THỬ NGHIỆM MÔI TRƯỜNG NHÂN SINH KHỐI VI KHUẨN Bacillus spp. VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG PHÒNG TRỊ BỆNH TRÊN MỘT SỐ CÂY RAU

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP THỬ NGHIỆM MÔI TRƯỜNG NHÂN SINH KHỐI VI KHUẨN Bacillus spp. VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG PHÒNG TRỊ BỆNH TRÊN MỘT SỐ CÂY RAU Họ Và Tên Sinh Viên: HUỲNH TIẾN ĐÔNG Ngành: NÔNG HỌC Niên Khóa: 2003 2007 Tháng 102007 i THỬ NGHIỆM MÔI TRƯỜNG NHÂN SINH KHỐI VI KHUẨN Bacillus spp. VÀ THỬ NGHIỆM KHẢ NĂNG PHÒNG TRỊ BỆNH TRÊN MỘT SỐ CÂY RAU Tác giả HUỲNH TIẾN ĐÔNG Khóa luận được đệ trình để đáp ứng yêu cầu cấp bằng kỹ sư nông nghiệp ngành Nông Học Giáo viên hướng dẫn TS. LÊ ĐÌNH ĐÔN KS. PHẠM THỊ MINH KIỀU Tháng 10 năm 2007 ii LỜI CẢM TẠ Thành kính ghi công ơn sinh thành, dưỡng dục của ba mẹ. Các anh chị, cùng những người thân trong gia đình đã động viên tinh thần, hỗ trợ và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho con trong học tập. Chân thành cảm ơn:  Ban giám hiệu trường Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm khoa Nông Học đã quan tâm giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập tại trường.  Quý thầy cô khoa Nông Học đã tận tình dạy bảo những kiến thức quý báu trong suốt quá trình học tập.  Cô Phạm Thị Minh Kiều, và các cán bộ công tác tại phòng thực tập Bộ môn Bảo vệ Thực vật đã tận tình hướng dẫn, truyền đạt cho tôi những kiến thức trong thời gian thực tập đề tài tại Bộ môn Bảo vệ Thực vật.  Các anh chị trong khoa Nông Học cùng tập thể lớp Nông Học 29 đã luôn giúp đỡ và động viên tôi trong thời gian học tập và thực hiện đề tài. Tôi xin gởi lời tri ân sâu sắc đến TS Lê Đình Đôn, người đã tận tình hướng dẫn và cho tôi những lời khuyên quý báu giúp tôi hoàn thành luận văn này. Tp. HCM, tháng 10 năm 2007 Sinh viên thực hiện Huỳnh Tiến Đông iii TÓM TẮT Đề tài nghiên cứu “ Thử nghiệm môi trường nhân sinh khối vi khuẩn Bacillus spp. và đánh giá khả năng phòng trị bệnh trên một số cây rau” đã được tiến hành tại Trường Đại học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh và Huyện Củ Chi, thời gian từ tháng 4 đến tháng 10 năm 2007. Đề tài gồm 3 phần: thử nghiệm môi trường nhân sinh khối Bacillus spp. Rd2.11, đánh giá khả năng phòng trị bệnh lỡ cổ rễ do Rhizoctonia solani gây ra của chế phẩm trên cây dưa leo và đậu cove trong điều kiện nhà lưới, đánh giá khả năng phòng trị bệnh lỡ cổ rễ của chế phẩm trên cải ngọt. Sau khi thử nghiệm các môi trường khác nhau đã xác định được môi trường S là môi trường gồm các thành phần: 2% bột đậu nành, 0,05% KH2PO4, 0,3% mật rỉ là môi trường nhân sinh khối vi khuẩn Bacillus spp. Rd2.11 đạt mật số cao nhất (2,05×109 cfuml)và có giá thành rẻ nhất (544 đồnglít dung dịch môi trường). Xác định được thời gian lên men là 96 giờ tỉ lệ bào tử môi trường S đạt cao nhất là 89,2% Thí nghiệm phòng trừ bệnh cây trong điều kiện nhà lưới được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, đã tìm ra được cách sử dụng chế phẩm hiệu quả nhất: xử lí đất gieo ươm đạt mật số 106 cfugam đất (1g chế phẩmkg đất) trước khi gieo hạt giống; xử lí đất trồng bằng dung dịch chế phẩm có mật số 107cfuml (10g chế phẩmlít nước) phun ướt đẫm vào chậu trước khi trồng; phun định kỳ lên lá và vào chậu 7 ngàylần bằng cách : pha loãng chế phẩm đạt mật số 107cfuml. Chế phẩm cho thấy có hiệu quả trong việc phòng trừ bệnh lỡ cổ rễ do Rhizoctonia solani gây ra trên dưa leo và đậu cove. Trên dưa leo tỉ lệ bệnh của nghiệm thức chủng bệnh và có cách xử lý như trên là 50% so với đối chứng không xử lý chế phẩm, chủng bệnh là 85%. Trên đậu cove tỉ lệ là 45 % so với đối chứng là 85%. Đối với thí nghiệm trên cải ngọt, thí nghiệm được bố trí theo kiểu khối đầy đủ ngẫu nhiên, chế phẩm Bacillus spp. Rd2.11 được sử dụng có hiệu quả hơn đối với chế phẩm Citrex và với đối chứng trong việc phòng trừ bệnh lỡ cổ rễ do Rhizoctonia solani gây ra trên cải ngọt. Ở thời điểm 15 ngày sau gieo, nghiệm thức xử lý đất và phun bằng chế phẩm vi khuẩn Bacillus spp. Rd2.11 có tỷ lệ chết cây con là 28,2% thấp hơn so với nghiệm thức đối chứng không xử lý chế phẩm (44,5 %) và nghiệm thức xử lý đất và phun bằng chế phẩm kích kháng sinh học Citrex (32,7%). Ở thời điểm 20 ngày iv sau trồng, tỉ lệ bệnh trên lá của nghiệm thức xử lý Bacillus spp. Rd2.11 là 5,57 % thấp hơn so với nghiệm thức xử lý bằng chế phẩm kích kháng sinh học Citrex (7,73%) và nghiệm thức đối chứng (10,2%). Bên cạnh đó, chiều cao và năng suất đạt được ở nghiệm thức xử lý Bacillus spp. Rd2.11 cao hơn khi so với các nghiệm thức khác. Ở thời điểm 20 ngày sau trồng chiều cao cải nghiệm thức xử lý bằng chế phẩm Bacillus spp. Rd2.11(22,6 cm) rất khác biệt so với nghiệm thức xử lý bằng chế phẩm Citrex (19,61 cm) và với đối chứng (18,21 cm). Ở thời điểm 25 ngày sau trồng năng suất cải ngọt nghiệm thức xử lý Bacillus spp. (1,667 kgm2) cao hơn và có khác biệt so với nghiệm thức xử lý Citrex (1,383 kgm2) và nghiệm thức đối chứng (1,22 kgm2) Đề tài bước đầu đã xây dựng được các quá trình chọn lọc, nhân sinh khối vi khuẩn và cách sử dụng chế phẩm đạt hiệu quả, giúp cho việc ứng dụng chế phẩm sinh học này trong công tác bảo vệ thực vật được dễ dàng và thiết thực hơn. v MỤC LỤC Trang Trang tựa i Cảm tạ ii Tóm tắt iii Mục lục v Danh sách các chữ viết tắt vii Danh sách các hình và đồ thị viii Danh sách các bảng ix CHƯƠNG 1. GIỚI THIỆU 1.1. Đặt vấn đề 1 1.2. Mục đích và yêu cầu 2 1.2.1 Mục đích 2 1.2.2 Yêu cầu 2 CHƯƠNG 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Biện pháp phòng trừ sinh học trong phòng trừ bệnh hại cây trồng 3 2.2 Các đặc tính của vi khuẩn Bacillus 3 2.2.1 Đặc điểm hình thái và phát triển của vi khuẩn Bacillus spp. 3 2.2.1.1 Sự phân bố của vi khuẩn Bacillus spp. 3 2.2.1.2 Phân loại vi khuẩn Bacillus spp. 4 2.2.1.3 Đặc điểm phát triển của Bacillus spp. 4 2.2.1.4 Ảnh hưởng của điều kiện môi trường lên sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn 5 2.2.2 Cơ chế kháng của vi khuẩn Bacillus spp. với nấm gây hại 6 2.3 Bệnh lở cổ rễ, chết rạp cây con do nấm Rhizoctonia solani 6 2.4 Các phương pháp lên men tạo chế phẩm sinh học 7 2.4.1.Phương pháp lên men chìm 7 2.4.2 Phương pháp lên men bề mặt không vô trùng tạo chế phẩm nấm 8 2.4.3 Phương pháp lên men hai giai đoạn tạo chế phẩm nấm 9 2.4.4 Phương pháp lên men xốp 9 vi 2.4.5 Phương pháp nhân sinh khối vi khuẩn Bacillus spp. 2.4.5.1 Nhân sinh khối vi khuẩn bằng phương pháp lên men chìm 10 2.4.5.2 Tạo và bảo quản chế phẩm dạng bột 10 2.5 Tình hình nghiên cứu, sản xuất và thương mại hóa các sản phẩm có nguồn gốc từ vi khuẩn Bacillus spp. 11 2.5.