Nghiên cứu thu nhận glutathione từ sinh khối nấm men và ứng dụng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI ĐÀM THỊ MINH PHƯƠNG NGHIÊN CỨU THU NHẬN GLUTATHIONE TỪ SINH KHỐI NẤM MEN VÀ ỨNG DỤNG Chuyên ngành : Công nghệ sinh học LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN : GS TS NGUYỄN THỊ HIỀN HÀ NỘI - 2010 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu mà thân trực tiếp thực Các số liệu kết trình bày luận văn trung thực, khách quan chưa công bố công trình khác Hà Nội, ngày 21 tháng 10 năm 2010 Tác giả luận văn Đàm Thị Minh Phương LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn nhận nhiều giúp đỡ, đóng góp ý kiến thầy cô, bạn bè đồng nghiệp Nhân xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới GS TS Nguyễn Thị Hiền – Giảng viên Bộ môn Công nghệ lên men, người có nhiều công sức tận tình hướng dẫn, bảo giúp đỡ suốt trình thực hoàn thành luận văn Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành tới Ban giám hiệu Trường Đại học Bách khoa Hà Nội, thầy cô công tác làm việc Viện Công nghệ sinh học Công nghệ thực phẩm, tập thể cán Viện Đào tạo Sau đại học Trường Đại học Bách khoa Hà Nội, đồng nghiệp Trung tâm Công nghệ sinh học Công nghệ thực phẩm Hà Nội, Viện Công nghiệp thực phẩm giúp đỡ tạo điều kiện cho suốt thời gian học tập hoàn thành luận văn Cuối cùng, xin cảm ơn gia đình, bạn bè cổ vũ, động viên giúp đỡ thời gian học tập hoàn thành luận văn Xin chân thành cảm ơn giúp đỡ! Hà Nội, ngày 21 tháng 10 năm 2010 Tác giả luận văn Đàm Thị Minh Phương MỤC LỤC TRANG PHỤ BÌA LỜI CAM ĐOAN LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU DANH MỤC CÁC HÌNH VÀ BIỂU ĐỒ MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1.Glutathione 1.1.1 Cấu trúc glutathione 1.1.2 Chức glutathione 1.1.2.1 Glutathione chất chống oxy hoá bảo vệ tế bào 1.1.2.2 Glutathione chất hỗ trợ cho hệ thống miễn dịch 1.1.2.3 Glutathione chất có tác dụng khử độc tế bào 1.2 Công nghệ sản xuất glutathione 10 1.2.1 Sản xuất glutathione phương pháp tổng hợp hoá học 10 1.2.2 Sản xuất glutathione phương pháp enzim 12 1.2.3 Sản xuất glutathione phương pháp lên men vi sinh vật 15 1.2.3.1 Vi sinh vật tổng hợp glutathione 15 1.2.3.2 Tổng hợp glutathione vi sinh vật tái tổ hợp 17 1.2.4 Tối ưu hóa trình lên men tổng hợp glutathione 19 1.3 Saccharomyces cerevisiae tổng hợp glutathione 22 1.3.1 Nấm men Saccharomyces cerevisiae 22 1.3.2 Sinh tổng hợp GSH từ nấm men Saccharomyces 24 1.4 Ứng dụng glutathione 30 CHƯƠNG NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33 2.1 Nguyên vật liệu 33 2.1.1.Vi sinh vật môi trường 33 2.1.2 Rau má tươi 34 2.2 Thiết bị 34 2.3 Phương pháp nghiên cứu 35 2.3.1 Phương pháp phân tích hóa lý 35 2.3.1.1 Phân tích hàm lượng glutathione sinh khối tế bào nấm men 35 2.3.1.2 Phân tích hàm lượng đường 35 2.3.1.3 Phân tích protein 36 2.3.2 Phương pháp công nghệ 36 2.3.2.1 Phương pháp lên men phòng thí nghiệm 36 2.3.2.2 Phương pháp thu nhận sinh khối nấm men chứa GSH 36 2.3.2.3 Phương pháp tạo bột sinh khối nấm men chứa GSH 37 2.3.2.4 Phương pháp thu hồi GSH từ sinh khối nấm men 37 2.3.3 Phương pháp cảm quan 38 2.3.4 Phương pháp qui hoạch thực nghiệm 38 2.2.5 Ứng dụng tạo bột rau má tan chứa glutathione 38 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 39 3.1 Nghiên cứu lựa chọn chủng