tham khảo.
TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC ĐỊNH LƯỢNG ACID HOMOVANILLIC (HVA) VÀ ACID VANILLYLMANDELIC (VMA) TRONG NƯỚC TIỂU BẰNG SẮC KÝ KHÍ KHỐI PHỔ Trần Thị Chi Mai1, Trần Thị Thu Trang2, Hoàng Trung Kiên2 Trường Đại học Y Hà Nội, 2Bệnh viện Nhi Trung ương Nghiên cứu nhằm xây dựng hiệu chuẩn quy trình kỹ thuật định lượng đồng thời acid homovanillic (HVA) acid vanillylmandelic (VMA) niệu sắc ký khí khối phổ Phương pháp định lượng đồng thời HVA VMA niệu sắc ký khí khối phổ (GCMS) xây dựng dựa phương pháp phân tích acid hữu cơ: tách chiết HVA VMA nước tiểu, tạo dẫn xuất di - tri (trimethylsilyl), phân tách định lượng phương pháp SIM GCMS Giới hạn phát phương pháp 0,9 µmol/L cho HVA VMA Khoảng tuyến tính HVA 5,68 đến 192,9 µmol/L, VMA 3,2 đến 221 µmol/L Sai số tồn tính toán phương pháp nhỏ sai số cho phép Qui trình kỹ thuật định lượng đồng thời VMA HVA niệu phương pháp GCMS xây dựng xác xác thực, sử dụng để phục vụ chẩn đoán theo dõi điều trị u nguyên bào thần kinh Từ khoá: acid homovanillic, acid vanillylmandelic, sắc ký khí khối phổ, u nguyên bào thần kinh I ĐẶT VẤN ĐỀ Các khối u có nguồn gốc từ mào thần kinh u nguyên bào thần kinh (UNBTKNeuroblastoma) hay u tuỷ thượng thận (Pheochrocytomas) có đặc điểm tăng tiết catecholamin Do vậy, việc định lượng catecholamin (noradrenalin, adrenalin) sản phẩm chuyển hoá chúng acid homovanillic (HVA) acid vanillylmandelic (VMA) đóng vai trò quan trọng chẩn đốn theo dõi điều trị bệnh nhân u nguyên bào thần kinh, u tuỷ thượng thận [1; 2] Trên giới, phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (High Performance liquid choromatography- HPLC) thường sử dụng định lượng HVA VMA nước tiểu.Tại Việt Nam, có phòng xét nghiệm định lượng VMA niệu phương pháp sử dụng đo quang sau tiến hành tinh Địa liên hệ: Trần Thị Chi Mai, Khoa Kỹ thuật Y học, Trường Đại học Y Hà Nội Email: mai.duong2@yahoo.com Ngày nhận: 08/01/2013 Ngày chấp thuận: 26/4/2013 TCNCYH 82 (2) - 2013 phần VMA sắc ký trao đổi ion Phương pháp rẻ tiền, đơn giản độ xác khơng cao nhiều yếu tố nhiễu Trước định lượng VMA niệu bệnh nhân không ăn số thực phẩm chuối, sô la Hiện chưa có phòng xét nghiệm Việt Nam triển khai kỹ thuật định lượng HVA niệu Việc định lượng đồng thời HVA VMA niệu phương pháp sắc ký khí khối phổ phương pháp nhạy đặc hiệu, nhiều tác giả giới phát triển sử dụng sàng lọc chẩn đoán u nguyên bào thần kinh [1; 2] Việc chuẩn hóa kỹ thuật đưa vào ứng dụng điều kiện phòng xét nghiệm nước ta nhằm cải thiện việc chẩn đoán theo dõi u nguyên bào thần kinh cần thiết Vì đề tài tiến hành với mục tiêu: xây dựng hiệu chuẩn qui trình kỹ thuật định lượng đồng thời VMA HVA niệu phương pháp sắc ký khối phổ II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP Chất liệu nghiên cứu Thiết bị: GCMS (GC 7890A - MS 5975) Agilent Cột sắc ký HP- 5MS 30m x 0,25 