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 11 2.5.2 Những nghiên cứu trong nước 12 2.5.3 Tình hình sản xuất và thương mại hóa chế phẩm trên thế giới 12 CHƯƠNG 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 14 3.2 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 14 3.2.1 Vật liệu nghiên cứu 14 3.2.2 Phương pháp nghiên cứu 15 3.2.2.1 Thử nghiệm môi trường nhân sinh khối vi khuẩn 15 3.2.2.2 Đánh giá tác động của chế phẩm Bacillus spp. đối với bệnh do Rhizoctonia solani trên cây dưa leo và đậu cove ở giai đoạn cây con 17 3.2.2.3 Đánh giá tác động của chế phẩm Bacillus spp. đối với bệnh do Rhizoctonia solani trên cây cải ngọt 18 CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Thử nghiệm môi trường nhân sinh khối vi khuẩn Bacillus spp. 21 4.2 Đánh giá khả năng phòng trừ bệnh chết cây con đối với cây dưa leo và đậu cove. 27 4.2.1 Đánh giá khả năng phòng trừ bệnh chết cây con đối với cây dưa leo 27 4.2.2 Đánh giá khả năng phòng trừ bệnh chết cây con đối với đậu cove 29 4.3 Sử dụng chế phẩm Bacillus spp. phòng trừ bệnh cho cải ngọt 31 CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận 35 5.2. Đề nghị 35 TÀI LIỆU THAM KHẢO 36 PHỤ LỤC 38 vii DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT NST: Ngày sau trồng NT: Nghiệm thức ĐC: Đối chứng CFU: Colony Forming Units: đơn vị hình thành khuẩn lạc NSG: Ngày sau gieo MT: Môi trường viii DANH SÁCH CÁC HÌNH ẢNH VÀ ĐỒ THỊ Trang Hình 3.1 Chu kỳ phát triển của nhóm vi khuẩn hình thành bào tử 5 Hình 4.1 Các môi trường nhân sinh khối Baccilus spp Rd 2.11. 22 Hình 4.2 Hình thái vi khuẩn Baccilus spp Rd 2.11 sau các thời điểm lên men 24 Hinh 4.3 Chế phẩm Bacillus spp.Rd 2.11 dạng bột 26 Hình 4.4 Khảo sát tính độc chế phẩm Bacillus spp. Rd2.11 trên hạt cà chua 26 Hình 4.5 Khả năng đối kháng của chế phẩm Bacillus spp. Rd2.11 đối với Rhizoctonia 26 Hình 4.6 Khả năng đối kháng của chế phẩm Bacillus spp. Rd2.11 đối với Ralstonia 26 Hình 4.7 Các cấp bệnh lỡ cổ rễ do nấm Rhizoctonia solani trên dưa leo và đậu cove 30 Hình 4.8 Tỉ lệ cây dưa leo chết ở 10 ngày sau trồng 30 Hình 4.9 Sự phát triển đậu cove ở thời điểm 10 ngày sau trồng 30 Hình 4.10 Triệu chứng bệnh do Rhizoctonia solani gây ra trên cải ngọt 33 Hình 4.11 Cải ngọt giai đoạn vườn ươm lúc 10 ngày sau gieo 33 Hình 4.12 Cải ngọt ở thời điểm 15 ngày sau trồng 33 Đồ thị 4.1 Mật số vi khuẩn trên các môi trường 21 Đồ thị 4.2 Tỷ lệ bào tử hình thành qua các thời điểm nhân sinh khối 23 Đồ thị 4.3 PH của các môi trường 25 ix DANH SÁCH CÁC BẢNG Trang Bảng 4.1 Chiều cao dưa leo ở các nghiệm thức 27 Bảng 4.2 Diễn biến bệnh lỡ cổ rễ đậu cove do Rhizoctonia gây ra trong thí nghiệm 28 Bảng 4.3 Diễn biến bệnh lỡ cổ rễ đậu cove do Rhizoctonia gây ra trong thí nghiệm 31 Bảng 4.5 Tỉ lệ lá cải bệnh giai đoạn trồng ra đồng 33 Bảng 4.6 Chiều cao cây cải giai đoạn trồng sản xuất 33 Bảng 4.7 Năng suất cải ngọt lúc 25 ngày sau trồng 34 1 Chương 1 MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Trong những năm gần đây, nền nông nghiệp Việt Nam có những bước tiến vượt bậc, đã đáp ứng phần lớn nhu cầu lương thực thực phẩm trong nước. Tuy nhiên, chất lượng và hiệu quả của việc sản xuất nông sản hàng hóa ở nước ta còn nhiều hạn chế so với các nước trong khu vực. Để khắc phục vấn đề này, chúng ta cần quan tâm đến việc xây dựng nền nông nghiệp theo hướng sinh thái bền vững, tăng nhanh số lượng và nâng cao chất lượng nông sản. Theo đó, công tác giống cây trồng và bảo vệ thực vật đóng vai trò rất quan trọng. Công tác phòng trừ sâu bệnh hại cây trồng hiện nay được áp dụng bằng nhiều biện pháp. Trong đó, biện pháp hóa học vẫn được sử dụng nhiều nhất và được xem là hữu hiệu nhất nhờ vào giá thành tương đối rẻ và tác dụng nhanh. Tuy nhiên, nông dân thường phun thuốc thường xuyên và với liều lượng cao điều đó vô tình làm cho các tác nhân gây hại trở nên kháng thuốc và làm tồn đọng một khối lượng lớn thuốc bảo vệ thực vật trong sản phẩm và môi trường. Rau xanh có thời gian sinh trưởng ngắn và có thể bị nhiều loại sâu bệnh hại tấn công, nhất là bệnh chết rạp cây con do Rhizoctoni solani và Pythium gây ra. Do đó rau xanh là một trong những loại cây trồng được phun thuốc nhiều nhất. Rau xanh là loại thực phẩm được dùng chủ yếu là ăn tươi vì thế yêu cầu an toàn đối với rau xanh luôn được đặt lên hàng đầu. Trước tình hình đó, biện pháp phòng trừ sâu bệnh hại bằng sinh học đã được nhiều nhà khoa học quan tâm vì có thể khống chế hiệu quả các tác nhân gây hại. Giúp cân bằng hệ vi sinh vật trong đất. Mặt khác, các sản phẩm nông nghiệp trở nên an toàn hơn và môi trường sẽ ít ô nhiễm. Hiện nay, phòng trừ dịch hại cây trồng bằng biện pháp sinh học được đẩy mạnhnghiên cứu ở nhiều nước cũng như tại Việt Nam, được coi là một lĩnh vực quan trọng. Biện pháp chủ yếu là sử dụng các loài vi sinh vật đối kháng để khống chế các tác nhân gây hại. Trong đó vi khuẩn Bacillus spp. được chứng minh có khả năng kháng một số nấm gây hại như Rhizoctoni solani và Pythium và một số vi khuẩn gây 2 hại khác nhờ vào khả năng sản sinh ra các chất kháng sinh. Trong tự nhiên, vẫn có vi khuẩn đối kháng tồn tại và phát triển trong đất tuy nhiên mật số không đủ để khống chế bệnh hại. Do đó, việc nhân nhanh mật số vi khuẩn để phóng thích ra môi trường nhằm cân bằng hệ vi sinh vật là một việc làm hết sức cần thiết và cấp bách Xuất phát từ những vấn đề trên đã cho thấy tính cấp thiết của việc thực hiện đề tài “Chọn lọc môi trường nhân sinh khối vi khuẩn Bacillus spp. và thử nghiệm đánh giá khả năng phòng trị bệnh trên một số cây rau” 1.2 Mục đích và yêu cầu của đề tài 1.2.1 Mục đích Xác định được môi trường và thời gian nhân sinh khối Bacillus spp. đạt mật số cao và có hiệu quả kinh tế để tạo chế phẩm sinh học để phòng trừ bệnh chết cây con do Rhizoctoni solani gây ra trên các loại cây rau. 1.2.2 Yêu cầu Môi trường nuôi cấy phải đạt cho mật số vi khuẩn cao đạt yêu cầu đối với chế phẩm vi sinh và có khả năng phòng trừ bệnh trên các loại cây trồng khác nhau. 3 Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Biện pháp phòng trừ sinh học trong phòng trừ bệnh hại cây trồng. Kiểm soát sinh học là việc sử dụng các tác nhân sinh học để kiểm soát các tác nhân gây hại trước hoặc sau khi dịch bệnh xảy ra. Mục đích chính là tăng mật số các vi sinh vật có ích để tấn công và áp đảo các tác nhân gây hại (George N Agrios, 2000). Những nghiên cứu về biện pháp sinh học phòng trừ bệnh hại cây trồng đã được nghiên cứu từ năm 1908, Potter