Khảo sát khả năng ức chế enzym tyrosinase của dịch nuôi cấy nấm mốc Aspergillus oryzae (Ahlb.) E.Cohn trong môi trường chứa chè xanh Camellia sinensis (L.) Kuntze

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN HỮU ĐỨC KHẢO SÁT KHẢ NĂNG ỨC CHẾ ENZYM TYROSINASE CỦA DỊCH NUÔI CẤY NẤM MỐC Aspergillus oryzae (Ahlb.) E Cohn TRONG MÔI TRƯỜNG CHỨA CHÈ XANH Camellia sinensis (L.) Kuntze KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2019 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN HỮU ĐỨC MÃ SINH VIÊN: 1401147 KHẢO SÁT KHẢ NĂNG ỨC CHẾ ENZYM TYROSINASE CỦA DỊCH NUÔI CẤY NẤM MỐC Aspergillus oryzae (Ahlb.) E Cohn TRONG MÔI TRƯỜNG CHỨA CHÈ XANH Camellia sinensis (L.) Kuntze KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: PGS.TS Đàm Thanh Xuân Nơi thực hiện: Bộ môn Công nghiệp Dược HÀ NỘI - 2019 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới PGS.TS Đàm Thanh Xuân – người thầy truyền dạy cho học quý báu lòng yêu khoa học từ ngày đầu nghiên cứu tới nay, hết lòng hướng dẫn, tận tâm bảo giúp đỡ tơi hồn thành khóa luận tốt nghiệp Tơi xin chân thành cảm ơn thầy, cô giáo anh, chị kỹ thuật viên Bộ môn Công nghiệp Dược, đặc biệt tổ Công nghệ Sinh học bảo, giúp đỡ tơi giải khó khăn tạo điều kiện cho tơi hồn thành khóa luận Tơi xin gửi lời cảm ơn đến Ban giám hiệu, phịng ban tồn thể thầy giáo trường Đại học Dược Hà Nội dạy dỗ, tạo môi trường tốt cho học tập nghiên cứu trường suốt năm Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, người thân bạn bè bên, tiếp cho động lực, giúp đỡ quãng đường học tập nghiên cứu Hà Nội, ngày 10 tháng 05 năm 2019 Sinh viên Nguyễn Hữu Đức MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ Chương TỔNG QUAN 1.1 Aspergillus oryzae 1.1.1 Chi Aspergillus 1.1.2 Loài Aspergillus oryzae 1.2 Enzym tyrosinase 1.2.1 Định nghĩa 1.2.2 Vai trò 1.2.3 Một số chất ức chế tyrosinase, chế ứng dụng 1.3 Chè xanh 11 1.3.1 Vài nét chè xanh 11 1.3.2 Các catechin chè xanh 12 1.4 Một số nghiên cứu tác dụng ức chế tyrosinase chè xanh Aspergillus oryzae 14 Chương ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị 16 2.1.1 Nguyên vật liệu 16 2.1.2 Thiết bị sử dụng 18 2.2 Nội dung nghiên cứu 19 2.2.1 Khảo sát khả sinh trưởng Aspergillus oryzae dịch chiết chè xanh 19 2.2.2 Thử hoạt tính ức chế enzym tyrosinase dịch lên men 20 2.3 Phương pháp nghiên cứu 20 2.3.1 Phương pháp giữ giống 20 2.3.2 Phương pháp lên men 20 2.3.3 Phương pháp định tính acid kojic từ dịch lên men [10] 21 2.3.4 Phương pháp thử hoạt tính ức chế enzym tyrosinase [33] 21 2.3.5 Phương pháp Schoorl - Regenbogen định lượng đường khử [5] 22 2.3.6 Phương pháp định lượng đường saccharose [9] 23 Chương THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 24 3.1 Khảo sát khả sinh trưởng Aspergillus oryzae mơi trường có chứa dịch chiết chè 24 3.1.1 Định lượng đường tiêu thụ Aspergillus oryzae từ dịch sau lên men 24 3.1.2 Khảo sát khối lượng sinh khối khô thu 27 3.1.3 Định tính kết tinh acid kojic dịch lên men sau kết thúc môi trường 29 3.2 Thử hoạt tính ức chế enzym tyrosinase dịch ni cấy 32 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT C Catechin CG Catechin gallate cs cộng DMSO Dimethyl sulfoxide EC Epicatechin ECDG Epicatechin digallate ECG Epicatechin