giống 39 3.1.1 Nghiên cứu lựa chọn chủng nấm men có khả sinh tổng hợp GSH 39 3.1.2 Nghiên cứu ảnh hưởng việc bổ sung axit amin đến hiệu suất tổng hợp GSH chủng nấm men lựa chọn 40 3.2 Nghiên cứu lựa chọn thành phần môi trường nuôi cấy thích hợp cho trình sinh tổng hợp GSH chủng Saccharomyces sp TBS 43 3.2.1 Ảnh hưởng nguồn dinh dưỡng cacbon đến khả sinh tổng hợp GSH 43 3.2.2 Ảnh hưởng nguồn nitơ đến khả sinh tổng hợp GSH 46 3.2.3 Ảnh hưởng muối khoáng nguyên tố vi lượng đến khả sinh tổng hợp GSH 49 3.2.4 Ảnh hưởng số axit amin vitamin đến khả sinh tổng hợp GSH 52 3.3 Nghiên cứu lựa chọn tối ưu hóa điều kiện công nghệ nuôi cấy thích hợp cho trình sinh tổng hợp glutathione phương pháp lên men chìm 54 3.3.1 Tối ưu hóa điều kiện nhiệt độ, pH, thời gian nuôi cấy tỷ lệ nhân giống 54 3.3.2 Nghiên cứu ảnh hưởng chế độ thông khí đến khả tổng hợp GSH 59 3.3.3 Ảnh hưởng thời điểm bổ sung L-cysteine đến khả sinh tổng hợp GSH 60 3.3.4 Ảnh hưởng phương thức lên men đến khả sinh tổng hợp GSH 61 3.4 Nghiên cứu xác định phương pháp thu hồi glutathione từ sinh khối nấm men 65 3.4.1 Nghiên cứu lựa chọn phương pháp thu hồi sinh khối nấm men 65 3.4.2 Phương pháp tạo bột sinh khối nấm men giàu GSH 66 3.4.2.1 Lựa chọn phương pháp tạo bột sinh khối nấm men giàu GSH 66 3.4.2.2 Xác định chế độ sấy phun thích hợp 67 3.4.2.3 Nghiên cứu phương pháp bảo quản, bảo tồn hoạt tính sinh học bột sinh khối nấm men giàu GSH 70 3.4.3 Nghiên cứu lựa chọn phương pháp tách chiết GSH từ sinh khối tế bào nấm men 72 3.4.2.1 Phương pháp tách chiết có phá vỡ tế bào 73 3.4.2.2 Phương pháp tách chiết GSH không phá vỡ tế bào nấm men 75 3.5 Nghiên cứu tạo bột rau má tan có chứa GSH 76 3.5.1 Nghiên cứu tỷ lệ phối trộn tạo sản phẩm bột rau má tan chứa GSH 78 3.5.2 Ảnh hưởng loại bao bì đến chất lượng sản phẩm thời gian bảo quản 78 3.5.3 Nghiên cứu ảnh hưởng nhiệt độ thời gian bảo quản đến hàm lượng glutathione bột rau má tan 79 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 81 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT GSH Glutathione GSSG Glutathione disulfide ROS Reactive oxygen species: Các phân tử oxy hoạt động SOD Enzym superoxidedismutaza ELF Ephithelial lung fluid: Dịch màng phổi DCOP Chronic obstructive pulmonary disease: Bệnh phổi tắc nghẽn mãn tính SARD Acute respiratory distress syndrome: Hội chứng suy hô hấp cấp GSHI γ - glutatmylcysteine synthetaza GSHII Enzym glutathione synthetaza γ - GTP γ - glutamyl transpeptidaza NTG N-methyl-N’-nitro-N-nitrosoguanidine MG methylglyoxal EMS Ethylmethane sulfonate POL Lipid peroxidation: Sự peroxit hóa lipit aa Axit amin DTNB 2, 2’ dinitro – 5, 5’ dithiobenzoic axit DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU Bảng 1.1 Thống kê giai đoạn phát triển sản xuất glutathione 11 Bảng 1.2 Thống kê nghiên cứu sử dụng phương pháp enzim để sản xuất GSH vi sinh vật 14 Bảng 1.3 Thống kê nghiên cứu, sản xuất glutathione phương pháp lên men sử dụng vi sinh vật tự nhiên 17 Bảng 1.4 Thống kê nghiên cứu ứng dụng vi sinh vật tái tổ hợp sản xuất glutathione .19 Bảng 2.1 Các chủng nấm men có khả sinh tổng hợp GSH .33 Bảng 2.2 Thành phần môi trường nuôi cấy 34 Bảng 3.1 Nghiên cứu lựa chọn chủng nấm men có khả tổng hợp GSH 40 Bảng 3.2 Ảnh hưởng bổ sung axit amin đến hiệu suất tổng hợp sinh khối GSH chủng nấm men .41 Bảng 3.3 Ảnh hưởng nguồn dinh dưỡng cacbon đến phát triển tổng hợp glutathione chủng nấm men 44 Bảng 3.4 Ảnh hưởng nồng độ glucoza đến hiệu suất tổng hợp sinh khối tế bào glutathione chủng nấm men Saccharomyces sp TBS 45 Bảng 3.5 Ảnh hưởng nguồn nitơ đến phát triển tổng hợp glutathione chủng nấm men Saccharomyces sp TBS 46 Bảng 3.6 Kết lựa chọn hàm lượng nguồn nitơ thích hợp cho chủng nấm men Saccharomyces sp TBS tổng hợp sinh khối GSH 48 Bảng 3.7 Ảnh hưởng muối khoáng nguyên tố vi lượng đến phát triển tổng hợp glutathione chủng nấm men Saccharomyces sp TBS 50 Bảng 3.8 Lựa chọn nồng độ KH2PO4 ZnSO4 thích hợp cho chủng nấm men Saccharomyces sp TBS phát triển tổng hợp glutathione 51 Bảng 3.9 Ảnh hưởng bổ sung số axit amin vitamin đến phát triển tổng hợp glutathione chủng nấm men Saccharomyces sp TBS 53 Bảng 3.10 Mức thí nghiệm yếu tố .54 Bảng 3.11 Ma trận thực nghiệm kết thực nghiệm theo ma trận 55 Bảng 3.12 Bảng kết phân tích hồi qui tuyến tính 56 Bảng 3.13 Kết thực nghiệm điểm lựa chọn tối ưu 58 Bảng 3.14 Ảnh hưởng chế độ thông khí đến phát triển tổng hợp GSH chủng nấm men Saccharomyces sp TBS 59 Bảng 3.15 Ảnh hưởng lưu lượng khí cấp tới phát triển tổng hợp GSH chủng nấm men Saccharomyces sp TBS 60 Bảng 3.16 Ảnh hưởng thời điểm bổ sung axit amin L-cysteine đến hiệu suất tổng hợp sinh khối GSH chủng nấm men Saccharomyces sp TBS 61 Bảng 3.17 Động học lên men tổng hợp sinh khối tế bào GSH chủng nấm men Saccharomyces sp TBS nuôi cấy theo mẻ theo mẻ có tiếp thêm môi trường 62 Bảng 3.18 Nghiên cứu lựa chọn phương pháp thu hồi sinh khối nấm men Saccharomyces sp TBS chứa GSH nội bào .66 Bảng 3.19 Ảnh hưởng chế độ sấy phun đến hiệu suất thu hồi GSH 68 Bảng 3.20 Ảnh hưởng loại bao bì khác tới độ ẩm hàm lượng GSH sản phẩm bột sinh khối nấm men chứa glutathione sau trình bảo quản tháng 70 Bảng 3.21 Ảnh hưởng axít ascorbic đến chất lượng cảm quan hàm lượng glutathione bột sinh khối nấm men sấy phun 71 Bảng 3.22 Ảnh hưởng nhiệt độ thời gian bảo quản đến hàm lượng glutathione bột sinh khối nấm men Saccharomyces sp TBS 72 Bảng 3.23 Kết nghiên cứu ảnh hưởng tỷ lệ bi sinh khối nấm men 74 Bảng 3.24 Kết nghiên cứu ảnh hưởng thời gian phá tế bào .74 Bảng 3.25 Kết tỷ lệ phối trộn tạo sản phẩm rau má tan chứa glutathione 78 Bảng 3.26 Ảnh hưởng nhiệt độ thời gian bảo quản đến hàm lượng glutathione bột sinh khối nấm men Saccharomyces sp TBS 80 DANH MỤC CÁC HÌNH VÀ BIỂU ĐỒ Hình 1.1 Công thức cấu tạo glutathione Hình 1.2 Cấu trúc GSH (bên trái) GSSG (bên phải) Hình 1.3 Một vài khả cho electron GSH Hình 1.4 Con đường sinh tổng hợp vai trò sinh lý GSH tế bào vi sinh vật 12 Hình 1.5 Một số sản phẩm GSH thương mại 16 Hình 1.6 Cấu tạo tế bào nấm men 23 Hình 1.7 Chu trình γ-glutamyl 24 Hình 1.8 Sự vận chuyển trao đổi sulfua S cerevisiae .27 Hình 1.9 Mô hình tổng hợp GSH, vận chuyển trao đổi chất GS-X nấm men S cerevisiae .28 Hình 1.10 Sự trao đổi chất methanol nấm men ưa methyl .29 Hình 3.1 Chủng nấm men Saccharomyces sp TBS 43 Hình 3.2 Kết bề mặt đáp ứng với hai yếu tố thời gian nuôi cấy tỷ lệ giống cố định 57 Hình 3.3 Kết bề mặt đáp ứng với hai yếu tố pH tỷ lệ giống cấp cố định 58 Hình 3.4 Động học trình lên men tổng hợp sinh khối tế bào chủng nấm men Saccharomyces sp TBS nuôi cấy theo mẻ theo mẻ có tiếp thêm môi trường 63 Hình 3.5 Quy trình công