Biểu hiện, tinh chế GM CSF (granulocyte macrophage colony stimulating factor) người tái tổ hợp từ nấm men và thử nghiệm hoạt tính in vitro2

ỦY BAN NHÂN DÂN TP HCM ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ TRƯỜNG ĐH KHOA HỌC TỰ NHIÊN BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC BIỂU HIỆN, TINH CHẾ GM-CSF (GRANULOCYTE-MACROPHAGE COLONY STIMULATING FACTOR) NGƢỜI TÁI TỔ HỢP TỪ NẤM MEN VÀ THỬ NGHIỆM HOẠT TÍNH IN VITRO Chủ nhiệm đề tài TS Trần Văn Hiếu Tp Hồ Chí Minh, tháng năm 2015 DANH SÁCH NHỮNG THÀNH VIÊN THAM GIA NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI VÀ ĐƠN VỊ PHỐI HỢP CHÍNH Danh sách thành viên tham gia nghiên cứu: Họ tên STT Cơ quan công tác Trần Văn Hiếu, TS Trường ĐH KHTN, ĐHQG-HCM Phạm Thị Kim Liên, ThS Trường ĐH KHTN, ĐHQG-HCM Ngô Thị Kim Hằng, ThS Trường ĐH KHTN, ĐHQG-HCM Trần Tiến Anh Thy, ThS Trường ĐH KHTN, ĐHQG-HCM Đặng Tất Trường, ThS Trường ĐH KHTN, ĐHQG-HCM Nguyễn Thanh Thảo, ThS Trường ĐH KHTN, ĐHQG-HCM Trần Linh Thước, GS.TS Trường ĐH KHTN, ĐHQG-HCM Chủ nhiệm, chủ trì nghiên cứu tạo dịng, biểu hiện, tinh chế thử hoạt tính GM-CSF Thư kí đề tài, tham gia nghiên cứu tạo chủng nấm men P pastoris tái tổ hợp thử hoạt tính tế bào Tham gia nghiên cứu tạo chủng nấm men S cerevisiae tái tổ hợp Tham gia thực q trình thu nhận, tinh chế thử hoạt tính tế bào Tham gia nghiên cứu tạo chủng nấm men P pastoris tái tổ hợp Tham gia thực trình thu nhận, tinh chế thử hoạt tính tế bào Chỉ đạo chun mơn Đơn vị phối hợp chính: - Nơi thực đề tài: Trường ĐH KHTN, ĐHQG-HCM THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU TỔNG QUAN ĐỀ TÀI 1.1 Bệnh giảm bạch cầu hạt sau hóa/xạ trị Tại Việt Nam, ung thư nguyên nhân hàng đầu gây tử vong Theo số liệu công bố Hội thảo Quốc gia phòng chống ung thư, năm 2010 Việt Nam có 126.300 ca mắc khoảng 100.000 người tử vong Tỉ lệ mắc ung thư Việt Nam tăng nhanh Riêng Bệnh viện K từ năm 2005 đến 2009 có 71.610 bệnh nhân ung thư, tăng 2,5 lần so với giai đoạn 2001-2004 Theo WHO, số người chết ung thư nước ta năm 2005 71.000 người chiếm 13% tổng số người chết dự đoán đến năm 2030 lên đến 19,2% Do hóa trị định cho nhiều bệnh nhân nên nhu cầu sử dụng thuốc điều trị GCSF hay GM-CSF để giảm nguy neutropenia lớn Như vậy, nhu cầu sử dụng GM-CSF có thật lớn Việt Nam Biệt dược Leukine Bayer Healthcare Pharmaceuticals sản xuất phân phối với giá khoảng khoảng 3,2 triệu tới 6,4 triệu đồng/liều tiêm/ngày, đắt so với mặt thu nhập chung Việt Nam Việc sử dụng GM-CSF điều trị neutropenia Việt Nam chưa phổ biến Thuốc hết quyền thương mại vào tháng 12 năm 2017 Hiện nay, nghiên cứu sản xuất GM-CSF chưa quan tâm thực Việt Nam Do vậy, việc nghiên cứu, phát triển thuốc GM-CSF đón đầu trước thuốc hết thời hạn quyền vào năm 2017 để phục vụ điều trị bệnh phát triển lĩnh vực sinh dược (biopharmaceutics) Việt Nam nhu cầu thiết thực xúc thực tiễn đời sống sản xuất 1.2 GM-CSF 1.2.1 Vai trò GM-CSF trình tạo tế bào máu dịng tủy GM-CSF đóng vai trị quan trọng cần thiết cho hình thành tế bào dịng tủy Trừ hồng cầu, tế bào dòng tủy cần có GM-CSF q trình biệt hóa trưởng thành chúng Đặc biệt, GM-CSF cần thiết cho trưởng thành bạch cầu trung tính, tế bào đơn nhân tế bào tua 1.2.2 Cấu trúc phân tử GM-CSF GM-CSF glycoprotein tiết, có trọng lượng phân tử 14 kDa đến 35 kDa mã hóa gen nằm cánh dài NST số năm người GMCSF người chuột có chứa hai vị trí tiềm cho việc gắn đường thông qua nối nitơ (N-linkage) Việc gắn nhóm đường làm tăng trọng lượng phân tử acid hóa GM-CSF GM-CSF tạo từ E coli có hoạt tính sinh học in vitro cao chứng tỏ đường hóa khơng cần thiết cho hoạt tính GMCSF lại có ảnh hưởng tới lực gắn lên thụ thể Cấu trúc sơ cấp GM-CSF chuột, vượn, người bò xác định Ở đầu N phân tử protein có chứa trình tự tiên phong, bao gồm 25 amino acid GM-CSF trưởng thành chuột