NHÂN DÒNG, THIẾT kế VECTOR, BIỂU HIỆN XYLANASE tái tổ hợp TRONG PICHIA PASTORIS GS115 KHÓA LUẬN tốt NGHIỆP dược sĩ

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN XUÂN CHIẾN Mã sinh viên: 1701057 NHÂN DÒNG, THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN XYLANASE TÁI TỔ HỢP TRONG PICHIA PASTORIS GS115 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: TS Đào Thị Mai Anh TS Đỗ Thị Tun Nơi thực hiện: Bộ mơn Hóa Sinh Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam HÀ NỘI - 2022 LỜI CẢM ƠN Trước tiên, em xin gửi lời cảm ơn đến tồn thể thầy giáo Trường Đại học Dược Hà Nội, người dạy dỗ truyền đạt kiến thức quý báu cho em suốt thời gian học tập rèn luyện trường Em xin chân thành cảm ơn thầy cô mơn Hóa Sinh, trường Đại học Dược Hà Nội Em xin cảm ơn anh chị phịng Cơng nghệ sinh học enzym - Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam tạo điều kiện thuận lợi tận tình hướng dẫn em trình thực tập, nghiên cứu Em xin chân thành cảm ơn TS Đỗ Thị Tuyên định hướng ý tưởng nghiên cứu, tận tình hướng dẫn thí nghiệm, thường xun dạy kiến thức chun mơn tạo điều kiện tốt giúp em học tập, rèn luyện thực khóa luận suốt trình thực tập phịng Cơng nghệ sinh học enzym - Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Đặc biệt, em gửi lời cảm ơn lòng biết ơn sâu sắc tới TS Đào Thị Mai Anh Cô người thầy tận tâm giúp em tìm đam mê mình, giúp em định hướng bước đường học tập nghiên cứu khoa học, mà cô điểm tựa cho em lời khuyên chân thành sống, tiếp thêm động lực cho em suốt thời gian qua Đây hành trang quý giá để em tự tin, vững chãi đường nghiệp sống mai Em xin cảm ơn đề tài nghiên cứu khoa học cấp Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam: “Tạo chủng Aspergillus niger tái tổ hợp sinh tổng hợp enzym xylanase hoạt tính cao định hướng ứng dụng làm thực phẩm chức năng”, mã số 106.02-2018.37 TS Đỗ Thị Tuyên làm chủ nhiệm cung cấp kinh phí để thực nghiên cứu Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới ba mẹ, người thân gia đình, bạn bè bên cạnh, động viên tiếp thêm niềm tin, động lực cho em đường học tập rèn luyện thân Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 19 tháng 05 năm 2022 Sinh Viên Nguyễn Xuân Chiến MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Enzym xylanase 1.1.1 Định nghĩa 1.1.2 Phân loại 1.1.3 Nguồn gốc đặc tính 1.1.4 Ứng dụng 1.2 Xylanase từ Aspergillus 1.2.1 Chi Aspergillus 1.2.2 Gen mã hóa xylanase từ chủng Aspergillus niger 1.3 Vector biểu chủng biểu P pastoris 1.3.1 Chủng biểu P pastoris 1.3.2 Vector biểu 1.4 Tình hình nghiên cứu biểu xylanase .9 1.4.1 Trên giới 1.4.2 Ở Việt Nam 10 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12 2.1 Nguyên vật liệu thiết bị 12 2.1.1 Chủng giống 12 2.1.2 Hóa chất 12 2.1.3 Các dung dịch đệm 12 2.1.4 Môi trường 14 2.1.5 Máy móc thiết bị thí nghiệm 14 2.2 Nội dung nghiên cứu 15 2.3 Phương pháp nghiên cứu 16 2.3.1 Phương pháp nuôi cấy 16 2.3.2 Phương pháp khuếch đại gen từ khuôn ADN tổng số 16 2.3.3 Phương pháp nối ghép gen ngoại lai 16 2.3.4 Phương pháp biến nạp ADN plasmid vào tế bào E coli 17 2.3.5 Phương pháp tách chiết ADN plasmid từ tế bào E coli 17 2.3.6 Điện di ADN gel agarose 18 2.3.7 Xử lý ADN plasmid enzym cắt giới hạn 18 2.3.8 Tinh ADN từ gel agarose 18 2.3.9 Biến nạp ADN plasmid vào tế bào nấm men phương pháp xung điện 19 2.3.10 Tách chiết ADN tổng số nấm men 19 2.3.11 Xác định hoạt tính xylanase 20 2.3.11.1 Định tính xylanase 20 2.3.11.2 Định lượng xylanase 20 2.3.12 Điện di protein gel polyacrylamid (SDS-PAGE) 21 2.3.13 Xử lý số liệu 22 CHƯƠNG THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 23 3.1 Kết 23 3.1.1 Nhân dòng thiết kế vector biểu gen mã hóa xylanase D từ A niger DSM1957 23 3.1.1.1 Nhân dòng gen mã hóa xylanase D 23 3.1.1.2 Thiết kế vector biểu pPICZαA/xlnD (pPXlnD) 25 3.1.1.3 Tạo chủng P pastoris GS115 mang gen xln D 28 3.1.2 Biểu rXlnD tái tổ hợp P pastoris 30 3.1.2.1 Nghiên cứu thời gian biểu 32 3.1.2.2 Nghiên cứu nồng độ methanol cảm ứng .33 3.2 Bàn luận 33 3.2.1 Kết nhân dòng thiết kế vector biểu gen mã hóa xylanase D từ A niger DSM1957 34 3.2.2 Kết biểu rXlnD tái tổ hợp 36 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 39 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt AOX1 Alcohol oxidase AOX2 Alcohol oxidase ADN Deoxyribonucleic acid APS Bis acrylamid bp CAGR Ammonium persulfate N, N’-Methylen-bis-acrylamid