gallate EGC Epigallocatechin EGCDG Epigallocatechin digallate EGCG Epigallocatechin gallate GC Môi trường lên men sử dụng glucose 10% dịch chiết nước chè xanh GC Gallocatechin GCG Gallo catechin gallate GN Môi trường lên men sử dụng glucose 10% nước RO RO Reverse Osmosis – Thẩm thấu ngược S10C Môi trường lên men sử dụng saccharose 10% dịch chiết nước chè xanh S20C Môi trường lên men sử dụng saccharose 20% dịch chiết nước chè xanh DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Độc tố số chủng giống nấm mốc thuộc chi Aspergillus Bảng 1.2 Thành phần polyphenol nguyên liệu chè theo vùng vụ thu hái 12 Bảng 2.1 Các hóa chất sử dụng đề tài 16 Bảng 2.2 Các môi trường sử dụng đề tài 17 Bảng 2.3 Các thiết bị sử dụng 19 Bảng 3.1 Các môi trường lên men Aspergillus oryzae 24 Bảng 3.2 Hàm lượng đường glucose (GN, GC) saccharose (S10C, S20C) môi trường trước sau lên men 25 Bảng 3.3 Kết khối lượng sinh khối khô thu 28 Bảng 3.4 Kết kết tinh sản phẩm từ dịch lên men sau kết thúc môi trường nuôi cấy 31 Bảng 3.5 Kết % ức chế tyrosinase dịch nuôi cấy mơi trường khác nồng độ thử 100 µg/ml 33 Bảng 3.6 Kết % ức chế tyrosinase dịch nuôi cấy môi trường khác nồng độ thử 500 µg/ml 33 Bảng 3.7 Kết % ức chế tyrosinase chất đối chứng hydroquinone 33 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1 Aspergillus oryzae kính hiển vi quang học (a), (b) kính hiển vi điện tử (c) Hình 1.2 Con đường phản ứng tổng hợp sắc tố melanin từ tyrosin Hình 1.3 Cơng thức tổng qt catechin 13 Hình 1.4 Một số cấu trúc catechin chè xanh điển hình 13 Hình 3.1 Khối lượng đường tiêu thụ trình lên men 26 Hình 3.2 Khối lượng trung bình sinh khối khô Aspergillus oryzae nuôi cấy môi trường 28 Hình 3.3 Hình ảnh định tính acid kojic dịch sau lên men môi trường lên men GN (trái) GC (phải) 30 Hình 3.4 Hình ảnh sản phẩm thu kết tinh dịch sau lên men môi trường nuôi cấy GN (a) GC, S10C, S20C (b) 31 Hình 3.5 Biểu đồ biểu thị giá trị % ức chế trung bình mơi trường lên men enzym tyrosinase 34 ĐẶT VẤN ĐỀ Từ xưa đến nay, làm đẹp vấn đề đặc biệt trọng nữ giới nam giới Trong thời đại công nghiệp phát triển nay, người ngày tiếp xúc nhiều với hóa chất độc hại, với mơi trường bị nhiễm bên ngồi khiến da nhanh chóng bị tổn hại, ảnh hưởng đến vẻ đẹp bên Ngoài yếu tố bất lợi nguyên nhân dẫn đến xuất bệnh liên quan đến da tăng cường mức hắc tố da, làm da xuất nhiều mảng tối màu bất thường dẫn đến ung thư da Do chế phẩm chăm sóc da, làm trắng da ngày sử dụng nhiều Hiện thị trường có số chất sử dụng làm trắng da có nguồn gốc tổng hợp hóa học hydroquinone, hydrogen peroxide…- thuộc nhóm có khả ức chế tốt enzym tyrosinase - có tác dụng hiệu làm sáng da chiếm ưu gây hại cho người sử dụng [19], sản phẩm có nguồn gốc tự nhiên ngày ưa chuộng trọng đầu tư nghiên cứu [14] Trong nghiên cứu thành phần làm trắng da chứa dịch chiết chè xanh nuôi cấy với Aspergillus oryzae nhóm tác giả CHANG cs cho kết khả quan [16] Tuy nhiên Việt Nam chưa có báo đề cập nghiên cứu vấn đề Do đó, để góp phần vào nghiên cứu chất trắng da, đề tài “Khảo sát khả ức chế enzym tyrosinase dịch nuôi cấy nấm mốc Aspergillus oryzae (Ahlb.) E Cohn môi trường chứa chè xanh Camellia Sinensis (L.) Kuntze” tiến hành với mục tiêu sau: - Khảo sát khả phát triển