đã chứng minh rằng hoạt tính của vi sinh vật gây hại cho cây trồng có thể bị ức chế bằng các sản phẩm trao đổi chất của các loài vi sinh vật khác (Cook and Baker, 1983).Năm 1926, Sanford đã gợi ý dùng quần thể vi khuẩn hoại sinh có trong phân xanh để phòng chống bệnh ghẻ khoai tây (Cook and Baker, 1983). Năm 1932, Weidling đã mô tả hiện tượng Trichoderma ký sinh trên một số loài nấm khác. Năm 1937 – 1938, Drechsler nghiên cứu hiện tượng nấm ký sinh nấm và nấm ký sinh tuyến trùng. (Cook and Baker, 1983) Từ giai đoạn khởi đầu cho đến nay, việc sử dụng các biện pháp sinh học phòng trừ bệnh hại cây trồng đã gặt hái được rất nhiều thành công và ngày càng được sử dụng rộng rãi. 2.2 Các đặc tính của vi khuẩn Bacillus 2.2.1 Đặc điểm hình thái và phát triển của vi khuẩn Bacillus spp. 2.2.1.1 Sự phân bố của vi khuẩn Bacillus spp. Những nhiên cứu cho thấy các loài Bacillus spp. là các loài vi khuẩn định cư ở vùng rễ cây trồng (Nguyễn Trọng Thể, 2004). Nguyễn Trung Thành (2004) cũng đã phân lập Bacillus spp. bằng cách lấy rễ và đất ở vùng sát rễ. Bacillus spp. rất đa dạng về chủng loại và tác dụng. Tuy nhiên chúng chủ yếu được liệt vào 3 loại: loại có hại cho cây trồng, loại trung tính và loại có ích cho cây trồng hay còn gọi là vi khuẩn thúc đẩy sự tăng trưởng cây. Ảnh hưởng có ích của 4 nhóm vi khuẩn này là do chúng sản sinh ra các chất kích thích tăng trưởng cây, các chất ức chế hoặc làm suy yếu tác nhân gây bệnh hoặc cả hai (Nguyễn Trọng Thể, 2004) 2.2.1.2 Phân loại vi khuẩn Bacillus spp. Theo mô tả trong khóa phân loại của Bergey, vi khuẩn Bacillus spp. là những loài thuộc chi Bacillus, thuộc họ Bacillacaea. Trong đó B. subtilis là trực khuẩn Gram dương có kích thước 23 x 0,70,8 µm, nội bào tử ở trung tâm kích thước 1,51,8 x 0,8µm (John G. Holt, 1997) Chỉ có 1 nội bào tử được hình thành trong tế bào sinh dưỡng, ở 1000C bào tử của Bacillus spp. Tồn tại được 180 phút, có tính ổn định cao với nhiệt độ thấp và sự khô cạn, tác động của hóa chất và các tia bức xạ (John G. Holt, 1997) 2.2.1.3 Đặc điểm phát triển của Bacillus spp. Hình 3.1 Chu kỳ phát triển của nhóm vi khuẩn hình thành bào tử.( James G. Cappuccino). Chú thích: A: giai đoạn vỡ lớp vỏ bào tử; B: tế bào sinh dưỡng; C: tiền bào tử; D: nội bào tử; E: bào tử giải phóng ra khỏi màng tế bào; F: bào tử tự do A B E C D F 5 Theo James G. Cappuccino (2002), khi môi trường sống thuận lợi thì bào tử vi khuẩn sẽ nảy mầm và hình thành tế bào sinh dưỡng, quá trình nhân đôi xảy ra liên tục đạt được mật số tối đa. Khi môi trường cạn kiệt dinh dưỡng và điều kiện sống không thuận lợi tế bào sinh dưỡng sẽ xuất hiện nội bào tử bên trong. Sở dĩ bào tử có có khả năng chịu đựng cao đối với điều kiện không thuận lợi là do cấu tạo trạng thái sinh học của bào tử đã thay đổi nhiều so với thể dinh dưỡng. Vỏ bào tử chứa nhiều lipit và dày làm hạn chế rất nhiều sự xâm nhập của các chất hóa học. Đồng thời cấu trúc xốp của màng lại là vật cáh nhiệt khá tốt. lượng nước trong bào tử rất ít, phần lớn ở trạng thái liên kết làm cho sức chịu đựng của bào tử với điều kiện bên ngoài nhất là nhiệt độ tăng lên nhiều. Hơn nữa, các hệ enzym ở trạng thái gần như không hoạt động, các phản ứng sinh hóa hầu như không xảy ra, làm cho bào tử có thể tồn tại ở trạng thái nghỉ một thời gian dài tới nhiều năm. (Thomas D. Brock) Vi khuẩn có khả năng phát triển trong những khoảng biến thiên về pH rất rộng. Nhìn chung các loài vi khuẩn thích hợp với pH môi trường cao hơn nấm. Ở pH khác nhau, sức chịu đựng của bào tử với nhiệt độ cũng thay đổi. pH càng thấp, sức đề kháng với nhiệt độ càng giảm. 2.2.1.4 Ảnh hưởng của điều kiện môi trường lên sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn Dinh dưỡng: dinh dưỡng có thể ảnh hưởng đến hai giá trị của vi khuẩn đó là số lượng và kích thước tế bào. Bacillus spp. là loài vi sinh vật dị dưỡng nên đòi hỏi phải được cung cấp trong quá trình phát triển. Nhu cầu về dinh dưỡng của vi khuẩn rất đa dạng quan trọng nhất là nguồn nitơ, kế đến là các khoáng chất và vitamin. Nitơ có trong thành phần protein, axit nucleic và những chất khác có chứa N của tế bào vi khuẩn. Các loài vi khuẩn có thể sử dụng đạm từ các nhóm nitrat, nitrit. Bên cạnh đó các khoáng chất như: lưu huỳnh, photpho, kali, canxi, magiê, sắt cũng rất cần thiết cho sự phát triển của vi khuẩn. Do đó nếu thành phần dinh dưỡng không đầy đủ ta phải cung cấp thêm các muối khoáng cho vi khuẩn trong quá trình nuối cấy bằng cách thêm vào các hợp chất vô cơ. (Thomas D. Brock) Hô hấp: vi khuẩn Bacillus spp. là các loài vi sinh vật hiếu khí. Trong quá trình hô hấp đòi hỏi phải có các nguyên liệu hô hấp như: oxi, hydrat carbon, các axit hữu cơ. 6 Quá trình hô hấp ngoài việc cung cấp các nguyên tố dinh dưỡng thì không khí sạch là thành phần không thể thiếu.(Thomas D. Brock) pH môi trường: mỗi loài vi sinh vật có khoảng giá trị biến thiên mà chúng có thể tồn tại và phát triển. Điều kiện tự nhiên thường có pH biến thiên từ 59. Vi khuẩn Bacillus spp. là loài có thể phát triển được với điểm cực đại pH của môi trường khoảng 10 – 11. Tuy nhiên pH thích hợp cho sự phát triển của vi khuẩn Bacillus spp. từ 6 – 7,5 (Thomas D. Brock) Nhiệt độ: vi khuẩn Bacillus spp. Chủ yếu được nuôi cấy và nhân sinh khối với khoảng nhiệt độ chủ yếu từ 27 – 350C, tuy nhiên chúng có thể phát triển ở nhiệt độ từ 50 – 700C.(Thomas D. Brock) 2.2.2 Cơ chế kháng của vi khuẩn Bacillus spp. với nấm gây hại Cơ chế đối kháng của các loại nấm và vi khuẩn rất đa dạng. Chẳng hạn đối với nấm Trichoderma, hiện tượng nấm Trichoderma ký sinh nấm gây bệnh được Weiding gọi là hiên tượng “Giao thoa sợi nấm” (Cnyder, 1976). Nấm Trichoderma còn có khả năng tiết ra các chất kháng sinh có khả năng gây độc cho nấm gây bệnh (Agrowcal và cộng tác viên, 1979) Đối với vi khuẩn Bacillus spp., hoạt động kháng chủ yếu do vi khuẩn có khả năng tiết ra các chất kháng sinh, đa số là các acid amin dạng chuỗi và dạng vòng (Loeffler et al, 1986). Vi khuẩn có khả năng tạo ra các chất dễ chuyển hóa bên ngoài thành tế bào có thể ức chế hoạt động của nấm (Loeffler, 1986). Bên cạnh đó Bacillus spp. còn có khả năng tạo ra các enzym thủy phân bao gồm các enzym: cellulase, chitinase và β1,3glucanase (Marten et al., 2000). Chính các enzyme này có thể phân giải màng tế bào và thành tế bào nấm gây hại. Các dòng vi khuẩn Bacillus spp. còn có khả năng sản xuất các chất kháng sinh như: fentcin, zwittermycin ( aminopolyol) và kanosamin. 