Nghiên cứu biểu hiện gene và định hướng tạo chế phẩm sinh học chứa chitinase và protease từ Lecanicillium lecanii diệt nấm bệnh hại cây trồng (tt)

Nghiên cứu biểu hiện gene và định hướng tạo chế phẩm sinh học chứa chitinase và protease từ Lecanicillium lecanii diệt nấm bệnh hại cây trồng (tt)Nghiên cứu biểu hiện gene và định hướng tạo chế phẩm sinh học chứa chitinase và protease từ Lecanicillium lecanii diệt nấm bệnh hại cây trồng (tt)Nghiên cứu biểu hiện gene và định hướng tạo chế phẩm sinh học chứa chitinase và protease từ Lecanicillium lecanii diệt nấm bệnh hại cây trồng (tt)Nghiên cứu biểu hiện gene và định hướng tạo chế phẩm sinh học chứa chitinase và protease từ Lecanicillium lecanii diệt nấm bệnh hại cây trồng (tt)Nghiên cứu biểu hiện gene và định hướng tạo chế phẩm sinh học chứa chitinase và protease từ Lecanicillium lecanii diệt nấm bệnh hại cây trồng (tt)Nghiên cứu biểu hiện gene và định hướng tạo chế phẩm sinh học chứa chitinase và protease từ Lecanicillium lecanii diệt nấm bệnh hại cây trồng (tt)Nghiên cứu biểu hiện gene và định hướng tạo chế phẩm sinh học chứa chitinase và protease từ Lecanicillium lecanii diệt nấm bệnh hại cây trồng (tt)Nghiên cứu biểu hiện gene và định hướng tạo chế phẩm sinh học chứa chitinase và protease từ Lecanicillium lecanii diệt nấm bệnh hại cây trồng (tt)

ÐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ÐẠI HỌC SƢ PHẠM BÁO CÁO TĨM TẮT ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ CẤP ĐẠI HỌC NĂM 2016 NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN GENE VÀ ĐỊNH HƢỚNG TẠO CHẾ PHẨM SINH HỌC CHỨA CHITINASE VÀ PROTEASE TỪ LECANICILLIUM LECANII DIỆT NẤM BỆNH HẠI CÂY TRỒNG Mã số: ĐH2016-TN04-01 Chủ nhiệm đề tài: TS NGUYỄN HỮU QUÂN Thái Nguyên, năm 2018 i ÐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ÐẠI HỌC SƢ PHẠM BÁO CÁO TÓM TẮT ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP ĐẠI HỌC NĂM 2016 NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN GENE VÀ ĐỊNH HƢỚNG TẠO CHẾ PHẨM SINH HỌC CHỨA CHITINASE VÀ PROTEASE TỪ LECANICILLIUM LECANII DIỆT NẤM BỆNH HẠI CÂY TRỒNG Mã số: ĐH2016-TN04-01 Xác nhận tổ chức chủ trì Chủ nhiệm đề tài TS Nguyễn Hữu Quân Thái Nguyên, năm 2018 ii DANH SÁCH CÁC THÀNH VIÊN THAM GIA ÐỀ TÀI TT Họ tên Đơn vị Nhiệm vụ Trường Đại học Sư phạm - Đại học TS Nguyễn Hữu Quân TS Hoàng Phú Hiệp CN Nguyễn Thị Hồng Chuyên Thái Nguyên Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên Chủ nhiệm Thành viên Thành viên ĐƠN VỊ PHỐI HỢP CHÍNH Tên đơn vị nƣớc Nội dung phối hợp Họ tên ngƣời nghiên cứu đại diện đơn vị Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư Phân tích hóa sinh, PGS.TS Nguyễn Thị Tâm phạm - Đại học Thái Nguyên Phân tích sinh học phân tử iii MỤC LỤC MỞ ĐẦU Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU Chƣơng VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu hóa chất 2.2 Phương pháp nghiên cứu Chƣơng KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .4 3.1 Nhân dòng gene mã hóa endochitinase khơng mang tín hiệu peptide từ chủng nấm L lecanii 3.2 Nghiên cứu tạo vector biểu gene mã hóa chitinase nấm men P pastoris X33 3.2.1 Thiết kế plasmid pPImchit1 biểu gen mchit1 nấm men 3.2.2 Xây dựng hệ thống biểu P pastoris X33/pPImchit1 3.3 Nghiên cứu chuyển cấu trúc gene mã hóa endochitinase khơng mang peptide tín hiệu vào nấm men P pastoris X33 3.3.1 Biểu gene mã hóa endochitinase khơng mang peptide tín hiệu vào nấm men P pastoris X33 3.3.2 Sàng lọc dòng nấm men P pastoris X33/pPIChit tái tổ hợp 3.4 Tinh đánh giá tính chất rmchit1 .6 3.4.1 Tinh rmchit1 3.4.2 Đánh giá tính chất rmchit1 3.5 Nghiên cứu điều kiện sinh protease đánh giá tính chất lý hóa protease từ chủng nấm L lecanii VTCC-F-1037 10 3.5.1 Khảo sát điều kiện sinh protease từ nấm L lecnaii VTCC-F-1037 .10 3.5.2 Tinh đánh giá tính chất protease từ nấm L lecanii VTCC-F-1037 12 3.6 Thử nghiệm khả ức chế nấm bệnh hại trồng phức hệ protease/rmchit1 định hướng tạo chế phẩm diệt nấm bệnh 14 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .15 KẾT LUẬN 15 KIẾN NGHỊ 15 iv DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1 Hoạt tính rmchit1 dòng nấm men P pastoris X33 tái tổ hợp .6 Bảng 3.2 Các bước tinh rmchit1 nấm men P pastoris X33 Bảng 3.3 Ảnh hưởng ion kim loại EDTA lên hoạt tính rmchit1 Bảng 3.4 Các bước tinh protease từ nấm L lecanii VTCC-F-1037 .12 v DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 3.1 Kết nhân dòng gen mchit1 khơng mang tín hiệu peptide Hình 3.2 Trình tự gene mchit1 trình tự amino acids suy diễn khơng mang peptide tín hiệu từ nấm L lecanii 43H Hình 3.3 Kết thiết kế vector biểu pPImchit1 Hình 3.4 Điện di sản phẩm kiểm tra hệ biểu rmchit1 P pastoris X33 Hình 3.5 Điện di SDS-PAGE rmchit1 tinh thơng qua cột ProBondTM resin (A) Định tính rmchit1 đĩa chất chitin nhuộm lugol (B) Hình 3.6 Nhiệt độ tối ưu (A) độ bền nhiệt (B) rmchit1 .8 Hình 3.7 pH tối ưu (A) độ bền pH (B) rmchit1 Hình 3.8 Ảnh hưởng dung môi hữu (A) chất tẩy rửa (B) lên hoạt tính rmchit1 Hình 3.9 Hoạt tính protease từ nấm L lecanii VTCC-F-1037 đĩa thạch chứa chất casein 0,5% 10 Hình 3.10 Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy (A) pH nuôi cấy (B) đến khả sinh protease từ nấm L lecanii VTCC-F-1037 10 Hình 3.11 Ảnh hưởng nhiệt độ nuôi cấy (A) nồng