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC mm internal diameter x 0,25 um film thickness (Agilent).Hệ thống làm bay dung mơi khí nitơ Hóa chất: Acid 3-phenylbutyric hãng Sigma- Aldrich, BSTFA (N,O-bis(trimethylsilyl) trifluoroacetamide) hãng Supelco, Ethyl acetate Fluka Lyphocheck Quantitative Urine Control level level hãng Bio-Rad Chuẩn HVA/VMA (Calibrator for HVA/VMA urine) hãng Recipe Các dung môi hố chất khác hãng Merck có độ tinh khiết mức phân tích Bệnh phẩm: Mẫu nước tiểu ngẫu nhiên trẻ khoẻ mạnh trẻ bị u nguyên bào thần kinh, acid hoá HCl 6M sau thu thập bảo quản -20oC phân tích Phương pháp 2.1 Xây dựng quy trình kỹ thuật định lượng đồng thời HVA VMA niệu Chuẩn bị mẫu: cho 50 µl nội chuẩn acid 3- phenyl butyric vào ml nước tiểu, hỗn hợp bão hòa NaCl chiết tách ethyl acetate môi trường acid (pH < 1) Làm khô mẫu tách chiết khí nitơ Ủ mẫu với BSTFA 75 phút 80°C để gắn nhóm trimethylsilyl (trong BSTFA) với nhóm -OH phân tử HVA, với nhóm -OH VMA Phân tích GCMS tiến hành cột sắc ký HP - 5MS 30m x 0,25 mm internal diameter x 0,25 um film thickness (Agilent) Mẫu bơm bơm mẫu tự động Agilent 7693 Chương trình nhiệt độ lò từ 160oC đến 280oC vòng 15,8 phút Tốc độ khí He qua cột ml/ phút HVA VMA phát phổ khối theo phương pháp SIM (selected ion monitoring) Các ion đặc hiệu cho chất lựa chọn Đường chuẩn xây dựng chạy hỗn hợp chuẩn chứa lượng HVA VMA chuẩn biết chuẩn nội Ba mức chuẩn phân tích sắc ký khối phổ chạy mẫu thử, đỉnh tạo đo phương pháp SIM đường chuẩn ba điểm thiết lập cho chất phân tích Sau thiết lập đường chuẩn ba điểm cho HVA VMA, định lượng HVA VMA mẫu thử phần mềm Chemstation Sử dụng chuẩn nội để hiệu chỉnh mát trình chuẩn bị mẫu Hai mức vật liệu kiểm tra chất lượng (QC- Quality Control material) chạy với bệnh phẩm lần làm xét nghiệm định lượng HVA VMA nước tiểu 2.2 Các thực nghiệm đánh giá kỹ thuật Xác định giới hạn phát hiện: Tiến hành pha loãng 2, 4, 8, 16, 32 64 lần dung dịch chuẩn có nồng độ cao HCl 0,2 M (dung mơi dùng pha chuẩn) Các chuẩn pha lỗng chạy lần đợt phân tích theo quy trình chuẩn (standard operation procedures- SOP), tính SD CV nồng độ để xác định nồng độ thấp định lượng có độ xác chấp nhận (giới hạn phát hiện) Thực nghiệm đánh giá độ tuyến tính: Chuẩn bị hai hỗn hợp nước tiểu bệnh nhân Hỗn hợp thứ mẫu phân tích có nồng độ thấp Hỗn hợp thứ hai mẫu phân tích có nồng độ cao gần với cao giá trị dự đoán khoảng phân tích Trộn hai mẫu bệnh phẩm với tỷ lệ sau 1/0, 3/1, 1/1, 1/3 0/1 Tiến hành phân tích định lượng HVA VMA mẫu Mỗi mẫu làm lặp lại 03 lần Tính giá trị trung bình thu mẫu Vẽ đồ thị để đánh giá độ tuyến tính phần mềm Linchecker Philippe Marquis: trục hoành nồng độ tính tốn lý thuyết, trục tung nồng độ trung TCNCYH 82 (2) - 2013 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC bình đo Tính tốn độ dốc (slope) giao điểm với trục Y (intercept) So sánh độ dốc