chứa 124 amino acid, người, vượn bị có thêm amino acid nằm vị trí amino acid số 27 28 so chuột amino acid nằm chuỗi xoắn α bốn chuỗi liên quan tới khả gắn lên thụ thể tiểu đơn vị  GM-CSF người chuột tương đồng mặt trình tự mức 56% khơng có hoạt tính chéo lẫn 1.2.3 Hoạt tính sinh học phƣơng pháp xác định hoạt tính GM-CSF Hoạt tính GM-CSF phát định lượng in vitro dựa số ngun tắc khả kích thích tạo nhóm tế bào (colony formation assay) tế bào tủy xương, khả kích thích phân chia tế bào tủy xương, khả kích thích tăng trưởng số dịng tế bào ni cấy phụ thuộc GM-CSF dòng tế bào tiền thân hồng cầu-bạch cầu TF1, dòng tế bào chuẩn cho thử nghiệm GM-CSF người khả biệt hóa tế bào đơn nhân thành tế bào tua có diện IL-4 1.3 Các hệ thống biểu protein tái tổ hợp cho GM-CSF 1.3.1 Hệ thống Escherichia coli Việc lựa chọn tế bào thích hợp cho sản xuất cịn phụ thuộc vào nhiều yếu tố đặc điểm, ứng dụng protein mục tiêu, đặc điểm tăng trưởng, mức biểu hiện, biến đổi hậu dịch mã chi phí Hiện nay, Escherichia coli chủng chủ sử dụng phổ biến sản xuất protein tái tổ hợp có ưu thếnổi bật tốc độ tăng trưởng nhanh chóng, đạt mật độ tế bào cao, phát triển môi trường đơn giản, rẻ tiền, đặc tính di truyền hiểu biết rõ, sản lượng protein sản xuất cao, có nhiều chủng đột biến, nhiều vector tạo dịng thích hợp thao tác di truyền dễ dàng Tuy nhiên, nhược điểm lớn hệ thống biểu protein tái tổ hợp tạo dạng không tan (thể vùi), hoạt tính, đặc biệt biểu vượt mức nên đòi hỏi phải tái gấp cuộn protein mục tiêu sau thu nhận Hơn nữa, protein tạo thường thiếu biến đổi sau dịch mã, yêu cầu cần thiết cho protein có nguồn gốc từ người dùng trị liệu 1.3.2 Hệ thống tế bào động vật hữu nhũ Hệ thống tế bào động vật hữu nhũ (CHO dịng phát sinh) có hệ thống biến đổi sau dịch mã hoàn chỉnh biến đổi phức tạp phù hợp với việc sản xuất protein có kích thước phân tử lớn, phức tạp Tuy nhiên, việc trì dịng tế bào tốn yêu cầu an toàn khiến cho việc ứng dụng hệ thống gặp nhiều trở ngại, phần lớn xuất phát từ vấn đề kinh phí 1.3.3 Hệ thống nấm men Saccharomyces cerevisiae coi hệ thống “chuẩn vàng” thứ S cerevisiae coi sinh vật an tồn GRAS (Generally Recognized as Safe); mơi trường đơn giản, rẻ tiền; tiết protein mạnh Tuy nhiên, nấm men lại glycosyl q mức Q trình N-glycosyl hố S cerevisiae ln có chứa liên kết α-1,3 glycan đầu kết thúc , liên kết có tính kháng ngun cao nên có khả gây tác dụng phụ điều trị Gần đây, Pichia pastoris lên hệ thống nấm men phù hợp cho mục đích biểu protein tái tổ hợp từ người nguồn cacbon glucose, glycerol, sorbitol,… P pastoris sử dụng nguồn cacbon 1C mang tính khử methan, methanol Tăng trưởng tối ưu nhiệt độ 30-32oC, pH 3,3-7,0 Chu kỳ tế bào khoảng 90 phút, sinh sản cách nhân đôi nảy chồi Biểu tiết protein ngoại lai mạnh, điều hồ chặt chẽ, ni cấy mật độ cao môi trường đơn giản, rẻ tiền quan trọng khơng glycosyl q mức nên hệ thống thay thích hợp cho S cerevisiae 1.4 GM-CSF tái tổ hợp thƣơng mại tình hình nghiên cứu Việt Nam 1.4.1 GM-CSF tái tổ hợp thƣơng mại Hiê ̣n có hai da ̣ng GM -CSF thương ma ̣i phổ biế n là Sargramostim và Molgramostim LEUKINE® (Sargramostim) GM-CSF tái tở hơ ̣p đươ ̣c tổ ng hơ ̣p Saccharomyces cerevisia, bao gồ m 127 amino acid của GM -CSF tự nhiên ở người, khác amino acid thứ 23 (Arginine đươ ̣c thay bằ ng Leucine ) đươ ̣c glycosyl hóa Sargramostim có khối lượng phân tử 19,5; 16,8; 15,5 kDa đươ ̣c FDA chấ p thuâ ̣n vào tháng năm 1991 với tên thương ma ̣i là Leukine, sản xuất lần Bayer HealthCare Pharmaceuticals Leukine có ứng dụng c hủ yếu: (i) Phục hồi tủy xương sau ghép tủy ghép tế bào gốc tạo máu; (ii) Tăng số lươ ̣ng ba ̣ch cầ u trung tính sau điề u tri ̣ ung thư bằ ng hóa tri ̣ Giá bán 999 USD/(250 mcg x lọ) LEUCOMAX® (Molgramostim) GM-CSF tái tở hơ ̣p đươ ̣c tổ ng hơ ̣p Escherichia coli, bao gồ m 127 amino