NGUYỄN THẠCH PHONG NGHIÊN cứu các điều KIỆN BIỂU HIỆN, TINH SẠCH và ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG THUỶ PHÂN ARABINOXYLAN của XYLANASE tái tổ hợp từ CHỦNG PICHIA PASTORIS GS115 LUẬN văn THẠC sĩ dược học

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THẠCH PHONG NGHIÊN CỨU CÁC ĐIỀU KIỆN BIỂU HIỆN, TINH SẠCH VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG THUỶ PHÂN ARABINOXYLAN CỦA XYLANASE TÁI TỔ HỢP TỪ CHỦNG PICHIA PASTORIS GS115 LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH: HOÁ SINH DƯỢC MÃ SỐ 8720208 Người hướng dẫn khoa học: TS Đỗ Thị Tuyên TS Đào Thị Mai Anh HÀ NỘI 2022 LỜI CẢM ƠN Trước tiên, em xin gửi lời cảm ơn đến tồn thể thầy giáo Trường Đại học Dược Hà Nội, người dạy dỗ truyền đạt kiến thức quý báu cho em suốt thời gian học tập rèn luyện trường Em xin chân thành cảm ơn thầy cô môn Hóa Sinh, trường Đại học Dược Hà Nội, anh chị phịng Cơng nghệ sinh học Enzym – Viện Công nghệ sinh học tạo điều kiện thuận lợi hướng dẫn em trình thực tập, nghiên cứu Em xin chân thành cảm ơn TS Đỗ Thị Tuyên định hướng ý tưởng nghiên cứu, tận tình hướng dẫn thí nghiệm thực khóa luận suốt q trình thực tập phịng Cơng nghệ sinh học Enzym – Viện Công nghệ sinh học Ngoài em xin gửi lời cảm ơn trân trọng đến quỹ Phát triển khoa học công nghệ Quốc gia Nafosted tài trợ thực đề tài Đặc biệt, em gửi lời cảm ơn lòng biết ơn sâu sắc tới TS Đào Thị Mai Anh Cô người thầy tận tâm giúp em tìm đam mê mình, giúp em định hướng bước đường học tập nghiên cứu khoa học, mà cịn cho em lời khun chân thành sống, tiếp thêm động lực cho em suốt thời gian qua Cảm ơn anh chị lớp cao học 25, bạn Trương Thị Thanh Thanh, Lê Nguyễn Anh Thư đồng hành, động viên tơi q trình học tập Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới ba mẹ, người thân gia đình, bạn bè ln bên cạnh, động viên tiếp thêm niềm tin, động lực cho em đường học tập rèn luyện thân Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 21 tháng 04 năm 2022 Học viên Nguyễn Thạch Phong MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Arabinoxylan 1.1.1 Định nghĩa 1.1.2 Nguồn gốc phân bố tự nhiên 1.1.3 Phân loại 1.1.4 Ứng dụng 1.2 Enzym xylanase 1.2.1 Định nghĩa 1.2.2 Phân loại 1.2.3 Phân bố tự nhiên 1.2.4 Ứng dụng 1.2.5 Xylanase từ chủng Aspergillus niger 1.3 Chủng Pichia pastoris GS115 13 1.3.1 Nguồn gốc, phân loại 13 1.3.2 Bộ gen di truyền 14 1.3.3 Điều kiện nuôi cấy 14 1.3.4 Ứng dụng 14 1.4 Tình hình nghiên cứu xylanase tái tổ hợp từ chủng Pichia pastoris GS115 15 1.4.1 Trên giới 15 1.4.2 Tại Việt Nam 16 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 2.1 Nguyên vật liệu thiết bị 18 2.1.1 Chủng giống 18 2.1.2 Hóa chất 18 2.1.3 Môi trường 20 2.1.4 Thiết bị thí nghiệm 21 2.2 Nội dung nghiên cứu 22 2.3 Phương pháp nghiên cứu 24 2.3.1 Phương pháp nuôi cấy Pichia pastoris GS115 24 2.3.2 Khảo sát điều kiện nuôi cấy biểu xylanase tái tổ hợp 24 2.3.3 Phương pháp tinh xylanase tái tổ hợp 25 2.3.4 Phương pháp xác định hàm lượng protein tái tổ hợp 25 2.3.5 Phương pháp điện di protein gel polyacrylamid ( SDS- PAGE) 26 2.3.6 Phương pháp định tính xylanase 28 2.3.7 Phương pháp định lượng xylanase 28 2.3.8 Phương pháp đánh giá khả thuỷ phân arabinoxylan 30 2.3.9 Phương