Xây dựng quy trình thu nhận dịch chiết nấm men từ xác men của quá trình lên men rượu công nghiệp

NTTU-NCKH-04 CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập - Tự - Hạnh phúc Đơn vị chủ trì: Trường Đại học Nguyễn Tất Thành BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NCKH DÀNH CHO CÁN Bộ - GIẢNG VIÊN 2020 Tên đề tài: Xây dựng quy trình thu nhận dịch chiết nấm men từ xác men trình lên men ruợu cơng nghiệp Số hợp đồng: 2020.01.014 Chủ nhiệm đề tài: Nguyễn Thị Phuơng Đơn vị công tác: Viện kỹ thuật công nghệ cao NTT- Đại học Nguyễn Tất Thành Thời gian thực hiện: tháng (02/2020 - 11/2020) TP Hô Chỉ Minh, ngày 18 tháng 12 năm 2020 MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan nấm men sản xuất rượu 1.2 Các phương pháp phá vỡ tế bào 1.3 Tình hình nghiên cứu cao nấm men CHƯƠNG NỘI DƯNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu 2.1 Vật liệu nghiên cứu 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Khảo sát quy trình thu nhận dịch chiết nấm men 2.2.2 Hiệu suất tách chiết cao nấm men 2.2.3 Hàm lượng dinh dưỡng cao nấm men 2.2.4 Hiệu cao nấm men nuôi cấy vi khuẩn CHƯƠNG KÉT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 10 3.1 Khảo sát tách chiết dịch chiết nấm men 10 3.1.1 Ảnh hưởng tỉ lệ bã men nước lên hiệu suất tách chiết 10 3.1.2 Ảnh hưởng điều kiện nhiệt độ lên hiệu suất tách chiết 11 3.1.3 Ảnh hưởng thời gian xử lý lên hiệu suất tách chiết 13 3.2 Hiệu suất tách chiết giá trị dinh dưỡng cao nấm men 15 3.3 Hiệu cao nấm men nuôi cấy vi khuẩn 16 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 18 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Tên viết tắt Tên đầy đủ ATCC : American Type Culture Collection s cerevisae : Saccharomyces cerevisae E co li : Escherichia coli p aeruginosa : Pseudomonas aeruginosa s aureus : Staphylococcus aureus B cereus : Bacillus cereus DANH MỤC CÁC sơ ĐỊ, HÌNH ẢNH Hình 3.1 Hàm lượng nucleic acid protein tách chiết quy trình sử dụng tỉ lệ bã men: nước 1:1, 1:2, 1:3, 1:4 1:5 (khối lượng/thể tích) Hình 3.2, Mật độ tế bào nấm men (A) trước sau xử lý nhiệt độ 121°c 20 phút với tỉ lệ tế bào nấm menmước cất (B) 1:1, (C) 1:2, (D) 1:3, (E) 1:4 (F) 1:5 Hình ảnh chụp với kính hiển vi có độ phóng đại 1000 lần Hình 3.3 Hàm lượng nucleic acid protein tách chiết nhiệt độ 100°C, 110°C 121°c Hình 3.4 Mật độ tế bào nấm men trước xử lý (A) sau xử lý nhiệt độ (B) 100°C, (C) 110°C (D) 121°c Hình ảnh chụp với kính hiển vi có độ phóng đại 1000 lần Hình 3.5 Mật độ tế bào nấm men trước xử lý (A) sau xử lý nhiệt độ 121°c (B) 10 phút, (C) 20 phút (D) 30 phút, độ phóng đại 1000 lần Hình 3.6, Hàm lưọng nucleic acid protein tách chiết từ bã men nhiệt độ 110°C 10 phút, 20 phút 30 phút Hình 3.7 Đường cong tăng trưởng chủng vi sinh vật E coli, p aeruginosa, s aureus B cereus ni mơi trường có nguồn