độ casein (B) đến khả sinh protease từ nấm L lecanii VTCC-F-1037 .10 Hình 3.12 Ảnh hưởng nguồn nitơ (A) nguồn cacbon (B) đến khả sinh protease từ nấm L lecanii VTCC-F-1037 12 Hình 3.13 Điện di SDS-PAGE protease từ nấm L lecanii VTCC-F-1037 thơng qua cột Sephadex G-100 (A) định tính protease đĩa chất casein nhuộm Coomassie Brilliant Blue R250 (B) 13 Hình 3.14 Nhiệt độ tối ưu (A) pH tối ưu (B) protease từ L lecanii VTCC-F-1037 13 Hình 3.15 Độ bền nhiệt (A) độ bền pH (B) protease từ nấm L lecanii VTCC-F-1037 14 Hình 3.16 Ức chế phát triển nấm bệnh F oxysporum (A) R solani (B) phức hệ protease/rmchit1 Giếng 1: nước, giếng 2-5: phức hệ protease/rmchit1 14 Hình 3.17 Sợi nấm R solani (A, B) F oxysporum (C, D) xử lý với nước (A, C) với phức hệ protease/rmchit1 (B, D) 15 vi DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Tiếng Anh Tiếng Việt BLAST Basic local alignment search tool Phần mềm so sánh trình tự bp Chit DNA dNTPs Base pair Gene encoding chitinase Deoxyribonucleic acid 2-Deoxynucleoside 5-triphosphate Cặp bazơ Gen mã hóa chitinase Acid deoxyribonucleic Các nucleotide ĐC IPTG EDTA EtBr Control Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside Ethylenediamine tetraacetic acid Ethidium bromide Đối chứng Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside Axit ethylenediamine tetraacetic Ethidium bromide kb Kilo base Kilo base kDa Kilo Dalton Kilo Dalton M Marker Thang chuẩn OD Optical density Mật độ quang PCR Polymerase chain reaction Phản ứng khuếch đại gen RNA Ribonucleic acid Axit ribonucleic RNase Ribonuclease Enzyme thủy phân RNA rchit1 SDSPAGE Sodium dodecyl sulfate Polyacrylamide gel electrophoresis Chitinase tái tổ hợp Điện di protein TBE Tris boric acid EDTA Tris boric acid EDTA TE Tris EDTA Tris EDTA TEMED N,N,N,N-Tetramethylethylenediamine N,N,N,N-Tetramethylethylenediamine v/v Volume/volume Thể tích/thể tích w/v Weight/volume Khối lượng/thể tích vii THƠNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Thơng tin chung: Tên đề tài: Nghiên cứu biểu gene định hướng tạo chế phẩm sinh học chứa chitinase protease từ Lecanicillium lecanii diệt nấm bệnh hại trồng Mã số: ĐH2016-TN04-01 Chủ nhiệm đề tài: TS Nguyễn Hữu Quân Tổ chức chủ trì: Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên Thời gian thực hiện: Từ tháng 06/2016 đến tháng 6/2018 Mục tiêu - Biểu gene mã hóa chitinase từ nấm L lecanii nấm men Pichia pastoris X33 - Nghiên cứu đặc tính vai trò phức hệ chitinase/protease q trình diệt nấm bệnh hại trồng nhằm định hướng tạo chế phẩm sinh học Tính sáng tạo: - Đề tài cơng trình chứng minh vai trò tín hiệu peptide liên quan tới: (1) suất biểu rmchit1 từ nấm L lecanii 43H nấm men P pastoris X33, (2) phương pháp tinh rmchit1, (3) yếu tố ảnh hưởng tới tính chất lý hóa rmchit1 - Đề tài bước đầu tinh protease từ nấm L lecanii VTCC-F-1037 xác định nhiệt độ, pH tối ưu, độ bền nhiệt độ bền pH protease - Đề tài bước đầu chứng minh phức hợp chitinase/protease có vai trò q trình thủy phân nấm F oxysporum R solani Kết nghiên cứu: - Đã phân lập gen mã hóa endochitinase khơng mang peptide tín hiệu (mchit1) từ nấm L lecanii 43H nhân dòng vector pJET1.2 blunt - Đã thiết kế vector biểu pPImchit1 mang gen mchit1 vector pPICZαA biểu nấm men P pastoris X33 với suất biểu 2,048 U/ml - Đã tinh endochitinase tái tổ hợp không mang peptide tín hiệu (rmchit1) thơng qua cột ProBondTM resin có kích thước 43 kDa, hoạt tính riêng đạt 159,45 U/mg protein, độ 16,93 lần hiệu suất thu hồi đạt 45% - Đã chứng minh nhiệt độ pH tối ưu cho rmchit1 hoạt động 45°C, pH 6.0; rmchit1 bền dải nhiệt độ từ 30-35°C; pH 6.0 sau16 ủ Các dung môi hữu cơ; chất tẩy rửa; ion kim loại EDTA có ảnh hưởng đến hoạt tính rmchit1 - Đã tối ưu điều kiện sinh tổng hợp protease từ nấm L lecanii VTCC-F-1037 tinh protease thông qua tủa muối ammonium sulfate qua cột sắc ký lọc gel Sephadex G100 có kích thước 40 kDa, hoạt tính riêng đạt 78,73 U/mg protein, độ đạt 2,3 lần, hiệu suất thu hồi đạt 17% Protease tinh có nhiệt độ pH tối ưu 40°C pH 6,0 - Bước đầu xác định chitinase/protease có khả thủy phân sợi nấm F oxysporum R solani Sản phẩm 5.1 Sản phẩm khoa học 03 báo khoa học cơng bố tạp chí quốc tế kỷ yếu hội nghị quốc tế Huu Quan Nguyen, Van Hanh Vu, Phuong Dung Le, Hoang Mau Chu (2018), “High-level expression, purification and properties of an Endochitinase gene without signal peptide from Lecanicillium lecanii 43H in Pichia pastoris”, Molecular Biology Reports (SCIE, IF: viii 1,889) Nguyen Huu Quan, Chu Hoang Mau, Tu Quang Tan (2018) “Purification and properties of protease from Lecanicillium lecanii”, Proceding: 5th Academic conference on natural science for young scientists, master and PhD students from Asean countries, tr 197-203 Nguyen Huu Quan, Vu Van Hanh (2016) “Optimazation of culture conditions for production of protease by Lecanicillium lecanii” Proceding: The 4th Academic conference on natural science for master and PhD students from Asean countries, tr 248-254 5.2 Sản phẩm đào tạo Hướng dẫn 02 đề tài sinh viên nghiên cứu khoa học nghiệm thu Đỗ Thị Kim Oanh, Thái Thị Hòa, Nguyễn Thị Vân (2017), Tối ưu điều kiện sinh tổng hợp chitinase từ chủng nấm ký sinh côn trùng Đề tài sinh viên nghiên cứu khoa học, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên Đinh Thị Thùy, Thân Thị Kim Phượng (2017), Nghiên cứu khả sinh enzyme ngoại bào từ loài nấm sợi phân lập Thái Nguyên Đề tài sinh viên nghiên cứu khoa học, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên Phƣơng thức chuyển giao, địa ứng dụng, tác động lợi ích mang lại kết nghiên cứu - Kết chuyển thành công cấu trúc mang gen mchit1 vào nấm men P pastoris X33 sở cho việc sử dụng cấu trúc vector pPImchit1 chuyển vào nấm men P pastoris X33, góp phần tạo rmchit1 có suất cao - Các kết thu sở phát triển nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật chuyển gen nhằm nâng cao suất biểu rmchit1, thuận lợi cho tinh rmchit1 nghiên cứu tính chất lý hóa, ứng dụng thủy phân nấm hại trồng phòng thí nghiệm Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên - Kết nghiên cứu báo cơng bố tạp chí khoa học kỷ yếu quốc tế sử dụng làm tài liệu phục vụ đào tạo nghiên cứu cho sinh viên, học viên cao học, nghiên cứu sinh cán Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên số trường đại học khác Ngày 31 tháng năm 2018 Tổ chức chủ trì Chủ nhiệm đề tài Nguyễn Hữu Quân ix INFORMATION ON RESEARCH RESULTS General information - Project title: Research of gene expression and orientation of production of probiotics contained chitinase and protease from Lecanicillium lecanii to control against plant pathogenic fungi - Code number: DH2016-TN04-01 - Coordinator: Dr Nguyen Huu Quan - Implementing institution: Thai Nguyen University of Education - Duration: 24 months Objective(s) - Expression of endochitinase gene from L lecanii 43H in the P pastoris X33 - Research the characterization and role of chitinase/protease associated with hydrolysis of plant pathogenic fungus to produce bio-preparations Creativeness and innovativeness - Project is the first work that has demonstrated the role of signal peptide in relation to: (1) expression of rmchit1 in P pastoris X33, (2) rmchit1 purification, (3) Factors affecting the physical and chemical properties of rmchit1 - The first step was to purify the protease from L lecanii VTCC-F-1037 and initially showed the optimal pH and temperature for protease activity - The first step was to confirm that the chitinase/protease complex plays a role in the hydrolysis of F oxysporum and R solani Research results - Isolated the gene encoding endochitnase without signal peptide (mchit1) from the L lecanii 43H and cloned in pJET1.2 blunt vector - Designed pPImchit1 plasmid expression of mchit1 gene in yeast with expression yield of 2.048 U/ml - The rmchit1 was purified from the culture supernatant, by affinity chromatography with ProBondTM resin, and thus revealed only one protein band of approximately 43 kDa on SDS-PAGE (Fig 5, lane 3) with a specific activity 159.45 U/mg protein, with a purification factor of 16.93 and a recovery of 45 % - It has been shown that the temperature and pH optimum for rmchit1 are 45°C, pH 6.0; rmchit1 was stable at a temperature range of 30-35°C; and pH 6.0 after 16 hours of incubation Organic solvents; detergents; metal ion and EDTA affect the activity of rmchit1 - The research determined the optimum conditions for protease biosynthesis from L lecanii VTCC-F-1037 and an extracellular protease was purified by ammonium sulfate precipitation and throughout Sephadex G100 gel filtration chromatography; it showed a molecular mass of approximately 40 kDa with a specific activity of 78.73 U/mg protein, and the purification factor of 2.3 with a yield of 17% Optimum temperature and pH were observed at 40°C and pH 6.0, respectively - Initially, the ability to hydrolyze mycelial fungus F oxysporum and R solani by the MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Nấm Lecanicillium lecanii lồi nấm kí sinh trùng, chúng thường tác động đến loại mô định tuyến mỡ mơ khác bị hòa tan enzyme (chitinase, protease) nấm Trong trình tác động lên trùng, nấm tiết enzyme mạnh tốc độ hủy hoại tiêu diệt côn trùng gây bệnh nhanh, tiết kiệm thời gian Dựa vào đặc tính nấm, việc tạo lượng lớn enzyme đặc biệt chitinase bổ sung vào chế phẩm sinh học cần thiết Chitinase enzyme thuỷ phân chitin thành đơn phân N-acetyl glucosamine, chitobiose hay chitotriose qua việc xúc tác thủy giải liên kết β-1,4-glucoside C1 C4 phân tử N-acetyl glucosamine liên tiếp chitin Chitinase có ứng dụng rộng rãi lĩnh vực nông nghiệp, y học Trong trình sinh tổng hợp chitinase từ nấm L lecanii, gen mã hóa chitinase mang peptide tín hiệu đoạn peptide nằm đầu N chuỗi polypeptide có vai trò q trình tiết protein qua màng cắt bỏ peptidase khu trú bề mặt phía ngồi màng tạo phân tử protein có hoạt tính sinh học Gen mã hóa chitinase mang tín hiệu peptide từ nấm L Lecanii nhân dòng biểu nấm men P pastoris Tuy nhiên, việc biểu gen chứa peptide tín hiệu ảnh hưởng đến suất biểu hiện, ảnh hưởng đến hoạt tính tính chất enzyme tái tổ hợp Do đó, biểu chitinase tái tổ hợp khơng chứa peptide tín hiệu tự nhiên nâng cao suất biểu enzyme tái tổ hợp thay đổi số tính chất enzyme tái tổ hợp Xuất phát từ sở trên, tiến hành lựa chọn đề tài “Nghiên cứu biểu gene định hƣớng tạo chế phẩm sinh học chứa chitinase protease từ Lecanicillium lecanii diệt nấm bệnh hại trồng” Mục tiêu nghiên cứu Biểu gene mã hóa endochitinase từ nấm L lecanii nấm men