pháp xử lý số liệu 31 CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ 32 3.1 Kết khảo sát điều kiện biểu xylanase từ chủng Aspergillus niger DMS1957 Pichia pastoris GS115 32 3.1.1 Kết biểu xylanase tái tổ hợp điều kiện 32 3.1.2 Khảo sát điều kiện biểu nâng cao hoạt tính xylanase tái tổ hợp 33 3.2 Kết tinh đánh giá đặc tính sinh học thủy phân arabinoxylan enzyme xylanase tái tổ hợp từ chủng Pichia pastoris GS115 40 3.2.1 Kết tinh xylanase tái tổ hợp phương pháp sắc ký lực 40 3.2.2 Đánh giá độ tinh xylanase tái tổ hợp 42 3.2.3 Đánh giá khả thủy phân arabinoxylan 43 CHƯƠNG BÀN LUẬN 45 3.1 Về kết khảo sát điều kiện biểu nâng cao hoạt tính xylanase tái tổ hợp 45 3.2 Khảo sát kết tinh đánh giá khả thủy phân arabinoxylan xylanase tái tổ hợp 47 KẾT LUẬN 50 DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt ATCC American Type Culture collection AX Arabinoxylans Cộng Cs IUBMB International Biochemistry Union and of Liên hiệp Hoá sinh Sinh học Molecular phân tử Quốc tế Biology MW Molecular weight Trọng lượng phân tử NSP Non-starch polysaccharides Polysaccharid không tinh bột PAGE Polyacrylamid gel electrophoresis PBS Phosphate buffer saline Dung dịch đệm phosphat PFGE Pulsed Field Gel Electrophoresis Điện di trường xung BSA Bovine Serum Albumin Albumin huyết bò SDS Sodium dodecyl sulfat TLC Thin layer chromatography Sắc ký lớp mỏng WEAX Water-extractable arabinoxylan Arabinoxylan chiết xuất nước WUEAX Water-unextractable arabinoxylan Arabinoxylan không chiết xuất nước DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Một số ứng dụng arabinoxylan Bảng 1.2: Đặc điểm lý hóa số xylanase từ Aspergillus niger 13 Bảng 1.3: Thông tin gen Pichia pastoris GS115 14 Bảng 2.1: Các hóa chất sử dụng 18 Bảng 2.2: Thành phần loại đệm dung dịch 19 Bảng 2.3: Môi trường sử dụng nghiên cứu 20 Bảng 2.4: Các thiết bị sử dụng 21 Bảng 2.5: Thành phần gel polyacrylamid 12,5% 27 Bảng 3.1: Hoạt tính hoạt tính riêng xylanase 33 Bảng 3.2: Kết định lượng xylanase tái tổ hợp sau 24 34 Bảng 3.3: Hoạt tính xylanase nồng độ methanol cảm ứng 120 37 Bảng 3.4: Kết định lượng xylanase môi trường dịch nuôi cấy 38 Bảng 3.5 So sánh hoạt tính hoạt tính riêng trước sau khảo sát 40 Bảng 3.6: Kết định lượng xylanase tái tổ hợp sau tinh phương pháp sắc kí lực 41 Bảng 3.7: Kết trình tinh xylanase tái tổ hợp 41 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Cấu trúc arabinoxylan (AX) vị trí bị công enzym xylanolytic liên quan đến phân hủy nó……………………………………… Hình 1.2: Vị trí xúc tác xylanase enzym khác phản ứng thuỷ phân xylan [81]………………………………………………………………………………… Hình 1.3: Sơ đồ gen xylanase A từ chủng Aspergillus niger DMS1957………… Hình 1.4: Sơ đồ gen xylanase B từ chủng Aspergillus niger DMS1957………… Hình 1.5: Sơ đồ gen xylanase D từ chủng Aspergillus niger DMS1957………… Hình 1.6: Hai quan điểm đại diện cấu trúc tổng thể endoxylanase I từ A niger (được phát Raster3D; Merritt & Murphy, 1994 [73]) Hai gốc glutamat xúc tác, Glu79 (trên) Glu170 (dưới), (a)……… 10 Hình 1.7: Con đường xúc tác xylanase……………………………………………… 12 Hình 2.1: Nội dung nghiên cứu……………………………………………………… 23 Hình 2.2: Đường chuẩn Bradford…………………………………………………….26 Hình 2.3: Đường chuẩn xylose……………………………………………………… 29 Hình 