Aspergillus oryzae môi trường có chứa dịch chiết chè xanh - Thử hoạt tính ức chế enzym tyrosinase dịch chiết chè xanh lên men Aspergillus oryzae CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Aspergillus oryzae 1.1.1 Chi Aspergillus Năm 1729, Pier Antonio Micheli - nhà thực vật học người Ý khai sinh ngành nấm học qua tài liệu công bố “giống lạ” Nhưng theo giáo sư Ekrikssion Gunnan (1978) người có cơng nghiên cứu sâu nấm mốc lại Elias Fries (1794 – 1874) Elizabeth Tootyll (1984) cho nấm mốc có khoảng 5.100 giống 50.000 lồi mơ tả, nhiên ước tính có 100.000 đến 250.000 loài nấm diện trái đất [7] Aspergillus chi tiếng nghiên cứu nhiều Giống nấm Aspergillus lên đến 200 lồi, có khoảng 20 lồi gây hại cho người Aspergillus có dạng hình sợi, phân nhánh, có vách ngăn, khơng màu, màu nhạt trở nên nâu, nâu nhạt số vùng định khuẩn lạc Sợi nấm đa bào, đầu sợi nấm sinh sản phình to tạo thành tế bào hình chai, phía mọc cuống sinh bào tử đính Các bào tử đính xịe hoa cúc Về màu sắc: Aspergillus niger màu đen, Aspergillus oryzae màu vàng hoa cau, Aspergillus awamori màu đen, Aspergillus flavus màu vàng xanh, Aspergillus usami màu đen nâu Chúng phân bố chủ yếu bề mặt loại lương thực thực phẩm trình bảo quản, đất, nhiều loại đồ dùng gia đình, số đồ dùng cơng nghiệp cịn kí sinh thể sống Nhiều lồi đóng vai trị vi sinh vật phân hủy chất hữu cơ, số lồi dùng cơng nghiệp để tạo acid oxalic, acid citric, nhiều loại men, chất kháng sinh… Ở Việt Nam, Aspergillus oryzae sử dụng từ lâu với mục đích làm tương gọi mốc vàng, mốc hoa cau [8] Vào năm 1960, người Anh chịu thiệt hại lớn vụ dịch gà tây ăn phải khô lạc mốc nhập từ Braxin với nguyên nhân phát độc tố Aspergillus flavus Người ta xác định độc tố đặt tên aflatoxin, tên chắp từ ba chữ: “A” chữ “Aspergillus”, “fla” chữ “flavus” “toxin” nghĩa độc tố Cho đến cuối năm 1973 aflatoxin phát tới 16 loại Các aflatoxin ý nhiều aflatoxin gây ung thư aflatoxin ức chế enzym tyrosinase dịch sau lên men chủ yếu đến từ tác dụng ức chế acid kojic diện dịch lên men thu Trong nghiên cứu nhóm tác giả CHANG cs người Hàn Quốc, dịch nuôi cấy sau kết thúc lên men Aspergillus oryzae với dịch chiết nước nóng chè xanh, tương tự so với đề tài, cho kết tỉ lệ ức chế enzym tyrosinase nồng độ 25 ppm 60% [16] Kết lớn nhiều so với kết đề tài thu mơi trường lên men có sử dụng dịch chiết nóng chè xanh gồm GC, S10C S20C nồng độ thử hoạt tính ức chế 100 µg/ml 500 µg/ml (tương đương 100ppm 500ppm) Tuy đề tài nghiên cứu sử dụng dịch chiết chè xanh, loại chè sử dụng khác biệt Loại chè mà đề tài sử dụng trồng Việt Nam thuộc loại thứ chè Trung Quốc (C sinensis var sinensis), cịn chè Hàn Quốc chủ yếu thuộc thứ chè Assam (C sinensis var assamica) Ngồi cịn có khác định từ tính chất đất đai, khí hậu Thật vậy, nghiên cứu đánh giá chất lượng chè báo cáo nồng độ catechin dịch chiết chè xanh Hàn Quốc cao nhất, cao nhiều so với chè xanh Trung Quốc với nồng độ tương ứng 441 (mg/100 ml) 343 (mg/100 ml) [24] Mà catechin có hoạt tính ức chế tốt tyrosinase [35] Ngồi ra, nhóm tác giả sử dụng nước ion hóa làm dung mơi chiết xuất mơi trường ni cấy Aspergillus oryzae Cịn đề tài sử dụng nguồn nước RO nguồn nước có sẵn phịng nghiên cứu thay nước ion hóa Nước ion hóa có khác biệt định với nước