Ammonium persulfat Base pair Compounded Annual Growth Cặp base nitơ Tốc độ tăng trưởng hàng năm kép rate CAZy Carbohydrate-Active enzymes Cơ sở liệu enzym carbohydrat Database DNS Dinitro salysilic acid Acid dinitro salysilic dNTP EDTA Deoxynucleoside triphosphate Ethylen diamin tetra acetic acid Acid ethylen diamin tetraacetic GH kb kDa MUT MW Glycosid hydrolase Kilo base Kilo Dalton Methanol utilisation pathway Molecular weight Con đường sử dụng methanol Khối lượng phân tử OD Optical density Mật độ quang PAGE Polyacrylamide gel Điện di gel polyacrylamid electrophoresis SDS Sodium dodecyl sulfate Natri dodecyl sulfat SmF Submerged fermentation Lên men chìm SSF Solid state fermentation Lên men rắn TEMED N,N,N’,N’- Tris Tetramethylethylenediamin Tris-(hydroxymethyl) aminomethan VTCC Vietnam Type Culture Bảo tàng giống chuẩn vi sinh vật Việt Collection Nam v/v w/v Volume/volume Weight/volume XOS Xylo-oligosaccharide YNB Yeast Nitrogen Base Yeast Nitrogen Base DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Nguồn gốc vai trò oligosaccharid khác [10] Bảng 1.2 Đặc điểm gen mã hóa xylanase từ chủng A niger [73] .7 Bảng 2.1 Danh mục hóa chất sử dụng nghiên cứu 12 Bảng 2.2 Dung dịch sử dụng nghiên cứu 12 Bảng 2.3 Môi trường sử dụng nghiên cứu 14 Bảng 2.4 Các máy móc thiết bị sử dụng nghiên cứu 14 Bảng 2.5 Trình tự cặp mồi sử dụng nghiên cứu 16 Bảng 2.6 Thành phần gel polyacrylamid 12,5% 22 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Cấu tạo vector biểu pPICZ A [31] Hình 2.1 Sơ đồ nghiên cứu 15 Hình 2.2 Đường chuẩn xylose 21 Hình 3.1 Điện di đồ sản phẩm PCR .23 Hình 3.2 Điện di đồ sản phẩm tách plasmid pJXlnD 24 Hình 3.3 Sản phẩm cắt kiểm tra plasmid pJXlnD với EcoRI NotI 24 Hình 3.4 Điện di đồ sản phẩm tinh .25 Hình 3.5 Sản phẩm tách plasmid pPXlnD 26 Hình 3.6 Sản phẩm cắt plasmid pPXlnD với enzym EcoRI NotI 26 Hình 3.7 Trình tự gen mã hóa xylanase D từ chủng A niger DSM1957 trình tự amino acid suy diễn 28 Hình 3.8 Điện di đồ tinh sản phẩm cắt plasmid pPXlnD với enzym SacI 28 Hình 3.9 Điện di đồ sản phẩm tách ADN nấm men .29 Hình 3.10 Điện di đồ sản phẩm PCR khuếch đại gen xln D với cặp mồi đặc hiệu 30 Hình 3.11 Điện di đồ sản phẩm PCR khuếch đại gen xln D với cặp mồi AOX1 .30 Hình 3.12 Vịng thủy phân chất xylan dịch ngoại bào chủng tái tổ hợp XpPXlnD .31 Hình 3.13 Điện di đồ SDS-PAGE kiểm tra hệ thống biểu rXlnD P pastoris GS115 32 Hình 3.14 Nghiên cứu thời gian biểu rXlnD 32 Hình 3.15 Ảnh hưởng nồng độ MeOH cảm ứng lên mức độ biểu rXlnD .33 ĐẶT VẤN ĐỀ Xylanase enzym xúc tác trình thủy phân liên kết β - 1,4 xylan, polysaccharid phong phú lớn thứ hai thành phần thành tế bào thực vật Thành tế bào thực vật nguyên liệu tổng hợp bao gồm cellulose (chiếm 35-50%), hemicellulose (chủ yếu xylan) (chiếm 20-30%) lignin (chiếm 20-30%) liên kết chặt chẽ với [11] Tác dụng xylanase giúp chuyển đổi chất cao phân tử thành xylooligosaccharid xylose Các sản phẩm thủy phân nguyên liệu cần thiết cho nhiều ngành công nghiệp khác như: Công nghiệp thực phẩm [39], thức ăn chăn nuôi [12], công nghiệp giấy bột giấy [40], [76], nhiên liệu sinh học [40], xử lý chất thải công nghiệp [67] đặc biệt gần công nghiệp dược phẩm [18], [64] Theo báo cáo phân tích Grand View Research, quy mơ thị trường enzym toàn cầu định giá 10,69 tỷ USD vào năm 2020 dự kiến mở rộng với tốc độ tăng trưởng kép hàng năm (CAGR) 6,5% từ năm 2021 đến năm 2028 Phân khúc carbohydrase (được phân loại thành amylase, xylanase, cellulose, pectinase lactase) thống trị thị trường với tỷ trọng doanh thu 45,0% vào năm 2020 Nguyên nhân tượng nhu cầu ngày tăng từ ngành công nghiệp sử dụng sản phẩm thủy phân cuối xylan Bên cạnh đó, nhận thức người tiêu dùng sức khỏe tăng thúc đẩy việc tiêu thụ kích thích nhu cầu sản phẩm thực phẩm chức có nguồn gốc sản phẩm thủy phân xylan [30] Phần lớn q trình cơng nghiệp thực nhiệt độ cao pH khác nhau, để đảm bảo nguồn cung đáp ứng nhu cầu kể trên, thách thức mà ngành công nghiệp enzym phải đối mặt độ nhạy cao enzym nhiệt độ độ pH vấn đề liên quan đến xử lý sản phẩm Cũng lý mà enzym bền với nhiệt, ổn định môi trường kiềm môi trường acid có ưu lớn [9] Việc phân lập sàng lọc vi sinh vật ưa nhiệt, ý nhiều để tìm sinh vật sản xuất xylanase bền nhiệt [71] Kết cho thấy loài Aspergillus fumigates, Bacillus pumilus, Trichoderma reesei Bacillus firmus sinh xylanase có khả điều chỉnh nhiệt chịu nhiệt