acid của GM -CSF tự nhiên ở người và không đươ ̣c glycosyl hóa , có trọng lượng phân tử 14,5 kDa, khơng có thêm Methionine ở đầ u N Molgramostim có tên thương ma ̣i là Leucomax® đồng phát triểnbởi hai cơng ty Schering -Plough và Novartis Leucomax® đươ ̣c đưa thi ̣trường từ năm 1991 dưới sự đồ ng ý của EMEA Molgramostim có ứng du ̣ng tương tự Sargramostim Giá Leucomax khoảng 480 USD/300 µg Bằ ng sáng chế của Molgramo stim đã hế t hạn từ năm 2006 1.4.2 Tình hình nghiên cứu GM-CSF Việt Nam Cơng nghệ sản xuất protein tái tổ hợp dùng làm thuốc bảo hộ quyền thường không chuyển giao Công nghệ sản xuất GMCSF tái tổ hợp phức tạp, đòi hỏi kết hợp hiệu phương pháp, kỹ thuật công nghệ gen, công nghệ lên men công nghệ protein enzyme Cho đến nay, Việt Nam, việc nghiên cứu sản xuất ứng dụng GM-CSF làm thuốc chưa quan tâm Việc nghiên cứu thành công công nghệ sản xuất GM-CSF tái tổ hợp Việt Nam khơng có ý nghĩa khoa học mà cịn góp phần làm giảm khoảng cách trình độ khoa học - cơng nghệ Việt Nam so với nước khu vực giới Thêm vào đó, việc quyền sản xuất GM-CSF S cerevisiae Bayer Healthcare Pharmaceuticals (Hoa Kỳ) hết liệu lực vào 12/2017 mở hội lớn cho nước ta tiếp cận sản xuất GM-CSF Tại Trường ĐH Khoa học Tự nhiên, ĐH Quốc gia TP.HCM, việc dùng công nghệ gen để phân lập dòng sản xuất protein tái tổ hợp dùng cho mục đích chẩn đốn làm vắcxin thực thành công nhiều năm Bên cạnh đó, chúng tơi quan tâm đặc biệt đến việc nghiên cứu công nghệ sản xuất GM-CSF tái tổ hợp để làm thuốc Thời gian vừa qua, bước đầu tổng hợp thông tin, đưa chiến lược tiếp cận hướng ứng dụng tới cho sản phẩm Với việc làm đó, chúng tơi bước đầu tối ưu hóa tổng hợp gen mã hóa GM-CSF người nấm men Các nội dung nghiên cứu đặt để giải đề tài lần NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 2.1 Nội dung 1: Phân lập dòng gen mã hóa GM-CSF ngƣời 2.1.1 Thiết kế gen mã hóa GM-CSF thay đổi codon 2.1.2 Phân lập dòng E coli mang gen hgmcsf biểu P pastoris 2.1.3 Phân lập dòng E coli mang gen hgmcsf biểu S cerevisiae 2.2 Nội dung 2: Phân lập dòng nấm men P pastoris tổng hợp tiết GMCSF ngoại bào 2.2.1 Tạo dòng P pastoris X33 mang plasmid tái tổ hợp pPICZαA/hGM-CSF 2.2.2 Kiểm tra khả biểu protein hGM-CSF dạng tiết môi trƣờng chủng P pastoris X33::hgmcsf 2.2.3 Lên men thu nhận protein hGM-CSF quy mô 3500 mL 2.3 Nội dung 3: Phân lập dòng nấm men S cerevisiae tổng hợp tiết GM-CSF ngoại bào 2.3.1 Tạo dòng S cerevisiae BY4742 mang plasmid tái tổ hợp pYES2hgmcsf 2.3.2 Kiểm tra khả biểu hGM-CSF S cerevisiae BY4742/pYES2-hgmcsf 2.3.3 Lên men thu nhận protein hGM-CSF quy mô 3500 mL 2.4 Nội dung 4: Nghiên cứu phƣơng pháp thu nhận GM-CSF đƣợc tổng hợp tiết ngoại bào nấm men P pastoris S cerevisiae 2.4.1 Thu nhận GM-CSF đƣợc tổng hợp tiết ngoại bào nấm men P pastoris 2.4.2 Thu nhận GM-CSF đƣợc tổng hợp tiết ngoại bào nấm men S cerevisiae 2.5 Nội dung 5: Bƣớc đầu tinh GM-CSF qui mơ phịng thí nghiệm 2.5.1 Tinh hGM-CSF từ sản phẩm lên men chủng P pastoris X33::hgmcsf 2.5.2 Tinh hGM-CSF từ sản phẩm lên men chủng S cerevisiae BY4742/hgmcsf 2.6 Nội dung 6: Đánh giá chất lƣợng GM-CSF 2.6.1 Đánh giá mức độ tinh khiết hGM-CSF sau tinh 2.6.2 Đánh giá hoạt tính hGM-CSF sau tinh KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Nội dung 1: Phân lập dòng gen mã hóa GM-CSF ngƣời 3.1.1 Thiết kế gen mã hóa GM-CSF thay đổi codon Hình 1.Kết gióng cột trình tự GM-CSF người cơng bố Kết cho thấy, 1/20 trình tự có khác biệt amino acid thứ 21 (G thay A) 7/20 trình tự có khác biệt amino acid thứ 117 (T thay I) Chúng tơi chọn trình tự chiếm đa số để so sánh với trình tự cơng bố thuốc Leukine Kết trình bày hình 3.2 Hình Kết gióng cộtcác trình tự GM-CSF đại diện với trình tự GM-CSF thuốc Leukine Tiếp đó, trình tự nucleotide trình tự đại diện sử dụng làm nguồn thơng tin đầu vào để