RO Có nghiên cứu cho nước ion hóa có khả chống oxy hóa tốt, cịn nước RO khơng [32] Vì catechin bảo vệ tốt q trình ni cấy Mặt khác, nghiên cứu nhóm tác giả CHANG có điều chỉnh pH (điều kiện pH mà catechin dịch chiết chè ổn định nhất) thay điều chỉnh pH 6,5 đề tài Tuy nhiên, đề tài có thử nghiệm điều chỉnh pH môi trường lên men tương tự GC trước tiến hành lên men sau khoảng ngày tiến hành kiểm tra pH dung dịch có pH khoảng - (là pH phù hợp cho phát triển Aspergillus oryzae) Vì thay đổi khơng đáng kể 35 Tóm lại, quy mơ phịng thí nghiệm, với điều kiện khác biệt tại, trình khảo sát khả ức chế enzym tyrosinase dịch nuôi cấy Aspergillus oryzae dịch chiết chè xanh cần thay đổi nghiên cứu để cải thiện thêm 36 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Kết luận Sau thời gian thực hiện, đề tài hoàn thành mục tiêu đạt kết sau: 1.1 Aspergillus oryzae có khả phát triển tốt mơi trường dịch chiết chè xanh với nguồn carbohydrate glucose saccharose Tuy nhiên môi trường dịch chiết chè xanh Aspergillus oryzae tập trung vào phát triển sinh khối sinh sản phẩm thứ cấp acid kojic 1.2 Hoạt tính ức chế enzym tyrosinase môi trường lên men Aspergillus oryzae sử dụng dịch chiết chè xanh nồng độ thử nghiệm 500 ppm 32,92%, 28,57%, 37,53% tương ứng với môi trường khảo sát GC, S10C, S20C Đề xuất Do thời gian nghiên cứu hạn hẹp nhiều thiếu xót, đề tài xin đưa đề xuất sau: 2.1 Tiếp tục nuôi cấy đánh giá khả ức chế enzym dịch lên men dịch chiết chè xanh với Aspergillus oryzae với nguồn chè xanh cụ thể khác dịch chiết chè bổ sung thêm catechin cho tương đương với chè xanh Hàn Quốc 2.2 Khảo sát lên men thêm mơi trường nước ion hóa 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt: Đỗ Tất Lợi (2006), Cây thuốc vị thuốc Việt Nam, Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội Đỗ Thanh Hà (2017), "Nghiên cứu công nghệ tách catechin từ chè xanh (camellia sinensis L.),chuyển hóa tạo dẫn xuất o-acetyl catechin khảo sát hoạt tính dọn gốc tự chúng", Luận án Tiến sĩ Khoa học Lê Tất Khương, Hoàng Văn Chung, et al (1999), Giáo trình Cây Chè, Nhà xuất Nơng Nghiệp, Đại học Thái Nguyên Lê Thị Phương Lan (2011), Bước đầu tìm hiểu nghiên cứu tổng quan quy trình sản xuất nước tương nấm mốc Aspergillus oryzae Khóa luận tốt nghiệp, Trường Đại học Cơng nghệ thành phố Hồ Chí Minh, pp 17-23 Nguyễn Đình Luyện (2015), Thực tập kỹ thuật sản xuất dược phẩm, Trường Đại học Dược Hà Nội, Hà Nội, pp 44-56 Nguyễn Thị Huyền (2018), "Khảo sát khả sinh aicd kojic nấm mốc Aspergillus oryzae" Nguyễn Văn Bá (2009), Đại cương nấm mốc, OpenStax_CNX Phạm Văn Hùng (1975), Phân loại nấm mốc Aspergillus số điểm miền Bắc Việt Nam số ứng dụng thực tiễn, Luận án cấp II, Trường Đại học Tổng hợp Hà Nội, pp 3-32 Trần Thị Thanh Mẫn, Trần Thị Minh Hương, et al (2010), Giáo trình phân tích thực phẩm, Trường Cao đẳng Lương thực - Thực phẩm, pp 117-118 10 Trương Phương, Trần Cát Đông, et al (2013), "Nghiên cứu điều chế kojic dipalmitat Phần 1: Sàng lọc chủng Aspergillus oryzae nghiên cứu điều kiện lên men thu nhận acid kojic", Tạp chí Dược học, 8, pp 35-41 Tài liệu tiếng Anh: 11 Barbesgaard Peder, Heldt-Hansen Hans Peter, et al (1992), "On the safety of Aspergillus oryzae: a review", Applied Microbiology and Biotechnology, 