NGHIÊN CỨU THU NHẬN CHẾ PHẨM SINH KHỐI VI KHUẨN Bacillus subtilis PHÒNG TRỪ MỘT SỐ NẤM BỆNH HẠI CÂY TRỒNG

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU THU NHẬN CHẾ PHẨM SINH KHỐI VI KHUẨN Bacillus subtilis PHÒNG TRỪ MỘT SỐ NẤM BỆNH HẠI CÂY TRỒNG Ngành học : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Sinh viên thực : NGUYỄN LÝ NHƠN Niên khóa : 2007 – 2011 Tháng 07/2011 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU THU NHẬN CHẾ PHẨM SINH KHỐI VI KHUẨN Bacillus subtilis PHÒNG TRỪ MỘT SỐ NẤM BỆNH HẠI CÂY TRỒNG Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực ThS NGUYỄN NHƯ NHỨT NGUYỄN LÝ NHƠN Tháng 07/2011 LỜI CẢM ƠN Sau sáu tháng thực khóa luận, với nổ lực thân với giúp đỡ, động viên gia đình, người thân, bạn bè q thầy mà em hồn thành tốt khóa luận Bằng lòng biết ơn sâu sắc, em xin gởi lời cảm ơn đến: Ban giám hiệu trường Đại học Nông Lâm TP.HCM, Ban chủ nhiệm q thầy Bộ mơn Cơng nghệ sinh học tận tâm dạy, truyền đạt kiến thức tạo điều kiện thuận lợi cho em trình học tập nghiên cứu ThS Nguyễn Như Nhứt, tất nhiệt tình tận tâm thầy giúp cho em hồn thành tốt khóa luận tốt nghiệp Thầy Nguyễn Văn Lẫm, cô Lê Hồng Thủy Tiên cô Biện Thị Lan Thanh người gắn bó với em tập thể lớp DH07SH suốt q trình học tập thực khóa luận Em xin gởi lời cảm ơn tới ban giám đốc Chi nhánh công ty TNHH Gia Tường tạo điều kiện cho em đến thực đề tài công ty Đồng thời em xin cảm ơn anh chị cơng ty nhiệt tình bảo cho em suốt thời gian thực tập công ty Cuối xin cảm ơn cha mẹ, người tạo con, nuôi dưỡng dạy dỗ suốt 22 năm qua Tất trở nên vô nghĩa khơng có bàn tay cha mẹ Con gởi lời cảm ơn tới tất người thân khác gia đình khuyên răn dạy dỗ suốt năm qua Xin cảm ơn người! Sinh viên thực Nguyễn Lý Nhơn i TÓM TẮT Trong năm gần đây, Bacillus subtilis sử dụng tác nhân sinh học có hiệu phòng trừ nấm bệnh nhiều nước giới Nhưng Việt Nam chưa có nhiều báo cáo ứng dụng Bacillus subtilis vấn đề Do đó, chúng tơi thực đề tài “Nghiên cứu thu nhận chế phẩm sinh khối vi khuẩn Bacillus subtilis phòng trừ số nấm bệnh trồng” với mục tiêu thu nhận chế phẩm có khả kiểm sốt nấm bệnh Trong phạm vi nghiên cứu, từ chủng Bacillus subtilis (Ba02, Ba06, Ba39, Ba40) chủng nấm bệnh (Sclerotium rolfsii, Rhizoctonia solani, Phytophthora capsici Fusarium sp.) chọn chủng Bacillus có hiệu đối kháng cao với nấm bệnh phương pháp đối kháng đĩa thạch PGA Sau đó, nghiên cứu điều kiện môi trường tối ưu cho phát triển chủng Bacillus chọn Từ đó, thu nhận chế phẩm sinh khối bước đầu thử nghiệm trồng điều kiện vườn ươm Kết thí nghiệm cho thấy chủng Ba02 có hiệu đối kháng cao ổn định nấm bệnh Chủng nuôi cấy lắc 48 môi trường chứa lactose 2%, bột trùn Quế thủy phân 1%, KH2PO4 0,4 g/l, MgSO4.7H2O 0,2 g/l pH 7,5 canh trường đạt 4,3 x 108 CFU/ml Kết nghiên cứu cho thấy chế phẩm có khả phòng bệnh tốt số trồng, làm tăng tỉ lệ mầm, giảm tỷ lệ chết tăng sức sống sức đề kháng trồng ii SUMMARY The thesis title is “Research on Bacillus subtilis biomass production for the antagonism some fungal phytopathogens” Recently, Bacillus subtilis has been used as an effectively biocontrol agent to antagonise phytopathogens in the world In Vietnam, there are not any report on application of Bacillus subtilis in biocontrol Therefore, we studied this thesis for acquisition the Bacillus subtilis biomass which has ability to control fungal deseases