giao điểm tính tốn với độ dốc giao điểm mong muốn (là 0,0) Xác định độ xác: Hai loại vật liệu kiểm tra chất lượng (QC) bình thường bệnh lý phân tích lần chạy, mẫu chạy 15 lần (n = 15) để thu thập liệu đánh giá độ xác lần chạy Hai loại QC nước tiểu bình thường bệnh lý chạy 20 mẻ khác vòng tháng (n = 20) Tính giá trị trung bình, độ lệch chuẩn, CV để đánh giá độ xác lần chạy lần chạy Tiêu chuẩn chấp nhận: Độ xác lần chạy: SD < 0,25 sai số toàn cho phép Độ xác lần chạy: SD < 0,33 sai số toàn cho phép Thực nghiệm so sánh phương pháp: Các vật liệu ngoại kiểm amin sinh học chương trình ngoại kiểm Úc (RCPA) chạy vòng tháng liên tục: tháng 02 mẫu tuyến tính 01 mẫu bệnh phẩm ngoại kiểm Kết so sánh với trung bình SD ngoại kiểm Độ lệch (bias) giá trị so với trung bình chung ngoại kiểm biểu diễn dạng đồ thị để đánh giá độ lệch hệ thống (systemic bias) độ không xác thực (inaccuracy) Đạo đức nghiên cứu: Nghiên cứu chấp thuận Hội đồng Y đức bệnh viện Nhi Trung ương III KẾT QUẢ Hình Sắc ký đồ tổng số chạy phương pháp SIM Với chương trình chạy sắc ký khí sau: nhiệt độ lò ban đầu 160oC, tốc độ tăng nhiệt giai đoạn đầu 8oC/phút, 50oC/phút, tổng thời gian phân tích cho mẫu 15,8 phút; kết sắc ký đồ (hình 1) cho thấy nội chuẩn có thời gian lưu 4,95, HVA 9,13 VMA 10,6 phút Khi qua detector khối phổ, với chế ion hóa điện (electron impact mass spectrometry), nội chuẩn chất cần phân tích bị bắn phá thành mảnh ion đặc trưng Trong phương pháp này, nội chuẩn hai chất cần phân tích lựa chọn mảnh ion đích ion định lượng Tại nồng độ pha loãng thấp HVA VMA 0,9 µmol/L, CV 5,9% 6,3%, xem 0,9 µmol/L giới hạn phát HVA VMA TCNCYH 82 (2) - 2013 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC B A Hình Đồ thị tuyến tính HVA (a) MA (b) Phương trình thể mối tương quan nồng độ HVA đo với nồng độ HVA tính tốn theo lý thuyết y= 0,998 x – 0,3985 Như vậy, độ dốc 0,998 giao điểm với trục tung - 0,3985 Khoảng nồng độ HVA thử nghiệm đánh giá độ tuyến tính từ 5,68 đến 192,9 µmol/L Phương trình thể mối tương quan nồng độ VMA đo với nồng độ VMA tính tốn theo lý thuyết y = 0,9974 x + 0,2151 Như vậy, độ dốc 0,9974 giao điểm với trục tung 0,2151 Khoảng nồng độ VMA thử nghiệm đánh giá độ tuyến tính từ 3,2 đến 221 µmol/L Bảng Độ xác phương pháp Mẫu Độ xác lần chạy (n = 15) Độ xác lần chạy (n = 20) HVA VMA QC mức QC mức QC mức QC mức X (µmol/L) 10,9 87,8 18,2 90,6 SD 0,27 1,06 0,54 1,61 CV (%) 2,45 1,2 2,97 1,79 X (µmol/L) 10,2 84,7 16,9 85,4 SD 0,37 1,77 0,75 2,48 CV (%) 3,6 2,1 6,6 2,6 Độ biến thiên (CV) lần chạy hai thông số HVA VMA 5% Độ biến thiên (CV) lần chạy HVA nhỏ 5% Với VMA, CV QC mức 6,6%, QC mức nhỏ 5% TCNCYH 82 (2) - 2013 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC GCMS 120 200 GCMS 100 160 80 120 60 80 40 40 20 A B Ngoai kiem 20 40 60 80 Unweighted linear regression N = 12 Slope : 0.971 [ 0.898 to 1.043 ] Intercept : 0.0 [ -5.4 to 5.4 ] 100 120 0 Ngoai kiem 40 80 120 Unweighted linear regression N = Slope : 1.021 [ 0.936 to 1.107 ] Intercept : 1.4 [ -5.7 to 8.4 ] 160 200 Hình Đồ thị so sánh kết mẫu HVA tuyến tính (a) bệnh phẩm (b) với kết ngoại kiểm Trong vòng tháng, 12 mẫu ngoại kiểm HVA tuyến tính chương trình ngoại kiểm amin sinh học Úc phân tích phương pháp sắc ký khối phổ xây dựng phòng xét nghiệm Kết cho thấy, khơng có mẫu ngồi giới hạn cho phép Đồ thị có độ dốc 0,971 giao điểm Các thơng số tính tốn độ xác là: SD = 4, CV = 6,4% Thông số tính tốn độ xác thực độ lệch (bias) = 1,9 Sáu mẫu ngoại kiểm HVA bệnh phẩm (nước tiểu bệnh nhân) chương trình ngoại kiểm amin sinh học Úc phân tích phương pháp GCMS xây dựng phòng xét nghiệm Kết cho thấy khơng có mẫu ngồi giới hạn cho phép Đồ thị có độ dốc 1,021 giao điểm 1,4 Các thơng số tính tốn độ xác là: SD = 4,2, CV = 4,7% Thơng số tính tốn độ xác thực độ lệch (bias) = 3,2 IV BÀN LUẬN Phương pháp định lượng HVA VMA phát triển dựa phương pháp kinh điển để xác định thành phần acid hữu niệu: chiết tách ethyl acetate/tạo dẫn xuất trimethylsilyl/phân tách định lượng HVA VMA thực phương pháp SIM (selected ion monitoring) máy sắc ký khối phổ Đường chuẩn chạy lần với mẫu thử đánh giá tính hợp thức vật liệu kiểm tra chất lượng (QC hai mức Bio- Rad) Kết mẫu bệnh phẩm chấp nhận QC nằm giới hạn cho phép Phương pháp định lượng đồng thời HVA VMA sắc ký khối phổ kỹ thuật thực lần phòng xét nghiệm (in-house development), cần phải đánh giá trước TCNCYH 82 (2) - 2013 đưa vào sử dụng Các thực nghiệm nhằm đánh giá sai số phương pháp Phương pháp chấp nhận sai số khơng ảnh hưởng đến việc phân tích diễn giải kết xét nghiệm, không ảnh hưởng đến việc chẩn đoán theo dõi điều trị bệnh Giá trị 0,9 µmol/L xem giới hạn định lượng HVA VMA phương pháp Nghiên cứu Kaluzna cộng có giới hạn định lượng HVA 1,26 µmol/L, VMA 0,76 µmol/L [4] Khoảng tuyến tính HVA xác định 5,36 - 194 µmol/L, VMA 3,2 - 222 µmol/L Độ dốc hai đồ thị xấp xỉ giao điểm xấp xỉ (hình 2) Như vậy, khoảng tuyến tính hai thơng số định lượng phương pháp bao phủ vùng giới hạn có ý nghĩa định chẩn đốn bệnh TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC Thực nghiệm xác định độ xác cho phép đánh giá sai số ngẫu nhiên phép phân tích Thực nghiệm xác định độ xác phương pháp định lượng HVA VMA sắc ký khối phổ tiến hành hai mẫu vật liệu kiểm tra chất lượng: QC mức có nồng độ HVA VMA nằm giới hạn bình thường QC mức có nồng độ hai thơng số mức bệnh lý Kết bảng cho thấy độ biến thiên (CV) lần chạy lần chạy hai mức đạt tiêu chuẩn Căn vào tiêu chuẩn mong muốn cho xét nghiệm định lượng HVA VMA niệu Ricos cộng [4], CV < 11,1 %, sai số tồn cho phép < 31,3% CV thơng số HVA lần chạy với hai mức QC 2,45% 1,2%, nhỏ 0,25 lần sai số toàn cho phép (0,25 x 31,3% = 7,825%) CV thông số HVA lần chạy với hai mức QC 3,6% 2,1 %, nhỏ 0,33 lần