dinh dưỡng cao nấm men mẫu thí nghiệm, cao nấm men hãng Himedia hãng Angel Ket trình bày giá trị trung bình ba lần lặp lại (Mean) độ lệch chuẩn (SD) Hình 3.8 Khuẩn lạc chủng E coli, p aeruginosa, s aureus B cereus nuôi môi trường chứa cao nấm men thử nghiệm, cao nấm men hãng Himedia Angel Đối chứng âm môi trường nuôi cấy không chứa cao nấm men Phụ lục Hình ảnh 10 g cao nấm men sản xuất từ bã men rượu DANH MỤC CÁC BẢNG BIÊU Phụ lục Tỉ lệ tế bào nấm men bị phá vỡ theo thông số khảo sát (1) Tỉ lệ bã memdThO, (2) Thời gian hấp (3) Nhiệt độ hấp Phụ lục Hàm lượng amino acid lượng đường khử cao nấm men sản xuất từ bã men rượu TÓM TẮT KÉT QUẢ NGHIÊN cứu STT Công việc thực Thu nhận xác nấm men đánh giá tình trạng dinh duỡng xác nấm men ruợu Kết đạt Bã men có chứa hàm lượng protein, amino acid tự đường cao Thu nhận dịch chiết từ xác nấm men sau lên men xác định Thu nhận cao nấm men sau hàm luợng dinh dưỡng bao gồm trình đơng khơ kèm theo quy trình tối hàm lượng đường tong, protein, ưu cho tách chiết dịch chiết nấm amino acid tự dịch men chiết nấm men Cao nấm men có hiệu tương đương sản phẩm cao nấm men Thử nghiệm khả sinh trưởng thương mại nuôi cấy chủng chủng vi sinh vật vi sinh vật thử nghiệm bao gồm hai chủng Gram âm hai chủng Gram dương STT Sản phẩm đạt Sản phẩm đăng ký 10g cao nấm men 100 mL dịch chiết nấm men 01 báo đăng Tạp chí khoa 01 báo đăng Tạp chí khoa học cơng nghệ đại học Nguyễn học công nghệ đại học Nguyễn Tất Tất Thành Thành Thời gian thực hiện: 02/2020 - 11/2020 Thời gian nộp báo cáo: MỞ ĐẦU Saccharomyces cerevỉsiae có vai trò lớn sản xuất cao nấm men dùng thực phẩm thành phần dinh dưỡng môi trường nuôi cấy nghiên cứu vi sinh Trong đó, Saccharomyces cerevisiae dịng men quan trọng chiếm ưu trình lên men rượu, diện phần lớn quy trình sản xuất loại thức uống lên men truyền thống Mặt khác, sản lưọng rượu nước khảo sát sở sản xuất rượu công nghiệp khoảng 300 triệu lít nước (theo thống kê năm 2018) Điều dẫn đến phế phẩm trình lên men rượu bao gồm xác nấm men thải môi trường nước ta lớn Để tận dụng nguồn xác men rẻ tiền từ phế phẩm q trình lên men rượu cơng nghiệp giải vấn đề rác thải lên men rượu công nghiệp nhằm tạo sản phẩm hữu ích, đề tài “Xây dựng quy trình thu nhận cao nấm men từ xác men q trình lên men rượu cơng nghiệp” thực Để tận dụng nguồn xác men thải từ q trình lên men rượu cơng nghiệp hiệu quả, cao nấm men thu phương pháp học đơn giản tốn chi phí, cách sử dụng nhiệt độ áp suất phá vỡ tế bào nấm men Hàm lượng nucleic acid protein thử nghiệm khảo sát điều kiện tối ưu tách chiết dịch chiết nấm men phương pháp sử dụng nồi hấp sử dụng để đánh giá điều kiện tỉ lệ bã memnước, nhiệt độ thời gian hấp thích họp Ket cho thấy, dịch chiết nấm men có hàm lượng dinh dưõng tối ưu với điều kiện tỉ lệ bã memnước 1:4 (khối lượng/thể tích) hấp 110°C 20 phút