P pastoris X33 Nghiên cứu đặc tính vai trò phức hệ chitinase/protease trình diệt nấm bệnh hại trồng nhằm định hướng tạo chế phẩm sinh học Nội dung nghiên cứu 3.1 Nhân dòng gene mã hóa endochitinase khơng mang tín hiệu peptide từ chủng nấm L lecanii - Thiết kế cặp mồi PCR nhân gene mã hóa mchit1 từ nấm L lecanii 43H; - Tách dòng phân tử xác định trình tự gene mã hóa mchit1 khơng mang tín hiệu peptide từ chủng nấm L lecanii 43H 3.2 Nghiên cứu tạo vector biểu gene rmchit1 P pastoris X33 - Thiết kế vector biểu mang gene mã hóa rmchit1 - Kiểm tra cấu trúc vector biểu trước biến nạp vào P pastoris X33 3.3 Nghiên cứu chuyển cấu trúc gene mã hóa rmchit1 vào P pastoris X33 - Biến nạp vector biểu pPICZα mang gene mã hóa rmchit1 vào P pastoris X33 phương pháp xung điện - Sàng lọc dòng nấm men mang gene có khả sinh tổng hợp rmchit1 - Tối ưu khả biểu rmchit1 tái tổ hợp 3.4 Tinh đánh giá tính chất lý hóa rmchit1 - Tinh chitinase tái tổ hợp từ chủng từ nấm men P pastoris X33 - Đánh giá tính chất lý hóa chitinase tái tổ hợp từ nấm men P pastoris X33 3.5 Nghiên cứu điều kiện sinh tổng hợp protease đánh giá tính chất lý hóa protease từ chủng nấm L lecanii - Khảo sát điều kiện sinh tổng hợp protease từ nấm L lecanii - Đánh giá số tính chất lý hóa protease từ nấm L lecanii 3.6 Thử nghiệm khả ức chế nấm bệnh hại trồng phức hệ chitinase/protease định hƣớng tạo chế phẩm diệt nấm bệnh Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU Đề tài tham khảo 156 tài liệu để tổng kết nội dung có liên quan, bao gồm: (1) nấm Lecanicillium lecanii, (2) Chitinase; (3) Protease; (4) Ứng dụng nấm L lecanii phức hệ chitinase/protease, (3) Một số nghiên cứu gen biểu gen mã hóa chitinase Chitinase nhóm enzyme thủy phân có khả phân cắt liên kết β-1,4-glycoside C1 C4 hai phân tử N-acetyl glucosamine liên tiếp phân tử chitin, chitobiose chitotriose Chitinase tổng hợp từ nhiều nguồn sinh vật khác tự nhiên thực vật, động vật vi sinh vật Trong đó, vi sinh vật xem nguồn cung cấp chitinase nhiều so với động vật thực vật Nấm Lecanicillium có khả kí sinh tự nhiên giết chết nhiều loại côn trùng rệp, ruồi trắng, cánh đều, cánh cứng, cánh thẳng, bướm Do vậy, việc tăng cường nghiên cứu phát triển chế phẩm sinh học diệt côn trùng từ nấm Lecanicillium cần thiết Dựa vào đặc tính thủy phân chitin, chitinase lựa chọn cho ứng dụng cụ thể thực tiễn như: ứng dụng y tế, nông nghiệp, bảo vệ môi trường cơng nghệ sinh học Gen mã hóa chitinase nghiên cứu nhiều đối tượng vi sinh vật nấm Lecanicillium, Beauveria, Trichoderma, Gen mã hóa chitinase từ số chủng nấm nhiều tác giả nghiên cứu biểu hệ thống biểu khác biểu vi khuẩn E coli, vi khuẩn Bacillus, nấm men thực vật Ở Việt Nam, hướng nghiên cứu chitinase chủ yếu tập chung vào trình tối ưu khả sinh chitinase số chủng vi sinh vật sử dụng chitinase để ức chế phát triển, nghiên cứu biểu gen chitinase thực vật giúp trồng có khả chống lại số nấm bệnh Chƣơng VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu hóa chất Chủng nấm L lecanii VTCC-F-1037 L lecanii 43H Phòng Các chất chức sinh học, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam cung cấp Vi khuẩn E coli DH5α sử dụng để nhân dòng gen tế bào nấm men P pastoris X33 dùng để biểu gen Vector pJET1.2/blunt (Fermentas) để nhân dòng pPICZαA (Invitrogen) dùng để biểu gen mchit1 Nấm F oxysporum R solani Phòng Vi sinh vật đất, Viện Cơng nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam cung cấp Các thiết bị sử dụng làm thí nghiệm mới, đại có độ xác cao thuộc Phòng Công nghệ Sinh học Enzyme, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên Hóa chất sử dụng thí nghiệm dạng tinh khiết 2.2 Phương pháp nghiên cứu Đề tài sử dụng nhóm phương pháp nghiên cứu như: (1) Phương pháp ni cấy; (2) Xác định hoạt tính chitinase/protease; (3) Tinh nghiên cứu ảnh hưởng số yếu tố lý hóa lên hoạt tính độ bền rmchit1 protease; (4) Phương pháp sinh học phân tử; (5) Phương pháp thử nghiệm khả ức chế nấm bệnh rmchit1/protease; (6) Phương pháp phân tích, xử lý số liệu 2.2.1 Nhóm phƣơng pháp ni cấy Hoạt hóa chủng nấm; ni cấy nấm thu sinh khối; nuôi cấy vi khuẩn E coli, nấm men P pastoris; nuôi tối ưu biểu sinh tổng hợp protease 2.2.2 Xác định hoạt tính chitinase/protease 2.2.3 Tinh nghiên cứu ảnh hƣởng yếu tố lý hóa lên hoạt tính độ bền rmchit1/protease 2.2.4 Phƣơng pháp sinh học phân tử 2.2.4.1 Nhóm phương pháp nhân dòng gen Tách chiết tinh DNA tổng số từ nấm DNA plasmid từ vi khuẩn → Nhân gen rmchit1 PCR → Nhân dòng gen xác định trình tự nucleotide: i) Tinh sản phẩm PCR, ii) Ghép nối đoạn gen vào vector nhân dòng pJET1.2, iii) Biến nạp plasmid tái tổ hợp vào vi khuẩn E coli DH5α; iv) Tách chiết plasmid, v) Cắt kiểm tra sản phẩm cắt, vi) Xác định phân tích trình tự nucleotide 2.2.4.2 Nhóm phương pháp biểu gen Thiết kế vector biểu pPICZαA mang gen rmchit1 Vector tái tổ hợp biến nạp xung điện vào nấm men P pastoris X33 hội nhập với genome điểm AOX1 2.2.5 Nhóm phƣơng pháp thử nghiệm khả ức chế nấm rmchit1/protease 2.2.6 Phƣơng pháp phân tích, xử lý số liệu Sử dụng phần mềm Microsoft Excel chương trình DNAStar Chƣơng KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Nhân dòng gene mã hóa endochitinase khơng mang tín hiệu peptide từ chủng nấm L lecanii Dựa trình tự nucleotide gen chit1 mã hóa