độ cao Tuy nhiên, xylanase tự nhiên, từ vi sinh vật, sản xuất với số lượng thấp thiếu điều kiện thích hợp cho phát triển vi khuẩn thông số lên men khơng tương thích Việc trì nhiệt độ cao thiết bị lên men để sản xuất quy mơ lớn khó khăn Đây xem vấn đề nan giải cơng tìm xylanase ứng dụng tốt cho ngành công nghiệp Trước thực tế này, việc ứng dụng công nghệ sinh học để cải tiến việc sản xuất tạo xylanase công nghiệp làm nên bước chuyển biến lớn lĩnh vực công nghiệp enzym Khi sử dụng kỹ thuật nhân dịng gen xylanase cơng nghệ tái tổ hợp, việc chọn lọc thực nhằm sản xuất enzym tái tổ hợp với nhiều đặc tính tốt so với enzym tự nhiên Với mục đích này, chúng tơi tiến hành đề tài: “Nhân dòng, thiết kế vector biểu xylanase D tái tổ hợp Pichia pastoris GS115” với mục tiêu: (1) Nhân dòng thiết kế vector biểu xylanase D từ chủng Aspergillus niger DSM1957 (2) Biểu xylanase D Pichia pastoris GS115 CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Enzym xylanase 1.1.1 Định nghĩa Xylanase glycosidase (O-glycosid hydrolase, EC 3.2.1.x) xúc tác trình thủy phân liên kết 1,4-β-D-xylosidic xylan Các enzym giúp phân giải polysaccharid xylan mạch thẳng thành xylose, nguồn carbon cho q trình trao đổi chất tế bào vi sinh vật Xylanase báo cáo lần vào năm 1955 [38], ban đầu chúng gọi pentosanase, Liên minh Hóa sinh Sinh học phân tử Quốc tế (IUBMB) công nhận vào năm 1961 gán mã enzym EC 3.2.1.8 Tên thức chúng endo-1,4-β-xylanase, thuật ngữ đồng nghĩa thường sử dụng bao gồm xylanase, endoxylanase, 1,4-β-D-xylan-xylanohydrolase, endo-1,4-β-D-xylanase, β1,4-xylanase β-xylanase 1.1.2 Phân loại Hệ thống phân loại xylanase giới thiệu năm 1989 [34] phân loại dựa so sánh cấu trúc sơ cấp vùng xúc tác nhóm enzym họ có trình tự liên quan Phân loại ban đầu nhóm cellulase xylanase thành họ (A-F) [34], cập nhật thành 77 họ vào năm 1999 (1-77) [35] tiếp tục phát triển trình tự glycosidase xác định Hiện tại, có 172 họ glycosid hydrolase tồn thích sở liệu CAZy [45] Về bản, xylanase chia vào hai họ GH10 GH11 dựa trình tự gen, xylanase tìm thấy họ glycosid hydrolase khác, chẳng hạn GH 5, 7, 43 [43] 1.1.3 Nguồn gốc đặc tính Xylanase tạo nấm, vi khuẩn, nấm men, tảo biển, động vật nguyên sinh, ốc sên, động vật giáp xác, trùng,… [59] Những xylanase có đặc tính hóa lý, cấu trúc, khả hoạt động, sản lượng tính đặc hiệu khơng giống nhau, làm tăng hiệu mức độ thủy phân xylan, đa dạng phức tạp xylanase Sự đa dạng kết dư thừa di truyền, số trường hợp khác biệt xử lý sau dịch mã Xylanase tạo vi khuẩn xạ khuẩn (Bacillus sp., Pseudomonas sp., Streptomyces sp.) hoạt động hiệu phạm vi pH rộng từ 5-9, với nhiệt độ tối ưu cho hoạt động xylanase từ 35ºC đến 60ºC [52] Các nghiên cứu Bacillus spp cho thấy hoạt tính xylanase cao pH kiềm nhiệt độ cao [48] Nấm (Aspergillus spp., Fusarium spp., Penicillium spp.) nhà sản xuất xylanase quan trọng giải phóng xylanase ngoại bào với sản lượng enzym cao Ngồi ra, xylanase nấm có hoạt tính cao so với vi khuẩn nấm men Tuy nhiên, xylanase có nguồn gốc từ nấm có số đặc điểm khiến chúng không khả dụng cho kỹ thuật đường trao đổi chất tận dụng thêm promoter để đảm bảo lượng chất chuyển hóa kiểm sốt Vì lý chúng tơi lựa chọn thiết kế vector biểu pPICZαA, mang gen chọn lọc kháng zeocin, chứa promoter AOX1 có trình tự mã hóa cho 6xHis giúp dễ dàng cho tinh sau Thông thường, vector biểu thiết kế có gắn thêm ba mã hóa cho histidin ba kết thúc nằm sau 6xHis Do protein tái tổ hợp biểu gắn thêm đuôi 6xHis Để loại bỏ việc tổng hợp 6xHis q trình biểu xln D, ba kết thúc thiết kế bổ sung sau gen xln D trước 6xHis Plasmid pPICZαA mở vịng hai enzym giới hạn EcoRI NotI ghép nối vào đoạn gen xln D cắt từ plasmid pJXlnD enzym nối T4 ligase tạo plasmid tái tổ hợp pPXlnD Plasmid tái tổ hợp pPxlnD cắt kiểm tra với EcoRI NotI cho băng có kích thước khoảng 3600 bp tương ứng với pPICZαA băng có kích thước khoảng 1000 bp tương ứng với đoạn chèn Như gene xln D chèn vào pPICZαA Plasmid pPXlnD sau đọc trình tự để kiểm tra cấu trúc biểu trước biểu P pastoris GS115 Các kết mục 3.1.1.2 cho thấy thiết kế thành công vector biểu với cấu trúc vector biểu khung đọc, gen xln D chèn vào vị trí mong muốn, trình tự gen giống hồn tồn với trình tự gen gốc ban đầu, trình tự mồi, vị trí cắt enzym giới hạn, trình tự nucleotid mã hóa cho 6xHis đầy đủ Kết cho thấy tín hiệu khả quan khả tạo xylanase tái tổ hợp cho sản xuất có khả tinh 3.2.2 Kết