Cao nấm men sau thu nhận q trình đơng khơ thể hiệu chủng vi khuẩn bao gồm vi khuẩn Gram dương Gram âm tương đương cao nấm men thương mại nước Như vậy, thành công việc sản xuất cao nấm men phương pháp sử dụng nhiệt độ áp suất lên bã men trình lên men rượu công nghiệp Dịch chiết nấm men sản xuất từ bã men rượu đánh giá có tiềm sản xuất cao nấm men kết họp với trình sấy phun tạo cao nấm men khảo sát điều kiện bảo quản CHƯƠNG TÔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan nấm men sản xuất rượu Trong sản xuất rượu, hai giai đoạn chủ yếu trình lên men rượu trình đường hóa - chuyển hóa tinh bột thành đường lên men q trình lên men - chuyển hóa từ đường thành cồn nấm men [1], Có nhiều dịng nấm men khác tham gia q trình sản xuất rượu Tuy nhiên, dòng men quan trọng chiếm ưu trình lên men rượu thuộc giống Saccharomyces, đặc biệt Saccharomyces cerevỉsỉae diện phần lớn loại thức uống lên men truyền thống [2], [3] Ngồi việc đóng góp cơng nghiệp rượu, bia bánh mì, Saccharomyces cerevỉsỉae có vai trò lớn sản xuất cao nấm men dùng thực phẩm thành phần dinh dưỡng môi trường nuôi cấy nghiên cứu vi sinh Cao nấm men định nghĩa thành phần bên tế bào nấm men có khả tan nước sau phá bỏ màng tế bào Trong công nghiệp sản xuất cao nấm men, cao nấm men tạo với ba bước chính: lên men thu sinh khối nấm men, phá bỏ màng tế bào, thu nhận phần tan nước (thành phần tế bào nấm men) Mặt khác, theo số liệu Tổng cục Thống kê vào năm 2016, sản lượng rượu nước 306,8 triệu lít, rượu cơng nghiệp chiếm khoảng 75 triệu lít sản xuất từ khoảng 167 sở sản xuất rượu cơng nghiệp, cịn lại rượu nấu quy mơ hộ gia đình chiếm tới 200 triệu lít Đen năm 2018, theo thống kê sơ Bộ Công Thương, sản lượng rượu sản xuất 316,3 triệu lít nước [4], Do vậy, phế phẩm trình lên men rượu bao gồm xác nấm men thải môi trường nước ta lớn Đe tận dụng nguồn xác men rẻ tiền từ phế phẩm trình lên men rượu công nghiệp giải vấn đề rác thải lên men rượu công nghiệp nhằm tạo sản phẩm hữu ích, đề tài “Xây dựng quy trình thu nhận cao nấm men từ xác men q trình lên men rượu cơng nghiệp” thực 1.2 Các phương pháp phá vỡ tế bào Cao nấm men sản xuất thơng qua phá vỡ thành tế bào nấm men enzyme nội sinh, enzyme ngoại sinh acid Cao nấm men giàu chất dinh dưỡng cần thiết cho phát triển vi sinh vật, cao nấm men cung cap peptide, amino acid, nucleotide, vitamin, nguyên to vi lượng yếu tố tăng trưởng khác cho môi trường nuôi cấy [5], Thành phần hóa học sản phẩm cao nấm men thương mại khác thương hiệu sản xuất Tuy nhiên, thành phần chất béo hàm lượng đường, hàm lượng protein trung bình chiết xuất nấm men thương mại thường dao động từ 50 đến 75% khối lượng [6] Tùy thuộc vào mục đích sản xuất, phương pháp phá vỡ màng tế bào thu nhận nguyên sinh chất khác sử dụng Một số phương pháp để sản xuất cao nấm men công nghiệp tự phân hủy