Mô tả kết quả định lượng steroid niệu bằng kỹ thuật sắc ký khí- khối phổ (GC-MS) ở các bệnh nhân tăng sản thượng thận bẩm sinh (TSTTBS) và rối loạn phát triển giới tính (RLPTGT). Đối tượng và phương pháp: Mẫu nước tiểu ngẫu nhiên của các bệnh nhân nghi mắ
Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số * 2018 ĐỊNH LƯỢNG STEROID NIỆU BẰNG SẮC KÝ KHÍ KHỐI PHỔ TRONG CHẨN ĐOÁN TĂNG SẢN THƯỢNG THẬN BẨM SINH VÀ RỐI LOẠN PHÁT TRIỂN GIỚI TÍNH Trần Thị Ngọc Anh1, Trần Thị Chi Mai2, Trần Minh Điển3, Vũ Chí Dũng3, Ronda F Greaves4 TĨM TẮT Mục tiêu: Mơ tả kết định lượng steroid niệu kỹ thuật sắc ký khí- khối phổ (GC-MS) bệnh nhân tăng sản thượng thận bẩm sinh (TSTTBS) rối loạn phát triển giới tính (RLPTGT) Đối tượng phương pháp: Mẫu nước tiểu ngẫu nhiên bệnh nhân nghi mắc TSTTBS, RLPTGT Bệnh viện Nhi trung ương từ 1/2016 đến 1/2017 Định lượng steroid niệu kỹ thuật GC-MS máy Agilent Kết quả: 35/42 bệnh nhân chẩn đoán TSTTBS, RLPTGT 33 bệnh nhân thiếu enzym 21hydroxylase, bệnh nhân thiếu enzym 11β-hydroxylase, bệnh nhân thiếu 5α-reductase Đặc trưng thiếu hụt 21-hydroxylase nồng độ PT tỷ lệ PT/(THE+THF+5α-THF) cao khoảng tham chiếu Đặc trưng cho thiếu hụt 11β-hydroxylase nồng độ THS tỷ lệ THS/(THE+THF+5α-THF) cao khoảng tham chiếu Đặc trưng cho thiếu hụt enzym 5α-reductase tỷ lệ 5α-THF/THF thấp, tỷ lệ E/A cao giá trị khoảng tham chiếu Kết luận: Kỹ thuật định lượng steroid niệu phương pháp GC-MS cơng cụ tốt giúp chẩn đốn TSTTBS RLPTGT thiếu hụt enzym 21-hydroxylase, 11β-hydroxylase, 5α-reductase thăm dò nội tiết cho bệnh nhân Từ khóa: Tăng sản thượng thận bẩm sinh, thiếu 21-hydroxylase, 11β-hydroxylase, 5α-reductase 2, sắc ký khí- khối phổ ABSTRACT URINE STEROID PROFILING BY GAS CHROMATOGRAPHY- MASS SPECTROMETRY IN DIAGNOSIS OF CONGENITAL ADRENAL HYPERPLASIA AND DISORDERS OF SEX DEVELOPMENT Tran Thi Ngoc Anh, Tran Thi Chi Mai, Tran Minh Đien, Vu Chi Dung, Greaves F Ronda * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 22 - No 3- 2018: 196 - 204 Aims: To describe the characteristic pattern of gas chromatography- mass spectrometry (GC-MS) urine steroid profiling of the patients with congenital adrenal hyperplasia and disorders of sex development Material and method: Random urine samples from patients suspected having congenital adrenal hyperplasia or disorders of sex development were collected in Nation Children’s hospital The urine steroid metabolites were analysed by GC-MS on Agilent machine Results: Among 42 patients suspected of CAH/DSD, there are 33 patients with 21-hydroxylase deficiency, one with 11β-hydroxylase deficiency and one with 5α-reductase In the patients with 21-hydroxylase deficiency, pregnanetriol (PT) level was very high, ratio PT/(THE+THF+5α-THF) higher than normal In the patient with 11β-hydroxylase deficiency, THS level and ratio of THS/(THE+THF+5α-THF) higher than normal In the patient with 5α-reductase deficiency, the ratio of 5α-THF/THF was lower and the ratio of E/A was higher than reference intervals Trường Đại học Y Hà Nội Bệnh viện Nhi trung ương Bệnh viện Việt Đức Tác giả liên lạc: Trần Thị Ngọc Anh ĐT: 0904395444 Email: ngocanhbm@gmail.com 196 Đại học RMIT Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số * 2018 Nghiên cứu Y học Conclusions: The urine steroid profiling by GC-MS is a useful tool in the investigation and diagnosis of CAH and DSD due different steroidogenesis defect and should be included a first-line endocrine investigation in this group of patients Keywords: Congenital adrenal hyperplasia (CAH), disorders of sex development (DSD), 21-hydroxylase deficiency, 11β-hydroxylase deficiency, 5α-reductase deficiency, GC-MS ĐẶT VẤN ĐỀ ĐỐITƯỢNG-PHƯƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU Thiếu hụt enzym tham gia Đối tượng trình tổng hợp hormon