The research contain selecting the best Bacillus subtilis from four Bacillus subtilis strains (Ba02, Ba06, Ba39 and Ba40); optimizing component of medium for proliferation of the selected strain; and test antagonistic activity of the culture on seeds in nursery The result indicated that Bacillus subtilis Ba02 was the most antagonistic with Sclerotium rolfsii, Rhizoctonia solani, Phytophthora capsici, and Fusaruim sp., this strain was incubated and shaken on liquid medium consist of 2% lactose, 1% perionyx excavates, 0.4 g/l KH2PO4, 0.2 g/l MgSO4.7H2O at pH 7.5, the culture after 48 hours incubation contain 4.3 x 108 CFU/ml and got a good potential to control fungal phytopathogens Key words: Bacillus subtilis, phytopathogen, biomass, biocontrol iii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i  TÓM TẮT ii  SUMMARY iii  MỤC LỤC iv  DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT viii  DANH SÁCH CÁC BẢNG ix  DANH SÁCH CÁC HÌNH x  Chương MỞ ĐẦU 1  1.1. Đặt vấn đề 1  1.2 Yêu cầu đề tài 2  1.3 Nội dung thực 2  Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3  2.1 Một số bệnh hại trồng biện pháp kiểm soát 3  2.1.1 Bệnh hại trồng 3  2.1.1.1 Tình hình bệnh hại trồng 3  2.1.1.2 Đặc điểm nấm gây bệnh 6  2.1.1.3 Một số nấm bệnh trồng 10  2.1.2 Một số biện pháp kiểm soát 11  2.1.2.1 Biện pháp sử dụng giống kháng chống chịu bệnh 11  2.1.2.2 Biện pháp canh tác 12  2.1.2.3 Biện pháp hóa học 12  2.1.2.4 Biện pháp sinh học 13  2.2 Tổng quan Bacillus subtilis 15  2.2.1 Vị trí phân loại 15  2.2.2 Đặc điểm sinh thái phân bố 15  2.2.3 Đặc điểm hình thái 15  2.2.4 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa 16  2.2.5 Tính đối kháng Bacillus subtilis 17  2.2.6 Kiểm soát nguồn bệnh thực vật 18  2.2.6.1 Kiểm soát nấm bệnh thực vật 18  2.2.6.2 Kiểm soát vi khuẩn bệnh thực vật 19  2.2.7 Một số ứng dụng Bacillus subtilis 19  iv 2.2.7.1 Trong nông nghiệp 19  2.2.7.2 Trong công nghệ thực phẩm 19  2.2.7.3 Trong công nghiệp 20  2.2.7.4 Trong y học 20  Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 21  3.1 Thời gian địa điểm ngiên cứu 21  3.1.1 Thời gian nghiên cứu 21  3.1.2 Địa điểm nghiên cứu 21  3.2 Vật liệu 21  3.2.1 Chủng giống nghiên cứu 21  3.2.2 Thực vật khảo sát 21  3.2.3 Dụng cụ thiết bị hóa chất 22  3.2.3.1 Dụng cụ 22  3.2.3.2 Thiết bị 22  3.2.3.3 Hóa chất 22  3.2.4 Môi trường nuôi cấy 22  3.2.4.1 Môi trường PGA (MT1) 22  3.2.4.2 Môi trường cao thịt – peptone (MT2) 22  3.2.4.3 Môi trường nước chiết giá đậu – đường – peptone (MT3) 23  3.2.4.4 Môi trường nước chiết giá đậu – đường – peptone – agar (MT4) 23  3.3 Phương pháp 23  3.3.1 Phương pháp bảo quản giống vi sinh vật 23  3.3.2 Phương pháp cấy trung gian nấm bệnh 24  3.3.3 Phương pháp cấy trung gian Bacillus subtilis 24  3.3.4 Phương pháp xác định hiệu đối kháng Bacillus subtilis 24  3.3.5 Phương pháp xác định số lượng tế bào Bacillus subtilis 25  3.3.5.1 Xác định số lượng tế bào phương pháp đếm khuẩn lạc 25  3.3.5.2 Xác định số lượng tế bào phương pháp đo OD 26  3.3.6 Phương pháp xác định lượng đạm tổng số 26  3.3.7 Phương pháp nuôi cấy lỏng thu nhận sinh khối Bacillus subtilis 26  3.4 Phương pháp nghiên cứu 27  3.4.1 Lựa chọn chủng Bacillus subtilis có hiệu đối kháng cao 27  3.4.1.1 Cấy đối kháng với cấy Bacillus subtilis trước 27  3.4.1.2 Cấy đối kháng với cấy song song Bacillus subtilis nấm