nghệ tạo bột sinh khối nấm men giàu GSH .69 Hình 3.6 Quy trình tạo bột rau má tan chứa GSH 77 Biểu đồ 3.1 Ảnh hưởng phương pháp sấy đến hiệu suất thu hồi sinh khối nấm men chứa GSH 67 Biểu đồ 3.2 Ảnh hưởng phương pháp tách chiết đến hiệu suất thu hồi GSH 73 Biểu đồ 3.3 Ảnh hưởng nồng độ cồn đến hiệu suất tách chiết GSH 75 Biểu đồ 3.4 Ảnh hưởng loại bao bì khác tới độ ẩm hàm lượng GSH sản phẩm bột rau má tan sau trình bảo quản tháng 79 vị thơm đặc trưng rau má bảo quản bao bì PA-nhôm-PE, tháng sau bảo quản nhiệt độ phòng hàm lượng GSH giảm 1% KIẾN NGHỊ - Tiếp tục nghiên cứu tạo chủng đột biến có khả sinh tổng hợp GSH cao độ an toàn sinh học - Tiếp tục nghiên cứu tạo sản phẩm GSH tinh khiết - Ứng dụng tạo nhiều sản phẩm thực phẩm chức ăn uống giàu GSH 82 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Bùi Chí Hiếu (1981), “150 thuốc Nam”, NXB y học Hồ Chí Minh Bùi Minh Giang (2006), “Nghiên cứu Saponin triterpenoid có hoạt tính sinh học số thuốc Việt Nam”, Đại học Bách khoa Hà Nội Lương Đức Phẩm (1997), “Công nghệ vi sinh vật”, NXB Nông nghiệp Lương Đức Phẩm (2006), “Nấm men công nghiệp”, NXB Khoa học Kỹ Thuật Nguyễn Phương cộng (2007), “Nghiên cứu ứng dụng công nghệ sấy phun để thiết kế chế tạo thiết bị sản xuất bột đậu tương uống liền bột nấm men giàu protein khoáng chất”, Trung tâm Công nghệ sinh học Công nghệ thực phẩm Hà Nội Hà Duyên Tư (2006), “Kỹ thuật phân tích cảm quan thực phẩm”, NXB Khoa học Kỹ thuật Tài liệu tiếng Anh Ajinomoto co (1982b), “Production of glutathione”, JP patent No 57,005,699 Alfafara C G., Miura K., Shimizu H., Shioya S., Suga K (1992b), “Fuzzy control of ethanol concentration and its application to maximum glutathione production in yeast fed-batch culture”, Biotechnol Bioeng., 41, pp 493-501 Alfafara C.G., Kanda A., Shioi T., Shimizu H., Shioya S., Suga K (1992a) “Effect of amino acids on glutathione production by Saccharomyces cerevisiae”, Appl Microbial Biotechnol , 36, pp 538-540 10 Alfafara C.G., Miura K., Shimizu H., Shioya S., Suga K (1992b), “Cysteine addition strategy for maximum glutathione production in fed-batch culture by Saccharomyces cerevisiae”, Appl Microbial Biotechnol , 37, pp 141-146 11 Altomare E., Vendemiale G., Alano O (1998) “Hepatic glutathione content in patents with alcoholic and non alcoholic liver diseases”, Life Sci, 43, pp 991-998 83 12 Anderson M.E (1997), “Glutathione and glutathione delivery compounds”, Adv Pharmacol., 38, pp 65-78 13 Benedetti A., Berardi E.G.K., Manzoni M., Nichele M., Pagani H., Rollini M (2005), “Process for producing glutathione”, US Patent No 6,902,912 B2 14 Block K (1949), “The synthesis of glutathione in isolated liver”, J Biol Chem, 179, pp 1245-1254 15 Bursell S E., King G L (2000) “The potential use of glutathionyl hemoglobin as a clinical marker of oxidative stress”, Clin Chem, 46, pp 145-146 16 Carmel – Harel O , Storz G (2000) “Roles of glutathione and thioredoxindependent reduction systems in the Escherichia coli and Saccharomyces cerevisiae responses to oxidative stress”, Annu Rev Microbiol, 54, pp 439-461 17 Cha J Y., Park, Jeon B.S., Lee Y.C., Cho Y.S (2004), “Optimal fermentation conditions for enhanced glutathione production by Saccharomyces cerevisiae FF-8”, Journal of Microbiology, 42(1), pp.51-55 18 Chai Y.C., Ashraf