36(5), pp 569-572 12 Boissy Raymond E, Visscher Marty, et al (2005), "DeoxyArbutin: a novel reversible tyrosinase inhibitor with effective in vivo skin lightening potency", Experimental dermatology, 14(8), pp 601-608 13 Burdock G A., Soni M G., et al (2001), "Evaluation of Health Aspects of Kojic Acid in Food Regulatory Toxicology and Pharmacology", 33(1), pp 80-101 14 Burger Pauline, Landreau Anne, et al (2016), "Skin whitening cosmetics: Feedback and challenges in the development of natural skin lighteners", Cosmetics, 3(4), pp 36 15 Burnett CL, Bergfeld WF, et al (2010), "Final Report of the Safety Assessment of Kojic Acid as Used in Cosmetics", International Journal of Toxicology, 29(6), pp 244-273 16 Chang Hui Kyoung, Choi Hyang Tee, et al., Whitening cosmetic composition containing green tea extract 2013, Google Patents 17 Chaudhary Jignesh, Pathak AN, et al (2014), "Production technology and applications of kojic acid", Annual Research & Review in Biology, 4(21), pp 3165 18 Choi Yang Kyu, Rho Yong Kwan, et al (2010), "Effects of vitamin C vs multivitamin on melanogenesis: comparative study in vitro and in vivo", International journal of dermatology, 49(2), pp 218-226 19 Enguita Francisco J, Leitão Ana Lúcia (2013), "Hydroquinone: environmental pollution, toxicity, and microbial answers", BioMed Research International, 2013 20 Funayama Masataka, Arakawa Hirokuni, et al (1995), "Effects of α-and βarbutin on activity of tyrosinases from mushroom and mouse melanoma", Bioscience, biotechnology, biochemistry, 59(1), pp 143-144 21 Hakozaki Tomohiro, Takiwaki Hirotsugu, et al (2006), "Ultrasound enhanced skin‐lightening effect of vitamin C and niacinamide", Skin Research Technology, 12(2), pp 105-113 22 Hazzaa MM, Saad AM, et al (2013), "High Production of Kojic acid crystals by isolated Aspergillus oryzae var effuses NRC14", J Appl Sci Res, 9(3), pp 1714-1723 23 Hong Yang-Hee, Jung Eun Young, et al (2014), "Physiological effects of formulation containing tannase-converted green tea extract on skin care: physical stability, collagenase, elastase, and tyrosinase activities", Integrative medicine research, 3(1), pp 25-33 24 Koch Wojciech, Kukula-Koch Wirginia, et al (2018), "Green tea quality evaluation based on its catechins and metals composition in combination with chemometric analysis", Molecules, 23(7), pp 1689 25 Kooyers T., Westerhof W (2005), "Toxicology and health risks of hydroquinone in skin lightening formulations", Journal of the European Academy of Dermatology and Venereology, 20(7), pp 777-780 26 Korner A., Pawelek J (1982), "Mammalian tyrosinase catalyzes three reactions in the biosynthesis of melanin", Science, 217(4565), pp 11631165 27 Lu Min-Jer, Chen Chinshuh (2007), "Enzymatic tannase treatment of green tea increases in vitro inhibitory activity against N-nitrosation of dimethylamine", Process Biochemistry, 42(9), pp 1285-1290 28 Machida M (2002), "Progress of Aspergillus oryzae Genomics", Advances in Applied Microbiology, pp 81-107 29 Machida Masayuki, Asai Kiyoshi, et al (2005), "Genome sequencing and analysis of Aspergillus oryzae", Nature, 438(7071), pp 1157 30 Maeda Kazuhisa, Fukuda Minoru (1996), "Arbutin: mechanism of its