sai số toàn cho phép (0,33 x 31,3% = 10,4%) Tương tự, CV thông số VMA lần chạy với hai mức QC 2,97% 1,97%, nhỏ 0,25 lần sai số toàn cho phép (0,25 x 31,3 = 7,825%) CV thông số VMA lần chạy với hai mức QC 6,6% 2,6 %, nhỏ 0,33 lần sai số toàn cho phép (0,33 x 31,3% = 10,4%) Như vậy, độ xác xét nghiệm định lượng HVA VMA sắc ký khối phổ giá trị có ý nghĩa lâm sàng chấp nhận Thực nghiệm so sánh phương pháp tiến hành để đánh giá độ không xác thực (inaccuracy) hay sai số hệ thống Nghiên cứu tiến hành phân tích mẫu ngoại kiểm amin sinh học Úc phương pháp xây dựng phòng xét nghiệm Tuy nhiên, chương trình ngoại kiểm amin sinh học khơng có thơng số VMA nên có HVA xem xét đánh giá Với 12 mẫu ngoại kiểm HVA tuyến tính, khơng có mẫu giới hạn cho phép Đồ thị so sánh phương pháp sắc ký khối phổ với giá trị trung vị ngoại kiểm có độ dốc 0.971 giao điểm Các thông số tính tốn độ xác là: SD = 4, CV = 6,4% Thơng số tính tốn độ xác thực độ lệch = 1,9 Như sai số toàn tính tốn cho mẫu HVA tuyến tính là: độ lệch + x SD = 1,9 + x = 13,9, nhỏ sai số toàn cho phép xét nghiệm định lượng HVA niệu 31,3 Với mẫu ngoại kiểm HVA bệnh phẩm (nước tiểu bệnh nhân), khơng có mẫu kết giới hạn cho phép Đồ thị so sánh phương pháp sắc ký khối phổ với giá trị trung vị ngoại kiểm có độ dốc 1,021 giao điểm 1,4 Các thơng số tính tốn độ xác là: SD = 4,2, CV = 4,7% Thơng số tính tốn độ xác thực độ lệch = 3,2 Như sai số tồn tính toán cho mẫu HVA bệnh phẩm là: độ lệch + x SD = 3,2 + x 4,2 = 15,8, nhỏ sai số toàn cho phép xét nghiệm định lượng HVA niệu 31,3 [5] Như vậy, phương pháp định lượng HVA VMA niệu GCMS chuẩn hố phòng xét nghiệm hồn tồn chấp nhận độ xác độ xác thực V KẾT LUẬN Quy trình kỹ thuật định lượng đồng thời VMA HVA niệu phương pháp sắc ký khối phổ: chiết tách HVA VMA ethyl acetate/ tạo dẫn xuất trimethylsilyl/ sử dụng hệ thống sắc ký khối phổ để phân tách định lượng Các thực nghiệm hiệu chuẩn qui trình kỹ thuật định lượng đồng thời VMA HVA niệu phương pháp sắc ký khối phổ cho thấy phương pháp thực cho kết xác xác thực, sử dụng để TCNCYH 82 (2) - 2013 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC phục vụ chẩn đoán theo dõi điều trị u nguyên bào thần kinh Lời cảm ơn Xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc tới Ban giám đốc bệnh viện Nhi Trung ương, Hiệp hội Hoá sinh lâm sàng châu Á Thái Bình Dương, TS Ronda Greaves - Giảng viên Trường đại học RMIT, hỗ trợ kinh phí kỹ thuật cho nghiên cứu TÀI LIỆU THAM KHẢO Fauler G., Leis H.J, Huber E., Schellauf Ch et al (1997) Detarmination of homovanillic acid and vanillylmandelic acid in neuroblastoma Screening by Stable Isotope Dilution GCMS Journal of mass spectrometry 32, 507 - 514 Allenbrand R and Garg U (2010) Quantitation of Homovanillic acid (HVA) and Vanillylmandelic acid (VMA) in urine using Gas chromatography- Mass spectrometry (GCMS) Clinical Applications