S.S., Rokutan K., Johnson Jr R.B., Thomas J.A (1994), “S-thiolation of individual human neutrophil proteins including actin by stimaulation of the respiratory bust: evidence against a role for glutathione disulfide”, Arch Biochem Biophys, 310, pp 273-281 19 David B Fankhauser (2004), “Protein assay by microbiuret: standardization”, University of Cincinnati Clermont college 20 Desagher S., Glowinski J., Premont J., “Astrocytes protect neutrons from hydrogen peroxide toxicity”, J Neurosci, 16, pp 2553-2562 21 Douglas K.T (1989), “Chemical synthesis of glutathione and analogs”, Coenzymes Cofactors, 3, pp 243-278 22 Ghosh M., Shen J., Rosen B P (1999), “Pathaways of As(III) detoxification in Saccharomyces cerevisiae”, Proc Nalt Acad Sci USA, 96(9), 50015006 84 23 Gmunder H., Droge W (1991), “Differential effects of glutathione depletion on T cell subsets”, Cellular Immunology, 138, pp 229-237 24 Grant C.M and Dawes I (1996), “Synthesis and role of glutathione in protection against oxidative stress in yeast”, Redox Rep, 2, pp 223-229 25 Guo J., Breslow E., Meister A (1996), “The amino acid sequence of rat kidney 5-oxo-L-prolinase determined by cDNA cloning”, J Biol Chem, 271, pp 32293-32300 26 Gushima H., Miya T., Murata K., Kimura A (1983), “Construction of glutathione producing strains of Escherichia coli B by recombinant DNA techniques”, J App Biochiem, 5, pp 43-52 27 Gut A., Chaloner C., Schofield D (1995), “Evidence of toxic metabolite stress in black South Africans with chronic pancreatitis”, Clin Chim Acta., 236, pp 145-153 28 Hamada S., Tanaka H., Sakato K (1983), “ Glutathione”, EP patent No 79,241 29 Harrington C.R., Mead T.H (1935), “Synthesis of glutathione”, Biochem J., 29, pp 1602-1611 30 Hengstler J.G., Arand M., Herrero M.E (1998), “Polymorphisms of Nacetyltransferases, glutathione S-transferases, microsomal epoxide hydrolase and sulfotransferases: influence on cancer susceptibility”, Recent Results Cancer Res., 154, pp 47-85 31 Hirakawa K., Nomura K., Kato M (1985), “Lactic acid for high yield glutathione production by yeasts”, JP patent No 60,244,284 32 Huang C.Y., Sun R.B., Lu T.S., Lai J.T (2005), “Purification of glutathione and gama – glutamylcysteine from fermentation broths”, Conference of the Annual Meeting of Taiwan Association for Food Science and Technology, November 25, 2005, Taichung, Taiwan 33 Ikeno Y., Tanno K., Omori I., Yamada R (1977), “Glutathione”, JP Patent No 52,087,296 34 Inoue Y., Nomura W., Takeuchi Y., Ohdate T., Tamasu S., (2007), “Efficient extraction of thioredoxin from Saccharomyces cerevisiae by ethanol”, Appl Environ Microb., 73, pp 1672-1675 85 35 Ishii S., Miyajima R (1989), “Glutathione manufacture by cultivation of saccharomyces in a synthetic medium”, JP Patent No 60,248,199 36 Jaspers Ch.J., Gigot D., Penninckx M.J (1985), “Pathways of glutathione degradation in yeast Saccharomyces cerevisiae”, Phytochemistry, 24, pp 703-707 37 Jaspers Ch.J., Penninckx M.J (1984), “Glutathione metabolism in yeast Saccharomyces cerevisiae: evidence that γ-glutamyltranspeptidase is a vacuolar enzyme”, Biochemie, 66, pp 71-74 38 Kidd P (1997), “Glutathione: Systemic protectant against oxidative and free radical damage”, Alt Med Rev, 2(3), pp 155-176 39 Kimura H., Inoe Y., Kobayashi S (1996), “Glutathione manufacture with recombinant Saccharomyces”, JP patent No 8, 070,884 40 Kinoshita K., Machida M., Oka S., Yamamoto Y., Tomikanehara H (1986), “Manufacture of yeast cells containing high glutathione”, JP patent No 61,192,282 41 Kono G., Harada M., Sugisaka K., Nishida M (1977), “High glutathione containing yeasts”, JP patent No 52,125,687 42 Kyowa Hakko Kogyo co (1984), “Yield increase in glutathione produced by yeasts”, JP patent No 59, 034, 899 43 Langer R.S., Hamilton B.K., Gardner C.R (1976), “Enzymatic regeneration of ATP”, AlChE J., 22, pp 1079-1090 44 Lee J., Godon C., Lagniel G., Spector D., Garin J., Labarre J., Toledanno M.B (1999), “Yap1 and Skn7 control two specialized oxidative stress response regulons in yeast”, J Biol Chem, 274, pp 16040-16046 45 Li Y., Chen J., Mao Y.Y., Lun S.Y., Koo Y.M (1998), “Effect of additives and fed-batch culture strategies on the production of glutathione by recombinant Escherichia coli”, Process Biochem, 33, pp 709-714 46 Li Y., Hugenholtz J., Sybesma W., Abee T., Moleneer D (2005), “Using Lactococcus lactis for glutathione overproduction”, Applied Microbiological Biotechnology, 67(1), pp 83-90 47 Li Y., Wei G., Chen J (2004), “Glutathione: a review on biotechnological production”, App Microbiol Biotechnol, 66, pp 233 – 242 86 48 Loguercio C., Taranto D., Vitale L.M (1996), “Effect of liver cirrhosis and age on the glutathione concentration in plasma, erythrocytes, and gastric mucosa of man”, Free Radic Bio Med., 20, pp.483-488 49 Mehdi K., Thierie J., Penninckx M.J (2001), “γ-glutamyltranspeptidase in yeast Saccharomyces cerevisiae and its role in the vacular transport and metabolism of glutathione”, Biochem J, 359, pp 631-637 50 Meister A., Anderson M.E (1983), “Glutathione”, Anuu Rev Biochem., 52, pp 711-760 51 Meister A., Larsson A (1989), “Glutathione synthetase deficiency and other disorders of γ-glytamyl cycle”, In: Scriver C.R., Beaudet A.L., Sly W.S., Valle D., editors The metabolic basis of inherited disease 6th ed New York: McGraw-Hill, pp 855-868 52 Miyake T., Hazu T., Yoshida S., Kanayama M., Tomochika K., Shinoda S., Ono B (1998), “Glutathione transport systems of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae, Biosce Biotechnol Biochem, 62, pp 18581864 53 Molano J., Bowers B., Cabib E (1980), “Distribution of chitin in the yeast cell wall: an ultrastructural and chemical study”, J Cell Biol., 85, 199212 54 Murata K., Kimura A (1982), “Some properties of glutathione biosynthesisdeificient mutants of Escherichia coli B”, J Gen Microbiol, 128, pp 1047-1052 55 Murata K., Kimura A (1990), “Overproduction of glutathione and its derivatives by genetically engineered microbial cells”, Biotechnol Adv., 8, pp 59-96 56 Murata K., Miya T., Gushima H., Kimura A (1983), “Cloning and amplification of a gene for glutathione synthetase in Escherichia coli B, Agric Biol Chem, 47, pp 1381-1383 57 Murata K., Tani K., Kato J., Chibata I (1981c), “Gluathione production by immobilized Saccharomyces cerevisiae cells containing an ATP regeration system”, Agri Biol Chem, 45, pp 2131-2132 87 58 Nam Sun Wang (2009), “Glucose assay by dinitrosalicylic colorimetric method”, University of Maryland 59 Nie W., Wei G., Du G., Li Y., Chen J (2005), “Enhanced intracellular