depigmenting action in human melanocyte culture", Journal of Pharmacology Experimental Therapeutics, 276(2), pp 765-769 31 Maeda Kazuhisa, Fukuda Minoru (1996), "Arbutin: mechanism of its depigmenting action in human melanocyte culture", Journal of Pharmacology Experimental Therapeutics, 276(2), pp 765-769 32 Magro Massimiliano, Corain Livio, et al (2016), "Alkaline Water and Longevity: A Murine Study", Evidence-Based Complementary Alternative Medicine, 2016 33 MASUDA T., YAMASHITA D., et al (2005), "Screening for Tyrosinase Inhibitors among Extracts of Seashore Plants and Identification of Potent Inhibitors from Garcinia subelliptica", Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 69(1), pp 197-201 34 McKay Diane L, Blumberg Jeffrey B (2002), "The role of tea in human health: an update", Journal of the American College of Nutrition, 21(1), pp 1-13 35 No Jae Kyung, Kim You Jung, et al (1999), "Inhibition of tyrosinase by green tea components", Life sciences, 65(21), pp PL241-PL246 36 Rosfarizan Mohamad, Mohd Shamzi Mohamed, et al (2010), "Kojic acid: Applications and development of fermentation process for production", Biotechnology and Molecular Biology Reviews, 5(2), pp 24-37 37 Saijo Ryoyasu (1982), "Isolation and chemical structures of two new catechins from fresh tea leaf", Agricultural Biological chemistry, 46(7), pp 1969-1970 38 Sarkar Rashmi, Arora Pooja, et al (2013), "Cosmeceuticals for hyperpigmentation: What is available?", Journal of cutaneous aesthetic surgery, 6(1), pp 39 Smit Nico, Vicanova Jana, et al (2009), "The hunt for natural skin whitening agents", International journal of molecular sciences, 10(12), pp 5326-5349 40 Tse T W (2010), "Hydroquinone for skin lightening: Safety profile, duration of use and when should we stop?", Journal of Dermatological Treatment, 21(5), pp 272-275 41 Vincent J Hearing (1987), "Mammalian monophenol monooxygenase (tyrosinase): Purification, properties, and reactions catalyzed", Metabolism of Aromatic Amino Acids and Amines, pp 154-156 42 Vincent J Hearing, Mercedes Jiménez (1987), "Mammalian tyrosinase— The critical regulatory control point in melanocyte pigmentation", International Journal of Biochemistry, 19(12), pp 1141-1147 43 Zaveri Nurulain T (2006), "Green tea and its polyphenolic catechins: medicinal uses in cancer and noncancer applications", Life sciences, 78(18), pp 2073-2080 PHỤC LỤC (GN) (GC) (S10C) (S20C) (S10N) Phụ lục Hình ảnh sinh khối Aspergillus oryzae với môi trường nuôi cấy GN, GC, S10C, S20C sau kết thúc Phụ lục Hình ảnh phản ứng acid kojic (hòa tan ethanol) với sắt (III) clorid 3% Phụ lục Bảng xác định đường theo phương pháp Schoorl - Regenbogen Tiêu thụ Na2S2O3 0,1N Tiêu thụ Glucose (mg) Na2S2O3 0,1N (ml) Glucose (mg) (ml) 3,2 13 42,4 3,1 6,3 3,4 14 45,8 3,1 9,4 3,5 15 49,3 3,2 12,6 3,5 16 52,8 3,3 15,9 3,5 17 56,3 3,3 19,2 3,5 18 59,8 3,2 22,4 3,5 19 63,3 3,2 25,6 3,6 20 66,9 3,3 28,9 3,8 21 70,7 3,4 10 32,3 3,8 22 74,5 3,4 11 35,7 4,0 23 78,5 3,4 12 39,0 4,1 24 82,6 3,4 4,0 25 86,6 Phụ lục Các phiếu trả kết từ Viện hóa sinh VIỆN HÀN LÂM CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập - Tự - Hạnh phúc KHOA HỌC & CƠNG NGHỆ VN VIỆN HĨA SINH BIỂN PHIẾU TRẢ KẾT QUẢ Đơn vị