bệnh 27  v 3.4.1.3 Cấy đối kháng với cấy Bacillus subtilis sau 27  3.4.2 Khảo sát điều kiện tăng sinh chủng Bacillus subtilis 28  3.4.2.1 Ảnh hưởng nguồn carbon bổ sung 28  3.4.2.2 Ảnh hưởng nồng độ carbon bổ sung 28  3.4.2.3 Ảnh hưởng nguồn nitrogen bổ sung 29  3.4.2.4 Ảnh hưởng nồng độ nitrogen bổ sung 29  3.4.2.5 Ảnh hưởng nồng độ nguyên tố khoáng P bổ sung 30  3.4.2.6 Ảnh hưởng nồng độ khoáng Mg bổ sung 30  3.4.2.7 Ảnh hưởng nồng độ pH môi trường 31  3.4.2.8 Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy 31  3.4.3 Thu nhận canh trường chủng Bacillus subtilis chọn lọc 32  3.4.4 Đánh giá hiệu đối kháng chế phẩm B subtilis 32  3.4.4.1 Đánh giá môi trường đĩa PGA 32  3.4.4.2 Đánh giá trồng 32  Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34  4.1 Kết 34  4.1.1 Lựa chọn chủng Bacillus subtilis có hiệu đối kháng cao 34  4.1.1.1 Cấy đối kháng với cấy Bacillus subtilis trước 34  4.1.1.2 Cấy đối kháng với cấy song song Bacillus subtilis nấm bệnh 35  4.1.1.3 Cấy đối kháng với cấy Bacillus subtilis sau 36  4.1.2 Khảo sát ảnh hưởng thành phần môi trường lên tăng sinh Bacillus subtilis 37  4.1.2.1 Ảnh hưởng nguồn carbon bổ sung 38  4.1.2.2 Ảnh hưởng nồng độ lactose bổ sung 39  4.1.2.3 Ảnh hưởng nguồn nitrogen bổ sung 39  4.1.2.4 Ảnh hưởng nồng độ bột trùn Quế thủy phân 40  4.1.2.5 Ảnh hưởng nồng độ khoáng KH2PO4 bổ sung 41  4.1.2.6 Ảnh hưởng nồng độ khoáng Mg bổ sung 42  4.1.2.7 Ảnh hưởng pH ban đầu môi trường nuôi cấy 42  4.1.2.8 Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy 43  4.1.3 Đánh giá hiệu đối kháng dịch sinh khối B subtilis chủng Ba02 45  4.1.3.1 Đánh giá môi trường đĩa PGA 45  4.1.3.2 Đánh giá trồng 47  4.2 Thảo luận 49  Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 53  vi 5.1. Kết luận 53  5.2. Đề nghị 53  TÀI LIỆU THAM KHẢO 54  PHỤ LỤC vii DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT A Ba02 Ba06 Ba39 Ba40 C CFU Dex dk dt fi Glu H I Lac MT N NB01 NB02 NB03 NB04 NT ni PGA Sac S SS T V : Số tế bào vi khuẩn (CFU) ml mẫu : Bacillus subtilis Ba02 : Bacillus subtilis Ba06 : Bacillus subtilis Ba39 : Bacillus subtilis Ba40 : Tỷ lệ bình thường (%) : Colony - forming unit : Dextrine : Đường kính khuẩn lạc nấm bệnh trung bình đĩa đối chứng (cm) : Đường kính khuẩn lạc nấm bệnh trung bình đĩa đối kháng (cm) : Độ pha loãng tương ứng : Glucose : Tỷ lệ hạt nảy mầm (%) : Hiệu ức chế (%) : Lactose : Môi trường : Tổng số khuẩn lạc đếm đĩa chọn : Sclerotium rolfsii : Rhizoctonia solani : Phytophthora capsici : Fusarium sp : Nghiệm thức : Số lượng đĩa cấy độ pha loãng thứ i : Potato Glucose Agar : Saccharose : Cấy Bacillus sau so với nấm bệnh : Cấy Bacillus song song với nấm bệnh : Cấy Bacillus trước so với nấm bệnh : Thể tích dịch mẫu cấy vào đĩa (ml) viii số kết tham khảo cho thấy khoảng thời gian tăng sinh hiệu chủng Bac subtilis từ sau 32 Trong số nghiên cứu cho thấy số môi trường nuôi cấy chủng vi sinh vật có khả sử dụng nguồn dinh dưỡng cách nhanh chóng tăng sinh thúc đẩy Ngược lại, số mơi trường có chứa thành phần dinh dưỡng mà vi sinh vật phải tốn nhiều thời gian để chuyển hóa thành dạng mà chúng dễ sử dụng khoảng thời gian tăng sinh kéo dài Khi chọn lọc điều kiện môi trường tối ưu cho tăng sinh chủng Ba02 tiến hành tăng sinh chủng theo yếu tố môi trường vừa chọn lọc để thu nhận chế phẩm sinh khối tiến hành thử nghiệm chế phẩm trồng