cách sử dụng enzyme nội sinh nấm men, nhiệt phân, plasmolysis - phương pháp tự phân hủy với số thay đổi liên quan đến việc thêm muối vô dung môi hữu cơ, thủy phân cách sử dụng enzyme acid ngoại sinh phá vỡ học, nhiệt độ áp suất cao sử dụng [7], Những phương pháp sử dụng thêm enzyme, acid dung môi vô hữu làm tăng chi phí sản xuất làm cho bước tinh chế thêm phức tạp [8] Tùy thuộc vào ứng dụng chiết xuất nấm men, phương pháp chiết xuất sử dụng khác Các phịng thí nghiệm vi sinh học Việt Nam có nhu cầu tương đối cao cao nấm men, nhiên, có vài sản phẩm cao nấm men từ thương hiệu Merck, Sigma- Aldrich, Himedia Thêm vào đó, giá sản phẩm thường cao quy trình sản xuất phức tạp chi phí nhập Hãng Angel cơng ty Việt Nam sản xuất cao nấm men với giá thành cạnh tranh Tuy nhiên, việc tìm phương pháp hiệu chi phí cho sản xuất cao nấm men với nguồn xác men sau lên men rượu công nghiệp việc làm thiết thực Phá vỡ tế bào phương pháp học sử dụng nhiệt độ áp suất cao để làm vỡ tế bào nấm men khắc phục vấn đề liên quan đến giá thành độ phức tạp trình 1.3 Tình hình nghiên cứu cao nấm men Các báo cáo giới sản xuất cao nấm men thuờng báo cáo sản xuất cao nấm men dùng thực phẩm Cho đến nay, phuong pháp tự ly giải (autolysis) phương thức sử dụng thường xuyên sản xuất cao nấm men thực phẩm [9] Quá trình tự ly giải phương pháp sử dụng enzyme tế bào để phân giải thành phần tế bào Quá trình tự ly giải thường bắt đầu bước phá màng tế bào sau ly tâm Huyền phù men thô thêm vào bể trộn 50 55°C điều kiện tối ưu pH 5.0 24 Bước làm cho tế bào nấm men chết bị ly giải enzyme nội sinh chúng Huyền phù sau ly tâm để tách phần tan khỏi phần khơng hịa tan Cuối cùng, dựa nhu cầu khách hàng, cao nấm men đóng gói thành ba dạng: lỏng, sệt bột thơng qua bước cô đặc sấy phun [7], Mặc dù sử dụng rộng rãi, phương pháp autolysis có số nhược điểm suất thấp trình tách pha rắn - lỏng khó khăn [10], Ngồi ra, q trình ly giải thực cách sử dụng enzyme thủy phân ngoại sinh Hyoky cộng (1997) báo cáo chiết xuất nấm men sản xuất cách phân hủy lượng nấm men (men bia men làm bánh) enzyme, cách thu hồi chất tan tinh chế dung dịch chất hấp phụ polymer Xử lý cao nấm men chất hấp phụ polymer giúp loại bỏ chất tạo vị đắng chất có mùi hương không mong muốn khác Tuy nhiên, q trình phức tạp địi hỏi chi phí cao [11] Trong nghiên cứu vi sinh vật, nghiên cứu thực Zarei cộng (2016) đưa kết đầy hứa hẹn cao nấm men sản xuất từ men bánh mì phương pháp học Trong quy trình này, cao chiết nấm men sản xuất phương pháp học nhiệt độ áp suất cao Chiết xuất nấm men sau thử nghiệm để đánh giá khả tăng trưởng tế bào vi khuẩn {Escherichia coli men mẫu thí nghiệm, cao nấm men hãng Himedia hãng Angel Ket trình bày giá trị trang bình ba lần lặp lại (Mean) độ lệch chuẩn (SD) Ngồi ra, hình dạng kích thước khuẩn lạc chủng vi khuẩn nuôi môi trường