2.3 Bệnh lở cổ rễ, chết rạp cây con do nấm Rhizoctonia solani Bệnh do nấm Rhizoctonia solani Kuhn, thuộc lớp nấm trơ Mycelia Sterilia. Sợi nấm không màu, sau có màu nâu vàng, sợi nấm đa bào có kích thước 8 13 µm. Nấm 7 hình thành hạch, hạch có hình dạng không đều, màu nâu đen (Võ Thị Thu Oanh, 2000). Theo Võ Thị Thu Oanh (2000), nấm phát triển thích hợp ở nhiệt độ 17 28oC, nhiệt độ trên 30oC nấm phát triển kém, pH thích hợp nhất ở 6 7. Nấm là loại bán hoại sinh, đa thực, sống được trên nhiều loại cây trồng khác nhau. Nấm tồn tại trên tàn dư cây trồng. Trong đất, chúng có thể sống hoại sinh trong đất một thời gian dài nhiều năm. Nguồn bệnh phân bố chủ yếu trong đất, bệnh phát triển mạnh khi thời tiết có mưa, ẩm độ cao nhưng không quá ngập nước. Nguồn bệnh lây lan do tưới nước, văng nước. Mật độ, kỹ thuật canh tác cũng ảnh hưởng rất lớn đến tình trạng lây lan bệnh (Persley. M, 1994) Vết bệnh xuất hiện chủ yếu ở phần rễ và cổ rễ nơi tiếp xúc với mặt đất. Vết bệnh gây tổn thương toàn bộ rễ hay 1 phần rễ. Chỗ vết bệnh thường, thâm đen và thối rữa, vết bệnh ban đầu là những chấm nhỏ sau đó lan rất nhanh (Võ Thị Thu Oanh, 2000). Tùy độ tuổi cây con mà cổ rễ bị teo tóp và gục ngã hay chỉ loét một phần. 2.4 Các phương pháp lên men tạo chế phẩm sinh học Lên men là quá trình nuôi cấy vi sinh vật để chúng tạo ra sinh khối hay các sản phẩm trao đổi chất. Tùy đặc điểm của từng loài vi sinh vật mà người ta sẽ xây dựng các quy trình nuôi cấy và thu nhận sản phẩm khác nhau. Hiện nay, trên thế giới đã có nhiều phương pháp lên men tạo chế phẩm sinh học và bước đầu được áp dụng để sản xuất ở quy mô công nghiệp. Tuy nhiên các quy trình lên men vẫn còn nằm trong giai đoạn tìm kiếm để tìm ra các quy trình tối ưu. Mục đích trên hết là tìm ra các quy trình có hiệu suất cao, giá thành rẻ, đồng thời tiện dụng trong bảo quản và sử dụng. 2.4.1.Phương pháp lên men chìm Phương pháp lên men chìm giúp ta thu nhận được sản phẩm có độ đồng nhất cao. Với các thiết bị được trang bị đầy đủ thì có thể áp dụng cơ khí hóa và tự động hóa dễ dàng. Các thiết bị có thể sắp xếp theo dây chuyền nên đòi hỏi phải tính toán kỹ để không xảy ra tình trạng nhiễm các vi sinh vật lạ. 8 Mặc dù có các tính năng như trên nhưng phương pháp này đòi hỏi chi phí cao cho việc trang bị máy móc, thiết bị và trong các khâu: khử trùng toàn bộ hệ thống, khuấy đảo, sục khí để cung cấp không khí. Do phải khuấy đảo liên tục nên cần phải xác định thời điểm thích hợp để dừng quá trình lên men đúng lúc nhằm thu được sản phẩm như mong muốn. Ta có thể tham khảo quy trình lên men chìm chế tạo chế phẩm của Nguyễn Ngọc Tú, 1997 như sau: Vi sinh vật gốc được nuối 57 ngày Nhân giống trong bình 250 ml có 100 ml môi trường, lắc 200 vòngphút, To = 28 – 300C, nuôi trong 24 giờ Nhân giống trong bình 1000 ml có 500 ml môi trường, lắc 200 vòngphút, To = 28 – 300C, nuôi trong 24 giờ Lên men trong hệ thống 10 lít tự động có chứa 7 – 8 lít môi trường. Khuấy 550 vòngphút, To = 29 – 300C, nuôi trong 72 giờ. Ly tâm lạnh 3000 vòngphút trong 40 phút Sinh khối được đem trộn với các phụ gia Sấy khô ở 30 – 35oC Nghiền nhỏ, vô bao kín, bảo quản ở 5 – 10oC 2.4.2 Phương pháp lên men bề mặt không vô trùng tạo chế phẩm nấm Phương pháp lên men bề mặt không vô trùng tạo chế phẩm nấm đã được thực hiện bởi Evlacchova (1968), đã áp dụng phương pháp lên men này để tạo chế phẩm Boverin, chất diệt sâu vi sinh trên cơ sở nấm Beauveria bassiana. Môi trường dinh dưỡng được nấu sôi ở 100oC trong 20 phút, khi nguội được cho thêm kháng sinh Streptomicine (0,01%) để ngăn ngừa sự phát triển của vi khuẩn trong quá trình lên men. Để thực hiện phương pháp này hiệu quả cần tuân thủ theo các bước sau: Bào tử nấm được cấy phủ kín khắp bề mặt môi trường dung dịch ( đã đun sôi ở 100oC20 phút). Các bào tử nấm sau khi cấy sẽ tự điều hòa khuyếch tán thành một màng mỏng khắp bề mặt môi trường, ngăn ngừa các vi sinh vật lạ phát triển. Lượng bào tử trên một đơn vị bề mặt môi trường được cấy với một lượng lớn đủ áp đảo sự phát triển ban đầu của các vi sinh vật lạ (khoảng 1 – 2 tỷ bào tửcm2). 9 Ngay sau khi nảy mầm, bào tử của các nấm diệt sâu sẽ tiết ra các chất trao đổi chất, giống kháng sinh để ức chế sự phát triển của vi khuẩn và nấm lạ (Nguyễn Thân, 2004). Tạo môi trường pH thấp từ 5 – 5,5 để thuận lợi hơn cho sự phát triển của nấm, ức chế sự phát triển của vi khuẩn lạ. Sử dụng dụng cụ, thiết bị nuôi cấy sạch sẽ để hạn chế tối đa sự nhiễm của các vi sinh vật lạ (Nguyễn Thân, 2004). 2.4.3 Phương pháp lên men hai giai đoạn tạo chế phẩm nấm Người ta còn áp dụng phương pháp lên men 2 giai đoạn: lên men chìm sau đó chuyển sang lên men bề mặt. Bào tử nấm thu được trong phương pháp lên men 2 giai đoạn là bào tử đính có cấu trúc bền vững, thời gian sống lâu, có khả năng giữ hoạt tính diệt sâu cao hơn bào tử chồi nên rất được quan tâm nghiên cứu. Ta có thể tham khảo quy trình lên men hai giai đoạn của Nguyễn Ngọc Tú, 1997 như sau: Nấm nuôi trong các ống thạch nghiêng hay trong đĩa petri 7 – 10 ngày, To = 28 – 300C. Bột bào tử được cấy vào các chậu có chứa lớp dung dịch môi trường dày 1 – 1,5 cm (chậu được sấy ở 100oC30 phút, môi trường dung dịch được đun sôi ở 100oC30 phút) Nuôi trong 12 ngày, To = 25 – 300C, vớt thảm nấm có bào tử, cuốn tròn sao cho mặt bào tử ở bên trong, thấm ráo nước Thêm chất phụ gia, nghiền nhỏ Sấy khô ở 30 – 350C trong 2 ngày Đóng gói, bảo quản ở 5 – 100C trong tối 2.4.4 Phương pháp lên men xốp Đây là phương pháp được áp dụng rộng rãi nhất vì đây là quá trình lên men đơn giản, dễ thành công hơn so với các quy trình khác. Trong qua trình này, các loại cơ chất dùng để làm môi trường cho nấm đối kháng phát triển là cám trấu, bột gạo, bột bắp cùng các dung dịch dinh dưỡng để nuôi nấm (Nguyễn Thân, 2004). Do đó có thể tận dụng các phế phẩm trong nông nghiệp để sản xuất chế phẩm. 10 Nguyễn Anh Phi (2006) cũng đã thử nghiệm áp dụng quy trình lên men xốp đối với nấm Trichoderma virens. Bước đầu đã xây dựng được quy trình cụ thể cho nấm Trichoderma. Quy trình gồm các bước sau đây: Ống giống nuôi cấy 5 ngày Nấm Trichoderma virens nuôi 5 ngày trong môi trường dung dịch Cho môi trường vào bịch nhựa, có chiều dài 30 cm và chiều rộng 24 cm, được gắn một màng nhựa có khả năng thoáng khí và chịu được nhiệt độ cao. Hấp khử trùng môi trường ở 1210C, 20 phút. Để môi trường qua đêm rồi cấy dung dịch nấm vào. Trộn đều dung dịch nấm với môi trường nuôi cấy xốp, đặt ở phòng thoáng mát có To = 25 – 300C trong 14 ngày. Sấy khô chế phẩm trong tủ sấy mẫu ở nhiệt độ 300C trong 12 giờ Nghiền và trộn với phụ gia. 2.4.5 Phương pháp nhân sinh khối vi khuẩn Bacillus spp. 2.4.5.1 Nhân sinh khối vi khuẩn bằng phương pháp lên men chìm Theo Jayaraj (2004), môi trường nhân sinh khối vi khuẩn Bacillus spp. rất đa dạng với thành phần và sự hiện diện các chất rất khác biệt bao gồm cả nguyên liệu và các hóa chất. Trong đó các nguyên liệu thường được dùng là: bột bắp, bột đậu nành, tinh bột bắp, khoai tây, peptone, tryptone, mật rỉ. Các hóa chất thường được dùng để bổ sung thêm khoáng và các nguyên tố vi lượng như: KH2PO4, MgSO4.7H2O, CaCl2, NaCl, MnSO4.H2O, Na2HPO4, (NH4)2SO4. Sau khi phối trộn các thành phần nguyên liệu, dung dịch vi khuẩn gốc được cấy vào và đem đi lắc ở nhiệt độ 280C, tốc độ lắc khoảng 150 – 200 vòngphút. Tuy nhiên có thể lắc hoặc khuấy với tốc độ với tốc độ cao hơn. Khi tỷ lệ bào tử đạt giá trị cao thì ngừng quá trình nhân sinh khối vi khuẩn. 