điều kiện vườn ươm Kết thử nghiệm cho thấy hiệu phòng bệnh chế phẩm sinh khối Ba02 có tác dụng tương đối tốt cà chua cải chìa, làm tăng tỉ lệ mầm, sức sống sức đề kháng 52 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Dựa vào kết thu trình nghiên cứu, rút kết luận sau: Chủng Ba02 có hiệu đối kháng cao ổn định so với chủng so với chủng Bacillus subtilis khác trường hợp cấy đối kháng B subtilis trước, song song sau so với nấm bệnh Chủng nuôi cấy lắc môi trường tối ưu chứa lactose 2%, bột trùn Quế thủy phân 1%, KH2PO4 0,4 g/l MgSO4.7H2O 0,2 g/l pH 7,5 Thời gian thu sinh khối 48 giờ, chế phẩm thu sau nuôi cấy môi trường chọn lọc đạt 4,3 x 108 CFU/ml Chế phẩm có tác dụng phòng bệnh tốt số trồng cà chua cải chìa, làm tăng tỉ lệ mầm, giảm tỷ lệ chết tăng sức sống sức đề kháng trồng Kết nghiên cứu cho thấy tiềm ứng dụng to lớn B subtilis phòng trừ nấm bệnh trồng 5.2 Đề nghị Qua trình nghiên cứu thực đề tài, chúng tơi có số đề nghị sau để đề tài phát triển có ứng dụng thực tiễn hơn: - Thử nghiệm chế phẩm nhiều loại nấm bệnh nhiều phổ kí chủ khác khảo sát điều kiện thực tế ảnh hưởng đến phát triển Bacillus chế phẩm để đánh giá tổng quát hiệu chế phẩm loại nấm bệnh - Nghiên cứu sản xuất chế phẩm qui mô lớn điều kiện bảo quản tốt tạo tiền đề cho việc đưa chế phẩm sử dụng thực tế - Sử dụng Bacillus nhiều nguồn phân lập khác để tạo nhiều loại chế phẩm có hiệu cao - Tìm hiểu sâu chế đối kháng chủng Bacillus chọn lọc, nghiên cứu điều kiện thuận lợi cho Bacillus tạo nhiều chất kháng sinh hay enzyme có khả ức chế nấm bệnh để đa dạng hóa loại chế phẩm, phục vụ tốt cho cơng tác phòng trị bệnh trồng 53 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Nguyễn Đức Duy Anh 2005 Phân lập khảo sát số đặc điểm vi khuẩn Lactobacillus acidophilus Bacillus subtilis KLTN, Khoa Công nghệ Sinh học Trường Đại học Nông Lâm TP.HCM Lester W Burgess, Timothy E Knight, Len Tesoriero Phan Thúy Hiền 2009 Cẩm nang chẩn đoán bệnh Việt Nam NXB Trung tâm Nghiên cứu Nông nghiệp Quốc tế Australia Tô Minh Châu 2000 Giáo trình thực tập vi sinh vật học Tủ sách Trường Đại học Nông Lâm TP.HCM Nguyễn Lân Dũng, Hoàng Đức Nhuận, 1975 Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học tập I, II, III NXB Khoa học Kỹ thuật Nguyễn Văn Đĩnh 2004 Biện pháp sinh hoc bảo vệ thực vật NXB Nông nghiệp Nguyễn Thị Thành Đô, 2010 Nghiên cứu khả kháng nấm bệnh thực vật Bacillus ssp ứng dụng thu nhận chế phẩm KLTN, Khoa Khoa học Ứng dụng Trường Đại học Tôn Đức Thắng Nguyễn Ngọc Hải Tô Minh Châu 2001 Giáo trình thực tập vi sinh Tủ sách Trường Đại học Nông Lâm TP.HCM Nguyễn Thị Hồng 2009 Vi sinh nông nghiệp Tủ sách trường Đại học Nông Lâm TP.HCM Lý Kim Hữu, 2005 Khảo sát đặc điểm vi khuẩn Bacillus subtilis tìm hiểu điều kiện ni cấy thích hợp sản xuất thử nghiệm chế phẩm Probiotic KLTN, Khoa Chăn nuôi Thú y Trường Đại học Nông Lâm TP.HCM 10 Phạm Văn Kim 1982 Giáo trình Các nguyên lý bệnh hại trồng Giáo trình giảng dạy trực tuyến Đại học Cần Thơ 11 Vũ Triệu Mân 2007 Giáo trình bệnh chuyên khoa Trường Đại học Nông nghiệp I 12 Lương Đức Phẩm 1998 Công nghệ vi sinh vật NXB Khoa học Kỹ thuật Hà Nội 13 Trần Đỗ Quyên 2004 Thu nhận khảo sát hoạt tính chế phẩm alpha amylase từ Bacillus subtilis Báo cáo thực tập tốt nghiệp ngành Sinh Hóa Đại học Khoa Học Tự Nhiên TP HCM 14 Vũ Thị Thứ, 1996 Nghiên cứu đặc điểm sinh học khả ứng dụng số