biểu rXlnD tái tổ hợp Sau thiết kế thành công hệ biểu gen xln D P pastoris GS115, tiến hành nuôi biểu hiện, cảm ứng methanol sau 24h Kết định tính dịch sau 120h ni cho thấy dịch có khả thủy phân chất xylan, hoạt tính đạt 1,276 ± 0,057 IU/ml, chứng tỏ P pastoris GS115 mang gen tái tổ hợp có khả sản xuất xylanase Để chắn loại xylanase mà P pastoris GS115 mang gen tái tổ hợp xynlanase D chúng tơi tiến hành điện di protein có dịch Kết cho thấy, dịch chủng P pastoris GS115 mang gen tái tổ hợp có xuất băng protein khác so với chủng khơng mang gen biểu hiện, kích thước băng khoảng > 35kDa Theo tính tốn lý thuyết xylanase D Kích thước tương đồng với enzym xylanase D sinh từ Aspergillus sp giải trình tự nghiên cứu trước Các báo cáo khối lượng phân tử nằm khoảng 35-36 kDa [22], [57], [72] Tuy nhiên, để hồn tồn chắn xylanase D cần tiến hành thêm nghiên cứu để tinh protein tái tổ hợp nhận dạng xác xylanase D tái tổ hợp khối phổ MALDI - TOF 36 Với dòng nấm men tái tổ hợp khác số xln D hịa nhập vào gen, hoạt tính khác Dịng nhiều tích hợp gen xln D vào gen có hoạt tính cao Dựa vào kết điện di cho thấy mẫu số mẫu số xuất băng kích thước > 35kDa đậm so với mẫu cịn lại, chủng số có khả biểu tốt so với mẫu cịn lại lựa chọn dòng để sử dụng nghiên cứu sau Để có thêm nhiều nguyên liệu cho nghiên cứu sâu xylanase D, tiến hành khảo sát thêm hai điều kiện biểu xylanase là: thời gian nuôi cấy nồng độ methanol cảm ứng với mong muốn tìm điều kiện phù hợp cho trình sinh tổng hợp xylanase D P pastoris GS115 mang gen tái tổ hợp Lý để lựa chọn thời gian nuôi cấy yếu tố nghiên cứu điều kiện biểu xylanase yếu tố ảnh hưởng quan trọng đến suất chất lượng protein tái tổ hợp Khi tế bào sinh trưởng đến pha cân bằng, nguồn dinh dưỡng cạn dần nên tế bào có khuynh hướng sử dụng protein tái tổ hợp vốn tích lũy dư thừa làm nguồn dinh dưỡng cho tế bào trì Do vậy, xylanase tái tổ hợp cần phải thu mẫu thời điểm thích hợp để bảo tồn lượng protein tái tổ hợp tạo Để tìm thời gian nuôi cấy phù hợp, thu dịch enzym sau 24 nuôi cấy tiến hành định lượng hoạt tính enzym Kết mục 3.1.2.1 cho thấy thời điểm 120 giờ, xylanase tái tổ hợp có hoạt tính cao (1,233 ± 0,037 IU/ml) Thời điểm cho thấy tương đồng thời điểm xylanase A cho hoạt tính cao nghiên cứu trước A niger DSM1957 [24] Sau chọn thời gian nuôi cấy 120 giờ, tiếp tục khảo sát nồng độ methanol cảm ứng Nồng độ methanol xác định tốc độ tăng trưởng hấp thụ, tỉ lệ sản xuất protein tái tổ hợp nên lựa chọn nồng độ methanol ổn định mục tiêu giúp thiện suất sinh xylanase tái tổ hợp Nồng độ methanol khảo sát 0,1%; 0,2%; 0,5%; 0,8%; 1,0%; 1,5%; 2,0% thu dịch thời điểm 120 để định lượng hoạt tính xylanase tái tổ hợp Kết mục 3.1.2.2 cho thấy mật độ tế tăng tăng nồng độ chất cảm ứng từ 0,1-1,0%, nồng độ methanol cảm ứng 1,0% mật độ tế bào cao đạt 7,66 xylanase tái tổ hợp cho hoạt tính cao (1,153 ± 0,050 IU/ml) Khi nồng độ chất cảm ứng tăng lên 1,5-2,0%, mật độ tế bào giảm mạnh 1,12 2,0%, đồng thời hoạt tính xylanase giảm xuống thấp 0,919 ± 0,009 IU/ml Điều lý giải lực methanol oxidase thấp Khi đó, tốc độ oxy hóa methanol phụ thuộc vào nồng độ methanol, tốc độ tăng trưởng thấp nồng độ methanol thấp Khi nồng độ methanol tăng cao, phát triển tế bào bị ức chế đảo ngược lượng lớn hydrogen peroxid tạo tăng tốc độ oxy hóa methanol [15] 37 Do thời gian nghiên cứu có hạn, chúng tơi khảo sát điều kiện ban đầu nên kết thu hoạt tính xylanase cịn khiêm tốn Để sinh tổng hợp sản lượng enzym lớn phục vụ cho nghiên cứu, ứng dụng quy mô công nghiệp sau cần có nghiên cứu môi trường dinh dưỡng điều kiện khác để tối ưu điều kiện sinh tổng hợp xylanase 38 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT KẾT LUẬN Đã nhân dịng thiết kế thành cơng vector biểu xylanase D từ chủng Aspergillus niger DSM1957 Pichia pastoris GS115 mang gen mã hóa xylanase D, gen xln D có kích thước phân tử 957 bp Đã tạo chủng tái tổ hợp P pastoris GS115/pPXlnD biểu protein xylanase D từ chủng Aspergillus niger DSM1957, rXlnD có khối lượng phân tử > 35 kDa thể điện di SDS-PAGE Chủng tái tổ hợp biểu rXlnD tốt 120 nuôi cấy, cảm ứng 1% methanol sau 24 cho hoạt tính enzym đạt 1,153 IU/ml ĐỀ XUẤT Tiếp tục tối ưu thành phần môi trường dinh dưỡng điều kiện nuôi cấy để tăng khả sinh tổng hợp xylanase D tái tổ hợp chủng P pastoris GS115 Tinh xylanase D tái tổ hợp để đánh giá độ sạch, hiệu suất làm nguyên liệu để đánh giá tính