thử nghiệm: Trung tâm tiên tiến hóa sinh hữu Người thực hiện: Dương Thu Trang Người gửi mẫu: Nguyễn Hữu Đức Đơn vị: Đại học Dược Hà Nội SĐT: 0973046010 Email: huuduc921996@gmail.com Tên mẫu (ký hiệu)/số lượng mẫu: - mẫu đông khô: S20C, S10C, GC GN Yêu cầu thử hoa ̣t tính: Hoa ̣t tính ức chế enzyme tyrosinase Kết Bảng 1: Kết sàng lọc hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase mẫu STT Tên mẫu S20C S10C GC GN Hydroquinone* Nồng độ thử (µg/mL) %Inhibition Sai số 100 2.98 2.12 500 35.19 1.08 100 3.64 2.27 500 25.26 0.62 100 - - 500 24.14 2.43 100 24.93 1.93 500 93.72 1.73 10 9.79 1.50 50 87.50 0.30 * Hydroquinone dùng làm chất đối chứng Nhận xét: - Kết bảng cho thấy nồng độ thử nghiệm 500µg/mL, mẫu GN biểu hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase tốt Mẫu tiếp tục thử nghiệm giá trị IC50 Bảng 2: Giá trị IC50 hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase mẫu có hoạt tính Tên mẫu GN Hydroquinone* Nồng độ (µg/mL) % Ức chế 100 28.79 ± 1.84 200 68.37 ± 0.64 400 93.05 ± 1.05 500 96.09 ± 0.11 10 10.86 ± 1.49 25 29.46 ± 0.67 50 86.99 ± 0.33 100 92.25 ± 0.84 Giá trị IC50 (µg/mL) 141.25 ± 1.92 30.20 ± 0.98 * Hydroquinone dùng làm chất đối chứng Nhận xét: - Mẫu GN có giá trị IC50 141.25 ± 1.92 µg/mL, cao chất đối chứng hydroquinone * Kế t quả này chỉ có giá tri ̣ đố i với các mẫu gửi phân tích / Hà Nội, ngày Xác nhận quan tháng năm 2019 Người kiểm tra Người thực Nguyễn Hải Đăng Dương Thu Trang VIỆN HÀN LÂM CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập - Tự - Hạnh phúc KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ VN VIỆN HÓA SINH BIỂN PHIẾU TRẢ KẾT QUẢ Đơn vị thử nghiệm: Trung tâm tiên tiến hóa sinh hữu Người thực hiện: Dương Thu Trang Người gửi mẫu: Nguyễn Hữu Đức Đơn vị: Đại học Dược Hà Nội SĐT: 0973046010 Email: huuduc921996@gmail.com Tên mẫu (ký hiệu)/số lượng mẫu: - mẫu đông khô: S20C, S10C, GC GN Yêu cầu thử hoa ̣t tính: Hoa ̣t tính ức chế enzyme tyrosinase Kết Bảng 1: Kết sàng lọc hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase mẫu STT Tên mẫu S20C S10C GC GN Hydroquinone* Nồng độ thử (µg/mL) %Inhibition Sai số 100 4.12 2.19 500 39.86 2.22 100 7.29 1.74 500 31.88 1.46 100 7.60 2.08 500 41.70 1.12 100 34.09 2.28 500 93.73 0.84 25 45.94 1.55 50 86.50 0.17 * Hydroquinone dùng làm chất đối chứng Nhận xét: - Kết bảng cho thấy nồng độ thử nghiệm 500µg/mL, mẫu GN biểu hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase tốt * Kế t quả này chỉ có giá trị đố i với các mẫu gửi phân tích / Hà Nội, ngày Xác nhận quan tháng năm 2019 Người kiểm tra Người thực Nguyễn Hải Đăng Dương Thu Trang ... ? ?Khảo sát khả ức chế enzym tyrosinase dịch nuôi cấy nấm mốc Aspergillus oryzae (Ahlb.) E Cohn môi trường chứa chè xanh Camellia Sinensis (L.) Kuntze? ?? tiến hành với mục tiêu sau: - Khảo sát khả. .. TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN HỮU ? ?ỨC MÃ SINH VIÊN: 1401147 KHẢO SÁT KHẢ NĂNG ỨC CHẾ ENZYM TYROSINASE CỦA DỊCH NUÔI CẤY NẤM MỐC Aspergillus oryzae (Ahlb.) E Cohn TRONG MÔI TRƯỜNG CHỨA CHÈ... tự khả ức chế tyrosinase, dịch chiết chè xanh xử lý tannase thể khả ức chế cao so với dịch chiết chè thông thường, tương ứng 58,06% 35,38% ức chế enzym [23] Đối với Aspergillus oryzae, khả ức chế