chủng vi khuẩn thuộc chi Bacillus subtilis Luận án phó tiến sĩ khoa học, Sinh học, Viện sinh học nhiệt đới Tài liệu tiếng nước 15 A.Sattar Qureshi, M Aqeel Bhutto, Imrana Khushk, and M.Umar Dahot 2011 Optimization of cultural conditions for protease production by Bacillus subtilis EFRL 01 African Journal of Biotechnology 1: 5173-5181 16 Chien Jui Huang, Tang Kai Wang, Shu Chun Chung, and Chao Ying Chen 2005 Identification of an Antifungal Chitinase from a Potential Biocontrol 54 Agent, Bacillus cereus 28-9 Journal of Biochemistry and Molecular Biology 38: 82-88 17 Giuliano Bernal, Andrés Illanes, and Luigi Ciampi 2002 Isolation and partial purification of a metabolite from a mutant strain of Bacillus sp with antibiotic activity against plant pathogenic agents EJB Electronic Journal of Biotechnology 5: 12-20 18 Heidi I.G Abo Elnaga 2006 Bacillus subtilis as a Biocontrol Age for Controlling Sugar Beet Damping Disease Egypt J Phytopathogen 34: 51-59 19 J Domenech, M S Reddy, J W Kloepper, B Ramos, and J Gutierrez Manero 2006 Combined application of the biological product LS213 with Bacillus, Pseudomonas or Chryseobacterium for growth promotion and biological control of soil-borne diseases in pepper and tomato BioControl 51: 245-258 20 J H S Ferreira, F N Matthee, and A C Thomas 1991 Biological Control of Eutypa lata on Grapevine by an Antagonistic Strain of Bacillus subtilis The American Phytopathologycal Society 81: 283-287 21 L Korsten, and N Cook 1996 Optimizing Culturing Conditions for Bacillus Subtilis South African Avocado Growers’ Association Yearbook 19: 54-58 22 M Abou-Zeid, A.D Altalhi, and R.E Abd El-Fattah 2009 Bacterial control of pathogenic fungi isolated from some wild plants in Taif Governorate, Saudi Arabia Mycopath 1: 11-20 23 Maria Antonieta Gordillo 2009 Preliminary study and improve the production of metabolites with antifungal activity by a Bacillus sp strain IBA 33 Microbiology Insights 2: 15-24 24 Muhammad Irfan, Muhammad Nadeem, Quratual Ain Syed, and Shahjahan Baig 2011 Production of Thermostable α-amylase from Bacillus sp In Solid State Fermentation Journal of Applied Sciences Research 7: 607-617 25 Nalisha I., Muskhazli M., and Nor Farizan T 2006 Production of Bioactive Compounds by Bacillus subtilis against Sclerotium rolfsii Malaysian Journal of Microbiology 2: 19-23 26 Natthiya Buensanteai, Dusit Athinuwat, Tiyakhon Chatnaparat, Gary Y Yuen, and Sutruedee Prathuangwong 2008 Extracellular Proteome of Bacillus amyloliquefaciens KPS46 and Its Effect on Enhanced Growth Promotion and Induced Resistance Against Bacterial Pustule on Soybean Plant Kasetsart J (Nat Sci.) 42: 13-26 27 P J Fiddaman, and S Rossall 1992 The production of antifungal volatiles by Bacillus subtilis Applied bacteriology 74: 119-126 28 Reyes-RamMirez, B.I Escudero-Avarca, G Aguilar-Uscanga, P.M HaywardJones, and J Eleazar Barboza-Corona 2004 Antifungal Activity of Bacillus thuringiensis Chitinase and Its Potential for the Biocontrol of Phytopathogenic Fungi in Soybean Seeds Food Microbiology and Safety 69: 131-134 29 S Al-Rehiayani, S L Hafez, M Thornton, and P Sundararaj 1999 Effects of Pratylenchus neglectus, Bacillus megaterium, and oil radish of rapeseed green manure on reproductive potential of Meloidogyne chitwoodi on potato Nematropica 29: 37-49 55 Tài liệu từ internet 