chất lý hóa xylanase D tái tổ hợp 39 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Đặng Thị Kim Anh, Thân Thị Hương, et al (2016), "Biểu gen mã hóa endo-1,4-β-xylanase chịu nhiệt, hoạt động môi trường axit nhằm ứng dụng sản xuất thức ăn chăn ni", Tạp chí KH Nơng nghiệp Việt Nam, 14(3), tr 400-408 Trần Liên Hà, Nguyễn Thị Ngọc Ngà (2013), "Tách dịng biểu gene mã hóa enzyme xylanase từ nấm mốc Aspergillus niger C1 vào E coli BL21", Tạp chí Khoa học Cơng nghệ, 51(1), tr 73-73 Tiếng Anh 10 11 12 13 Ahmad M., Hirz M., et al (2014), "Protein expression in Pichia pastoris: recent achievements and perspectives for heterologous protein production", Applied microbiology biotechnology, 98(12), pp 5301-5317 Aiewviriyasakul K., Bunterngsook B., et al (2021), "Biochemical characterization of xylanase GH11 isolated from Aspergillus niger BCC14405 (XylB) and its application in xylooligosaccharide production", Biotechnology Letters, 43(12), pp 2299-2310 Ando H., Ohba H., et al (2004), "Hot compressed water decomposed products from bamboo manifest a selective cytotoxicity against acute lymphoblastic leukemia cells", Toxicol In Vitro, 18(6), pp 765-71 Avwioroko O J., Anigboro A A., et al (2018), "Isolation, identification and in silico analysis of alpha-amylase gene of Aspergillus niger strain CSA35 obtained from cassava undergoing spoilage", Biochem Biophys Rep, 14, pp 35-42 Bar K A (1992), "Protocol for efficient secrection of HSA developed from Pichia pastoris", Phamaceutical Engineering, 12, pp 48-51 Bassam B J., Caetano-Anolles G., et al (1991), "Fast and sensitive silver staining of DNA in polyacrylamide gels", Anal Biochem, 196(1), pp 80-3 Basu M., Kumar V., et al (2018), "Recombinant approaches for microbial xylanases: recent advances and perspectives", Current Protein Peptide Science, 19(1), pp 87-99 Bhatia L., Sharma A., et al (2019), "Lignocellulose derived functional oligosaccharides: production, properties, and health benefits", Prep Biochem Biotechnol, 49(8), pp 744-758 Bissoon S., Christov L., et al (2002), "Bleach boosting effects of purified xylanase from Thermomyces lanuginosus SSBP on bagasse pulp", Process Biochemistry, 37(6), pp 567-572 Café M B., Borges C A., et al (2002), "Avizyme improves performance of broilers fed corn-soybean meal-based diets", Journal of Applied Poultry Research, 11(1), pp 29-33 Cai J., Chen X L., et al (2021), "Cloning and heterologous expression of a novel xylanase gene TAX1 from Trichoderma atroviride and its 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 application in the deconstruction of corn stover", Applied Biochemistry Biotechnology, 193(10), pp 3029-3044 Cereghino G P L., Cereghino J L., et al (2001), "New selectable marker/auxotrophic host strain combinations for molecular genetic manipulation of Pichia pastoris", Gene, 263(1-2), pp 159-169 Couderc R., Baratti J (1980), "Oxidation of methanol by the yeast, Pichia pastoris Purification and properties of the alcohol oxidase", Agricultural biological chemistry, 44(10), pp 2279-2289 Cregg J M., Madden K R., et al (1989), "Functional characterization of the two alcohol oxidase genes from the yeast Pichia pastoris", Molecular cellular biology, 9(3), pp 1316-1323 Cregg J M., Tolstorukov I., et al (2009), "Expression in the yeast Pichia pastoris", Methods in enzymology, 463, pp 169-189 da Silva A E., Marcelino H R., et al (2012), "Xylan, a promising hemicellulose for pharmaceutical use", Products Applications of Biopolymers, 7, pp 61-84 Dagenais T R T., Keller N P (2009), "Pathogenesis of Aspergillus fumigatus in invasive aspergillosis", Clinical microbiology reviews, 22(3), pp 447-465 Dao T M A., Cuong N T., et al (2022), "Purification, identification, and characterization of a Glycoside hydrolase family 11-Xylanase with high activity from Aspergillus niger VTCC 017", Mol Biotechnol, 64(2), pp 187-198 Davani-Davari D., Negahdaripour M., et al (2019), "Prebiotics: Definition, types, sources, mechanisms, and clinical applications", Foods, 8(3), pp De Vries R P., Riley R., et al (2017), "Comparative genomics reveals high biological diversity and specific adaptations in the industrially and medically important fungal genus Aspergillus", Genome biology, 18(1), pp 1-45 Deng P., Li D., et al (2006), "Cloning of a gene encoding an acidophilic endo-β-1, 4-xylanase obtained from