3.1: Kết xác định hoạt tính xylanasae dịch ni cấy …………… 32 Hình 3.2: Kết điện di protein SDS-PAGE sau 24 ………………33 Hình 3.3: Khảo sát thời gian ni cấy……………………………………………… 34 Hình 3.4: Điện di đồ SDS-PAGE xylanase tái tổ hợp cảm ứng methanol nồng độ khác nhau…………………………………………………………………………… 35 Hình 3.5: Khảo sát nồng đồ methanol cảm ứng ……………………………………36 Hình 3.1: Khảo sát mơi trường ni cấy………… ……………………………… 38 Hình 3.7: Điện di đồ SDS – PAGE xylanase tái tổ hợp qua cột sắc ký lực… 41 Hình 3.8: Sắc ký mỏng thủy phân arabinoxylan thương mại hãng Megazym dịch xylanase tái tổ hợp với hệ dung môi n-butanol: acid acetic: H2O = (3:1:1) 42 ĐẶT VẤN ĐỀ Xylanase glycosidase thuộc nhóm enzym endohydrolysis xúc tác cho phản ứng thủy phân liên kết 1,4-β-D-xylosidic xylan [77] Xylanase giới thiệu lần vào năm 1955, với tên gọi ban đầu pentosanase liên hiệp Hóa sinh Sinh học phân tử quốc tế (IUBMB) công nhận đến năm 1961 với mã enzym EC 3.2.1.8 [39] Nhưng phải đợi đến tận năm 1980, xylanase bắt đầu sử dụng chuẩn bị thức ăn chăn ni sau ngành công nghiệp thực phẩm, dệt may giấy Mặc dù vậy, năm gần đây, việc ứng dụng công nghệ sinh học có sử dụng xylan, arabinoxylan xylanase phát triển đáng kể Hiện nay, xylanase cellulase với pectinase chiếm 20% thị trường enzym giới [47], [43], [80], [81], [45], [46], [36] Theo báo cáo công bố Gen Consulting Company, thị trường xylanase tồn cầu dự đốn tăng trưởng với tỷ lệ tăng trưởng hàng năm kép 6,6% vào năm 2023, quy mô thị trường mở rộng nhiều lĩnh vực như: thực phẩm đồ uống, thức ăn chăn nuôi, công nghiệp… nhiều khu vực giới: Bắc Mỹ, Châu Âu, Châu Á Thái Bình Dương, Trung Đông Châu Phi, Nam Mỹ [51] Đặc biệt gần đây, xylanase bắt đầu ứng dụng ngành sản xuất Dược phẩm Hoá chất Các sản phẩm thủy phân xylanase với chất xylan, arabinoxylan (gốc β-D-xylopyranosyl) chuyển đổi thành chất lỏng dễ cháy (ethanol), dung môi chất làm nhân tạo có hàm lượng calo thấp [34] Trong số sản phẩm này, xylitol polyalcohol có khả làm tương đương với sucrose khơng sinh lượng, thích hợp cho người bị tiểu đường, béo phì Khơng thế, sản phẩm cịn khuyến nghị sử dụng để phịng ngừa lỗng xương, nhiễm trùng đường hơ hấp, rối loạn chuyển hóa lipid, tổn thương thận đường tiêu hóa [26] KẾT LUẬN Từ số liệu thu thu số kết luận sau: Sau nghiên cứu điều kiện nâng cao biểu xylanase tái tổ hợp cho kết môi trường BMMY, 120 nuôi cấy, cảm ứng 1% methanol 280C cho hoạt tính enzyme cao đạt 21,62 IU/ml Đã tinh thành công xylanase tái tổ hợp Pichia pastoris GS115/pXlnA Xylanase tái tổ hợp thể điện di SDS-PAGE với trọng lượng phân tử khoảng 35 kDa, với hoạt tínhr riêng xylanase tăng từ 25,65 IU/mg lên 50,6 IU/mg, hiệu suất đạt 9,3% với độ 1,97 lần Bước đầu đánh giá mức độ thủy phân arabinoxylan thương mại enzym tái tổ hợp enzym thương mại 50 KIẾN NGHỊ Do thời gian thực đề tài nguồn kinh phí có hạn, luận văn nhận thấy kết bước đầu sơ khai cơng trình nghiên cứu, chúng tơi xin đưa kiến nghị: - Khảo sát điệu kiện yếu tố tham giá sắc ký lực để lựa chọn điều kiện tinh sách tối ưu - Khảo sát chất khác để đưa tranh tổng thể khả thủy phân arabinoxylan enzyme xylanase tái tổ hợp tinh 51 TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT Anh Đặng Thị Kim, et al., "Biểu gen mã hóa