chứa cao nấm men sản xuất từ men thải trình chưng cất rượu công nghiệp tương tự nuôi mơi trường chứa cao nấm men thương mại (Hình 3.8), Từ kết luận, cao nấm men thử nghiệm có hiệu tương đương với cao nấm men hãng Himedia Angel chủng vi khuẩn thử nghiệm Hình 3.8 Khuân lạc chủng E coli, p aeruginosa, s aureus B cereus nuôi môi trường chứa cao nấm men thử nghiệm, cao nấm men hãng Himedia Angel Đối chứng âm môi trường nuôi cấy không chứa cao nấm men 17 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Qua trình khảo sát điều kiện tách chiết nhiệt độ, thời gian tỉ lệ bã men:nước tỉ lệ bã men:nước 1:4 (khối lượng/thể tích) hấp nhiệt độ 11 o°c 20 phút coi tối ưu để tách chiết dịch chiết nấm men từ bã men q trình lên men rượu cơng nghiệp Dịch chiết nấm men sau đơng khơ để tạo cao nấm men với hiệu suất tạo cao nấm men theo điều kiện khảo sát tối ưu 0,63% so với lượng bã men ban đầu Cao nấm men thử nghiệm chứng minh hiệu nuôi cấy chủng vi khuân Gram dương (S aureus B cereus) Gram âm (£ colỉ p aeruginosa) so với sản phẩm cao nấm men thương mại nước Vì vây, cao nấm men sản xuất phương pháp vật lý (sử dụng nhiệt độ áp suất) từ bã men q trình lên men rượu cơng nghiệp coi có tiềm ni cấy vi khuẩn Chủ nhiệm đề tài Nguyễn Thị Phương 18 TÀI LIỆU THAM KHẢO Nout, M and K Aidoo, Asian fungal fermented food, in Industrial Applications 2002, Springer, p 23-47 Wang, H and s Fang, History of Chinese fermentedfoods Indigenous Fermented Food of Non-Westem Origin Hesseltine CW and Wang HL (Eds.), Cramer Press, Berlin and Stuttgart, 1986: p 23-35 Lee, A and Y Fujio, Microflora of banh men, a fermentation starter from Vietnam World Journal of Microbiology and Biotechnology, 1999 15(1): p 5155 Trung tâm Tư liệu Dịch vụ Thống kê - Tống Cục Thống kê Sản phấm chủ yếu ngành công nghiệp phân theo thành phần kinh tế (2018) http s: //www.gso.gov.vn/default.aspx?tabỉd=716 ) Jacob, F.F., et al., Yeast extract production using spent yeast from beer manufacture: influence of industrially applicable disruption methods on selected substance groups with biotechnological relevance European Food Research and Technology, 2019 245(6): p 1169-1182 Suwanapong, s., et al., Dried spent yeast and its hydrolysate as nitrogen supplements for single batch and repeated-batch ethanol fermentation from sweet sorghum juice Energies, 2013 6(3): p 1618-1631 Sommer, R., Yeast extracts: production, properties and components Food Australia, 1998 50(4): p 181-183 Zarei, o., s Dastmalchi, and M Hamzeh-Mivehroud, A simple and rapid protocol for producing yeast extract from Saccharomyces cerevisiae suitable for preparing bacterial culture media Iranian journal of pharmaceutical research: IJPR, 2016 15(4): p 907 Tanguler, H and H Erten, Utilisation of spent brewer's yeast for yeast extract production by autolysis: The