Aspergillus niger CGMCC1067 and constitutive expression in Pichia pastoris", Enzyme Microbial Technology, 39(5), pp 1096-1102 Do T T., Quyen D T (2013), "Cloning, expression and purification of an xylanase gene from Aspergillus niger DSM1957 in Pichia pastoris GS115", Journal of science and technology, 11(2), pp 285-291 Do T T., Quyen D T., et al (2013), "Molecular characterization of a glycosyl hydrolase family 10 xylanase from Aspergillus niger", Protein Expr Purif, 92(2), pp 196-202 dÕAnjou M C., Daugulis A J (1997), "A model-based feeding strategy for fed-batch fermentation of recombinant Pichia pastoris", Biotechnology techniques, 11(12), pp 865-868 Elgharbi F., Hmida-Sayari A., et al (2015), "Expression of an Aspergillus niger xylanase in yeast: Application in breadmaking and in vitro digestion", International journal of biological macromolecules, 79, pp 103-109 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 Ellatif S A., Abdel Razik E S., et al (2022), "Enhanced production, cloning, and expression of a xylanase gene from endophytic fungal strain Trichoderma harzianum kj831197 1: Unveiling the in vitro anti-fungal activity against phytopathogenic fungi", Journal of Fungi, 8(5), pp 447 Fang W., Gao H., et al (2014), "Cloning and expression of a xylanase xynB from Aspergillus niger IA-001 in Pichia pastoris", Basic Microbiol, 54 Suppl 1, pp S190-9 Grand View Research (2022), "Enzymes Market Size Worth $17.88 Billion by 2028: Grand View Research, Inc.", Retrieved 25/06, 2022, from https://www.grandviewresearch.com/press-release/global-enzymesmarket GSL Biotech LLC (2022), "pPICZ(alpha) A", Retrieved 25/06, 2022, from https://www.snapgene.com/resources/plasmidfiles/?set=yeast_plasmids&plasmid=pPICZ(alpha)_A Hartner F S., Glieder A (2006), "Regulation of methanol utilisation pathway genes in yeasts", Microbial cell factories, 5(1), pp 1-21 Hedayati M T., Pasqualotto A C., et al (2007), "Aspergillus flavus: human pathogen, allergen and mycotoxin producer", Microbiology, 153(6), pp 1677-1692 Henrissat B., Claeyssens M., et al (1989), "Cellulase families revealed by hydrophobic cluster analysis", Gene, 81(1), pp 83-95 Henrissat B., Coutinho P M (2001), "Classification of glycoside hydrolases and glycosyltransferases from hyperthermophiles", Methods Enzymol, 330, pp 183-201 Higgins D R (1995), "Overview of protein expression in Pichia pastoris", Current protocols in protein science, 2(1), pp 5.7 1-5.7 18 Ichishima E (2016), "Development of enzyme technology for Aspergillus oryzae, A sojae, and A luchuensis, the national microorganisms of Japan", Bioscience, Biotechnology, Biochemistry, 80(9), pp 1681-1692 Kinoshita K., Takano M., et al (1995), "Cloning of the xynNB gene encoding xylanase B from Aspergillus niger and its expression in Aspergillus kawachii", Journal of fermentation bioengineering, 79(5), pp 422-428 Kumar G P., Pushpa A., et al (2012), "A review on xylooligosaccharides", International Research Journal of Pharmacy, 3(7), pp Kumar V., Shukla P (2016), "Functional aspects of xylanases toward industrial applications", Frontier discoveries and innovations in interdisciplinary microbiology, Springer, pp 157-165 Khat-Udomkiri N., Sivamaruthi B S., et al (2018), "Optimization of alkaline pretreatment and enzymatic hydrolysis for the extraction of xylooligosaccharide from rice husk", AMB Express, 8(1), pp 115 Laemmli U K (1970), "Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4", Nature, 227(5259), pp 680-5 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 Lafond M., Guais O., et al (2014), "Four GH11 xylanases from the xylanolytic fungus Talaromyces versatilis act differently on (arabino) xylans", Applied microbiology biotechnology, 98(14), pp 6339-6352 Li Q., Ray C S., et al (2020), "Aspergillus niger production of pectinase and alpha-galactosidase for enzymatic soy processing", Enzyme Microb Technol, 134, pp 109476 Lombard V., Golaconda Ramulu H., et al (2014), "The carbohydrate-active enzymes database (CAZy) in 2013", Nucleic Acids Res, 42(Database issue), pp D490-5 Long L., Zhang Y., et al (2020), "Recombinant expression of Aspergillus niger GH10 endo‐xylanase in Pichia pastoris by constructing a double‐ plasmid co‐expression system", Journal of Chemical Technology Biotechnology, 95(3), pp 535-543 Macauley‐Patrick S., Fazenda M L., et al (2005), "Heterologous protein production using the Pichia pastoris expression system", yeast, 22(4), pp 249-270 Mandal A (2015), "Review on microbial xylanases and their applications", Appl Microbiol Biotechnol, 42, pp 45-42 McKee L S., Peña M J., et al (2012), "Introducing endo-xylanase activity into an exo-acting arabinofuranosidase that targets side chains", Proceedings of the National Academy of Sciences, 109(17), pp 6537-6542 Mewis K., Lenfant N., et al (2016), "Dividing the large glycoside hydrolase family 43 into subfamilies: a motivation for detailed enzyme characterization", Appl Environ Microbiol, 82(6), pp 1686-1692 Miller G L (1959), "Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar", Analytical Chemistry, 31(3), pp 426-428 Motta F L., Andrade C C P., et al (2013), "A review of xylanase production by the fermentation of xylan: classification, characterization and applications", Sustainable degradation of lignocellulosic biomasstechniques, applications commercialization, 1, pp 251-276 Moure A., Gullón P., et al (2006), "Advances in the manufacture, purification and applications of xylo-oligosaccharides as food additives and nutraceuticals", Process Biochemistry, 41(9), pp 1913-1923 Mussatto S I., Mancilha I M (2007), "Non-digestible oligosaccharides: A review", Carbohydrate Polymers, 68(3), pp 587-597 Nabarlatz D., Montane D., et al (2007), "Almond shell xylooligosaccharides exhibiting immunostimulatory activity", Carbohydr Res, 342(8), pp 1122-8 NCBI (2022), "Xylanase D [Aspergillus niger]", Retrieved 25/06, 2022, from https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/ACF75334.1?report=graph Ottenheim C., Verdejo C., et al (2014), "Hemicellulase production by Aspergillus niger DSM 26641 in hydrothermal palm oil empty fruit bunch hydrolysate and transcriptome analysis", Journal of bioscience bioengineering, 118(6), pp 696-701 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 Park H S., Jun S C., et al (2017), "Diversity, application, and synthetic biology of industrially important aspergillus fungi", Adv Appl Microbiol, 100, pp 161-202 Polizeli M L T M., Rizzatti A C S., et al (2005), "Xylanases from fungi: properties and industrial applications", Applied microbiology biotechnology, 67(5), pp 577-591 Saha B C (2003), "Hemicellulose bioconversion", Journal of industrial microbiology biotechnology, 30(5), pp 279-291 Samanta A K., Kolte A P., et al (2011), "A simple and efficient diffusion technique for assay of endo beta-1,4-xylanase activity", Braz J Microbiol, 42(4), pp 1349-53 Santos C R., Polo C C., et al (2014), "Mechanistic strategies for catalysis adopted by evolutionary distinct family 43 arabinanases", Journal of Biological Chemistry, 289(11), pp 7362-7373 Scientific Thermo (2015), Product information: CloneJET PCR Cloning Kit Thermo Fisher Scientific Inc., pp Shahi N., Hasan A., et al (2016), "Xylanase: a promising enzyme", J Chem Pharm Res, 8, pp 334-339 Shekhar C., Thakur S S., et al (2010), "Effect of exogenous fibrolytic enzymes supplementation on milk production and nutrient utilization in Murrah buffaloes", Tropical animal health production, 42(7), pp 14651470 Sheu W H., Lee I T., et al (2008), "Effects of xylooligosaccharides in type diabetes mellitus", J Nutr Sci Vitaminol (Tokyo), 54(5), pp 396-401 Shuaiyang W., Huiling L., et al (2013), "Preparation of xylan citrate - A potential adsorbent for industrial wastewater treatment", Carbohydrate polymers, 92(2), pp 1960-1965 Singh A., Narang A (2020), "The Mut(+) strain of Komagataella phaffii (Pichia pastoris) expresses PAOX1 and 10 times faster than Mut(s) and Mut(-) strains: evidence that formaldehyde or/and formate are true inducers of PAOX1", Appl Microbiol Biotechnol, 104(18), pp 7801-7814 Sredkova P., Batsalova T., et al (2020), "Prebiotics can change immunomodulatory properties of probiotics", Cent Eur J Immunol, 45(3), pp 248-255 Swennen K., Courtin C M., et al (2006), "Non-digestible oligosaccharides with prebiotic properties", Crit Rev Food Sci Nutr, 46(6), pp 459-71 Touzel J P., O'Donohue M., et al (2000), "Thermobacillus xylanilyticus gen nov., sp nov., a new aerobic thermophilic xylan-degrading bacterium isolated from farm soil", International Journal of Systematic Evolutionary Microbiology, 50(1), pp 315-320 Theobald S., Larsen T O., et al (2018), "Genus-level