endo-1, 4-β-xylanase chịu nhiệt, hoạt động t rong môi trường axit nhằm ứng dụng sản xuất hức ăn chăn nuôi" TIẾNG ANH Birijlall Natasha, et al (2011), "High level expression of a recombinant xylanase by Pichia pastoris NC38 in a 5L fermenter and its efficiency in biobleaching of bagasse pulp", Bioresource Technology 102(20), pp 97239729 Byrne Bernadette (2015), "Pichia pastoris as an expression host for membrane protein structural biology", Current opinion in structural biology 32, pp 9-17 Cao Li, et al (2011), "Antitumor and immunomodulatory activity of arabinoxylans: A major constituent of wheat bran", International Journal of Biological Macromolecules 48(1), pp 160-164 Claassen P A M., et al (1999), "Utilisation of biomass for the supply of energy carriers", Applied Microbiology and Biotechnology 52(6), pp 741755 Clarke A J., Bray, M R., and Strating, H (1993), "β-Glycanases and xylanases Their mechanism of action, in ACS Symposium Series No: 533", American Chemical Society, USA 27 Courtin CM, Gelders, GG, and Delcour, JA (2001), "Use of two endoxylanases with different substrate selectivity for understanding arabinoxylan functionality in wheat flour breadmaking", Cereal chemistry 78(5), pp 564-571 Cummings JH, et al (2009), "Dietary fibre: an agreed definition", Lancet (London, England) 373(9661), pp 365-366 DeVries JW, et al (1999), "A historical perspective on defining dietary fiber", Cereal foods world 44, pp 367-369 10 Do Thi Tuyen, Quyen, Dinh Thi, and Nguyen, Thi Nuong (2013), "Molecular characterization of a glycosyl hydrolase family 10 xylanase from Aspergillus niger", Protein expression and purification 92(2), pp 196-202 11 Do TT, Dam, TH, and Quyen, DT (2009), "Purification and biophysical characterization of xylanase from Aspergillus niger DSM 1957", Sci Technol J Agric Rural Dev 6, pp 16-21 12 Dornez Emmie, et al (2009), "Grain-associated xylanases: occurrence, variability, and implications for cereal processing", Trends in Food Science & Technology 20(11), pp 495-510 13 Fickers Patrick (2014), "Pichia pastoris: a workhorse for recombinant protein production", Current research in Microbiology and Biotechnology(2), pp 354-363 14 Garcia AL, et al (2007), "Arabinoxylan consumption decreases postprandial serum glucose, serum insulin and plasma total ghrelin response in subjects with impaired glucose tolerance", European journal of clinical nutrition 61(3), pp 334-341 15 Geissmann T and Neukom, H (1973), "note of ferulic acid as a constituent of the water-insoluble pentosans of wheat flour", Cereal Chemistry 16 Guilliermond Alexandre (1920), Zygosaccharomyces Pastori, nouvelle espèce de levures copulation hétérogamique, Société mycologique de France 17 Haltrich Dietmar, et al (1996), "Production of fungal xylanases", Bioresource Technology 58(2), pp 137-161 18 Harris Annie Deborah and Ramalingam, C (2010), "Xylanases and its application in food industry: a review", Journal of Experimental Sciences 1(7) 19 Iiyama K., Lam, TBT., and Stone, B A (1994), "Covalent Cross-Links in the Cell Wall", Plant Physiology 104(2), pp 315-320 20 JMares D and Stone, BA (1973), "Studies on wheat endosperm I Chemical composition and ultrastructure