Nghiên cứu biểu hiện gene và định hướng tạo chế phẩm sinh học chứa chitinase và protease từ Lecanicillium lecanii diệt nấm bệnh hại cây trồng (NCKH)

Nghiên cứu biểu hiện gene và định hướng tạo chế phẩm sinh học chứa chitinase và protease từ Lecanicillium lecanii diệt nấm bệnh hại cây trồng (NCKH)Nghiên cứu biểu hiện gene và định hướng tạo chế phẩm sinh học chứa chitinase và protease từ Lecanicillium lecanii diệt nấm bệnh hại cây trồng (NCKH)Nghiên cứu biểu hiện gene và định hướng tạo chế phẩm sinh học chứa chitinase và protease từ Lecanicillium lecanii diệt nấm bệnh hại cây trồng (NCKH)Nghiên cứu biểu hiện gene và định hướng tạo chế phẩm sinh học chứa chitinase và protease từ Lecanicillium lecanii diệt nấm bệnh hại cây trồng (NCKH)Nghiên cứu biểu hiện gene và định hướng tạo chế phẩm sinh học chứa chitinase và protease từ Lecanicillium lecanii diệt nấm bệnh hại cây trồng (NCKH)Nghiên cứu biểu hiện gene và định hướng tạo chế phẩm sinh học chứa chitinase và protease từ Lecanicillium lecanii diệt nấm bệnh hại cây trồng (NCKH)Nghiên cứu biểu hiện gene và định hướng tạo chế phẩm sinh học chứa chitinase và protease từ Lecanicillium lecanii diệt nấm bệnh hại cây trồng (NCKH)

ÐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ÐẠI HỌC SƢ PHẠM BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP ĐẠI HỌC NĂM 2016 NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN GENE VÀ ĐỊNH HƢỚNG TẠO CHẾ PHẨM SINH HỌC CHỨA CHITINASE VÀ PROTEASE TỪ LECANICILLIUM LECANII DIỆT NẤM BỆNH HẠI CÂY TRỒNG Mã số: ĐH2016-TN04-01 Chủ nhiệm đề tài: TS NGUYỄN HỮU QUÂN Thái Nguyên, năm 2018 i ÐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ÐẠI HỌC SƢ PHẠM BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP ĐẠI HỌC NĂM 2016 NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN GENE VÀ ĐỊNH HƢỚNG TẠO CHẾ PHẨM SINH HỌC CHỨA CHITINASE VÀ PROTEASE TỪ LECANICILLIUM LECANII DIỆT NẤM BỆNH HẠI CÂY TRỒNG Mã số: ĐH2016-TN04-01 Xác nhận tổ chức chủ trì Chủ nhiệm đề tài TS Nguyễn Hữu Quân Thái Nguyên, năm 2018 ii DANH SÁCH CÁC THÀNH VIÊN THAM GIA ÐỀ TÀI TT Họ tên TS Nguyễn Hữu Quân TS Hoàng Phú Hiệp CN Nguyễn Thị Hồng Chuyên Đơn vị Nhiệm vụ Trường Đại học Sư phạm Đại học Thái Nguyên Trường Đại học Sư phạm Đại học Thái Nguyên Trường Đại học Sư phạm Đại học Thái Nguyên Chủ nhiệm Thành viên Thành viên ĐƠN VỊ PHỐI HỢP CHÍNH Tên đơn vị ngồi nƣớc Nội dung phối Họ tên ngƣời hợp nghiên cứu đại diện đơn vị Khoa Sinh học, Trường Đại học Phân Sư phạm - Đại học Thái Ngun tích hóa PGS.TS Nguyễn Thị Tâm sinh, Phân tích sinh học phân tử iii MỤC LỤC DANH MỤC CÁC BẢNG v DANH MỤC CÁC HÌNH vi DANH MỤC TỪ VIÊT TẮT viii THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ix MỞ ĐẦU Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Nấm Lecanicillium lecanii 1.2 Chitinase 1.2.2 Phân loại chitinase 1.2.3 Cấu trúc trung tâm hoạt động chitinase 1.2.4 Cơ chế phản ứng chitinase 1.3 Protease 10 1.3.1 Nguồn gốc phân loại protease 11 1.3.2 Cấu trúc 13 1.3.3 Cơ chế xúc tác protease 14 1.3.4 Ảnh hưởng môi trường lên khả sinh protease 14 1.4 Ứng dụng nấm L lecanii phức hệ chitinase/protease 15 1.5 Một số nghiên cứu gen biểu gen mã hóa chitinase 17 1.5.1 Trên giới 17 1.5.2 Ở Việt Nam 21 1.5.3 Vai trò tín hiệu peptide 23 2.1 Vật liệu hóa chất 25 2.1.1 Chủng giống 25 2.1.2 Thiết bị 25 2.1.3 Hóa chất 25 2.1.4 Dung dịch đệm 25 2.1.5 Môi trường nuôi cấy 26 2.2 Phương pháp nghiên cứu 26 2.2.1 Phương pháp nuôi cấy 26 2.2.2 Phương pháp hóa sinh 28 2.2.3 Tinh enzyme 31 2.2.4 Nghiên cứu ảnh hưởng số yếu tố lý hóa lên hoạt tính độ bền iv protease tự nhiên rmchit1 33 2.2.5 Các phương pháp sinh học phân tử 34 2.2.6 Phương pháp thử nghiệm 36 2.2.7 Xử lý số liệu 36 Chƣơng KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 37 3.1 Nhân dòng gene mã hóa endochitinase khơng mang tín hiệu peptide từ chủng nấm L lecanii 37 3.2 Nghiên cứu tạo vector biểu gene mã hóa chitinase nấm men P pastoris X33 38 3.2.1 Thiết kế plasmid pPImchit1 biểu gen mchit1 nấm men 38 3.2.2 Xây dựng hệ thống biểu P pastoris X33/pPImchit1 39 3.3 Nghiên cứu chuyển cấu trúc gene mã hóa endochitinase khơng mang peptide tín hiệu vào nấm men P pastoris X33 39 3.3.1 Biểu gene mã hóa endochitinase khơng mang peptide tín hiệu vào nấm men P pastoris X33 39 3.3.2 Sàng lọc dòng nấm men P pastoris X33/pPIChit tái tổ hợp 40 3.4 Tinh đánh giá tính chất rmchit1 41 3.4.1 Tinh rmchit1 41 3.4.2 Đánh giá tính chất rmchit1 43 3.5 Nghiên cứu điều kiện sinh protease đánh giá tính chất lý hóa protease từ chủng nấm L lecanii VTCC-F-1037 47 3.5.1 Khảo sát điều kiện sinh protease từ nấm L lecnaii VTCC-F-1037 47 3.5.2 Tinh đánh giá tính chất protease từ nấm L lecanii VTCC-F-1037 52 3.6 Thử nghiệm khả ức chế nấm bệnh hại trồng phức hệ protease/rmchit1 định hướng tạo chế phẩm diệt nấm bệnh 56 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 59 KẾT LUẬN 59 KIẾN NGHỊ 59 TÀI LIỆU THAM KHẢO 60 v DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1 Thành phần môi trường nuôi cấy 26 Bảng 2.2 Các điều kiện nuôi nấm L lecanii VTCC-F-1037 sinh tổng hợp protease 27 Bảng 2.3 Thành phần gel cô gel tách 32 Bảng 3.1 Hoạt tính rmchit1 dòng nấm men P pastoris X33 tái tổ hợp 40 Bảng 3.2 Các bước tinh rmchit1 nấm men P pastoris X33 42 Bảng 3.3 Ảnh hưởng ion kim loại EDTA lên hoạt tính rmchit1 45 Bảng 3.4 Các bước tinh protease từ nấm L lecanii VTCC-F-1037 52 vi DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Cấu