endochitinase chứa peptide tín hiệu từ nấm L lecanii 43H (DQ412945), cặp mồi mChitF (5'-GCGAATTCATGC TGGCTACGCCAATC-3') mChitR (5'-GCTCTAGATCTTTCATGCCATTCTTGA-3') thiết kế để khuếch đại gene mchit1 khơng chứa peptide tín hiệu Sản phẩm PCR thu có kích thước khoảng 1,2 kb lớn so với gen chit1 (gen chứa peptide tín hiệu) (Hình 3.1A) Sản phẩm PCR sau gắn trực tiếp vào vector pJET1.2/blunt hình thành plasmid tái tổ hợp pJEmchit1 biến nạp vào vi khuẩn E coli DH5 Plasmid tái tổ hợp pJEmchit1 thu có kích thước lớn đối chứng (Hình 3.1B) Plasmid pJEmchit1 chọn lọc cắt kiểm tra enzyme EcoRI XbaI Sản phẩm cắt kiểm tra gel agarose 0,8% có băng DNA kích thước khoảng 3,0 kb tương ứng với vector pJET1.2/blunt băng lại có kích thước khoảng 1,2 kb tương ứng với đoạn gen mchit1 (Hình 3.1C) a c A B C Hình 3.1 Kết nhân dòng gen mchit1 khơng mang tín hiệu peptide Điện di sản phẩm PCR gene mchit1 (A), Plasmid tái tổ hợp pJEmchit1 (B) sản phẩm cắt PJEmchit1 enzyme EcoRI/XbaI (C) Giếng M: marker, Giếng 1: Sản phẩm PCR gene mchit1, Giếng 2: pJET1.2/blunt, Giếng 3: pJEmchit1, Giếng 4: pJEmchit1/EcoRI-XbaI Plasmid pJEmchit1 tách tinh kit QIAGEN để đọc trình tự nucleotide Đoạn gen mchit1 chủng nấm L lecanii 43H xác định trình tự có chiều dài 1209 nucleotide (bao gồm mã mở đầu kết thúc), thuộc họ glycosyl hydrolase 18 thủy phân liên kết glycoside Trình tự amino acid suy diễn dài 403 amino acid, khơng chứa peptide tín hiệu đầu N (phân tích signal peptide SignalP-3.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP)) Theo phân tích lý thuyết, protein có khối lượng phân tử khoảng 43 kDa, gồm 36 amino acid mang tính base mạnh, 41 amino acid có tính acid mạnh, 147 amino acid kị nước 126 amino acid phân cực (Hình 3.2) 3.2 Nghiên cứu tạo vector biểu gene mã hóa chitinase nấm men P pastoris X33 3.2.1 Thiết kế plasmid pPImchit1 biểu gen mchit1 nấm men Plasmid pJEmchit1 mang gen mchit1 vector pPICZαA cắt EcoRI XbaI Sau nối với T4 ligase tạo plasmid tái tổ hợp pPImchit1 Dịch lai biến nạp vào vi khuẩn E coli DH5α sốc nhiệt Plasmid pPImchit1 có kích thước lớn hơn, nên nằm cao so với pPICZαA (Hình 3.3A) Hình 3.2 Trình tự gene mchit1 trình tự amino acids suy diễn khơng mang peptide tín hiệu từ nấm L lecanii 43H Plasmid pPImchit1 tinh cắt enzyme EcoRI XbaI cho hai băng vector pPICZαA (~3,6 kb) gen mchit1 (1209 bp) (Hình 3.3 B) Plasmid pPImchit1 đọc trình tự để kiểm tra cấu trúc biểu trước biến nạp biểu nấm men P pastoris X33 Kết đọc trình tự cho thấy cấu trúc vector biểu khung đọc, DNA gen mchit1 chèn vào vị trí mong muốn, đủ điều kiện để đưa vào biểu nấm men P pastoris X33 Hình 3.3 Kết thiết kế vector biểu pPImchit1 Giếng 1: Plasmid pPICZαA, Giếng 2: Plasmid pPImchit1, Giếng 3: Plasmid pPImchit1 cắt enzyme EcoRI/XbaI, Giếng 4: Plasmid pPImchit1 cắt PmeI, Giếng M: Marker 1kb 3.2.2 Xây dựng hệ thống biểu P pastoris X33/pPImchit1 Để biểu gene mchit1, plasmid tái tổ hợp pPImchit1 cắt mở vòng PmeI thu băng có kích thước ~5,0 kb (ứng với kích thước vecor pPICZαA gene mchit1) (Hình 3.3C), sau biến nạp vào genome nấm men P pastoris X33 với mục đích tạo chủng tái tổ hợp biểu rmchit1 hiệu quả, bền ổn định đảm bảo cho nghiên cứu 3.3 Nghiên cứu chuyển cấu trúc gene mã hóa endochitinase khơng mang peptide tín hiệu vào nấm men P pastoris X33 3.3.1 Biểu gene mã hóa endochitinase khơng mang peptide tín hiệu vào nấm men P pastoris X33 Plasmid tái tổ hợp pPImchit1 sau cắt mở vòng PmeI biến nạp vào genome nấm men P pastoris X33 với mục đích tạo chủng tái tổ hợp Kết biến nạp nhận thấy, dòng nấm men tái tổ hợp nuôi môi trường YP bổ sung zeocin qua đêm, tách DNA, sau PCR với cặp mồi đặc hiệu mChitF/mChitR để kiểm tra hội nhập gene mchit1 vào genome nấm men Hình 3.4 cho thấy, sáu dòng nấm men (giếng 3-8) xuất băng với kích thước ~1.2 kb tương ứng với gene mchit1 vector pPImchit1 (giếng 2) Như vậy, kết luận dòng nấm men P pastoris X33 tái tổ hợp có chứa đoạn gen mchit1 Hình 3.4 Điện di sản phẩm kiểm tra hệ biểu rmchit1 P pastoris X33 Giếng 1: Marker, Giếng 2: DNA từ pPImchit1, Giếng 3-8: DNA từ dòng nấm men tái tổ hợp 3.3.2 Sàng lọc dòng nấm men P pastoris X33/pPIChit tái tổ hợp Sau biến nạp, 21 dòng tái tổ hợp ni xác định mức độ biểu rmchit1 Bảng 3.1 nhận thấy, 21 dòng có hoạt tính endochitinase Trong đó, dòng số có hoạt tính enzyme cao (2,048 U/ml) Dòng số sử dụng cho nghiên cứu Bảng 3.1 Hoạt tính rmchit1 dòng nấm men P pastoris X33 tái tổ hợp Dòng U/mL Dòng U/mL Dòng U/mL 0,950 ± 0,036 0,898 ± 0,006 1,717 ± 0,003 1,069 ± 0,050 1,107 ± 0,041 1,398 ± 0,012 10 11 12 13 14 0,585 ± 0,005 0,365 ± 0,080 1,095 ± 0,086 0,983 ± 0,003 0,261 ± 0,001 0,893 ± 0,006 1,473 ± 0,006 15 16 17 18 19 20 21 1,862 ± 0,041 1,179 ±0,050 1,412 ± 0,016 1,206 ± 0,007 1,076 ± 0,002 1,257 ± 0,024 0,575 ± 0,014 2,048 ± 0,013 3.4 Tinh đánh giá tính chất rmchit1 3.4.1 Tinh rmchit1 rmchit1 từ dòng nấm men P pastoris X33 số có hoạt tính 2,048 U/ml tiến hành tinh cột ProBondTM resin Kết tinh băng protein có kích thước khoảng 43 kDa điện di nhuộm AgNO3 0,1% (Hình 3.5A, giếng 3), với hoạt tính riêng 159,45 U/.mg protein, độ 16,93 lần hiệu suất thu hồi 45% (Bảng 3.2) Hoạt tính rmchit1 tổng số, dịch gắn cột, rmchit1 tinh dịch rửa định tính đĩa thạch có chứa 0,5% chất chitin Kết vòng phân giải màu trắng vàng (giếng 1; 