thực q trình tối ưu hoá codon nhằm gia tăng biểu protein có nguồn gốc từ người hai hệ thống nấm men Hình 3 Tần số xuất codon tương ứng với trình tự trước tối ưu sau tối ưu theo bảng mã ưu tiên sử dụng P pastoris S cerevisiae Kết cho thấy, sau q trình tối hố tần số codon (dưới 10%,) hoàn toàn thay codon phổ biến nấm men) Trình tự sau trình tối ưu gửi tổng hợp hố học cơng ty IDT kết kiểm chứng giải trình tự (kết khơng trình bày) 3.1.2 Phân lập dịng E coli mang gen hgmcsf biểu P pastoris S cerevisiae 3.1.2.1 Cấu trúc chủng E coli DH5α mang plasmid tái tổ hợp pPICZαA/hgmcsf a Thiết kế vector pPICZαA/hGM-CSF  Thu nhận gene hgmcsf Hình Thu nhận gene hgmcsf kỹ thuật PCR Giếng T: Thang DNA GenRuler™ kb Plus (Fermentas) Giếng 1: Sản phẩm PCR plasmid pGM-CSF với cặp mồi 5’hGM-XhoI/3’hGM-NotI  Cắt tạo đầu dính plasmid pPICZαA enzyme cắt hạn chế Hình Thu nhận pPICZαA Giếng T: Thang DNA O'GenRuler™ kb (Fermentas) Giếng 1: Plasmid pPICZαA sau cắt XhoI NotI b Biến nạp sản phẩm nối vào tế bào E coli DH5α khả nạp Hình Kết biến nạp sản phẩm nối vào tế bào E coli DH5α Đĩa 1: Vi khuẩn E coli DH5α Đĩa 2: Vi khuẩn E coli DH5α biến nạp sản phẩm nối c Sàng lọc, kiểm tra thu nhận chủng E coli DH5α mang plasmid tái tổ hợp pPICZαA/hGM-CSF  Sàng lọc thể biến nạp kỹ thuật PCR khuẩn lạc Hình 7.Sàng lọc thể biến nạp kỹ thuật PCR khuẩn lạc Giếng T: Thang DNA GenRuler™ kb Plus (Fermentas) Giếng 1: Sản phẩm PCR khuẩn lạc E coli DH5α cặp mồi 5’hGM-XhoI/3’hGM-NotI Giếng 2: Sản phẩm PCR plasmid pGM-CSF cặp mồi 5’hGM-XhoI/3’hGM-NotI Giếng 3,4,5,6: Sản phẩm PCR khuẩn lạc E coli DH5α mọc đĩa môi trường LB-zeocin25 cặp mồi 5’hGM-XhoI/3’hGM-NotI  Kiểm tra plasmid tái tổ hợp phản ứng PCR cắt với XhoI NotI Hình Kiểm tra plasmid pPICZαA tái tổ hợp kỹ thuật PCR cắt giới hạn Giếng T: Thang DNA GenRuler™ kb Plus (Fermentas) Giếng 1: Sản phẩm PCR plasmid pPICZαA với cặp mồi 5’hGM-XhoI/3’hGM-Not I Giếng 2: Sản phẩm PCR plasmid pPICZαA với cặp mồi 5’AOX1/3’AOX1 Giếng 3: Sản phẩm PCR plasmid pPICZαA tái tổ hợp với cặp mồi 5’hGM-XhoI/3’hGMNot I Giếng 4: Sản phẩm PCR plasmid pPICZαA tái tổ hợp với cặp mồi 5’AOX1/3’AOX1 Giếng 5: Plasmid pPICZαA cắt XhoI NotI Giếng 6: Plasmid pPICZαA tái tổ hợp cắt NotI Giếng 7: Plasmid pPICZαA tái tổ hợp cắt XhoI NotI d Giải trình tự plasmid pPICZαA tái tổ hợp Kết giải trình tự cho thấy gene hgmcsf dịng hóa đồng khung dịch mã tương đồng 100% so với trình tự cơng bố ngân hàng gene e Kết luận 3.2.3 Lên men thu nhận protein hGM-CSF quy mơ 3500 mL Hình 19 Kết điện di SDS-PAGE dịch lên men số thời điểm Giếng T: thang phân tử lượng protein Giếng 1-10: mẫu dịch lên men thời điểm: 1: 24 giờ; 2: 28 giờ; 3: 32 giờ; 4: 36 giờ; 5: 48 giờ; 6: 68 giờ; 7: 72 giờ; 8: 84 giờ; 9: 92 giờ; 10: 96 Từ số liệu ghi nhận trình lên men, tiến hành dựng đồ thị phân tích kết lên men hình 3.21 bao gồm: (1) đường cong khối lượng protein tiết, (2) đường cong tăng trưởng dựa vào giá trị OD600, (3) đường cong sinh khối khơ Hình 20 Q trình tăng sinh tiết protein chủng P pastoris X33::hgmcsf thí nghiệm lên men mẻ có bổ sung chất Q trình lên men dừng thời điểm 96 giờ, dịch lên men thu sau loại bỏ sinh khối có nồng độ protein tổng số 1208,27 mg/L 3.3 Nội dung 3: Phân lập dòng nấm men S cerevisiae tổng hợp tiết GM-CSF ngoại bào 3.3.1 Tạo dòng S cerevisiae BY4742 mang plasmid tái tổ hợp pYES2hgmcsf 3.3.1.1 Thu nhận plasmid pYES2-hgmcsf từ E coli DH5α/pYES2hgmcsf phƣơng pháp SDS-kiềm 13 Hình 21 Kết tách plasmid pYES2-hgmcsf từ E coli DH5α/pYES2-hgmcsf T: thang GeneRuler kb DNA ladder (Fermentas) 1: plasmid pYES2-hgmcsf tách từ E coli DH5α/pYES2-hgmcsf 3.3.1.2 Biến nạp plasmid tái tổ hợp pYES2-hgmcsf vào tế bào S cerevisiae BY4742 Hình 22 Sàng lọc thể biến nạp S cerevisiae BY4742/pYES2-hgmcsf môi trường khuyết dưỡng uracil Đĩa 1: tế bào S cerevisiae BY4742 