2.4.5.2 Tạo và bảo quản chế phẩm dạng bột Jayaraj (2004) đã nghiên cứu nhiều loại cơ chất để tạo chế phẩm dạng bột. thành phần chính gồm các chất: bột talc, bột lignite, bột CM. Cơ chất sau khi trộn xong đem đi hấp tiệt trùng ở 1210C trong 30 phút. Sau đó được đem đi sấy ở 500C trong 24 giờ trước khi trộn vào dung dịch vi khuẩn đã lên men. Chế phẩm được đem đi sấy ở nhiệt 11 độ 350C trong 48 giờ. Sau khi sấy khô chế phẩm được đem đi tồn trữ ở nhiệt độ phòng (280C). Chế phẩm Bacillus dạng bột đã được nghiên cứu và kiểm nghiệm trên nhiều loại cơ chất khác nhau. Sau 12 tháng bảo quản thì mật số vi khuẩn trên các loại cơ chất vẫn còn 100% so với ban đầu. Sau 24 tháng bảo quản thì mật số vi khuẩn trên các loại cơ chất chỉ giảm khoảng 10 – 15%. Các chế phẩm sau khi bảo quản được đem ra sử dụng và cho thấy có khả năng kiểm soát bệnh chết rạp cây con do Pythium aphanidermatum trên cây cà chua (Jayaraj, 2004). 2.5 Tình hình nghiên cứu, sản xuất và thương mại hóa các sản phẩm có nguồn gốc từ vi khuẩn Bacillus spp. 2.5.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới Mặc dù có hàng trăm, thậm chí hàng ngàn loài vi sinh vật được nghiên cứu và cho thấy có khả năng tác động đối với việc kiểm soát các tác nhân gây hại cây trồng trong các điều kiện như: trong phòng thí nghiệm, trong nhà lưới, ngoài đồng. Tuy nhiên chỉ một số ít được đăng ký và sử dụng rộng rãi. (George, 1997). Chẳn hạn đối với nấm thì có Trichoderma và Gliocladium virens được nghiên nghiên cứu và quan tâm nhiều nhất. Những loài nấm khác như Coniotlyrium minitans, Laetisaria arvalis và Talaromyces cũng là những loài nấm ký sinh trong phòng trừ sinh học (Fang và Tsao, 1995) Bên cạnh đó cũng đã có nhiều công trình nghiên cứu về vi khuẩn là một tác nhân phòng trừ sinh học rất được chú ý. Đây là nhóm vi khuẩn hoại sinh mà phổ biến nhất là Pseudomonas spp. kế đến là Bacillus spp. và Streptomyces (Burr và cộng tác viên, 1978; Weller và Cooker,1983)(Nguyễn Trọng Thể, 2004) Các nghiên cứu ở nước ngoài về Bacillus spp. chủ yếu tập trung vào các dòng vi khuẩn Bacillus subtilis, đây là các dòng có khả năng đối kháng cao và ổn định. Đã chứng minh được vi khuẩn Bacillus subtilis có thể được sử dụng để phòng trừ bệnh do nhiều tác nhân gây ra. Korsten (1997) đã thành công trong việc kết hợp phun Bacillus subtilis và thuốc trừ nấm để phòng trừ bệnh đốm đen trước thu hoạch do Pseudocercospora purpurea gây ra trên quả lê ở Nam Phi. Collins (2002) đã dùng một dòng Bacillus subtilis để phòng trừ bệnh đốm lá trên củ cải đường do Cercospora 12 beticola. Trên cây lê Trung Quốc, bệnh rụng cuống hoa đã làm giảm rất lớn năng suất trái, bệnh gây ra do nhiều tác nhân: Colletotrichum gloeosporioides, Thyronectria pseudotrichia, Phomopsis perseaea. Demoz (2005) cũng đã dùng vi khuẩn Bacillus subtilis để làm giảm đáng kể tỉ lệ bệnh do các tác nhân này gây ra. Okigbo đã sử dụng biện pháp sinh học trong việc phòng trừ bênh thối củ trong thời gian bảo quản của khoai mỡ do các tác nhân: Aspergilus niger, Penicillium oxalicum bằng cách sử dụng vi khuẩn Bacillus spp. để phòng trừ. 2.5.2 Những nghiên cứu trong nước Trong những năm gần đây, việc nghiên cứu và sử dụng các sản phẩm có nguồn gốc từ các vi khuẩn đối kháng rất phát triển. Bước đầu đã tạo được những kết quả rất đáng chú ý. Nguyễn Trung Thành (2004) bước đầu chọn lọc và đánh giá dòng vi khuẩn đối kháng phân lập từ đất để khống chế các nấm Rhizoctonia solani, Sclerotium rolfsii và Ralstonia solanacearum. Bước đầu đã chọn lọc được 47 dòng vi khuẩn Bacillus spp. phân lập trên mẫu rễ của 25 loại cây trồng khác nhau có tính đối kháng với các nấm trên. Nguyễn Trọng Thể đã chọn lọc và sử dụng vi khuẩn đối kháng, Pseudomonas fluorescens để phòng trừ bệnh do nấm Rhizoctonia solani và Sclerotium rolfsii gây hại trên cây cà chua và cây bông vải. Qua đó đã thiết lập được quy trình chọn lọc được các dòng vi khuẩn có tính đối kháng cao, ổn định. 2.5.3 Tình hình sản xuất và thương mại hóa chế phẩm trên thế giới Chính những đặc tính về khả năng kháng và bảo quản của vi khuẩn Bacillus spp. làm cho chúng trở thành nhóm vi sinh vật được đưa ra sản xuất và thương mại hóa cao nhất. Các công ty đã sản xuất rất nhiều dạng khác nhau như: dung dịch, bột. Chỉ riêng đối với nước Mỹ đã có 5 sản phẩm từ Bacillus spp.. Các sản phẩm được sử dụng với nhiều phương thức khác nhau và có khả năng trên nhiều tác nhân gây hại khác nhau. Sản phẩm có tên thương mại là HiStick NT được sản xuất bởi Becker Underwood Inc.MicroBio Gpoup, Ltd, có thể phòng trị bệnh do các tác nhân Fusarium, Rhizoctonia, Aspergillus gây bệnh trên đậu nành, đậu phộng, cây thuộc họ 13 hòa thảo, được sử dụng bằng cách ngâm hạt giống hoặc trộn khi xử lý hạt giống (Nguồn: internet) Công ty Gustafson cũng có 2 sản phẩm từ Bacillus spp. có tên thương mại là Kodiak và YiedShield. Sản phẩm Kodiak có thể phòng được các bệnh do Fusarium, Rhizoctonia, Aspergillus và Alternaria, được đóng gói dưới dạng bột khô và dùng để trộn chung với thuốc trừ nấm bệnh khác (Nguồn: internet) Sản phẩm có tên thương mại là Serenade, được sản xuất bởi AgraQuest, Inc, trị được các bệnh đốm lá do Cercospora gây ra trên dưa leo, nho, đậu phộng, rau cải, được đóng gói dưới dạng bột dùng để hòa vào nước phun (Nguồn: internet) Sản phẩm Companion của Growth Products được thành phẩm dưới dạng dung dịch, có khả năng kiểm soát các tác nhân gây bệnh: Fusarium, Rhizoctonia, Aspergillus và Phytopthora trong điều kiện nhà lưới và vườn ươm, dùng để xử lý hạt giống và phun trên cây trồng (Nguồn: internet) Đối với nước ta hiện nay, chưa có sản phẩm từ Bacillus spp. được đưa ra thương mại hóa tuy đã có rất nhiều công trình nghiên cứu về Bacillus spp.. Cho thấy tính cấp