steroid gây tăng sản Nhóm bệnh thượng thận bẩm sinh rối loạn phát triển giới Tiêu chuẩn lựa chọn tính TSTTBS bệnh di truyền gen lặn Mẫu nước tiểu bệnh nhân nghi ngờ mắc TSTTBS, RLPTGT trước điều trị nhiễm sắc thể thường Nguyên nhân thường gặp gây TSTTBS thiếu hụt enzym 21hydroxylase chiếm 90% trường hợp, Bệnh nhân, gia đình đồng ý tham gia nghiên cứu thiếu hụt 11β-hydroxylase chiếm 5-8% Tiêu chuẩn loại trừ trường hợp, nguyên nhân khác gây TSTTBS Bệnh nhân chẩn đoán điều trị TSTTBS từ trước thiếu 3β-HSD, 17α-hydroxylase/17,20 lyase gặp(8) Trong thiếu hụt enzym 5αreductase nguyên nhân rối loạn phát triển giới tính thường gặp người mang nhiễm sắc thể 46,XY(1,2) Định lượng steroid niệu phương pháp GC-MS cho phép chẩn đoán phần lớn trường hợp thiếu 21-hydroxylase cổ điển, thiếu 11β-hydroxylase cổ điển thiếu 5αreductase Tại Việt Nam, số ca mắc TSTTBS RLPTGT quản lý điều trị bệnh viện Nhi trung ương khoảng 840 bệnh nhân Đồng thời, số bệnh nhân TSTTBS thể thiếu 21-hydroxylase RLPTGT phát điều trị phẫu thuật BV Việt Đức(9,11) Tại khoa Hóa sinh- BV Nhi trung ương, ứng dụng thẩm định thành công kỹ thuật định lượng steroid niệu phương pháp sắc ký khí – khối phổ(10), kỹ thuật giúp chẩn đoán xác định số thể bệnh TSTTBS RLPTGT Mục tiêu mô tả đặc điểm kết định lượng steroid niệu GC-MS bệnh nhân TSTTBS, RLPTGT thiếu 21-hydroxylase, 11β- hydroxylase, 5α-reductase thực khoa Hóa sinh – Bệnh viện Nhi trung ương Bệnh nhân, gia đình khơng đồng ý tham gia nghiên cứu Thời gian thu thập mẫu tháng 1/2016 đến 1/2017 khoa khoa Nội tiết – Chuyển hóa – Di truyền –BV Nhi trung ương Sau phân tích steroid niệu phát hiện: 33 bệnh nhân thiếu 21-hydroxylase, có bệnh nhân phân tích gen CYP21A2 có đột biến khẳng định thiếu 21-hydroxylase bệnh nhân thiếu 11β-hydroxylase: nam, tháng tuổi, tim bẩm sinh kết hợp Phân tích phát đột biến gen CYP11B giúp khẳng định thiếu 11β-hydroxylase bệnh nhân thiếu 5α-reductase 2: 13 tuổi, kiểu hình nữ Nhóm chứng Mẫu nước tiểu ngẫu nhiên 191 trẻ bình thường, nam nữ tương đương Độ tuổi từ ngày đến 12 tuổi Mẫu lấy trường tiểu học, mẫu giáo Hà Nội, khoa sản –BV Đa khoa Vĩnh Phúc Bệnh phẩm Mẫu nước tiểu ngẫu nhiên >3 mL, bảo quản -20oC đến phân tích 197 Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số * 2018 Nghiên cứu Y học Đạo đức nghiên cứu: Hội đồng đạo đức y học trường Đại học Y Hà Nội thông qua Định lượng creatinine niệu máy Beckman AU 680 Phương pháp nghiên cứu Kết định lượng steroid niệu tính đơn vị µmol/L µmol/mmol creatinine Nghiên cứu mơ tả cắt ngang Quy trình định lượng steroid niệu GC-MS: Định lượng 17OH Progesterone (17OHP) kỹ thuật ELISA Thủy phân steroid niệu liên hợp enzym glucuronidase arylsulphatase Tách chiết steroid tự cột Bond-Elut C18 làm khơ dung dịch khí ni tơ Tạo dẫn xuất steroid với methoxyamine/pyridine 3% trimethylsilyl imidazol Tách chiết mẫu steroid Iso-octan, phân tích máy GC-MS 7890A hãng Agilent Độ lặp lại lần chạy có CV đạt từ 1,01-7,72% với mẫu bình thường từ 0,78-9,2% với mẫu nước tiểu bệnh lý Độ tái lặp lại lần chạy có CV đạt 10,16-14,53% với mẫu bình thường 12,5116,95% với mẫu bệnh lý Độ thu hồi sản phẩm từ 90-115%, giới hạn định lượng từ 0,050,16 µmol/L tùy sản phẩm(10) Xử lý số liệu: phần mềm thống kê Medcalc, SPSS KẾT QUẢ Giá trị khoảng tham chiếu Có 16 sản phẩm steroid niệu định lượng sản phẩm bán định lượng (THS) số 100 sản phẩm chuyển hóa hormon steroid nước tiểu Tuy nhiên để giúp chẩn đoán thiếu 21-hydroxylase, 11βhydroxylase 5α-reductase thường dùng số sản phẩm chuyển hóa tỷ lệ Bảng Giá trị khoảng tham chiếu xây dựng cho 191 trẻ bình thường, chia làm nhóm tuổi, khơng có khác biệt kết định lượng steroid niệu nam nữ với p> 0,05 cho thông số sau Bảng 1: Giá trị khoảng tham chiếu xét nghiệm steroid niệu trẻ em Số TT Ion định lượng 1-30 ngày (m/z) (n=44) PT 435