biến nạp với plasmid pYES2-hgmcsf Đĩa 2: đối chứng âm, tế bào S cerevisiae BY4742 khả nạp 3.3.1.3 Kiểm tra thể biến nạp phƣơng pháp PCR khuẩn lạc Hình 23 Kết kiểm tra thể biến nạp BY4742/pYES2-hgmcsf phương pháp PCR khuẩn lạc với cặp mồi đặc hiệu hGM-F/hGM-R Giếng T: thang GeneRuler kb DNA ladder (Fermentas) Giếng 1: đối chứng dương - sản phẩm PCR plasmid tái tổ hợp pYES2-hgmcsf Giếng 2: đối chứng âm – sản phẩm PCR khuẩn lạc chủng BY4742 không biến nạp Giếng 3, 4, 5: sản phẩm PCR khuẩn lạc khuẩn lạc dự tuyển Như vậy, biến nạp thành công plasmid pYES2-hgmcsf vào tế bào S cerevisiae BY4742 14 3.3.2 Kiểm tra khả biểu protein hGM-CSF S cerevisiae BY4742/pYES2-hgmcsf 3.3.2.1 Kiểm tra khả biểu hGM-CSF S cerevisiae BY4742/ pYES2-hgmcsf dạng tiết mơi trƣờng YP Hình 24 Kiểm tra biểu hGM-CSF dạng tiết S cerevisiae BY4742/pYES2-hgmcsf Giếng T: thang phân tử lượng protein Giếng 1: đối chứng âm, chủng S cerevisiae BY4742 cảm ứng galactose thu thời điểm 72 Giếng 2, 3, 4: chủng S cerevisiae BY4742/pYES2-hgmcsf cảm ứng galactose thu thời điểm 24, 48, 72 3.3.2.2 Khẳng định sử biểu hGM-CSF kỹ thuật Western blot Hình 25 Kiểm tra diện protein hGM-CSF mơi trường biểu Hình A: kết điện di SDS-PAGE Hình B: kết lai Western blot với kháng thể đặc hiệu kháng hGM-CSF Giếng T: thang phân tử lượng protein Giếng 1: đối chứng âm, chủng S cerevisiae BY4742 cảm ứng galactose thu thời điểm 72 Giếng 2, 3, 4: chủng S cerevisiae BY4742/pYES2-hgmcsf cảm ứng galactose thu thời điểm 24, 48, 72 Như vậy, tạo dịng thành cơng chủng nấm men S cerevisiae BY4742/pYES2-hgmcsf có khả tiết protein hGM-CSF điều kiện ni cấy có chất cảm ứng 15 3.3.3 Lên men thu nhận protein hGM-CSF quy mô 3500 mL Hình 26 Kết điện di kiểm tra protein tiết chủng S cerevisiae BY4742/pYES2-hgmcsf thu nhận lên men Quá trình lên men dừng thời điểm 72 giờ, dịch lên men thu sau loại bỏ sinh khối có nồng độ protein tổng số 64,1 mg/L Hình 27 Quá trình tăng sinh tiết protein chủng BY4742/pYES2hgmcsf thí nghiệm lên men mẻ có bổ sung galactose 3.4 Nội dung 4: Nghiên cứu phƣơng pháp thu nhận GM-CSF đƣợc tổng hợp tiết ngoại bào nấm men P pastoris S cerevisiae 3.4.1 Thu nhận GM-CSF đƣợc tổng hợp tiết ngoại bào nấm men P pastoris 3.4.1.1 Cô đặc dịch lên men phƣơng pháp lọc tiếp tuyến Bảng 1.Tính tốn hiệu suất thu hồi protein từ dịch lên men sau lọc tiếp tuyến Dịch lên men Thể tích (mL) Nồng độ protein (mg/mL) Khối lƣợng protein tổng số (mg) Trƣớc lọc 1950 1,208 2356,13 Sau lọc 400 5,007 2002,90 Hiệu suất thu hồi (%) 85,01 3.4.1.2 Thu nhận protein tổng từ dịch lên men phƣơng pháp tủa amonium sulfate 16 Bảng Hiệu suất thu hồi protein từ dịch lên men tủa 75% ammonium sulfate bão hòa Khối lƣợng protein (mg) Trƣớc tủa 18,6 Sau tủa 16,4 Hiệu suất thu hồi (%) 88% 3.4.2 Thu nhận GM-CSF đƣợc tổng hợp tiết ngoại bào nấm men S cerevisiae Bảng 3 Tính tốn hiệu suất thu hồi protein từ dịch lên men sau lọc tiếp tuyến Dịch lên men Thể tích (mL) Nồng độ protein (mg/mL) Khối lƣợng protein tổng số (mg) Trƣớc lọc 300 64,10.10-3 19,23 Sau lọc 100 175,34.10 Hiệu suất thu hồi (%) -3 17,53 91,17 Nội dung 5: Bƣớc đầu tinh hGM-CSF qui mơ phịng thí nghiệm 3.5.1 Tinh hGM-CSF từ sản phẩm lên men chủng P pastoris X33::hgmcsf 3.5.1.1 Tinh thu nhận hGM-CSF sắc ký kỵ nƣớc Hình 28.Kết tinh hGM-CSF sắc ký kỵ nước Giếng LMW: thang phân tử lượng protein Giếng S: mẫu trước tinh Giếng F: mẫu không bám cột Giếng E: phân đoạn protein dung ly 100% PBS Như vậy, thu hGM-CSF (14,8 kDa, 20 kDa 29-32 kDa) phân đoạn dung ly 100% PBS 3.5.1.2 Tinh thu nhận hGM-CSF sắc ký trao đổi anion 17 Hình 29.Kết tinh hGM-CSF sắc ký trao đổi anion Giếng T: thang phân tử lượng protein Giếng 1: dịch lên men lọc amicon; 2: dịch qua cột nạp mẫu; 3: dịch rửa cột tái cân bằng; giếng 4-9: phân đoạn protein thu dung ly 5%, 10%, 20%, 40%, 60%, 