thiết trong việc tìm ra cách sản xuất chế phẩm để việc sử dụng được tiến hành đại trà và tiện lợi. 14 Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu Thời gian: Đề tài được thực hiện từ tháng 4 năm 2007 đến tháng 10 năm 2007 Địa điểm nghiên cứu: Thí nghiệm thử nghiệm môi trường nhân sinh khối vi khuẩn thực hiện tại Phòng thí nghiệm Bệnh cây – Bộ môn Bảo Vệ Thực Vật – Khoa Nông Học – Trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh. Thí nghiệm Đánh giá tác động của chế phẩm Bacillus spp. đối với bệnh do Rhizoctonia solani trên cây dưa leo và đậu cove ở giai đoạn cây con thực hiện tại Trại thực nghiệm Bộ môn Bảo Vệ Thực Vật – Khoa Nông Học – Trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh. Thí nghiệm Đánh giá tác động của chế phẩm Bacillus spp. đối với bệnh do Rhizoctonia solani trên cây cải ngọt thực hiện tại vườn Bác Phùng Nhiệm, ấp Đình, xã Tân Phú Trung, huyện Củ Chi. 3.2 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 3.2.1 Vật liệu nghiên cứu Nấm Rhizoctonia solani được phân lập trên cây bông vải ở Đồng Nai Vi khuẩn Bacillus spp. được phân lập trên cây rau dền tại quận 12, Thành phố Hồ Chí Minh. Được ký hiệu là dòng Rd2.11, được lưu trữ tại Bộ môn Bảo Vệ Thực Vật. Các dụng cụ thí nghiệm và vật tư cần thiết trong phòng thí nghiệm như: Máy lắc, máy khuấy từ, pipet, buồng đếm hồng cầu, tủ hấp, tủ sấy và các dụng cụ cần thiết khác trong Phòng thí nghiệm Bệnh cây – Bộ môn Bảo Vệ Thực Vật – Khoa Nông Học Trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh 15 Các hóa chất như: KH2PO4, MnSO4.H2O, NaCl, Glucose, Urea, MgSO4.7H2O, Peptone, Tryptone, CaCl2, Nutrient broth, Na2HPO4, (NH4)2SO4. Các nguyên liệu khác như: bột đậu nành, mật rỉ, bột bắp, khoai tây. Và các phụ gia: bột Talc, bột CMC. Hạt giống dưa leo lai do công ty Liên doanh Hạt Giống Đông Tây sản xuất, tên khoa học: Cucumis sativus L., họ: Cucurbitaceae. Hạt giống đậu Côve leo Đài Loan (hạt đen) do công ty TNHH Thương mại Đại Địa sản xuất, tên khoa học: Phaseolus vulgaris L., họ: Fabaceae Leguminoseae Chế phẩm kích kháng sinh học hữu cơ có tên thương mại là Citrex do công ty Hóa Nông Hợp Trí phân phối, đang trong giai đoạn thử nghiệm. Với thành phần các hoạt chất là: Arcorbic acid 2,5%; Citric acid 3,5%; Lactic acid 3,5 %; Glycerin 86,5%; Sodium Chloride 1%; Water 3%. Hạt giống cải ngọt do công ty hạt giống Đông Tây sản xuất. Tên khoa học : Brassica chinensis L. Họ: Cruciferae 3.2.2 Phương pháp nghiên cứu: 3.2.2.1 Thử nghiệm môi trường nhân sinh khối vi khuẩn Bacillus spp. Dòng vi khuẩn Bacillus Rd2.11 có tính kháng mạnh đối với Rhizoctonia solani được chọn để nhân sinh khối. Thí nghiệm được bố trí trên 5 loại môi trường khác nhau với 3 lần lặp lại. Dung dịch vi khuẩn gốc sau khi gia nhiệt ở 900C trong vòng 30 phút để diệt các tế bào sinh dưỡng còn sót lại được cấy vào trong các bình môi trường đã được tiệt trùng với một lượng vi khuẩn gốc như nhau: 5mlbình môi trường 200ml. Các môi trường được chọn lọc có thành phần: Môi trường số 1 ( ký hiệu là MT S) Bột đậu nành 20glít Mật rỉ 0.5glít KH2PO4 3glít Môi trường số 2 (ký hiệu là MT M) Mật rỉ 19.85glít MnSO4.H2O 0.15glít CaCl2.H2O 0.35glít 16 Môi truờng số 3 (ký hiệu là MT N) Nutrient broth Môi trường số 4 (ký hiệu là MT C) Bột bắp 3.17glít Bột đậu nành 5.80glít Peptone 3.62glít Glucose 5glít Urea 3glít MgSO4.7H2O 0.3 glít KH2PO4 3 glít Môi trường số 5 (ký hiệu là MT P) Khoai tây 200glít KH2PO4 1glít Na2HPO4 2,5glít NaCl 1glít (NH4)2SO4 2glít MgSO4.7H2O 0.05glít CaCl2 0.05glít Tryptone 2glít Vi khuẩn được lắc ở tốc độ 150 vòngphút. Lắc trong vòng 5 ngày ở nhiệt độ phòng. Sau mỗi 24 giờ chiết sản phẩm lắc để xác định các chỉ tiêu cần thiết. Chỉ tiêu theo dõi: Mật số vi khuẩn là chỉ tiêu quan trọng để đánh giá khả năng phát triển của vi khuẩn. Sau mỗi 24 giờ, tiến hành chiết dịch vi khuẩn trong các bình tam giác. Dung dịch được đem đi pha loãng đến mật số thích hợp có thể đếm được. Đếm mật số trên buồng đếm hồng cầu. Công thức tính mật số vi khuẩn: D (cfuml)=( 4000 × 1000 × a × 10n)b Trong đó:D: Mật số vi khuẩn (đơn vị hình thành khuẩn lạc)1 ml dung dịch a: Số lượng vi khuẩn đếm được n: nồng độ pha loãng b: Số ô nhỏ của buồng đếm hồng cầu ( 256 ô ) 17 Tỉ lệ bào tử hình thành được xác định bằng cách nhuộm bào tử (James G. Cappuccino). Lấy khoảng 20µl dung dịch tran đều lên lame, để khô tự nhiên. Hơ nhẹ trên ngọn lửa đèn cồn để cố định mẫu. Nhuộm với thuốc nhuộm Malachite green trong 5 phút, đặt lame trong hơi nước nóng. Rửa sạch dưới vòi nước có áp lực mạnh để rửa sạch phần thuốc nhuộm còn thừa. Tiếp theo nhuộm với Safranin khoảng 1 phút, rửa sạch dưới vòi nước. Đếm tỉ lệ bào tử dưới vật kính ×100. Tế bào sinh dưỡng sẽ có màu hồng đỏ và bào tử sẽ có màu xanh. Công thức tính tỉ lệ bào tử: Tỉ lệ bào tử (%)= (Số lượng bào tử hình thànhTổng số vi khuẩn)×100% Xác định độ pH các môi trường nuôi cấy sau mỗi 24 giờ. Phương pháp tạo chế phẩm vi khuẩn ở dạng bột: dung dịch sau khi lắc 45 ngày, đem trộn đều với hổn hợp bột talc và CMC ( 1kg bột talc, 10g CMC) theo tỉ lệ 1:1(1lít dung dịch + 1 kg bột) đã được tiệt trùng. Sau đó đem sấy ở 400C trong 48 giờ Công thức tính chi phí tạm tính của chế phẩm CP tạm tính (đồnggam) = (CP môi trường + CP bột talc)Khối lượng chế phẩm 3.2.2.2 Đánh giá tác động của chế phẩm Bacillus spp. đối với bệnh do Rhizoctonia solani trên cây dưa leo và đậu cove ở giai đoạn cây con Chế phẩm vi khuẩn dạng bột sau khi được kiểm nghiệm tính hiệu quả trong điều kiện in vitro được sử dụng trong thí nghiệm. Hạt giống sau khi được tiệt trùng và ủ đến khi nứt nanh đều nhau được đem ra bố trí trong thí nghiệm. Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên bao gồm 7 nghiệm thức , mỗi nghiệm thức 20 cây (1 câychậu). Theo dõi số liệu mỗi 5 ngày sau trồng trên tất cả 20 cây. Các nghiệm thức được bố trí là các cách xử lý chế phẩm khác nhau NT1: Xử lí đất gieo ươm, phun định kỳ, chủng bệnh NT2: Xử lí đất gieo ươm, xử lí đất trồng, chủng bệnh NT3: Xử lí đất trồng, nhúng rễ, chủng bệnh NT4: Xử lí đất trồng, nhúng rễ, phun định kỳ, chủng bệnh NT5: Xử lí đất trồng, phun định kỳ, không chủng bệnh NT6: Không xử lí, không chủng bệnh NT7: Chủng bệnh, không xử lí 18 Chú thích Xử lí đất gieo ươm: trộn chế phẩm vào đất đạt mật số 106 cfugam đất (1g chế phẩmkg đất) trước khi gieo hạt giống Xử lí đất trồng: pha loãng chế phẩm đạt mật số 107cfuml (10g chế phẩmlít) phun đẫm vào chậu trước khi trồng Nhúng rễ: trước khi trồng cây vào chậu, nhúng rễ vào dung dịch chế phẩm mật số 5×108 cfuml (150glít nước) Phun định kỳ: pha loãng chế phẩm đạt mật số 107cfuml (10glít nước), phun đẫm định kỳ lên lá và vào chậu 7 ngàylần Chỉ tiêu theo dõi: Dưa leo theo dõi chiều cao cây, tỷ lệ bệnh định kỳ 5 ngàylần, và cấp bệnh lúc 20 NST. Đậu cove theo dõi tỷ lệ bệnh định kỳ 5 ngàylần và cấp bệnh trên đậu cove lúc 20 NST Công thức tính tỉ lệ bệnh: TLB(%) = (Số cây bệnhTổng số cây điều tra)100 Công thức tính chỉ số bệnh: CSB(%) = (ai×i)(b×n) ai: số cây bệnh cấp i (i = 1, 2, 3, 4) b: số cây điều tra (20) n: cấp bệnh cao nhất Chú thích : Cấp 1≤ 25% đường kính thân bị hại Cấp 2: 25% 50% đường kính thân bị hại Cấp 3: 50 75 % đường kính thân bị hại Cấp 4: 75% 100% đường kính thân bị hại 3.2.2.3 Đánh giá tác động của chế phẩm Bacillus spp. đối với bệnh do Rhizoctonia solani trên cây cải ngọt Chế phẩm vi khuẩn Bacillus spp. dạng bột sau khi được kiểm nghiệm tính hiệu quả trong điều kiện in vitro và chế phẩm kích kháng Citrex được sử dụng trong thí nghiệm. 19 Giai đoạn vườn ươm: Được bố trí theo kiểu khối đầy đủ ngẫu nhiên với 3 nghiệm thức và 3 lần lặp lại. Các chế phẩm được đem đi xử lý đất trước khi gieo hạt giống 5 ngày. Hạt giống được sạ đều trong các líp, mỗi líp gồm 3 ô ứng với 3 nghiệm thức. Diện tích mỗi nghiệm thức là 2m2, mỗi líp dài 6m. Tổng diện tích khu thí nghiệm là 18m2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm Rep1 Rep2 Rep3 NT1 NT2 NT3 NT2 NT1 NT1 NT3 NT3 NT2 Nghiệm thức 1: Xử lý đất và phun định kỳ 5 ngàylần bằng chế phẩm Bacillus spp. Rd2.11 dạng bột. Nghiệm thức 2: xử lý đất và phun định kỳ 5 ngàylần bằng chế phẩm kích kháng sinh học hữu cơ Citrex. Nghiệm thức 3: không phun chế phẩm và các thuốc trị nấm bệnh khác. Quá trình chăm sóc được tiến hành như nhau giữa các nghiệm thức và theo tập quán canh tác của chủ vườn. Không dùng bất cứ thuốc trừ bệnh và chất kích thích sinh trưởng nào khác đối với các nghiệm thức thí nghiệm. Pha loãng chế phẩm Bacillus spp. Rd2.11 theo tỷ lệ 1:20 ( 1 kg chế phẩm + 20 lít nước), mật độ bào tử đạt được là 5107 bào tửml. Chế phẩm kích kháng hữu cơ Citrex pha theo liều lượng khuyến cáo trên sản phẩm. Trước khi gieo 5 ngày và phun đẫm chế phẩm khi hạt nảy mầm 5 ngàylần. Theo dõi tỉ lệ chết cây con (%): lấy khung 20 × 20cm đặt ngẫu nhiên cố định trong ô thí nghiệm. Theo dõi định kỳ 5 ngàylần. Tỉ lệ cây chết được tính theo công thức: Tỉ lệ chết cây(%) = (A100)B Trong đó: A: số cây chết B: tổng số cây theo dõi 20 Giai đoạn trồng ra ruộng sản xuất Khi cải con được 15 ngày tiến hành trồng ra ruộng sản xuất. Cách bố trí thí nghiệm và xử lý chế phẩm tương tự trong vườn ươm. Đây là giai đoạn theo dõi tiếp theo nên phải được xử lý với chế phẩm như trong vườn ươm. Mỗi lần lặp lại theo dõi và lấy sô liệu cố định 15 câynghiệm thức. Tiến hành theo dõi chiều cao cây, chiều cây được tính từ gốc đến chóp lá cao nhất. Tỷ lệ lá bệnh 5 ngàylần, số lá được tính là số lá thật. Tính năng suất cải khi thu hoạch. Công thức tính tỉ lệ lá bệnh: TLB(%) = Số lá bệnh tổng số lá theo dõi Theo dõi chiều cao cây (5 ngàylần): chiều cao được đo từ đoạn thân sát mặt đất đến chóp lá cao nhất và là trung bình của tất cả các cây theo dõi Tính năng suất trung bình của mỗi nghiệm thức, cân trọng lượng (kg) thân lám2, lấy trung bình giữa các lần lặp lại Xử lý số liệu Số liệu được xử lý bằng phần mềm Excel và phân tích thống kê bằng phần mềm MSTATC (phân tích ANOVA). Số liệu lấy là giá trị trung bình của các lần lặp lại. 21 0 500 1000 1500 2000 2500 24h 48h 72h 96h 120h C N M P Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Nhân sinh khối vi khuẩn Bacillus spp. bằng phương pháp lên men chìm Phương pháp lên men chìm vi khuẩn Bacillus spp. rất dể thực hiện, thời gian lên men ngắn. Đây là phương pháp lên men rất phổ biến, từ một lượng nhỏ ban đầu sau khi lên men sẽ thu được một lượng rất lớn vi khuẩn. Sinh khối thu được có độ đồng nhất cao do đó có thể chọn ra được thời điểm thích hợp để có thể kết thúc quá trình lên men. Từ một lượng vi khuẩn gốc ban đầu như nhau, do thành phần môi trường khác nhau nên khi cho vào lên men đã thu được các sản phẩm có mật số vi khuẩn khác nhau . Đồ thị 4.1 Diễn biến mật số vi khuẩn (cfuml) sau thời gian lên men Mật số vi khuẩn (106) Thời gian 22 Qua kết quả được trình bày ở Đồ thị 4.1, từ thời điểm 24 giờ trở đi, mật số vi khuẩn giữa các môi trường có sự khác biệt rất lớn. Trong đó, ở thời điểm 24 giờ môi trường S (bột đậu nành, mật rỉ, KH2PO4) có khác biệt rất lớn so với các môi trường khác. Trong khoảng thời gian từ 0 giờ đến 48 giờ, các môi trường tăng nhanh về mật số. Từ 48 – 96 giờ, mật số có tăng nhưng chậm. Khi xét giữa các môi trường với nhau thì môi truờng S đạt mật số cao nhất (2,05 × 109 cfuml), kế đến là môi trừơng C (bột bắp, bột đậu nành, peptone) đạt mật số là 1,26 × 109 cfuml và P (môi trường khoai tây, tryptone) đạt 1,22 × 109 cfuml. Hai môi trường còn lại đạt mật số rất thấp, không đạt yêu cầu về mật số đối với chế phẩm sinh học (đạt trên 109cfuml). Hình 4.1 Môi trường nhân sinh khối vi khuẩn Bacillus spp. Rd2.11 trong thí nghiệm a: Môi trường S; b: Môi trường C; c: Môi trường P; d: Môi trường N; e: Môi trường M Để chế phẩm đạt mật số tối ưu, bên cạnh việc đòi hỏi chế phẩm đạt mật số cao thì tỷ lệ bào tử cũng góp phần quan trọng. Thời gian và điều kiện dinh dưỡng ảnh a b c d e 23 hưởng rất lớn đến khả năng sinh trưởng và phát triển, tùy thời điểm khác nhau mà vi khuẩn sẽ ở trạng thái là tế bào sinh dưỡng hay bào tử, khi môi trường cạn kiệt dinh dưỡng thì tế bào sinh dưỡng sẽ hình thành nội bào tử (James G. Cappuccino, 2002) và sau đó sẽ được tế bào phóng thích để thành bào tử tự do. Bào tử vi khuẩn có khả năng chống chịu tốt với các điều kiện bất lợi của môi trường. Khi sản xuất chế phẩm thì tỉ lệ bào tử cũng là chỉ tiêu quan trọng được xét đến vì có ảnh hưởng lớn đến thời gian bảo quản của chế phẩm. Vì thế, việc xác định thời gian hình thành của bào tử là cơ sở để xác định thời gian lên men thích hợp. Tỷ lệ bào tử càng cao thì số lượng vi khuẩn bị hao hụt trong quá trình tạo ra chế phẩm càng thấp, làm cho chế phẩm đạt được mật số tối ưu. 0 20 40 60 80 100 120 24 48 72 96 120 C N M P S Đồ thị 4.2 Tỷ lệ bào tử hình thành qua các thời điểm sau khi lên men Qua kết quả được trình bày ở Đồ thị 4.2, tỉ lệ bào tử của tất cả các nghiệm thức tăng dần từ theo thời gian và đạt cao nhất ở thời điểm 96 giờ, đến thời điểm 120 giờ thì tỷ lệ bào tử bắt đầu giảm do có thể trong môi trường vẫn còn các thành phần dinh dưỡng giúp vi khuẩn phát triển tiếp vòng đời mới. Ở thời điểm 96 giờ tỉ lệ bào tử của môi