C: Mẫu GM-CSF sau tinh sạch
4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 1 Kết luận
4.1. Kết luận
Nội dung 1: Phân lập dịng gen mã hóa GM-CSF ngƣời
Từ các thơng tin tham khảo trên ngân hàng gen và các hiểu biết về q trình tối ưu hố codon trong các chủng vi sinh vật, đề tài đã thiết kế in silico gen mã hoá cho GM-CSF người dựa trên phiên bản thuốc Leukine
Gen này được sử dụng làm khuôn để chuyển vào hai vector có khả năng biểu hiện trong hai chủng nấm men P. pastoris và S. cerevisiae. Vector tái tổ hợp này đã được kiểm chứng bằng PCR khuẩn lạc, cắt RE và giải trình tự (phụ
lục 1).
Nội dung 2: Phân lập dòng nấm men P. pastoris tổng hợp và tiết GM- CSF ngoại bào
Chủng nấm men tái tổ hợp P. pastoris mang gen mã hoá cho GM-CSF đã được kiểm chứng khả năng biểu hiện thông qua SDS-PAGE và lai với kháng thể đặc hiệu.
Nội dung 3: Phân lập dòng nấm men S. cerevisiae tổng hợp và tiết GM- CSF ngoại bào
Chủng nấm men tái tổ hợp S. cerevisiae mang gen mã hoá cho GM-CSF đã được kiểm chứng khả năng biểu hiện thông qua SDS-PAGE và lai với kháng thể đặc hiệu.
Nội dung 4: Nghiên cứu phƣơng pháp thu nhận GM-CSF đƣợc tổng hợp và tiết ngoại bào bởi nấm men P. pastoris và S. cerevisiae
Dịch lên men từ hai chủng tái tổ hợp P. pastoris hoặc S. cerevisiae được
thu nhận và cô đặc. Phương pháp lọc tiếp tuyến cho hiệu quả cô đặc tốt nhất.
Nội dung 5: Bƣớc đầu tinh chế GM-CSF qui mơ phịng thí nghiệm
Thực hiện hai phương pháp sắc ký trao đổi ion và kỵ nước để tinh sạch GM-CSF từ dịch cô đặc và phương pháp sắc ký trao đổi anion cho độ tinh sạch cao và hiệu suất thu hồi cao hơn so với sắc kí kỵ nước ở cả hai mẫu dịch lên men cô đặc từ P. pastoris và S. cerevisiae.
Nội dung 6: Đánh giá chất lƣợng GM-CSF
Mẫu GM-CSF tinh sạch từ P. pastoris và S. cerevisiae có khả năng kích thích sự tăng sinh tế bào sống phụ thuộc GM-CSF là TF-1 và mẫu tinh sạch từ
P. pastoris cho hoạt tính cao hơn mẫu từ S. cerevisiae.
4.2. Đề nghị
Với các kết quả đạt được từ đề tài, nhóm nghiên cứu có các kiến nghị sau:
26
ưu hoá codon sử dụng trên hệ thống biểu hiện tương ứng để tránh sản phẩm tái tổ hợp không được biểu hiện hay biểu hiện rất ít. (2) Sử dụng chủng P. pastoris làm chủng chủ biểu hiện cho GM-CSF nói riêng và các protein cần
đường hố nói chung thay cho S. cerevisiae vì tốc độ tăng trưởng cao, hiệu
suất biểu hiện cao, và mức độ glycosyl hoá vừa phải. (3) Để tăng tối đa mức độ đồng nhất về đường hố thì nên sử dụng chủng P. pastoris đột biến có
mang gen mã hoá cho q trình đường hố từ người (ví dụ như P. pastoris
SuperMan5).
Ngoài ra, xuất phát từ tình hình thực tế là thuốc Leukine sẽ hết hạn bản quyền vào tháng 12/2017, giá thành thuốc ngoại nhập cao (lên tới 4,3 triệu đồng/liều tiêm và cần tiêm nhiều liều), tạo thêm sự lựa chọn sản phẩm điều trị cho bệnh nhân và với kết quả nghiên cứu bước đầu của nhóm cho thấy nhóm đã nắm và làm chủ được cơng nghệ để có thể biểu hiện hGM-CSF (thành phần hoạt tính của thuốc Leukine) với lượng lớn, độ tinh sạch cao và có hoạt tính cao gấp 2 lần so với thuốc Leukine nên khả năng phát triển tiếp tục thành thuốc là hồn tồn khả thi.
Vì vậy, nhóm mạnh dạn đề xuất với Sở Khoa học và Công nghệ TPHCM tiếp tục đầu tư giai đoạn tiếp theo để nhóm có thể hồn thiện quy trình nhằm hướng tới việc sản xuất thuốc phục vụ cho nhu cầu hỗ trợ điều trị cho bệnh nhân ung thư ở Việt Nam.
27