100% dung dịch B 3.5.2 Tinh hGM-CSF từ sản phẩm lên men chủng S cerevisiae BY4742/hgmcsf 3.5.2.1 Tinh thu nhận hGM-CSF sắc ký kỵ nƣớc Hình 30 Kết điện di SDS-PAGE phân đoạn protein thu nhận từ sắc ký kỵ nước Giếng T: thang phân tử lượng protein Giếng 1: mẫu trước tinh sạch; 2: mẫu không bám cột (F); 3: mẫu không bám cột (W) Giếng 4-7: phân đoạn protein dung ly 20% PBS Giếng 8, 9: phân đoạn protein dung ly 50% PBS Giếng 10-13: phân đoạn protein dung ly 80% PBS Giếng 14-16: phân đoạn protein dung ly 100% PBS 3.5.2.2 Tinh thu nhận hGM-CSF sắc ký trao đổi anion Hình 31 Kết tinh hGM-CSF sắc ký trao đổi anion với cột HiTrap Q HP mL 18 Giếng T: thang phân tử lượng protein Giếng 1: dịch lên men lọc amicon; 2: dịch qua cột nạp mẫu; 3: dịch rửa cột tái cân bằng; giếng 4-9: phân đoạn protein thu dung ly 5%, 10%, 20%, 40%, 60%, 100% dung dịch B 3.6 Nội dung 6: Đánh giá chất lƣợng hGM-CSF sau tinh 3.6.1 Đánh giá mức độ tinh khiết hGM-CSF sau tinh 3.6.1.1 Sản phẩm P.pastorisX33::hgmcsf tinh từ dịch lên men chủng a Tinh thu nhận hGM-CSF sắc ký kỵ nước  Tính tốn độ tinh phân đoạn thu nhận Dựa tính tốn phần mềm Quantity One, protein hGM-CSF qua tinh kỵ nước có độ tinh 85,2%  Tính tốn hiệu suất tinh Bảng Hiệu suất tinh hGM-CSF sắc ký kỵ nước Mẫu Thể tích (mL) Nồng độ protein (mg/mL) Tổng protein (mg) Độ tinh (%) Hàm lƣợng hGM-CSF Trƣớc tinh 20 0,410 8,200 68,8 5,64 Phân đoạn chứa hGM-CSF 36 0,099 3,564 85,2 3,036 Hiệu suất tinh 53,8 Như vậy, từ khối lượng hGM-CSF dịch lên men trước tinh 5,64 mg, qua trình tinh thu hồi 53,8%, tương đương 3,036 mg hGM-CSF với độ tinh cao (85,2%) b Tinh thu nhận hGM-CSF sắc ký trao đổi anion   Tính tốn độ tinh phân đoạn Tính tốn hiệu suất tinh Bảng Hiệu suất tinh hGM-CSF sắc ký trao đổi anion Mẫu Thể tích (mL) Nồng độ protein (mg/mL) Tổng protein (mg) Độ tinh (%) Hàm lƣợng hGM-CSF (mg) Trƣớc tinh 49 0,084 4,12 68,17 2,81 Phân đoạn 14 0,123 1,722 92,68 1,60 56,9 Phân đoạn 15 0,071 1,065 95,23 1,01 35,9 19 Hiệu suất tinh (%) Tổng hiệu suất (%) 92,8 Như vậy, từ khối lượng hGM-CSF dịch lên men trước tinh 2,81 mg, qua trình tinh thu hồi 92,8%, tương đương 2,61 mg hGM-CSF với độ tinh cao (trên 90%) 3.6.1.2 Sản phẩm tinh từ dịch lên men chủng S cerevisiae BY4742/hgmcsf a Tinh thu nhận hGM-CSF sắc ký kỵ nước  Tính tốn độ tinh phân đoạn Từ phân đoạn hình 3.31, chọn đại diện phân đoạn dung ly 80% PBS (giếng 11) 100% PBS (giếng 15) để tính độ tinh phần mềm ImageJ v1.48 Kết sau:(1) Phân đoạn dung ly 80% PBS (giếng 11): 39,03% (phân đoạn 1) (2) Phân đoạn dung ly 100% PBS (giếng 15): 42,89% (phân đoạn 2)  Tính tốn hiệu suất tinh Bảng Hiệu suất tinh hGM-CSF sắc ký kỵ nước Mẫu Thể tích (mL) Nồng độ protein (mg/mL) Tổng protein (mg) Độ tinh (%) Hàm lƣợng hGM-CSF (mg) Trƣớc tinh 30 0,267 8,01 38,37 3,07 Phân đoạn 1,2 0,074 0,09 39,03 0,034 1,12 Phân đoạn 1,2 0,030 0,036 42,89 0,015 0,50 Hiệu suất tinh (%) Tổng hiệu suất (%) 1,62 Như vậy, từ khối lượng hGM-CSF dịch lên men trước tinh 3,07 mg, qua trình tinh thu hồi 1,62%, tương đương 0,049 mg hGM-CSF với độ tinh thấp b Tinh thu nhận hGM-CSF sắc ký trao đổi anion   Tính tốn độ tinh phân đoạn Tính tốn hiệu suất tinh Bảng Hiệu suất tinh hGM-CSF sắc ký trao đổi anion Mẫu Thể tích (mL) Nồng độ protein (mg/mL) Tổng protein (mg) 20 Độ tinh (%) Hàm lƣợng hGM-CSF (mg) Hiệu suất tinh (%) Trƣớc tinh 49 0,018 0,88 71,14 0,63 Phân đoạn 1,5 0,007 0,011 96,62 0,01 1,6 Phân đoạn 0,046 0,138 95,72 0,132 21 Phân đoạn 4,5 0,067 0,302 64,22 0,194 30,8 Tổng hiệu suất (%) 53,4 Như vậy, từ khối lượng hGM-CSF dịch lên men trước tinh 0,63 mg, qua trình tinh thu hồi 53,4%, tương đương 0,336 mg hGM-CSF với độ tinh cao Qua thấy hGM-CSF sản xuất từ hệ thống biểu S cerevisiae, việc tinh sắc ký trao đổi anion hiệu so với sắc ký kỵ nước 3.6.2 Đánh giá hoạt tính hGM-CSF sau tinh Hoạt