of the cell walls", Australian Journal of Biological Sciences 26(4), pp 793-812 21 Johnson IT (2005), "DIETARY FIBER| Physiological Effects and Effects on Absorption" 22 Liu Ming-Qi, Weng, Xiao-Yan, and Sun, Jian-Yi (2006), "Expression of recombinant Aspergillus niger xylanase A in Pichia pastoris and its action on xylan", Protein expression and purification 48(2), pp 292-299 23 Lu Zhong X, et al (2000), "Arabinoxylan fiber, a byproduct of wheat flour processing, reduces the postprandial glucose response in normoglycemic subjects", The American journal of clinical nutrition 71(5), pp 1123-1128 24 Michniewicz J, Biliaderis, GG, and Bushuk, W (1992), "Effect of added pentosans on some properties of wheat bread", Food Chemistry 43(4), pp 251-257 25 Niño-Medina Guillermo, et al (2009), "Maize processing waste water arabinoxylans: Gelling capability and cross-linking content", Food Chemistry 115(4), pp 1286-1290 26 Parajó Juan Carlos, Domínguez, Herminia, and Domínguez, JoséManuel (1998), "Biotechnological production of xylitol Part 1: Interest of xylitol and fundamentals of its biosynthesis", Bioresource Technology 65(3), pp 191-201 27 Phaff HJ, Miller, MW, and Shifrine, M (1956), "The taxonomy of yeasts isolated from Drosophila in the Yosemite region of California", Antonie van Leeuwenhoek 22(1), pp 145-161 28 Rose Devin and Inglett, George (2011), "A Method for the Determination of Soluble Arabinoxylan Released from Insoluble Substrates by Xylanases", Food Analytical Methods 4, pp 66-72 29 Sasaki Tomoko, Kohyama, Kaoru, and Yasui, Takeshi (2004), "Effect of water-soluble and insoluble non-starch polysaccharides isolated from wheat flour on the rheological properties of wheat starch gel", Carbohydrate Polymers 57(4), pp 451-458 30 Sasaki Tomoko, et al (2007), "Rheological properties of starch gels from wheat mutants with reduced amylose content", Cereal chemistry 84(1), pp 102-107 31 Sharma Archana, Parashar, Deepak, and Satyanarayana, Tulasi (2016), "Acidophilic Microbes: Biology and Applications", in Rampelotto, Pabulo H., Editor, Biotechnology of Extremophiles: Advances and Challenges, Springer International Publishing, Cham, pp 215-241 32 Slavin Joanne L (2008), "Position of the American Dietetic Association: health implications of dietary fiber", Journal of the American Dietetic Association 108(10), pp 1716-1731 33 Spohner Sebastian C, et al (2015), "Expression of enzymes for the usage in food and feed industry with Pichia pastoris", Journal of Biotechnology 202, pp 118-134 34 Sreenath H K and Jeffries, T W (2000), "Production of ethanol from wood hydrolyzate by yeasts", Bioresource Technology 72(3), pp 253-260 35 Tanaka Tsutomu, et al (2012), "Recent developments in yeast cell surface display toward extended applications in biotechnology", Applied microbiology and biotechnology 95(3), pp 577-591 36 Techapun Charin, et al (2003), "Thermostable and alkaline-tolerant microbial cellulase-free xylanases produced from agricultural wastes and the properties required for use in pulp bleaching bioprocesses: a review", Process Biochemistry 38(9), pp 1327-1340 37 Tenkanen M., Viikari, L., and Buchert, J (1997), "Use of acid-tolerant xylanase for