3) vòng thủy phân chitin nhuộm thuốc nhuộm lugol (Hình 3.5B) Như vậy, chúng tơi tinh rmchit1 khơng chứa peptide tín hiệu từ L lecanii 43H thông qua cột ProBondTM resin A B Hình 3.5 Điện di SDS-PAGE rmchit1 tinh thơng qua cột ProBondTM resin (A) Định tính rmchit1 đĩa chất chitin nhuộm lugol (B) Giếng 1/vòng 1: rmchit1 tổng số, giếng 2/vòng 2: dịch gắn cột, giếng 3/vòng 3: rmchit1 tinh sạch, vòng 4: dịch rửa, vòng 5: nước, and giếng M: marker Bảng 3.2 Các bước tinh rmchit1 nấm men P pastoris X33 Mẫu rmchit1 tổng số Dịch gắn cột Dịch rửa rmchit1 tinh Hoạt tính tổng số (U/ml) 16,38 5,90 0,92 7,38 Protein tổng số (mg/ml) 1,74 0,71 0,25 0,05 Hoạt tính riêng (U/mg) 9,42 8,28 3,73 159,45 Độ 16,93 Hiệu suất thu hồi (%) 100 36 45 3.4.2 Đánh giá tính chất rmchit1 3.4.2.1 Xác định nhiệt độ độ bền nhiệt rmchit1 Nghiên cứu nhiệt độ tối ưu độ bền nhiệt rmchit1 có vai trò quan trọng q trình tinh sử dụng chế phẩm enzyme đạt hiệu cao rmchit1 từ nấm men P pastoris X33 hoạt động dải nhiệt độ rộng từ 20-65°C Hoạt tính rmchit1 tăng dần từ 64% (30,86 U/mg protein) 20°C đến tối đa 48,39 U/mg 45°C giảm dần xuống 31% (14,83 U/mg protein) 65°C (Hình 3.6A) Như vậy, nhiệt độ tối ưu cho rmchit1 hoạt động 45°C Trong nghiên cứu này, hoạt tính rmchit1 trì từ 100% đến 81% sau ủ 24 30°C Hoạt tính lại rmchit1 đạt 81% sau ủ giảm xuống 65% sau ủ 24 35°C Trong khi, hoạt tính rmchit1 giảm mạnh ủ 40°C sau 24 hoạt tính lại 50% (Hình 3.6B) Như vậy, rmchit1 bền dải nhiệt độ 30-35°C A B Hình 3.6 Nhiệt độ tối ưu (A) độ bền nhiệt (B) rmchit1 3.4.2.2 Xác định độ bền nhiệt độ bền pH rmchit1 Hoạt tính enzyme bị ảnh hưởng pH mơi trường Trong nghiên cứu này, hoạt tính rmchit1 khảo sát dải pH từ 3,5-8,0 Kết cho thấy, hoạt tính rmchit1 bị hoạt tính hồn tồn pH 3,5 hoạt tính tăng dần pH 4.0 (đạt 28%) đến tối đa pH 6,0 sau giảm xuống dải pH 6,5-8,0 (Hình 3.7A) Hoạt tính rmchit1 bền pH 6,0 trì 80% hoạt tính sau ủ 16 Trong khi, hoạt tính rmchit1 giảm mạnh pH 7,0 pH 8,0 sau ủ hoạt tính enzyme bị hoàn toàn sau 8-12 ủ Ở pH 5,0 hoạt tính rmchit1 giảm mạnh sau ủ (Hình 3.7B) Như vậy, rmchit1 bền pH 6,0 A B Hình 3.7 pH tối ưu (A) độ bền pH (B) rmchit1 3.4.2.3 Ảnh hưởng ion kim loại EDTA tới hoạt tính rmchit1 Các ion kim loại EDTA có ảnh hưởng tới hoạt tính enzyme Chúng hoạt động cầu nối enzyme chất, làm thay đổi giảm q trình oxy hóa giúp cho phân tử enzyme (protein) ổn định Mức độ ảnh hưởng ion kim loại EDTA nồng độ khác hoạt tính rmchit1 từ nấm men P pastoris X33 khác Bảng 3.3 cho thấy, Ion Co2+ làm tăng hoạt tính rmchit1 ba nồng độ khảo sát, hoạt tính cao nồng độ mM (hoạt tính tăng 11% so với đối chứng) Ion Cu2+ nồng độ 5-10 mM Fe2+ nồng độ mM làm tăng hoạt tính rmchit1 Các ion kim loại lại ba nồng độ khảo sát giảm hoạt tính enzyme so với mẫu đối chứng Đặc biệt, chất ức chế mạnh Ag+ nồng độ 10-15 mM (rmchit1 không hoạt động), Al3+ Hg2+ nồng độ 10 mM với hoạt tính enzyme giảm xuống 20% so với mẫu chứng enzyme bị hoạt tính nồng độ 15 mM Kết nghiên cứu cho thấy, ion nồng độ khác có ảnh hưởng tới hoạt tính enzyme khác Hầu hết ion nồng độ cao, hoạt tính enzyme bị giảm Bảng 3.3 Ảnh hưởng ion kim loại EDTA lên hoạt tính rmchit1 Hoạt tính lại (%)* Ion kim loại (mM) 10 15 K Zn2+ Ni2+ 95 ± 0,3 94 ± 3,1 94 ± 2,2 95 ± 0,3 94 ± 3,1 94 ± 2,2 95 ± 0,9 91 ± 2,5 82 ± 3,2 Ca2+ Ba2+ Mg2+ Mn2+ Fe2+ Cu2+ Co2+ Pb2+ Ag+ Al+ Hg2+ EDTA Đối chứng 94 ± 2,4 91 ± 1,1 74 ± 1,7 79 ± 1,0 105 ± 1,4 111 ± 0,4 111 ± 2,1 90 ± 1,2 21 ± 2,0 80 ± 1,7 84 ± 2,3 69 ± 0,6 94 ± 2,4 91 ± 1,1 65 ± 1,4 90 ± 1,8 96 ± 1,1 127 ± 0,9 107 ± 2,1 86 ± 0,4 0±0 20 ± 0,2 18 ± 1,3 65 ± 1,7 100 ± 3,9 90 ± 1,8 95 ± 2,6 48 ± 1,7 89 ± 1,8 89 ± 0,1 94 ± 1,0 107 ± 1,6 77 ± 0,4 0±0 0±0 0±0 54 ± 0,4 + Giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn * 3.4.2.4 Ảnh hưởng dung môi hữu tới hoạt tính rmchit1 Tất dung mơi hữu MeOH, IsOH, EtOH, Acet BuOH nồng độ khác ảnh hưởng đến hoạt tính rmchit1 Việc bổ sung dung môi hữu nồng độ 10-30% làm giảm hoạt tính enzyme so với đối chứng Tuy nhiên, dung môi MeOH Acet nồng độ 10% 20% làm tăng hoạt tính rmchit1 từ 2% đến 21% so với đối chứng (Hình 3.8A) A B Bảng 3.8 Ảnh hưởng dung môi hữu (A) chất tẩy rửa (B) lên hoạt tính rmchit1 MeOH: methanol, IsOH: isopropanol, EtOH: Ethanol, Acet: acetone, BuOH: butanol; TW80: Tween 80, TW20: Tween 20, TX100: Triton X-100, TX114: Triton X-114, SDS: sodium dodecyl sulfate, CT: Đối chứng 3.4.2.5 Ảnh hưởng chất tẩy rửa tới hoạt tính rmchit1 Một số chất tẩy rửa có hoạt động bề mặt Tween 20, Tween 80, Triton X100, Triton X114 hay SDS ảnh hưởng tới hoạt tính rmchit1 Chất tẩy rửa Tween 80 làm tăng hoạt tính rmchit1 nồng độ từ 0,5% đến 2,0%; hoạt tính tăng mạnh nồng độ 1,5% (tăng 23% so với đối 10 chứng) Tween 20 Triton X-114 tương ứng nồng độ 0,5-2,0% 0,5% không ảnh hưởng tới hoạt tính rmchit1 Triton X-114 nồng độ 1,0-2,0 %; Triton X-100 SDS nồng độ 0,5-2,0 % làm giảm hoạt tính enzyme so với đối chứng Đặc biệt, hoạt tính rmchit1 giảm mạnh sử dụng SDS, hoạt tính trì 14% so với đối chứng (Bảng 3.8B) 3.5 Nghiên cứu điều kiện sinh protease đánh giá tính chất lý hóa protease từ chủng nấm L lecanii VTCC-F-1037 3.5.1 Khảo sát điều kiện sinh protease từ nấm L lecnaii VTCC-F-1037 3.5.1.1 Nghiên cứu khả sinh protease Nấm L lecanii nuôi môi trường MT, sau 120 ni cấy nhiệt độ 30°C hoạt