effect of temperature Food and bioproducts processing, 2008 86(4): p 317-321 Podpora, B., et al., Spent brewer’s yeast extracts as a new component offunctional food Czech Journal of Food Sciences, 2016 34(6): p 554-563 Hyoky, G., M Sarkki, and M Tylli, Non-bitter yeast extract Trends in Food Science & Technology, 1997 11(8): p 383 10 11 19 Phụ lục Tỉ lệ tế bào nấm men bị phá vỡ theo thông số khảo sát (1) Tỉ lệ bã men:dIỈ2O, (2) Thời gian hấp (3) Nhiệt độ hấp Tỉ lệ bã men: dHạO (g/mL) Thời gian hấp (phút) Nhiệt độ hấp (°C) 1:01 25.5 29 28,5 Tỉ lệ tế bào bị phá vỡ (%) 1:02 1:03 1:04 62 30,5 61 28,5 61,5 61,5 29 60,5 59 Tỉ lệ tế bào bị phá vỡ _ (%) _ 10 20 30 45.5 61 64.5 62 46,8 61 51 59,5 59 Tỉ lệ tế bào bị phá vỡ _ (%L 100 110 121 40 67,5 65 62 37,5 67 34,5 55 58 1:05 65 65 63 Phụ lục 10 g dịch chiết nấm men lưu trữ tủ lạnh -20°C, phịng thí nghiệm Vi sinh - Viện Kỹ thuật Công nghệ cao NTT - Trường Đại học Nguyễn Tất Thành, 300A Nguyễn Tất Thành, phường 13, quận 4, Tp HCM Hình ảnh 10 g cao nấm men thu nhận từ bã men trình lên men rượu công nghiệp Viện trưởng Chủ nhiệm đề tài Viện Kỹ thuật Công nghệ cao NTT Vũ Văn Vân Nguyễn Thị Phương Phụ lục Minh chứng Bài báo sản phẩm cho đề tài nhận phản hồi từ Ban Biên Tập Tạp chí Khoa học Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh [HCMCOUJS] Xác nhận viết: "Xây Dựng Quy Trinh Thu Nhận Dịch Chiết Nấm Men Từ Xác Men Của Quá Trình Lên Men Rượu Công Nghiệp" Hộp thư đến X Ho Chi Minh City Open University Journal of Science = journaiofscience@ou.edu.vn> 21:41 (1 trước) ẽ> □ K : tới tơi ▼ Kính gừi Ms Nguyen Thi Phuong: Tạp chí tràn trọng cám ơn quỷ Tác già quan tâm gửi viểt "Xây Dựng Quy Trình Thu Nhận Dịch Chiết Nấm Men Từ Xác Men Cùa Q Trình Lên Men Rượu Cơng Nghiệp" đến Tạp chí HCMCOUJS - KỸ THUẬT VÀ CỊNG NGHỆ Với hệ thổng trực tuyến cùa Tạp chí, quý Tác già có thê theo dơi tồn tiến trình phản biện, biên tập cách đăng nhập vào website Tạp chí: Đường dấn (URL) bàn thào: http://journalofscience.ou.edu.vn/index php/tech-vi/author/submission/1361 Tẽn người dùng: phuongnguyen Tạp chí sớm thơng tin đển Tác giả viết, Nếu cỏ thắc mắc nào, Quỷ tác già liên hệ lại với Tòa soạn Trân trọng càm ơn kính chúc q Tac già ln vui khỏe thành cơng./ Hình chụp email xác nhận nộp báo nghiệm thu từ tạp chí Khoa học Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh cho Bài báo “Xây dựng quy trình thu nhận dịch chiết nấm men từ xác men q trình lên men rượu cơng nghiệp” Xây Dựng Quy Trình Thu Nhận Dịch Chiết Nấm Men Từ Xác Men Của Q Trình Lên Men Rượu Cơng Nghiệp Nguyễn Thị Phương1 Vũ Văn Vân1’* 'viện Kỳ thuật công nghệ cao NTT, Trường Đại học Nguyễn Tất Thành *Tác giả liên hệ, Email: vanvu @ntt.edu.vn TÓM TẢT Saccharomỵces cerevỉsiae có vai trị lớn sản xuất cao nấm men dùng thực phấm thành phần dinh dưỡng môi trường nuôi cấy