bleaching of kraft pulps", Biotechnology Techniques 11(12), pp 935-938 38 Tuyen Do Thi, et al (2021), "Cloning, Expression, and Characterization of Xylanase G2 from Aspergillus oryzae VTCC-F187 in Aspergillus niger VTCC-F017", BioMed Research International 2021, p 8840038 39 Whistler Roy L and Masak, Edward (1955), "Enzymatic Hydrolysis of Xylan1", Journal of the American Chemical Society 77(5), pp 1241-1243 40 Yoshida-Shimokawa Tomoko, et al (2001), "Enzymic feruloylation of arabinoxylan-trisaccharide by feruloyl-CoA: arabinoxylan-trisaccharide Ohydroxycinnamoyl transferase from Oryza sativa", Planta 212(3), pp 470474 41 Zhang Pingyi, Zhang, Qian, and Whistler, Roy L (2003), "l‐Arabinose Release from Arabinoxylan and Arabinogalactan Under Potential Gastric Acidities", Cereal chemistry 80(3), pp 252-254 42 Zunft Hans-J Franz, et al (2004), "Reduction of the postprandial glucose and insulin response in serum of healthy subjects by an arabinoxylan concentrate isolated from wheat starch plant process water", Asia Pacific Journal of Clinical Nutrition 13 43 Aristidou A and Penttilä, M (2000), "Metabolic engineering applications to renewable resource utilization", Curr Opin Biotechnol 11(2), pp 18798 44 Bassam B J., Caetano-Anolles, G., and Gresshoff, P M (1991), "Fast and sensitive silver staining of DNA in polyacrylamide gels", Anal Biochem 196(1), pp 80-3 45 Beg Q K., et al (2000), "Enhanced production of a thermostable xylanase from Streptomyces sp QG-11-3 and its application in biobleaching of eucalyptus kraft pulp", Enzyme Microb Technol 27(7), pp 459-466 46 Beg Q K., et al (2001), "Microbial xylanases and their industrial applications: a review", Appl Microbiol Biotechnol 56(3-4), pp 326-38 47 Bhat M K (2000), "Cellulases and related enzymes in biotechnology", Biotechnol Adv 18(5), pp 355-83 48 Biely P., et al (1997), "Endo-beta-1,4-xylanase families: differences in catalytic properties", J Biotechnol 57(1-3), pp 151-66 49 Bradford M M (1976), "A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding", Anal Biochem 72, pp 248-54 50 Collins T., Gerday, C., and Feller, G (2005), "Xylanases, xylanase families and extremophilic xylanases", FEMS Microbiol Rev 29(1), pp 3-23 51 Consulting Gen (2018), "Global Xylanase Market Outlook 2018-2023", Market Research Store MRS - 250763, pp 1-9 52 da Silva Menezes B., Rossi, D M., and Ayub, M A (2017), "Screening of filamentous fungi to produce xylanase and xylooligosaccharides in submerged and solid-state cultivations on rice husk, soybean hull, and spent malt as substrates", World J Microbiol Biotechnol 33(3), p 58 53 De Schutter K., et al (2009), "Genome sequence of the recombinant protein production host Pichia pastoris", Nat Biotechnol 27(6), pp 561-6 54 DiCosimo R., et al (2013), "Industrial use of immobilized enzymes", Chem Soc Rev 42(15), pp 6437-74 55 Elgharbi F., et al (2015), "Expression of A niger US368 xylanase in E coli: purification, characterization and copper activation", Int J Biol Macromol 74, pp 263-70 56 Elgharbi F., et al (2015), "Expression of an Aspergillus niger xylanase in yeast: Application in breadmaking and in vitro digestion", Int J Biol Macromol 79, pp 103-9 57 Fang