tính sinh học GM-CSF thu sau tinh đánh giá thông qua thử nghiệm sinh học in vitro dòng tế bào TF-1 3.6.2.1 Hình thái mật độ tế bào dƣới tác động GM-CSF Hình 32 Tác động kích thích tăng sinh dòng tế bào TF-1 GM-CSF A: Mẫu chứng âm không bổ sung GM-CSF B: Mẫu GM-CSF chuẩn C: Mẫu GM-CSF sau tinh 3.6.2.2 Mối tƣơng quan nồng độ GM-CSF tăng sinh tế bào 21 Hình 33 Mối tương quan khả tăng trưởng tế bào nồng độ GM-CSF A: Mẫu GM-CSF tinh từ P pastoris B: Mẫu GM-CSF tinh từ S cerevisiae Hình 34.So sánh khả kích thích tăng trưởng tế bào TF-1 GM-CSF chưa tinh tinh từ P pastoris S cerevisiae Bảng Kết xác định hoạt tính mẫu GM-CSF ED50 (pg/ml) LU (units/mg) Khoảng đáp ứng (đơn vị OD) R2 GM-CSF từ P pastoris (EXC) 84,46 11,8 x 106 0,26 0,991 GM-CSF từ P pastoris (HIC) 198,7 5,0 x 106 0,32 0,995 GM-CSF từ P pastoris (crude) 1876 0,53 x 106 0,06 0,984 GM-CSF từ S cerevisiae (EXC) 27880 0,36 x 105 0,49 0,998 GM-CSF từ S cerevisiae (crude) 37238 0,27 x 105 0,05 0,990 Ngồi ra, so sánh hoạt tính hGM-CSF sản xuất từ P pastoris với thuốc Leukine công bố (5,6 x 106) cho thấy sản phẩm từ đề tài có hoạt tính gần tương đương (5,0 x 106) cao lần (11,8 x 106) tuỳ theo phương 22 pháp tinh chế Điều có ý nghĩa việc giảm giá thành sản phẩm giảm thể tích cần tiêm cho bệnh nhân 450 Hình 35 So sánh khả kích thích tăng trưởng tế bào TF-1 GMCSF tinh từ P pastoris từ mẫu thương mại từ E coli Khi so sánh hoạt tính mẫu GM-CSF tinh (chọn mẫu từ P pastoris làm đại diện) với mẫu GM-CSF từ hệ thống biểu khơng tạo đường hố (mẫu thương mại sản xuất từ E coli, R&D Biosciences) (hình 3.36 bảng 3.9) cho thấy đáp ứng tế bào mẫu tinh chậm thấp so với mẫu từ E coli khoảng 10 lần Nguyên nhân dẫn đến kết này: mẫu chuẩn sử dụng mẫu GM-CSF tái tổ hợp sản xuất E coli, đề cập, thử nghiệm hoạt tính in vitro, GMCSF có gắn gốc đường có hoạt tính yếu so với dạng khơng glycosyl hóa in vitro.Tuy nhiên, việc đường hố cần thiết cho tính bền in vivo hGM-CSF Bảng Bảng kết xác định hoạt tính mẫu GM-CSF ED50 (pg/ml) LU (units/mg) R2 Mẫu GM-CSF sau tinh 198,7 5,0 x 106 0,995 Mẫu GM-CSF từ E coli 35.9 2.7 x 107 0,9865 Như vậy, sau trình tinh sắc ký trao đổi anion, GM-CSF thu nhận từ P pastoriscó hoạt tính in vitro dịng tế bào TF-1 cao 3.7 So sánh hiệu biểu hGM-CSF từ P pastoris S cerevisiae Khi so sánh hiệu biểu hGM-CSF từ P pastoris S cerevisae (bảng 3.10) cho thấy P pastoris tăng trưởng tốt so với S cerevisae khoảng thời gian nuôi cấy thể qua giá trị OD (135 so với 32) hiệu 23 tiết/đơn vị OD (31,15 so với 7,0) Ngồi ra, sau q trình tinh mẫu thu từ P pastoris có hoạt tính sinh học cao gấp 327 lần so với mẫu thu từ S cerevisae với phương pháp độ tinh Như thấy, việc biểu protein tái tổ hợp có nguồn gốc từ người trường hợp cụ thể hGM-CSF P pastoris hiệu kinh tế nhiều so với S cerevisae Bảng 10 So sánh hiệu biểu P pastoris S cerevisiae OD sau 72h lên men Lƣợng protein tiết/OD (g) Hoạt tính/mg protein P pastoris S cerevisiae 135 32 31,15 11,8 x 10 24 7,0 0,036 x 106 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 4.1 Kết luận Nội dung 1: Phân lập dịng gen mã hóa GM-CSF ngƣời Từ thơng tin tham khảo ngân hàng gen hiểu biết q trình tối ưu hố codon chủng vi sinh vật, đề tài thiết kế in silico gen mã hoá cho GM-CSF người dựa phiên thuốc Leukine Gen sử dụng làm khuôn để chuyển vào hai vector có khả biểu hai chủng nấm men P pastoris S cerevisiae Vector tái tổ hợp kiểm chứng PCR khuẩn lạc, cắt RE giải trình tự (phụ lục 1) Nội dung 2: Phân lập dòng nấm men P pastoris tổng hợp tiết GMCSF ngoại bào Chủng nấm men tái tổ hợp P pastoris mang gen mã hoá cho GM-CSF kiểm chứng khả biểu thông qua SDS-PAGE lai với kháng thể đặc hiệu Nội dung 3: Phân lập dòng nấm men S cerevisiae tổng hợp tiết GMCSF ngoại bào Chủng nấm men tái tổ hợp S cerevisiae mang gen mã hoá cho GM-CSF kiểm chứng