of Mass Spectrometry, Method in Molecular Biology 603, 261- 269 James O Westgard, Elsa F Quam, Patrici L Brarry, Sharon S Ehrmeyer (1999) Basic method validation WesTgard QC Kaluzna-Czaplinska J, Socha E, Rynkowski J (2010) Determinnation of homovanillic acid and vanillulandelic acid in urine of autistic children by gas chromatography/mass spectrometry Med Sci Monit 16(9), 445 - 450 Ricos C, Alvarez V, Cava F, GarciaLario JV, Hernandez A, Jimenez CV, Minchinela J, Perich C, Simon M (1999) Desirable specifications for Total Error, Imprecision, and Bias, derived from intra – and inter – individual biologic variation Scand J Clin Lab Invest 59, 491 - 500 Summary QUANTITATION OF URINARY HOMOVANILLIC ACID (HVA) AND VANILLYLMANDELIC ACID (VMA) BY GAS CHROMATOGRAPHY - MASS SPECTROMETRY Elevated levels of HVA and VMA in urine are often indicated as the presence of neural crest derived tumors such as neuroblastoma in children and ganglioneuroma in adults A simple method of measuring urine HVA and VMA levels simultaneously would reduce the time and cost of diagnosis and treatment of these neural crest derived tumors The aim of this study was to develop and validate a method to measure the concentrations of HVA and VMA simultaneously by GCMS We have successfully developed a rapid and simple method for simultaneously quantizing the concentrations of HVA and VMA in urine using GCMS Urine samples were collected and HVA and VMA were extracted and derived into their respective di- and tri(trimethylsilyl) derivatives The derivatives were separated and quantified by SIM (Selected Ion Monitoring) on GCMS system The measuring limits for measuring both HVA and VMA in urine by GCMS were 0.9µmol/L The linearity range of HVA was 5.68 to 192.9 µmol/L and of VMA was 3.2 to 221 µmol/L The calculated total errors were smaller than the acceptable total values Therefore, this method allows clinicians to measurea accurately the concentrations of urinary VMA and HVA simultaneously using GCMS This simple technique can be applied to the routine diagnosis and treatment monitoring of neuroblastoma Keywords: homovanillic acid (HVA), vanillylmandelic acid (VMA), Gas chromatography mass spectrometry(GCMS), Neuroblastoma TCNCYH 82 (2) - 2013 ... pháp sắc ký khối phổ: chiết tách HVA VMA ethyl acetate/ tạo dẫn xuất trimethylsilyl/ sử dụng hệ thống sắc ký khối phổ để phân tách định lượng Các thực nghiệm hiệu chuẩn qui trình kỹ thuật định lượng. .. phép xét nghiệm định lượng HVA niệu 31,3 Với mẫu ngoại kiểm HVA bệnh phẩm (nước tiểu bệnh nhân), khơng có mẫu kết ngồi giới hạn cho phép Đồ thị so sánh phương pháp sắc ký khối phổ với giá trị... số ngẫu nhiên phép phân tích Thực nghiệm xác định độ xác phương pháp định lượng HVA VMA sắc ký khối phổ tiến hành hai mẫu vật liệu kiểm tra chất lượng: QC mức có nồng độ HVA VMA nằm giới hạn