tính protease sinh đạt 2,2 U/ml Dịch enzyme định tính đĩa thạch có chứa chất casein 0,5%, kết hình 3.9 cho thấy, vòng phân giải casein xuất sau nhuộm Coomassie Brilliant Blue 250 Như vậy, nấm L lecanii nghiên cứu có khả sinh tổng hợp protease ngoại bào Hình 3.9 Hoạt tính protease từ nấm L lecanii VTCC-F-1037 đĩa thạch chứa chất casein 0,5% 3.5.1.2 Thời gian sinh protease Thời gian lên men yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến trình sinh tổng hợp enzyme nấm Nấm L lecanii VTCC-F-1037 bắt đầu sinh protease sau 48 ni (hoạt tính đạt 0,936 U/ml), hoạt tính tiếp tục tăng tăng thời gian lên men đạt cực đại sau 144 giờ, hoạt tính đạt 3,001 U/ml Khi thời gian tiếp tục tăng sinh tổng hợp enzyme lại giảm, hoạt tính 1,48 U/ml sau 240 (Hình 3.10A) A B Hình 3.10 Ảnh hưởng thời gian ni cấy (A) pH nuôi cấy (B) đến khả sinh protease từ nấm L lecanii VTCC-F-1037 3.5.1.3 pH môi trường nuôi cấy 11 Ở pH môi trường khảo sát, khả sinh protease từ nấm L lecanii VTCC-F-1037 tăng dần từ pH 4,0 (đạt 2,093 U/ml) đến cực đại pH 6,5 (đạt 3,863 U/ml) Hoạt tính protease giảm xuống 1,836 U/ml pH 9,0 (Hình 3.10B) 3.5.1.4 Ảnh hưởng nhiệt độ nuôi cấy Nhiệt độ nuôi cấy yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến khả sinh tổng hợp enzyme Mỗi chủng vi sinh vật có khoảng nhiệt độ thích hợp cho sinh trưởng sinh tổng hợp enzyme Nhiệt độ tăng hoạt lực enzyme tăng theo song đến mức nhiệt độ giới hạn hoạt lực enzyme lại giảm xuống Kết nghiên cứu hình 3.11A cho thấy, nấm L lecanii VTCC-F1037 nuôi cấy môi trường MT bổ sung 1,0% casein, ni lắc 200 vòng/phút, pH 6,5 cho khả sinh tổng hợp protease cao 30°C (hoạt tính đạt 4,451 U/ml) khảo sát nhiệt độ lên men từ 25-37°C A B Hình 3.11 Ảnh hưởng nhiệt độ nuôi cấy (A) nồng độ casein (B) đến khả sinh protease từ nấm L lecanii VTCC-F-1037 3.5.1.5 Ảnh hưởng nồng độ chất Cơ chất cảm ứng đóng vai trò chất cảm ứng cho trình sinh tổng hợp loại enzyme tương ứng Khi sử dụng chất casein vào môi trường nuôi cấy tác động mạnh đến sinh trưởng sinh tổng hợp protease nấm L lecanii VTCC-F-1037 Kết cho thấy, nồng độ casein 1,5% hoạt tính protease sinh cao nhất, hoạt tính đạt 4,491 U/ml, cao so với lượng casein ban đầu (0,5%) (Hình 3.11B) 3.5.1.6 Ảnh hưởng nguồn nitơ Mức độ ảnh hưởng nguồn nitơ khác khả sinh protease chủng nấm L lecanii VTCC-F-1037 khác Kết hình 3.6 cho thấy, nấm L lecanii VTCC-F-1037 nuôi cấy môi trường MT pH 6,5 30°C, bổ sung casein 1,5% làm nguồn chất cảm ứng hoạt tính protease sinh cao môi trường bổ sung bột đậu tương 0,5% làm nguồn nitơ, hoạt tính đạt 5,276 U/ml cao so với đối chứng (pepton) Tiếp theo cao thịt casein hoạt tính đạt 5,19 5,103 U/ml Hoạt tính thấp mơi trường có bổ sung nguồn nitơ urê, hoạt tính đạt 1,047 U/ml (Hình 3.12A) 3.5.1.7 Ảnh hưởng nguồn cacbon Nguồn cacbon biết đến nguồn lượng có ảnh hưởng tới hoạt tính sinh protease chủng L Lecanii VTCC-F-1037 Các nguồn cacbon khác khả sinh proteae khác Khi sử dụng bột ngô nguồn cacbon để nuôi cấy chủng L Lecanii VTCC-F-1037 hoạt tính protease sinh cao nhất, hoạt tính protease đạt 6,842 U/ml, cao nấm men (hoạt tính đạt 5,214 U/ml) cao so với môi trường bổ sung nguồn cacbon khác Trong mơi trường 12 có nguồn cacbon vỏ lạc, vỏ cà phê, trấu cámvà CMC hoạt tính protease sinh thấp, hoạt tính đạt 1,32-1,822 U/ml (Hình 3.12B) A B Hình 3.12 Ảnh hưởng nguồn nitơ (A) nguồn cacbon (B) đến khả sinh protease từ nấm L lecanii VTCC-F-1037 PT: pepton, BĐT: bột đậu tương, CS: casein, CT: cao thịt, UR: urea, Na: NaNO3, KN: KNO3, AS: (NH4)2SO4, AN: NH4NO3 Glu: glucose, CNM: cao nấm men, LN: lõi ngô, BM: bã mía, VL: vỏ lạc, VCP: vỏ cà phê, TC: trấu cám, CMC: cacboxyl methyl cellulose, VQ: vỏ quyết, TB: tinh bột, BS: bã sắn, BN: bột ngô 3.5.1.8 Môi trường thay Từ kết trên, chúng tơi lựa chọn mơi trường từ ngun liệu có sẵn tự nhiên cách giữ nguyên thành phần khống mơi trường MT, thay pepton bột đậu tương, thay cao nấm men bột ngô với nồng độ 0,5%; nồng độ casein 1,5% Khả sinh tổng hợp protease từ nấm L lecanii VTCC-F-1037 môi trường thay tăng 2,3 lần so với môi trường ban đầu Như vậy, sử dụng môi trường từ số nguyên liệu rẻ tiền có sẵn Việt Nam như: bột đậu tương, bột ngô để nuôi cấy chủng nấm L lecanii VTCC-F-1037 hoạt tính protease sinh cao so với môi trường ban đầu Điều có ý nghĩa quan trọng thực mục tiêu tạo lượng lớn protease qua góp phần làm giảm giá thành chế phẩm protease thị trường 3.5.2 Tinh đánh giá tính chất protease từ nấm L lecanii VTCC-F-1037 3.5.2.1 Tinh protease từ nấm L lecanii VTCC-F-1037 Protease tạo từ nấm L lecanii VTCC-F-1037 môi trường nuôi cấy 5,62 U/ml (34,33 U/mg protein) sau 144 nuôi cấy Enzyme tổng số rủa với muối ammonium sulfate 65%, sau thẩm tách loại muối cho qua cột Sephadex G100 Thông qua bước tủa muối ammonium sulfate, protease thu có hoạt tính riêng đạt 87,51 U/mg protein với độ 1,2 lần hiệu suất thu hồi đạt 81% Protease sau cho qua cột Sephadex G-100, hoạt tính enzyme tinh đạt 78,73 U/mg; độ đạt 2,3 lần hiệu suất thu hồi đạt 17% (Bảng 3.4) Protease tổng số phân đoạn tinh điện di SDS-PAGE thu băng protein với kích thước khoảng 40 kDa nhuộm với AgNO3 0,1% (Hình 3.13A, giếng 2-4) Bảng 3.4 Các bước tinh protease từ nấm L lecanii VTCC-F-1037 Mẫu Enzyme tổng số 65% (NH4)2SO4 Qua cột G100 Protein tổng số (mg) 9,95 6,62 0,75 