W., et al (2014), "Cloning and expression of a xylanase xynB from Aspergillus niger IA-001 in Pichia pastoris", J Basic Microbiol 54 Suppl 1, pp S190-9 58 Frederick M M., et al (1985), "Purification and characterization of endoxylanases from Aspergillus niger I Two isozymes active on xylan backbones near branch points", Biotechnol Bioeng 27(4), pp 525-32 59 Fu G., et al (2012), "Cloning, Expression, and Characterization of an GHF 11 Xylanase from Aspergillus niger XZ-3S", Indian J Microbiol 52(4), pp 682-8 60 Galbe M and Zacchi, G (2002), "A review of the production of ethanol from softwood", Appl Microbiol Biotechnol 59(6), pp 618-28 61 Hamid A and Aftab, M N (2019), "Cloning, Purification, and Characterization of Recombinant Thermostable β-Xylanase Tnap_0700 from Thermotoga naphthophila", Appl Biochem Biotechnol 189(4), pp 1274-1290 62 Henrissat B., et al (1989), "Cellulase families revealed by hydrophobic cluster analysis", Gene 81(1), pp 83-95 63 Henrissat B and Coutinho, P M (2001), "Classification of glycoside hydrolases and glycosyltransferases from hyperthermophiles", Methods Enzymol 330, pp 183-201 64 Hunninghake D B., et al (1994), "Hypocholesterolemic effects of a dietary fiber supplement", Am J Clin Nutr 59(5), pp 1050-4 65 Jeffries T W (1996), "Biochemistry and genetics of microbial xylanases", Curr Opin Biotechnol 7(3), pp 337-42 66 Koh S., et al (2021), "Xylanase from Marine Filamentous Fungus Pestalotiopsis sp AN-7 Was Activated with Diluted Salt Solution Like Brackish Water", J Appl Glycosci (1999) 68(1), pp 11-18 67 Krisana A., et al (2005), "Endo-1,4-beta-xylanase B from Aspergillus cf niger BCC14405 isolated in Thailand: purification, characterization and gene isolation", J Biochem Mol Biol 38(1), pp 17-23 68 Kulkarni N., Shendye, A., and Rao, M (1999), "Molecular and biotechnological aspects of xylanases", FEMS Microbiol Rev 23(4), pp 411-56 69 Laemmli U K (1970), "Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4", Nature 227(5259), pp 680-5 70 Lafond M., et al (2014), "Four GH11 xylanases from the xylanolytic fungus Talaromyces versatilis act differently on (arabino)xylans", Appl Microbiol Biotechnol 98(14), pp 6339-52 71 Leggio L L., et al (2000), "X-ray crystallographic study of xylopentaose binding to Pseudomonas fluorescens xylanase A", Proteins 41(3), pp 36273 72 Liu M Q., Weng, X Y., and Sun, J Y (2006), "Expression of recombinant Aspergillus niger xylanase A in Pichia pastoris and its action on xylan", Protein Expr Purif 48(2), pp 292-9 73 Matte A and Forsberg, C W (1992), "Purification, characterization, and mode of action of endoxylanases and from Fibrobacter succinogenes S85", Appl Environ Microbiol 58(1), pp 157-68 74 Merritt E A and Murphy, M E (1994), "Raster3D Version 2.0 A program for photorealistic molecular graphics", Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 50(Pt 6), pp 869-73 75 Pel H J., et al (2007), "Genome sequencing and analysis of the versatile cell factory Aspergillus niger CBS 513.88", Nat Biotechnol 25(2), pp 22131 76 Pollet A., Delcour, J A., and Courtin, C M (2010), "Structural determinants of the substrate specificities of xylanases from different glycoside hydrolase