trúc bậc chitinase từ nấm C immitis [32] Hình 1.2 Cơ chế xúc tác chitinase B từ vi khuẩn S mecescens [99] Hình 1.3 Cơ chế thủy phân β-chitin chitinase A từ vi khuẩn B circulans [106] Hình 2.1 Đường chuẩn nồng độ N-acetyl glucosamine theo phương pháp Miller 29 Hình 2.2 Đường chuẩn nồng độ tyrosine 30 Hình 2.3 Các bước tinh protease 31 Hình 2.4 Đường chuẩn hàm lượng albumin huyết bò theo Bradford 33 Hình 3.1 Kết nhân dòng gen mchit1 khơng mang tín hiệu peptide 37 Hình 3.2 Trình tự gene mchit1 trình tự protein suy diễn khơng mang peptide tín hiệu từ nấm L lecanii 43H 38 Hình 3.3 Kết thiết kế vector biểu pPImchit1 39 Hình 3.4 Điện di sản phẩm kiểm tra hệ biểu rmchit1 P pastoris X33 40 Hình 3.5 Điện di SDS-PAGE rmchit1 tinh thơng qua cột ProBondTM resin (A) Định tính rmchit1 đĩa chất chitin nhuộm lugol (B) 41 Hình 3.6 Nhiệt độ tối ưu (A) độ bền nhiệt (B) rmchit1 43 Hình 3.7 pH tối ưu (A) độ bền pH (B) rmchit1 44 Bảng 3.8 Ảnh hưởng dung môi hữu (A) chất tẩy rửa (B) lên hoạt tính rmchit1 46 Hình 3.9 Hoạt tính protease từ nấm L lecanii VTCC-F-1037 đĩa thạch chứa chất casein 0,5% 48 Hình 3.10 Ảnh hưởng thời gian ni cấy (A) pH nuôi cấy (B) đến khả sinh protease từ nấm L lecanii VTCC-F-1037 48 Hình 3.11 Ảnh hưởng nhiệt độ nuôi cấy (A) nồng độ casein (B) đến khả sinh protease từ nấm L lecanii VTCC-F-1037 48 Hình 3.12 Ảnh hưởng nguồn nitơ (A) nguồn cacbon (B) đến khả sinh protease từ nấm L lecanii VTCC-F-1037 51 Hình 3.13 Điện di SDS-PAGE protease từ nấm L lecanii VTCC-F-1037 thơng qua cột Sephadex G-100 (A) định tính protease đĩa chất casein nhuộm Coomassie Brilliant Blue R-250 (B) 53 vii Hình 3.14 Nhiệt độ tối ưu (A) pH tối ưu (B) protease từ L lecanii VTCC-F-1037 55 Hình 3.15 Độ bền nhiệt (A) độ bền pH (B) protease từ nấm L lecanii VTCC-F-1037 56 Hình 3.16 Ức chế phát triển nấm F oxysporum (A) R solani (B) phức hệ chitinase/protease Giếng 1: nước, giếng 2-5: phức hệ protease/rmchit1 57 Hình 3.17 Sợi nấm R solani (A, B) F oxysporum (C, D) xử lý với nước (A, C) với phức hệ chitinase/protease (B, D) 57 viii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Tiếng Anh Tiếng Việt BLAST bp Basic local alignment search tool Base pair Phần mềm so sánh trình tự Cặp bazơ Chit DNA dNTPs Gene encoding chitinase Deoxyribonucleic acid Gen mã hóa chitinase Acid deoxyribonucleic Các nucleotide 2-Deoxynucleoside 5triphosphate ĐC Control Đối chứng IPTG Isopropyl-beta-D- Isopropyl-beta-D- EDTA thiogalactopyranoside Ethylenediamine tetraacetic acid thiogalactopyranoside Axit ethylenediamine tetraacetic EtBr kb kDa M Ethidium bromide Kilo base Kilo Dalton Marker Ethidium bromide Kilo base Kilo Dalton Thang chuẩn OD Optical density Mật độ quang PCR Polymerase chain reaction