30 http://www.cartage.org.lb/en/themes/sciences/lifescience/generalbiology/micro biology/Fungi/Classification/Classification.htm 31 http://biodidac.bio.uottawa.ca/thumbnails/filedet.htm?File_name=MYXO003B &File_type=GIF 32 http://www.ecometrex.com/mold_introduction.htm 33 http://www.wbdg.org/resources/air_decon.php?r=secure_safe 34 http://berkeley.edu/news/media/releases/2003/02/10_spores.shtml 35 http://www.sciencebuddies.org/sciencefairprojects/project_ideas/MicroBio_Inte rpreting_Plates.shtml 36 http://www.britannica.com/EBchecked/media/127579/ 56 PHỤ LỤC Xây dựng đường tương quan mật độ tế bào vi khuẩn, log N, với độ hấp thu bước sóng OD600nm Bảng Đường tương quan mật độ tế bào Bac subtilis nồng độ từ 0,1 – 0,5 bước sóng OD600nm Độ hấp thu OD600nm 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 Mật độ TB (x108) 0,11 0,29 0,59 9,4 1,31 Log N 7,05 7,47 7,77 7,97 7,12 8,40 y = 2,637x + 6,884 R2 = 0,9586 8,20 8,00 logN 7,80 7,60 7,40 7,20 7,00 6,80 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 Độ hấp thu OD600nm Đồ thị Tương quan logN OD600nm Bac subtilis 57 PHỤ LỤC  Các nghiệm thức đánh giá chế phẩm trồng a Thử nghiệm khả phòng bệnh chế phẩm  Xử lý hạt - Nghiệm thức (NT1): ngâm hạt dịch sinh khối Ba02 15 phút đem gieo - Nghiệm thức (NT4): ngâm hạt dịch nấm bệnh NB03 15 phút đem gieo - Nghiệm thức (NT3): ngâm hạt dịch NB03 Ba02 15 phút đem gieo - Nghiệm thức (NT2): ngâm hạt nước đem gieo  Xử lý đất hạt Nghiệm thức (NT1): trộn nấm bệnh NB02 vào đất trước tuần sau gieo Nghiệm thức (NT2): trộn nấm bệnh NB02 Ba02 lúc vào đất trước tuần sau gieo hạt - Nghiệm thức (NT3): gieo hạt b Thử nghiệm khả trị bệnh chế phẩm - Nghiệm thức (NT1): ngâm hạt dịch nấm bệnh NB03 15 phút đem gieo, có mầm tiến hành phun Ba02 - Nghiệm thức (NT2): ngâm hạt dịch nấm bệnh NB03 15 phút đem gieo  Hình ảnh kết đối kháng chủng Ba02 với nấm bệnh môi trường đĩa thạch PGA hiệu chế phẩm trồng: 58 NB01 - Ba02 (T) NB01 - Ba02 (SS) NB01 - Ba02 (S) NB01 - Ba06 (T) NB01 - Ba06 (SS) NB01 - Ba06 (S) NB01 - Ba39 (T) NB01 - Ba39 (SS) NB01 - Ba39 (S) NB01 - Ba40 (T) NB01 - Ba40 (SS) NB01 - Ba40 (S) Hình Hiệu đối kháng NB01 với chủng Bacillus subtilis T: cấy Bacillus trước nấm bệnh; SS: cấy Bacillus đồng thời với nấm bệnh; S: cấy Bacillus sau nấm bệnh 59 NB02 - Ba02 (T) NB02 - Ba02 (SS) NB02 - Ba02 (S) NB02 - Ba06 (T) NB02 - Ba06 (SS) NB02 - Ba06 (S) NB02 - Ba39 (T) NB02 - Ba39 (SS) NB02 - Ba39 (S) NB02 - Ba40 (T) NB02 - Ba40 (SS) NB02 - Ba40 (S) Hình Hiệu đối kháng NB02 với chủng Bacillus subtilis T: cấy Bacillus trước nấm bệnh; SS: cấy Bacillus đồng thời với nấm bệnh; S: cấy Bacillus sau nấm bệnh 60 Ba02 - NB03 (T) Ba02 - NB03 (SS) Ba02 - NB03 (S) Ba06 - NB03 (T) Ba06 - NB03 (SS) Ba06 - NB03 (S) Ba39 - NB02 (T) Ba39 - NB03 (SS) Ba39 - NB03 (S) Ba40 - NB04 (T) Ba40 - NB03 (SS) Ba40 - NB03 (S) Hình Hiệu đối kháng NB03 với chủng Bacillus subtilis T: cấy Bacillus trước nấm bệnh; SS: cấy Bacillus đồng thời với nấm bệnh; S: cấy Bacillus sau nấm bệnh 61 NB04 - Ba02 (T) NB03 - Ba02 (SS) NB04 - Ba02 (S) NB04 - Ba06 (T) NB04 - Ba06 (SS) NB04 - Ba06 (S) NB04 - Ba39 (T) NB04 - Ba39 (SS) NB04 - Ba39 (S) NB04 - Ba40 (T) NB04 - Ba40 (SS) NB04 - Ba40 (S) Hình Hiệu đối kháng NB04 với chủng Bacillus subtilis T: cấy Bacillus trước nấm bệnh; SS: cấy Bacillus đồng thời với nấm bệnh; S: cấy Bacillus sau nấm bệnh 62 NB01 – Bac02 (T) NB01 - Bac02 (SS) NB01 - Bac02 (S) NB02 – Bac02 (T) NB02 - Bac02 (SS) NB02 - Bac02 (S) NB03 – Bac02 (T) NB03 - Bac02 (SS) NB03 - Bac02 (S) NB04 – Bac02 (T) NB04 - Bac02 (SS) NB04 - Bac02 (S) Hình Hiệu đối kháng chế phẩm sinh khối chủng Bac02 với nấm bệnh T: cấy Bacillus trước nấm bệnh; SS: cấy Bacillus đồng thời với nấm bệnh; S: cấy Bacillus sau nấm bệnh 63 PHỤ LỤC Bảng phân tích ANOVA kết đối kháng Bacillus nấm bệnh  Trường hợp cấy đối kháng Bacillus trước: Analysis of Variance for Hieu qua - Type III Sums of Squares -Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value -MAIN EFFECTS A:chung Bacillus 2,57097 0,856991 6,63 0,0004 B:Chung nam benh 51,8257 17,2752 133,64 0,0000 RESIDUAL 13,8313 107 0,129265 -TOTAL (CORRECTED) 67,8912 113 -Xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx Table of Least Squares Means for Hieu qua with 95,0 Percent Confidence Intervals -Stnd Lower Upper Level Count Mean Error Limit Limit -GRAND MEAN 114 4,47732 chung Bacillus Ba02 27 4,39931 0,0697285 4,26108 4,53754 Ba06 29 4,42414 0,0668746 4,29157 4,55671 Ba39 29 4,35342 0,0668832 4,22083 4,48601 Ba40 29 4,73241 0,0667921 4,6 4,86482 Chung nam benh NB01 27 3,39433 0,0692258 3,25709 3,53156 NB02 24 4,44342 0,0737237 4,29727 4,58957 NB03 32 5,1375 0,0635573 5,0115 5,2635 NB04 31 4,93404 0,0646014 4,80597 5,0621 Xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx Multiple Range Tests for Hieu qua by chung Bacillus -Method: 95,0 percent LSD chung Bacillus Count LS Mean Homogeneous Groups -Ba39 29 4,35342 X Ba02 27 4,39931 X Ba06 29 4,42414 X Ba40 29 4,73241 X -Contrast Difference +/- Limits -Ba02 - Ba06 -0,0248305 0,190608 Ba02 - Ba39 0,0458904 0,190608 Ba02 - Ba40 *-0,333096 0,190608 Ba06 - Ba39 0,0707209 0,187174 Ba06 - Ba40 *-0,308266 0,187174 Ba39 - Ba40 *-0,378987 0,187174 -* denotes a statistically significant difference Xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx Multiple Range Tests for Hieu qua by Chung nam benh -Method: 95,0 percent LSD Chung nam benh Count LS Mean Homogeneous Groups -NB01 27 3,39433 X NB02 24 4,44342 X NB04 31 4,93404 X NB03 32 5,1375 X -Contrast Difference +/- Limits -NB01 - NB02 *-1,04909 0,199952 NB01 - NB03 *-1,74317 0,186251 NB01 - NB04 *-1,53971 0,18762 NB02 - NB03 *-0,69408 0,192461 NB02 - NB04 *-0,490615 0,193787 64 NB03 - NB04 *0,203465 0,179615  Trường hợp cấy đối kháng Bacillus song song: Analysis of Variance for Hieu qua - Type III Sums of Squares -Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value -MAIN EFFECTS A:chung Bacillus 0,526311 0,175437 1,26 0,2910 B:Chung nam benh 32,8896 10,9632 78,83 0,0000 RESIDUAL 15,8541 114 0,139071 -TOTAL (CORRECTED) 49,5311 120 -xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx Table of Least Squares Means for Hieu qua with 95,0 Percent Confidence Intervals -Stnd Lower Upper Level Count Mean Error Limit Limit -GRAND MEAN 121 4,7991 chung Bacillus Ba02 30 4,7514 0,0681237 4,61645 4,88635 Ba06 30 4,75806 0,0681237 4,62311 4,89302 Ba39 31 4,774 0,0670078 4,64126 4,90674 Ba40 30 4,91293 0,0682078 4,77781 5,04805 Chung nam benh NB01 27 3,8931 0,0718021 3,75087 4,03534 NB02 30 4,94704 0,0681236 4,81209 5,08199 NB03 32 5,30625 0,065924 5,17565 5,43685 NB04 32 5,05 0,065924 4,9194 5,1806 Xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx Multiple Range Tests for Hieu