nghiên cứu vi sinh Trong đó, s cerevỉsỉae dòng men quan trọng chiếm ưu trình lên men rượu, diện phần lớn quy trình sản xuất loại thức uống lên men truyền thống Đe tận dụng nguồn xác men thải từ q trình lên men rượu cơng nghiệp hiệu quả, cao nấm men thu phương pháp học đơn giản tốn chi phí, cách sử dụng nhiệt độ áp suất phá vỡ tế bào nấm men Hàm lượng nucleic acid protein thử nghiệm khảo sát điều kiện tối ưu tách chiết dịch chiết nấm men phương pháp sử dụng nồi hấp sử dụng đe đánh giá điều kiện tỉ lệ bã menmước, nhiệt độ thời gian hấp thích hợp Ket cho thấy, dịch chiết nấm men có hàm lượng dinh dưỡng tối ưu với điều kiện tỉ lệ bã menmước 1:4 (khối lượng/thể tích) hấp 110°C 20 phút Cao nấm men sau thu nhận trình đông khô hiệu chủng vi khuân bao gồm vi khuan Gram dương Gram âm tương đương cao nấm men thương mại ngồi nước Như vậy, chúng tơi thành cơng việc sản xuất cao nấm men phương pháp sử dụng nhiệt độ áp suất lên bã men trình lên men rượu cơng nghiệp Từ khóa: cao nấm men, học, dịch chiết nấm men, hèm rượu, Saccharomyces cerevisỉae Giói thiệu Trong sản xuất rượu, hai giai đoạn chủ yếu trình lên men rượu q trình đường hóa - chuyến hóa tinh bột thành đường lên men trình lên men - chuyến hóa từ đường thành cồn nấm men [1] Có nhiều dịng nấm men khác tham gia q trình sản xuất rượu Tuy nhiên, dịng men quan trọng chiếm ưu trình lên men rượu thuộc giống Saccharomyces, đặc biệt Saccharomyces cerevỉsỉae diện phần lớn loại thức uống lên men truyền thống [2], [3], Ngồi việc đóng góp cơng nghiệp rượu, bia bánh mì, Saccharomyces cerevỉsiae có vai trò lớn sản xuất cao nấm men dùng thực phẩm thành phần dinh dưỡng môi trường nuôi cấy nghiên cứu vi sinh Cao nấm men định nghĩa thành phần bên tế bào nấm men có khả tan nước sau phá bỏ màng tế bào Trong công nghiệp sản xuất cao nấm men, cao nấm men tạo với ba bước chính: lên men thu sinh khối nấm men, phá bỏ màng tế bào, thu nhận phần tan nước (thành phần tế bào nấm men) Mặt khác, theo số liệu Tổng cục Thống kê vào năm 2016, sản lượng rượu nước 306,8 triệu lít, rượu cơng nghiệp chiếm khoảng 75 triệu lít sản xuất từ khoảng 167 sở sản xuất rượu cơng nghiệp, cịn lại rượu nấu quy mô hộ gia đình chiếm tới 200 triệu lít Đen năm 2018, theo thống kê sơ Bộ Công Thương, sản lượng rượu sản xuất 316,3 triệu lít nước [4] Do vậy, phế phấm trình lên men rượu bao gồm xác nấm men thải môi trường nước ta lớn Đẻ tận dụng nguồn xác men rẻ tiền từ phế phẩm q trình lên men rượu cơng nghiệp giải vấn đe rác thải lên men rượu công nghiệp nhằm tạo sản phấm hữu ích, đề tài “Xây dựng quy trình thu nhận cao nấm men từ xác men q trình lên men rượu cơng nghiệp” thực Cao nấm men có the sản xuất thông qua phá vỡ thành tế bào nấm men enzyme nội sinh, enzyme ngoại sinh acid Cao nấm men giàu chất dinh dưỡng cần thiết cho phát triển vi sinh vật, cao nấm men