glutathione synthesis and excretion capability of Candida utilis by using a low pH-stress strategy”,Letters in Applied Microbiology, 40, pp 378 – 384 60 Nippon Zeon Co (1983), “Glutathione production”, JP patent No 58,146,294 61 Ohtake Y., Wantanabe K., Tezuka H., Ogata T., Yabuuchi S., Murata K., Kimura A (1988), “The expression of gamma-glutamylcysteine synthetase gene of Eschirichia coli in Saccharomyces cerevisiae”, Agric Biol Chem., 52, pp 2753-2762 62 Paolisso G., Tagliamonte M.R., Rizzo M.R (1998), “Oxidative stress and advancing aging: results in health centenarians”, J Am Geriatr Soc., 46, pp 833-838 63 Pastore A., Federici G., Bertini E., Piemonte F (2003), “Analysis of glutathione: implication in redox and detoxinfication”, Clin Chim Acta., 333, pp 19-39 64 Penninckx M (1993), “Metabolism and functions of glutathione in microorganisms”, Adv Microb Physial, 34, pp 239-301 65 Penninckx M (2000), “A short review on the rols of glutathione in the response of yeasts to nutritional, environmental, and oxidative stress”, Enzyme Microb Technol., 26, pp 737-742 66 Penninckx M.J (2002), “An overview on glutathione in Saccharomyces versus non-conventional yeasts”, FEMS Yeast Res, 2, pp 295-305 67 Penninckx M.J., Jaspers Ch.J., Wiame J.M (1980), “Glutathione metabolism in relate to the amino acid permeation systems in the yeast Saccharomyces cerevisiae”, Eur J Biochem, 104, pp 119-123 68 Richman P.G., Meister A (1975), “Regulation of gamma-glutamycystein synthetase b nonallosteric feedback inhibition by glutathione”, J Biol Chem., 250, pp 1422 88 69 Sahm H (1977), “Metabolism of methanol by yeast”, Adv Biochem En., 6, pp 103-127 70 Sakato K., Tanaka H (1992), “Advanced control of glutathione fermentation process”, Biotechonol Bioeng., 40, pp 904-912 71 Shimizu H., Araki K., Shioya S., Suga K (1991), “Optimal production of glutathione by controlling the specific growth rate of yeast in fed-batch culture”, Biotechnol Bioeng., 38, pp 196-205 72 Shimosaka M., Fukuda Y., Murata K., Kimura A (1982), “Application of hybrid plasmids carrying glycolysis genes to ATP production by Escherichia coli, J Bacteriol, 152, pp 98-103 73 Sibirnity A., Ubiivovk V M., Gonchar M V., Titorenko V I., Voronovsky A Y., Kapultsevich Y G., Blinik K M (1990), “Reactions of direct formaldehyde oxidation to CO2 are non-essential for energy supply of yeast methylotrophic growth”, Arch Microbiol., 154, pp 566-575 74 Sies H (1999), “Glutathione and its role in cellular functions”, Free Radical Biology and Medicine, 27, pp 916-921 75 Ubiivovk V M., Telegus Y V., Sibirnity A (1999), “Isolation and characterization of glutathione-deficient mutants of the methylotrophic yeast Hansenula polymorpha”, Microbidogiya, 68, pp 26-31 76 Udeh K.O Achremowicz B (1997), “High glutathione containing yeast Saccharomyces cerevisiae: optimization of production”, Acta Microbiologica Polonica, 46 (1), pp 105-114 77 Van Den Hazel H.B., Kielland-Brandt M.C., Winther J (1996), “Biosynthisis and function of yeast vacuolar proteases”, Yeast, 12, pp.1-16 78 Watanabe K., Yamano Y., Murata K., Kimura A (1986), “Glutathione production by Escherichia coli cells with hybrid plasmid containing tandemly polymerized genes for glutathione synthetase”, Appl Microbiol Biotechnol, 24, pp 