studies of gene dynamics for the Aspergillus genus", pp Uniprot (2022), "Aspergillus niger", Retrieved 25/06, 2022, from https://www.uniprot.org/uniprot/?query=organism%3A%22Aspergillus+n iger%22+AND+reviewed%3Ayes&sort=score 74 75 76 77 78 Verma D., Satyanarayana T (2012), "Molecular approaches for ameliorating microbial xylanases", Bioresource technology, 117, pp 360367 Vogl T., Glieder A (2013), "Regulation of Pichia pastoris promoters and its consequences for protein production", New biotechnology, 30(4), pp 385-404 Xu S., Fu B., et al (2015), "Bioconversion of H2/CO2 by acetogen enriched cultures for acetate and ethanol production: the impact of pH", World Journal of Microbiology Biotechnology, 31(6), pp 941-950 Zanphorlin L M., de Morais M A B., et al (2019), "Structure‐guided design combined with evolutionary diversity led to the discovery of the xylose‐releasing exo‐xylanase activity in the glycoside hydrolase family 43", Biotechnology Bioengineering, 116(4), pp 734-744 Zhao S., Liu Q., et al (2019), "Differential transcriptomic profiling of filamentous fungus during solid-state and submerged fermentation and identification of an essential regulatory gene PoxMBF1 that directly regulated cellulase and xylanase gene expression", Biotechnology for biofuels, 12(1), pp 1-14 PHỤ LỤC Bảng 4.1 Số liệu xây dựng đường chuẩn xylose y = 0,0051x - 0,3409 R² = 0,9941 Xylose Đệm KP (µg) (µl) 30 µg/ml OD1 OD2 OD3 ODTB 470 60 0,014 0,012 0,017 0,014 35 465 70 0,025 0,022 0,020 0,022 40 460 80 0,092 0,058 0,040 0,063 50 450 100 0,165 0,160 0,142 0,156 60 440 120 0,250 0,273 0,241 0,255 75 425 150 0,420 0,393 0,381 0,398 80 420 160 0,454 0,483 0,468 0,468 90 410 180 0,568 0,588 0,555 0,570 100 400 200 0,656 0,663 0,710 0,676 110 390 220 0,817 0,814 0,858 0,830 120 380 240 0,894 0,907 0,891 0,897 Bảng 4.2 Hoạt tính đo theo thời gian OD540 Thời gian cảm ứng (h) OD600 24 OD1 OD2 OD3 ODTB 0,675 0,044 0,035 0,054 0,044 48 1,340 0,059 0,058 0,046 0,054 72 6,960 0,084 0,074 0,083 0,080 96 7,585 0,087 0,110 0,117 0,105 120 8,095 0,147 0,126 0,120 0,131 144 8,343 0,091 0,085 0,087 0,088 168 8,495 0,069 0,043 0,065 0,059 192 9,110 0,057 0,055 0,046 0,053 Bảng 4.3 Hoạt tính theo nồng độ methanol cảm ứng Nồng độ methanol cảm ứng OD540 OD600 (%) OD1 OD2 OD3 ODTB 0,1 2,620 0,040 0,036 0,008 0,028 0,2 4,310 0,072 0,075 0,070 0,072 0,5 5,690 0,087 0,078 0,085 0,083 0,8 7,300 0,074 0,078 0,095 0,082 1,0 7,660 0,080 0,118 0,104 0,101 1,5 5,210 0,038 0,031 0,021 0,030 2,0 1,120 0,008 0,015 0,010 0,011 PHỤ LỤC Phương pháp nhuộm gel protein bạc Nhuộm gel protein bạc có độ nhạy cao so với nhuộm Comassie, phát 10-50 ng protein (Jeff Brodsky, Tamara prototol) Nguyên liệu: Dung dịch vừa đủ gel: - Dung dịch A1: 100 ml gồm ethanol (50 ml), acid acetic (12 ml), H2O (38 ml), formaldehyd 37% (50 µl) - Dung dịch A2: 200 ml ethanol 50% Dung dịch A3: 100 ml gồm 10 mg Na2S2O3 100 ml H2O Dung dịch A4: 100 mg AgNO3 100ml H2O Dung dịch A5: 100 ml gồm Na2CO3 (3 g), formaldehyd 37% (50 µl), dung dịch C (2 ml), H2O (98 ml) - Dung dịch A6: 100 ml EDTA 25mM Tiến hành: Rửa gel với dung dịch A1 Loại bỏ dịch Rửa gel lần, lần 70 ml dung dịch A2 20 phút Loại bỏ dịch Rửa gel với dung dịch A3 vịng phút ( rửa q lâu làm giảm khả nhuộm bạc) Loại bỏ dịch Rửa lại lần với nước cất, lần 20 giây Nhuộm gel 30 phút dung dịch A4 Loại bỏ dịch Rửa lại lần với nước cất lần 20 giây Hiện gel dung dịch A5 từ 10 phút đến Theo dõi cẩn thận gel, tránh để màu mức Dừng nhuộm dung dịch A6 20 phút Rửa gel nước cất BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN XUÂN CHIẾN NHÂN DÒNG, THIẾT KẾ VECTOR, BIỂU HIỆN XYLANASE TÁI TỔ HỢP TRONG PICHIA PASTORIS GS115 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2022 ... Nội dung nghiên cứu Nhân dịng, thiết kế vector, biểu xylanase D tái tổ hợp Pichia pastoris GS115 Biểu P pastoris Nhân dòng gen mã hóa GS115/ pPXlnD tái tổ xylanase D hợp Thiết kế vector tách dòng... vector biểu xylanase D tái tổ hợp Pichia pastoris GS115? ?? với mục tiêu: (1) Nhân dòng thiết kế vector biểu xylanase D từ chủng Aspergillus niger DSM1957 (2) Biểu xylanase D Pichia pastoris GS115. .. kiện sinh tổng hợp xylanase 38 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT KẾT LUẬN Đã nhân dịng thiết kế thành cơng vector biểu xylanase D từ chủng Aspergillus niger DSM1957 Pichia pastoris GS115 mang gen mã hóa xylanase