khả biểu thông qua SDS-PAGE lai với kháng thể đặc hiệu Nội dung 4: Nghiên cứu phƣơng pháp thu nhận GM-CSF đƣợc tổng hợp tiết ngoại bào nấm men P pastoris S cerevisiae Dịch lên men từ hai chủng tái tổ hợp P pastoris S cerevisiae thu nhận cô đặc Phương pháp lọc tiếp tuyến cho hiệu cô đặc tốt Nội dung 5: Bƣớc đầu tinh chế GM-CSF qui mơ phịng thí nghiệm Thực hai phương pháp sắc ký trao đổi ion kỵ nước để tinh GM-CSF từ dịch cô đặc phương pháp sắc ký trao đổi anion cho độ tinh cao hiệu suất thu hồi cao so với sắc kí kỵ nước hai mẫu dịch lên men cô đặc từ P pastoris S cerevisiae Nội dung 6: Đánh giá chất lƣợng GM-CSF Mẫu GM-CSF tinh từ P pastoris S cerevisiae có khả kích thích tăng sinh tế bào sống phụ thuộc GM-CSF TF-1 mẫu tinh từ P pastoris cho hoạt tính cao mẫu từ S cerevisiae 4.2 Đề nghị Với kết đạt từ đề tài, nhóm nghiên cứu có kiến nghị sau: (1) Với việc sử dụng gen có nguồn gốc từ người cần thực trình tối 25 ưu hoá codon sử dụng hệ thống biểu tương ứng để tránh sản phẩm tái tổ hợp không biểu hay biểu (2) Sử dụng chủng P pastoris làm chủng chủ biểu cho GM-CSF nói riêng protein cần đường hố nói chung thay cho S cerevisiae tốc độ tăng trưởng cao, hiệu suất biểu cao, mức độ glycosyl hoá vừa phải (3) Để tăng tối đa mức độ đồng đường hố nên sử dụng chủng P pastoris đột biến có mang gen mã hố cho q trình đường hố từ người (ví dụ P pastoris SuperMan5) Ngồi ra, xuất phát từ tình hình thực tế thuốc Leukine hết hạn quyền vào tháng 12/2017, giá thành thuốc ngoại nhập cao (lên tới 4,3 triệu đồng/liều tiêm cần tiêm nhiều liều), tạo thêm lựa chọn sản phẩm điều trị cho bệnh nhân với kết nghiên cứu bước đầu nhóm cho thấy nhóm nắm làm chủ cơng nghệ để biểu hGM-CSF (thành phần hoạt tính thuốc Leukine) với lượng lớn, độ tinh cao có hoạt tính cao gấp lần so với thuốc Leukine nên khả phát triển tiếp tục thành thuốc hồn tồn khả thi Vì vậy, nhóm mạnh dạn đề xuất với Sở Khoa học Công nghệ TPHCM tiếp tục đầu tư giai đoạn để nhóm hồn thiện quy trình nhằm hướng tới việc sản xuất thuốc phục vụ cho nhu cầu hỗ trợ điều trị cho bệnh nhân ung thư Việt Nam 26 CÁC CƠNG TRÌNH NGHIÊN CỨU LIÊN QUAN Tạo dòng, biểu thu nhận protein hGM-CSF tái tổ hợp từ Saccharomyces cerevisiae (2015) Luận văn Thạc sỹ Tạo dòng biểu protein hGM-CSF (Human GranulocyteMacrophage Colony-Stimulating Factor) tái tổ hợp dạng tiết hệ thống nấm men Saccharomyces cerevisiae (2013) Khoá luận cử nhân Phạm Thị Kim Liên, Đặng Tất Trường, Trần Văn Hiếu Tạo dòng biểu nhân tố kích thích tạo dịng bạch cầu hạt – đại thực bào hGM-CSF (human granulocyte macrophcolony stimulating factor) tái tổ hợp hệ thống Pichia pastoris Tạp chí Phát triển KH&CN 18(3): 22-29, 2013 Kim-Lien Pham, Tat-Truong Dang, Hieu Tran-Van, Linh-Thuoc Tran Cloning, expression and purification of recombinant biologically active human Granulocyte-Macrophage Stimulating factorr (hGM-CSF) in Pichia pastoris Gene and Immunotherapy Conference in Vietnam, 144-145 (2013) Trần Anh Minh, Nguyễn Thanh Thảo, Stephanie P Cartwright, Roslyn M Bill, Trần Văn Hiếu.Tạo dòng, biểu thu nhận protein hGM-CSF tái tổ hợp từ Saccharomyces cerevisiae Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 13(2A): 643-649, 2015 27 ... lƣợng hGM -CSF sau tinh 3.6.1 Đánh giá mức độ tinh khiết hGM -CSF sau tinh 3.6.1.1 Sản phẩm P.pastorisX33::hgmcsf tinh từ dịch lên men chủng a Tinh thu nhận hGM -CSF sắc ký kỵ nước  Tính tốn độ tinh. .. Bƣớc đầu tinh GM- CSF qui mô phịng thí nghiệm 2.5.1 Tinh hGM -CSF từ sản phẩm lên men chủng P pastoris X33::hgmcsf 2.5.2 Tinh hGM -CSF từ sản phẩm lên men chủng S cerevisiae BY4742/hgmcsf 2.6 Nội... dòng, biểu thu nhận protein hGM -CSF tái tổ hợp từ Saccharomyces cerevisiae (2015) Luận văn Thạc sỹ Tạo dòng biểu protein hGM -CSF (Human GranulocyteMacrophage Colony- Stimulating Factor) tái tổ hợp