375-378 79 Wei G., Li Y., Du G., Chen J (2003b), “Effect of surfactants on extracellulor accumulation of glutathione by Saccharomyces cerevisiae”, Process Biochem, 38, pp 1133-1138 89 80 Wu G., Fang Y.Z., Yang S., Lupton J.R., Turner N.D (2004), “Glutathione metabolism and its implications for health”, J Nutr., 134, pp 489-492 81 Xiong Z Q., Guo M J., Chu J., Zhuang Y P., Zhang S L (2009), “Efficient extraction of intracellular redued glutathione from fermentation broth of Saccharomyces cerevisiae by ethanol”, Bioresource Technology, 100, 1011-1014 82 Yoshida K., Hirokawa J., Tagami S (1995), “Weakened cellular seavenging activity against oxidative stress in diabetes mellitus: regulation of glutathione synthesis and efflux”, Diabetologia, 38, pp 201-210 90 91 PHẦN PHỤ LỤC PHỤ LỤC 1: MỘT SỐ HÌNH ẢNH SẢN PHẨM Hình 1.1 1.2: Rau má tan chứa GSH Hình 1.3: Thực phẩm bổ sung chứa GSH PHỤ LỤC 2: ĐƯỜNG CHUẨN GLUTATHIONE Bảng 2.1: Quan hệ độ hấp thụ quang bước sóng 412nm nồng độ GSH dung dịch Nồng độ GSH (mg/ml) OD (412nm) 0.1 0.082 0.2 0.17 0.3 0.258 0.4 0.32 0.5 0.431 0.6 0.55 0.7 0.64 0.8 0.732 0.9 0.779 0.867 Đường cong chuẩn GSH y = 0.8956x - 0.0097 R2 = 0.9952 OD(412nm) 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.2 Nồng độ GSH (mg/ml) Hình 2.1: Đường chuẩn GSH PHỤ LỤC 3: ĐÁNH GIÁ CẢM QUAN CHẤT LƯỢNG SẢN PHẨM 3.1 Phiếu đánh giá cảm quan bột nấm men giàu GSH Phiếu đánh giá cảm quan vận dụng theo TCVN 3216-1994: PHIẾU ĐÁNG GIÁ CẢM QUAN Sản phẩm: ……Bột nấm men giàu GSH…………………… Họ tên:……………… Tuổi ……… Ngày thử…………………… Mẫu sản phẩm giới thiệu, bạn quan sát nếm mẫu theo thứ tự từ trái qua phải, sau đánh giá mức độ ưa thích bạn tính chất (nêu bảng) theo thang điểm ứng với mức độ ưa thích sau: Không thích (1 điểm ) Rất thích (4 điểm) Khá thích (2 điểm ) Hết sức thích (5 điểm) Thích (1 điểm ) Bảng cho điểm sau: Tính chất xác định Mẫu M1 Đặc điểm M2 Điểm Đặc điểm M3 Điểm Đặc điểm Màu sắc Trạng thái Mùi vị Lưu ý: Sau lần thử, bạn nên uống nước lọc để mùi vị Cảm ơn tham gia nhiệt tình bạn! Điểm 3.2 Phiếu đánh giá cảm quan bột rau má tan chứa GSH Phiếu đánh giá cảm quan vận dụng theo TCVN 3216-1994: PHIẾU ĐÁNG GIÁ CẢM QUAN Sản phẩm: ……Bột rau má tan chứa GSH…………………… Họ tên:……………… Tuổi ……… Ngày thử…………………… Mẫu sản phẩm giới thiệu, bạn quan sát nếm mẫu theo thứ tự từ trái qua phải, sau đánh giá mức độ ưa thích bạn tính chất (nêu bảng) theo thang điểm ứng với mức độ ưa thích sau: Không thích (1 điểm ) Rất thích (4 điểm) Khá thích (2 điểm ) Hết sức thích (5 điểm) Thích (1 điểm ) Bảng cho điểm sau: Tính chất xác định Mẫu M1 Đặc điểm M2 Điểm Đặc điểm M3 Điểm Đặc điểm Màu sắc Trạng thái Mùi vị Lưu ý: Sau lần thử, bạn nên uống nước lọc để mùi vị Cảm ơn tham gia nhiệt tình bạn! Điểm ... 2.3.2.2 Phương pháp thu nhận sinh khối nấm men chứa GSH 36 2.3.2.3 Phương pháp tạo bột sinh khối nấm men chứa GSH 37 2.3.2.4 Phương pháp thu hồi GSH từ sinh khối nấm men 37 2.3.3 Phương... 65 3.4.1 Nghiên cứu lựa chọn phương pháp thu hồi sinh khối nấm men 65 3.4.2 Phương pháp tạo bột sinh khối nấm men giàu GSH 66 3.4.2.1 Lựa chọn phương pháp tạo bột sinh khối nấm men giàu... 3.4.2.3 Nghiên cứu phương pháp bảo quản, bảo tồn hoạt tính sinh học bột sinh khối nấm men giàu GSH 70 3.4.3 Nghiên cứu lựa chọn phương pháp tách chiết GSH từ sinh khối tế bào nấm men