trường C là 95,5%, môi trường N là 93,7%, môi trường M là 75,3%, môi trường P là 96,5%, môi trường S là 89,2%. Có thể kết thúc quá trình lên men ở thời điểm 96 giờ vì lúc này tỷ lệ bào tử đạt cao nhất. Tỷ lệ bào tử hình thành (%) Thời gian (h) 24 Hình 4.2 Sự hình thành bào tử của Bacillus spp. dòng Rd2.11 ở các thời điểm lên men a: Tế bào sinh dưỡng; b, c: Nội bào tử; d: Bào tử; e: Tế bào sinh dưỡng lúc nhân đôi a 72 giờ 96 giờ c d D a b 120 giờ 24 giờ 48 giờ a e 25 8 6 4 2 0 10 0h 24h 48h 72h 96h 120h C N M P S Mật số vi khuẩn đạt được phụ thuộc vào thành phần dinh dưỡng của môi trường, ngoài ra pH của dung dịch cũng có vai trò quan trọng trong sự phát triển của vi khuẩn. Khi pH thích hợp thì khả năng phát triển và khả năng chống chịu của vi khuẩn với các điều kiện bất lợi của môi trường cũng cao hơn. Đồ thị 4.3 Diễn biến độ pH của các môi trường sau thời gian lên men Qua kết quả được trình bày ở Đồ thị 4.3, pH mà vi khuẩn tồn tại và phát triển biến thiên trong một khoảng giá trị rất rộng từ 5 – 8,7, pH tốt nhất trong khoảng 6 – 8. Qua các thời điểm, pH của các môi trường có xu hướng tăng dần theo thời gian. pH của dung dịch ban đầu từ 6 – 7 thích hợp cho sự phát triển của vi khuẩn. Có thể chọn lọc được môi trường thích hợp để nhân sinh khối vi khuẩn ở quy mô lớn. Tuy nhiên chỉ dựa vào sự phát triển của vi khuẩn thì chưa đủ cơ sở để khẳng định tính hiệu quả, cần xét thêm chi phí nguyên liệu để có thể chọn lọc được môi trường nhân sinh khối kinh tế và hiệu quả nhất. Giả sử chi phí công lao động, nhiên vật liệu, tạo chế phẩm dạng bột của các môi trường là như nhau. Sau khi tính toán chi phí, giá thành của môi trường M thấp nhất (98 đồnglít) nhưng mật số thu được lại rất thấp nên không thể dùng môi trường M để sản xuất. Môi Thời gian pH môi trường 26 trường S có giá thành 544 đồnglít thấp hơn so các môi truờng còn lại. Môi trường N có giá thành 15.000 đồnglít. Môi truờng C có giá thành 6.300 đồnglít. Môi truờng P có giá thành 3960 đồnglít. Bên cạnh đó mật số đạt được lại cao nhất (20,5×108 cfuml) đáp ứng được yêu cầu về mật số đối với chế phẩm sinh học. Do đó có thể chọn môi trường có thành phần: bột đậu nành, mật rỉ, KH2PO4 để sản xuất chế phẩm dạng bột. Hình 4.3. Chế phẩm dạng bột Hình 4.4 Kiểm tra tính độc của chế phẩm vi khuẩn Bacillus spp. Rd2.11 Bacillus spp. Rd2.11 trên hạt cà chua Hình 4.5 Khả năng đối kháng của chế Hình 4.6 Khả năng đối kháng của chế phẩm phẩm Bacillus spp. Rd2.11 với R.solani Bacillus spp. Rd2.11 với Ralstonia A: Bacillus spp. ; B: R.Solani A: Bacillus spp. ; B: Ralstonia solanacearum A B B A 27 4.2 Đánh giá khả năng phòng trừ bệnh chết cây con đối với cây dưa leo và đậu cove trồng trong chậu 4.2.1 Đánh giá khả năng phòng trừ bệnh chết cây con trên cây dưa leo Tính kháng và các đặc tính khác của vi khuẩn có thể bị biến đổi trong các quá trình giữ mẫu, cấy chuyền, sấy chế phẩm. Sau khi kiểm tra trong điều kiện in vitro cho thấy chế phẩm không gây hại đối với cây trồng và vẫn giữ được tính kháng. Do đó việc kiểm tra khả năng phòng trị bệnh của chế phẩm trong điều kiện nhà lưới trước khi sử dụng ở diện rộng là cần thiết. Trong thí nghiệm này, ngoài việc đánh giá ảnh hưởng của chế phẩm đối với sự phát triển, tỉ lệ bệnh của dưa leo. Thí nghiệm còn tìm ra cách xử lý chế phẩm thích hợp khi trồng ngoài đồng ruộng. Vi khuẩn Bacillus spp. Rd2.11 có thể ảnh hưởng đến sự phát triển chiều cao cây, có những dòng kích thích cây phát triển rất tốt cũng có những dòng hạn chế sự phát triển cây trồng. Bảng 4.1 Ảnh hưởng của chế phẩm đến sự phát triển của cây dưa leo trong thí nghiệm NT Chiều cao dưa leo (cm) 5 NST 10 NST 15 NST 20 NST NT1 4,0ns 7,1 bc 9,5d 19,5 c NT2 3,7 7,2 abc 10,4 abc 17,3 c NT3 4,2 7,6 a 10,4 ab 18,9 c NT4 4,1 7,4 ab 9,6 cd 17,9 c NT5 4,0 7,3 ab 10,8 a 29,2 a NT6 4,0 6,8 c 10 bcd 25,6 b NT7 3,9 7,3 ab 10,6 ab 19,7 c CV(%) 12,5 8,7 10,98 12,13 LSD 0,01 LSD 0,05 0,395 0,703 2,48 NST: ngày sau trồng 28 Qua kết quả được trình bày ở Bảng 4.1. Chiều cao cây ở các nghiệm thức ở thời điểm 5 ngày sau trồng không có sự khác biệt. Chiều cao cây ở các nghiệm thức tăng mạnh giai đoạn cây từ 15 – 20 NST. Ở 20 ngày sau trồng, khi so sánh giữa 2 nghiệm thức không chủng bệnh là nghiệm thức 5 và nghiệm thức 6, chiều cao cây có sự khác biệt rất ý nghĩa về mặt thống kê. Ở 20 ngày sau trồng chiều cao cây ở nghiệm thức 5 có xử lý và phun định kỳ chế phẩm vi khuẩn Bacillus spp. Rd2.11 là 29,2 cm cao hơn so với NT 6 không xử lý chế phẩm có chiều cao là 25,6 cm. Tuy nhiên, đối với các nghiệm thức 1, 2, 3, 4, 7 có chủng bệnh và các cách xử lý khác (nghiệm thức 1: xử lí đất gieo ươm, phun định kỳ, chủng bệnh; nghiệm thức 2: xử lí đất gieo ươm, xử lí đất trồng, chủng bệnh; nghiệm thức 3: xử lí đất trồng, nhúng rễ, chủng bệnh; nghiệm thức 4: xử lí đất trồng, nhúng rễ, phun định kỳ, chủng bệnh; nghiệm thức 7: không xử lý, chủng bệnh) thì sự khác biệt không có ý nghĩa về mặt thống kê. Khi chủng bệnh, cây do phải chống chịu với nguồn bệnh nên không thể phát triển tốt. Qua đó cho thấy chế phẩm Bacillus spp. Rd2.11 có khả năng kích thích cây phát triển chiều cao. Bảng 4.2 Diễn biến bệnh lỡ cổ rễ trên dưa leo do Rhizoctonia gây ra trong thí nghiệm NT Tỉ lệ cây bệnh (%) Chỉ số bệnh (%) 5 NST 10 NST 15 NST 20 NST 20 NST NT1 0 50 60 75 63,75 NT2 0 30 45 95 72,5 NT3 0 35 50 85 67,5 NT4 0 25 40 50 38,75 NT5 0 0 0 0 0 NT6 0 0 5 5 1,25 NT7 0 55 45 85 67,5 NST: ngày sau trồng Qua kết quả được trình bày ở Bảng 4.2. Tỷ lệ bệnh có sự chênh lệch rất lớn, nghiệm thức 4 là nghiệm thức có cách xử lý chế phẩm là: xử lý đất, nhúng rễ, phun định kỳ có tỷ lệ bệnh rất thấp (50%) so với các nghiệm thức có chủng bệnh và có các cách xử lý khác là các nghiệm thức 1, 2, 3, 7 với tỷ lệ bệnh lần lượt là 75%, 95%, 29 85%, 85% . Khi xử lý chế phẩm, tỷ lệ cây bệnh giảm, đặc biệt là với cách xử lý chế phẩm theo nghiệm thức 4 : xử lý đất, nhúng rễ, phun định kỳ. Để xác định thêm mức độ hiệu quả của chế phẩm cần đánh giá thêm chỉ số bệnh của các nghiệm thức. Chỉ số bệnh là chỉ tiêu quan trọng để xác định mức độ bị hại của cây trồng. chỉ số bệnh càng cao thì cây trồng càng mắc bệnh nặng. Qua kết quả được trình bày ở Bảng 4.2. So sánh giữa các nghiệm thức có chủng bệnh ( NT 1, 2, 3, 4, 7 ), chỉ số bệnh rất có sự khác biệt. Nghiệm thức 4 có ch

THỬ NGHIỆM MÔI TRƯỜNG NHÂN SINH KHỐI VI KHUẨN Bacillus spp. VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG PHÒNG TRỊ BỆNH TRÊN MỘT SỐ CÂY RAU

Thông tin tài liệu

Từ khóa liên quan

Tài liệu cùng người dùng

Tài liệu liên quan