Hoạt tính tổng số (U/ml) 342,1 276,4 59,0 Hoạt tính riêng (U/mg) 4,38 41,78 78,73 Độ 1,2 2,3 Hiệu suất thu hồi (%) 100 81 17 13 Hoạt tính protease tổng số phân đoạn qua cột định tính đĩa thạch có chứa chất casein 0,5% Kết nhận thấy, đĩa thạch xuất vòng phân giải màu trắng protease thủy phân casein nhuộm với Coomassie Brilliant Blue R-250 (Hình 3.13B) Như vậy, chúng tơi tinh protease từ nấm L lecanii VTCC-F-1037 B A Hình 3.13 Điện di SDS-PAGE protease từ nấm L lecanii VTCC-F-1037 thơng qua cột Sephadex G-100 (A) định tính protease đĩa chất casein nhuộm Coomassie Brilliant Blue R-250 (B) Giếng 1/vòng 1: enzyme tổng số; giếng/vòng 2-4: phân đoạn qua cột Sephadex G100; giếng 5: marker 3.5.2.2 Nhiệt độ pH tối ưu protease từ nấm L Lecanii VTCC-F-1037 Hoạt tính protease tăng dần từ 62% (44,24 U/mg) 30°C đến tối đa (71,53 U/mg) 40°C, giảm mạnh xuống 78% (55,56 U/mg) 50°C giảm xuống 64,5 U/mg (10%) 70°C Như vậy, nhiệt độ tối ưu cho protease từ nấm L lecanii VTCC-F-1037 hoạt động 40°C (Hình 3.14A) Hoạt tính enzyme protease xác định dải pH khác đệm khác Kết cho thấy, protease từ nấm L lecanii VTCC-F-1037 hoạt động dải pH rộng từ 4,0-8,0 Hoạt tính protease khơng thay đổi từ 20% (đạt 29,72 U/mg) pH 4,0 đến 48% (đạt 72,85 U/mg) pH 4,5; tăng lên 79% (đạt 118,86 U/mg) pH 5,5 đạt cực đại 100% (đạt 151,32 U/mg) pH 6,0; sau tăng đến 61% (đạt 92,41 U/mg pH 6,5) Đệm tốt cho protease hoạt động đệm phosphat pH tối đa cho enzyme hoạt động pH 6.0 với hoạt tính đạt 151,32 U/mg (Hình 3.14B) A B Hình 3.14 Nhiệt độ tối ưu (A) pH tối ưu (B) protease từ L lecanii VTCC-F-1037 3.5.2.3 Độ bền nhiệt độ bền pH protease từ nấm L lecanii VTCC-F-1037 Protease từ nấm L lecanii VTCC-F-1037 bền nhiệt độ 30°C sau ủ 10 hoạt tính enzyme trì 80% hoạt tính ban đầu Hoạt tính protease trì 80% 35 40°C sau ủ Hoạt 14 tính protease giảm đáng kể sau 10 ủ giảm mạnh sau 12 ủ (Hình 3.15A) Enzyme bền pH 6,0 sau ủ trì 80% hoạt tính so với ban đầu Ở pH thấp (5,0) cao pH (7,0) hoạt tính protease giảm đáng kể khoảng thời gian ủ từ 4-12 giờ, hoạt tính trì khoảng 36% so với đối chứng (Hình 3.15B) A B Hình 3.15 Độ bền nhiệt (A) độ bền pH (B) protease từ nấm L lecanii VTCC-F-1037 Mục đích nghiên cứu xác định nhiệt độ, pH tối ưu, độ bền nhiệt độ bền pH cho protease sử dụng trình tạo chế phẩm sinh học Từ kết cơng bố, chúng tơi xác nhận protease từ nấm L lecanii VTCC-F-037 bền bới nhiệt dự trữ nhiệt độ phòng thuận lợi q trình nghiên cứu enzyme; đặc biệt nghiên cứu tạo chế phẩm sinh học 3.6 Thử nghiệm khả ức chế nấm bệnh hại trồng phức hệ chitinase/protease định hướng tạo chế phẩm diệt nấm bệnh Phức hệ chitinase/protease có khả ức chế phát triển nấm bệnh F oxysporum R solani Đường kính vòng ức chế chủng nấm 5,4 4,4 mm, giếng đối chứng (bổ sung nước) không xuất vòng ức chế (Hình 3.16) A B Hình 3.16 Ức chế phát triển nấm bệnh F oxysporum (A) R solani (B) phức hệ protease/rmchit1 Giếng 1: nước, giếng 2-5: phức hệ protease/rmchit1 Quan sát kính hiển vi độ phóng đại 160 lần cho thấy, ức chế trình phát triển sợi nấm chitinase kèm với thủy phân sợi nấm giải phóng tế bào riêng lẻ, sợi nấm xử lý với nước trì hình dạng (Hình 3.17) Lượng đường N-acetyl glucosamine giải phóng xử lý nấm F oxysporum R solani với chitinase/protease xác định 11,07 9,18 μg/ml 15 A C A C B B D B D Hình 3.17 Sợi nấm R solani (A, B) F oxysporum (C, D) xử lý với nước (A, C) với C phức hệ protease/rmchit1 (B, D) KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN - Gen mã hóa endochitinase khơng mang tín hiệu peptide (mchit1) phân lập từ nấm L lecanii 43H nhân dòng vector pJET1.2 blunt - Vector biểu pPIMChit1 mang gen mchit1 thiết kế biểu nấm men P pastoris X33 với suất biểu 2,048 U/ml - rmchit1 tinh thơng qua cột ProBondTM resin có kích thước 43 kDa, hoạt tính riêng đạt 159,45 U/mg protein, độ 16,93 lần hiệu suất thu hồi đạt 45% - Nhiệt độ pH tối ưu cho rmchit1 hoạt động 45°C pH 6,0; rmchit1 bền dải nhiệt độ từ 30-35°C pH 6.0 sau16 ủ Các dung môi hữu cơ; chất tẩy rửa; ion kim loại EDTA có ảnh hưởng đến hoạt tính rmchit1 - Điều kiện tối ưu sinh tổng hợp protease từ chủng nấm L lecanii VTCC-F-1037 tối ưu Protease tinh thông qua tủa muối ammonium sulfate qua cột sắc ký lọc gel Sephadex G100 có kích thước 40 kDa, hoạt tính riêng đạt 78,73 U/mg protein, độ đạt 2,3 lần, hiệu suất thu hồi đạt 17% Protease tinh có nhiệt độ tối ưu 40°C pH tối ưu 6,0 - Bước đầu xác định khả thủy phân sợi nấm F oxysporum R solani phức hệ chitinase/protease KIẾN NGHỊ Tiếp tục nghiên cứu sâu chế thủy phân sợi nấm việc tạo chế phẩm sinh học có chứa phức hệ enzyme protease/rmchit1 để thử nghiệm điều kiện in vivo in vitro ... phát từ sở trên, tiến hành lựa chọn đề tài Nghiên cứu biểu gene định hƣớng tạo chế phẩm sinh học chứa chitinase protease từ Lecanicillium lecanii diệt nấm bệnh hại trồng Mục tiêu nghiên cứu Biểu. .. nghiên cứu tạo chế phẩm sinh học 3.6 Thử nghiệm khả ức chế nấm bệnh hại trồng phức hệ chitinase/ protease định hướng tạo chế phẩm diệt nấm bệnh Phức hệ chitinase/ protease có khả ức chế phát triển nấm. .. THƠNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Thông tin chung: Tên đề tài: Nghiên cứu biểu gene định hướng tạo chế phẩm sinh học chứa chitinase protease từ Lecanicillium lecanii diệt nấm bệnh hại trồng Mã số: ĐH2016-TN04-01