Phản ứng khuếch đại gen RNA Ribonucleic acid Axit ribonucleic Ribonuclease Enzyme thủy phân RNA Chitinase tái tổ hợp Điện di protein RNase rchit1 SDSPAGE TBE TE TEMED v/v w/v Sodium dodecyl sulfate Polyacrylamide gel electrophoresis Tris boric acid EDTA Tris EDTA Tris boric acid EDTA Tris EDTA N,N,N,N- N,N,N,N- Tetramethylethylenediamine Tetramethylethylenediamine Volume/volume Weight/volume Thể tích/thể tích Khối lượng/thể tích ix THƠNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Thông tin chung: Tên đề tài: Nghiên cứu biểu gene định hướng tạo chế phẩm sinh học chứa chitinase protease từ Lecanicillium lecanii diệt nấm bệnh hại trồng Mã số: ĐH2016-TN04-01 Chủ nhiệm đề tài: TS Nguyễn Hữu Quân Tổ chức chủ trì: Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên Thời gian thực hiện: Từ tháng 06/2016 đến tháng 6/2018 Mục tiêu - Biểu gene mã hóa chitinase từ nấm L lecanii nấm men Pichia pastoris X33 - Nghiên cứu đặc tính vai trò phức hệ chitinase/protease q trình diệt nấm bệnh hại trồng nhằm định hướng tạo chế phẩm sinh học Tính sáng tạo: - Đề tài cơng trình chứng minh vai trò tín hiệu peptide liên quan tới: (1) suất biểu rmchit1 từ nấm L lecanii 43H nấm men P pastoris X33, (2) phương pháp tinh rmchit1, (3) yếu tố ảnh hưởng tới tính chất lý hóa rmchit1 - Đề tài bước đầu tinh protease từ nấm L lecanii VTCC-F-1037 xác định nhiệt độ, pH tối ưu, độ bền nhiệt độ bền pH protease - Đề tài bước đầu chứng minh phức hợp chitinase/protease có vai trò q trình thủy phân nấm F oxysporum R solani Kết nghiên cứu: - Đã phân lập gen mã hóa endochitinase khơng mang peptide tín hiệu (mchit1) từ nấm L lecanii 43H nhân dòng vector pJET1.2 blunt - Đã thiết kế vector biểu pPImchit1 mang gen mchit1 vector pPICZαA biểu nấm men P pastoris X33 với suất biểu 2,048 U/ml - Đã tinh endochitinase tái tổ hợp khơng mang peptide tín hiệu (rmchit1) thơng qua cột ProBondTM resin có kích thước 43 kDa, hoạt tính riêng đạt 159,45 U/mg protein, độ 16,93 lần hiệu suất thu hồi đạt 45% thi6ndichtrongviQcphdngch6ngs6uh4ic6ytr6ngitang,du phAm sinh hgc tt nAm doi dE dugc st phAn Tuy nhi6n, viQc sri dUng bien phrip dpng aC aiet tru c6c lopi sdu, nhQn, b9 tri vi bg crinh vi n6m AOi khring ti€u diet c6c lodi nAm Uenn la v6n dA dang cdn mcvi md n6ng nghiQp Cung voi sg ph6t triiSn kinh tti - xE hQi, nguoi ngdy cang c6 nhu cAu sri dgng cric sAn phAm rau qui s4ch, h4n ch6 mric th6p nh6t vigc sri dgng thu6c tru sdu h6a hgc dtng san xu6t rau, cri qui C6c lodi thi6n itich nhu n6m gdy h4i cdy tr6ng dd dugc sri dpng, chirng c6 ning ph6t tdn ti rit nhanh vi sinh cdn trung chi diQt c6c lodi cdn trung c6 h4i md kh6ng anh huong toi ngu6n nu6c, m6i truong sinh th6i vd sric kh6e ngudi, vdt nu6i Ndm t