qua by chung Bacillus -Method: 95,0 percent LSD chung Bacillus Count LS Mean Homogeneous Groups -Ba02 30 4,7514 X Ba06 30 4,75806 X Ba39 31 4,774 X Ba40 30 4,91293 X -Contrast Difference +/- Limits -Ba02 - Ba06 -0,00666667 0,190746 Ba02 - Ba39 -0,0226019 0,189202 Ba02 - Ba40 -0,161535 0,190746 Ba06 - Ba39 -0,0159352 0,189202 Ba06 - Ba40 -0,154869 0,190746 Ba39 - Ba40 -0,138934 0,189202 -Xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx Multiple Range Tests for Hieu qua by Chung nam benh -Method: 95,0 percent LSD Chung nam benh Count LS Mean Homogeneous Groups -NB01 27 3,8931 X NB02 30 4,94704 X NB04 32 5,05 X NB03 32 5,30625 X -Contrast Difference +/- Limits -NB01 - NB02 *-1,05394 0,195973 NB01 - NB03 *-1,41315 0,193051 NB01 - NB04 *-1,1569 0,193051 NB02 - NB03 *-0,359208 0,187742 NB02 - NB04 -0,102958 0,187742 NB03 - NB04 *0,25625 0,184689  Trường hợp cấy đối kháng Bacillus sau: 65 Analysis of Variance for Hieu qua - Type III Sums of Squares -Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value -MAIN EFFECTS A:chung Bacillus 1,57815 0,52605 9,89 0,0000 B:Chung nam benh 21,0714 7,0238 132,02 0,0000 RESIDUAL 6,01169 113 0,0532008 -TOTAL (CORRECTED) 28,7679 119 -Xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx Table of Least Squares Means for Hieu qua with 95,0 Percent Confidence Intervals -Stnd Lower Upper Level Count Mean Error Limit Limit -GRAND MEAN 120 5,72168 chung Bacillus Ba02 32 5,61562 0,0407741 5,53484 5,69641 Ba06 31 5,63535 0,0414436 5,55324 5,71745 Ba39 29 5,72521 0,0428489 5,64032 5,8101 Ba40 28 5,91055 0,0437505 5,82387 5,99723 Chung nam benh NB01 29 5,01745 0,0428489 4,93256 5,10234 NB02 31 5,99044 0,0414436 5,90833 6,07254 NB03 32 6,09063 0,0407741 6,00984 6,17141 NB04 28 5,78822 0,0437505 5,70154 5,8749 Xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx Multiple Range Tests for Hieu qua by chung Bacillus -Method: 95,0 percent LSD chung Bacillus Count LS Mean Homogeneous Groups -Ba02 32 5,61562 X Ba06 31 5,63535 X Ba39 29 5,72521 X Ba40 28 5,91055 X -Contrast Difference +/- Limits -Ba02 - Ba06 -0,0197223 0,115159 Ba02 - Ba39 -0,109584 0,117159 Ba02 - Ba40 *-0,294924 0,118251 Ba06 - Ba39 -0,0898615 0,118054 Ba06 - Ba40 *-0,275202 0,119138 Ba39 - Ba40 *-0,18534 0,121072 -Xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx Multiple Range Tests for Hieu qua by Chung nam benh -Method: 95,0 percent LSD Chung nam benh Count LS Mean Homogeneous Groups -NB01 29 5,01745 X NB04 28 5,78822 X NB02 31 5,99044 X NB03 32 6,09062 X -Contrast Difference +/- Limits -NB01 - NB02 *-0,972986 0,118054 NB01 - NB03 *-1,07317 0,117159 NB01 - NB04 *-0,770769 0,121072 NB02 - NB03 -0,100189 0,115159 NB02 - NB04 *0,202218 0,119138 NB03 - NB04 *0,302406 0,118251 - 66 ... biomass production for the antagonism some fungal phytopathogens” Recently, Bacillus subtilis has been used as an effectively biocontrol agent to antagonise phytopathogens in the world In Vietnam,... fusarinic acid, alternaric acid), nhóm protein sản phẩm phân giải protein urê, ammoniac, nhóm polysaccharide piricularin chất bay cyanic acid c Sinh sản nấm Nấm có nhiều phương thức sinh sản tùy... kháng sinh vi khuẩn tiết phong bế trình tổng hợp protein 17 cách ngăn cản ribosome tổng hợp chuỗi polypeptide hay đưa đến tổng protein bất thường, ảnh hưởng đến phát triển tác nhân gây bệnh 2.2.6