families", Crit Rev Biotechnol 30(3), pp 176-91 77 Prade R A (1996), "Xylanases: from biology to biotechnology", Biotechnol Genet Eng Rev 13, pp 101-31 78 Schell D J., et al (2003), "Dilute-sulfuric acid pretreatment of corn stover in pilot-scale reactor: investigation of yields, kinetics, and enzymatic digestibilities of solids", Appl Biochem Biotechnol 105 -108, pp 69-85 79 Shen Y., et al (2012), "An efficient xylose-fermenting recombinant Saccharomyces cerevisiae strain obtained through adaptive evolution and its global transcription profile", Appl Microbiol Biotechnol 96(4), pp 107991 80 Subramaniyan S and Prema, P (2000), "Cellulase-free xylanases from Bacillus and other microorganisms", FEMS Microbiol Lett 183(1), pp 1-7 81 Subramaniyan S and Prema, P (2002), "Biotechnology of microbial xylanases: enzymology, molecular biology, and application", Crit Rev Biotechnol 22(1), pp 33-64 82 Sunna A and Antranikian, G (1997), "Xylanolytic enzymes from fungi and bacteria", Crit Rev Biotechnol 17(1), pp 39-67 83 Törrönen A., Harkki, A., and Rouvinen, J (1994), "Three-dimensional structure of endo-1,4-beta-xylanase II from Trichoderma reesei: two conformational states in the active site", The EMBO journal 13(11), pp 2493-2501 84 Walia A., et al (2017), "Microbial xylanases and their industrial application in pulp and paper biobleaching: a review", Biotech 7(1), p 11 85 Wen S., Wu, G., and Wu, H (2021), "Biochemical characterization of a GH10 xylanase from the anaerobic rumen fungus Anaeromyces robustus and application in bread making", Biotech 11(9), p 406 86 Whitehead T R and Hespell, R B (1989), "Cloning and expression in Escherichia coli of a xylanase gene from Bacteroides ruminicola 23", Appl Environ Microbiol 55(4), pp 893-6 87 Zafar A., et al (2016), "Cloning, Expression, and Purification of Xylanase Gene from Bacillus licheniformis for Use in Saccharification of Plant Biomass", Appl Biochem Biotechnol 178(2), pp 294-311 PHỤ LỤC Trình tự nucleotid gen mã hố xylanase từ chủng Aspergillus niger DMS1957 Hình phụ lục 1: Trình tự Nucleotid gen xylanase A từ Aspergillus niger DMS1957 Hình phụ lục 2: Trình tự Nucleotid gen xylanase B từ Aspergillus niger DMS1957 Hình phụ lục 3: Trình tự Nucleotid gen xylanase D từ Aspergillus niger DMS1957 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THẠCH PHONG NGHIÊN CỨU CÁC ĐIỀU KIỆN BIỂU HIỆN, TINH SẠCH VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG THUỶ PHÂN ARABINOXYLAN CỦA XYLANASE TÁI TỔ HỢP TỪ CHỦNG PICHIA PASTORIS GS115 LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC HÀ NỘI 2022 ... nghiệp dược phẩm tiến hành đề tài ? ?Nghiên cứu điều kiện biểu hiện, tinh đánh giá khả thuỷ phân arabinoxylan enzym xylanase tái tổ hợp từ chủng Pichia pastoris GS115? ?? với mục tiêu: (1) Nghiên cứu điều. .. điều kiện biểu xylanase từ chủng Aspergillus niger DMS1957 Pichia pastoris GS115 (2) Tinh đánh giá đặc tính sinh học thuỷ phân arabinoxylan enzym xylanase tái tổ hợp từ chủng Pichia pastoris GS115. .. KẾT QUẢ 3.1 Kết khảo sát điều kiện biểu xylanase từ chủng Aspergillus niger DMS1957 Pichia pastoris GS115 3.1.1 Kết biểu xylanase tái tổ hợp điều kiện Các chủng P pastoris GS115 từ ống giống hoạt