cung cap peptide, amino acid, nucleotide, vitamin, nguyên tố vi lượng yếu tố tăng trưởng khác cho mơi trường ni cấy [5] Thành phần hóa học sản phẩm cao nấm men thương mại khác thương hiệu sản xuất Tuy nhiên, thành phần chất béo hàm lượng đường, hàm lượng protein trung bình chiết xuất nấm men thương mại thường dao động từ 50 đến 75% khối lượng [6], Tùy thuộc vào mục đích sản xuất, phương pháp phá vỡ màng tế bào thu nhận nguyên sinh chất khác có the sử dụng Một số phương pháp đế sản xuất cao nấm men công nghiệp tự phân hủy cách sử dụng enzyme nội sinh nấm men, nhiệt phân, plasmolysis - phương pháp tự phân hủy với số thay đối liên quan đến việc thêm muối vô dung môi hữu cơ, thủy phân cách sử dụng enzyme acid ngoại sinh phá vỡ học, nhiệt độ áp suất cao sử dụng [7] Những phương pháp sử dụng thêm enzyme, acid dung mơi vơ hữu làm tăng chi phí sản xuất làm cho bước tinh chế thêm phức tạp [8] Tùy thuộc vào ứng dụng chiết xuất nấm men, phương pháp chiết xuất sử dụng khác Các phịng thí nghiệm vi sinh học Việt Nam có nhu cầu tương đối cao cao nấm men, nhiên, có vài sản phẩm cao nấm men từ thương hiệu Merck, Sigma- Aldrich, Himedia Thêm vào đó, giá sản phẩm thường cao quy trình sản xuất phức tạp chi phí nhập Hãng Angel công ty Việt Nam sản xuất cao nấm men với giá thành cạnh tranh Tuy nhiên, việc tìm phương pháp hiệu chi phí cho sản xuất cao nấm men với nguồn xác men sau lên men rượu công nghiệp việc làm thiết thực Phá vỡ tế bào phương pháp học sử dụng nhiệt độ áp suất cao để làm vỡ tế bào nấm men có the khắc phục vấn đề liên quan đến giá thành độ phức tạp trình Cơ sở lý thuyết Các báo cáo giới sản xuất cao nấm men thường báo cáo sản xuất cao nấm men dùng thực phẩm Cho đến nay, phương pháp tự ly giải (autolysis) phương thức sử dụng thường xuyên sản xuất cao nấm men thực phấm [9], Quá trình tự ly giải phương pháp sử dụng enzyme tế bào để phân giải thành phần tế bào Quá trình tự ly giải thường bắt đầu bước phá màng tế bào sau ly tâm Huyền phù men thô thêm vào bể trộn 50 - 55°c điều kiện tối ưu pH 5,0 24 Bước làm cho tế bào nấm men chết bị ly giải enzyme nội sinh chúng Huyền phù sau ly tâm để tách phần tan khỏi phần khơng hịa tan Cuối cùng, dựa nhu cầu khách hàng, cao nấm men đóng gói thành ba dạng: lỏng, sệt bột thơng qua bước cô đặc sấy phun [7] Mặc dù sử dụng rộng rãi, phương pháp autolysis có số nhược điểm suất thấp trình tách pha rắn - lỏng khó khăn [10] Ngồi ra, q trình ly giải có the thực cách sử dụng enzyme thủy phân ngoại sinh Hyoky cộng (1997) báo cáo chiết xuất nấm men sản xuất cách phân hủy lượng nấm men (men bia men làm bánh) bang enzyme, cách thu hồi chất tan tinh chế dung dịch chất hấp phụ polymer Xử lý cao nấm men chất hấp phụ polymer giúp loại bỏ chất tạo vị đắng chất có mùi hương không mong muốn khác Tuy nhiên, trình phức tạp địi hỏi chi phí cao [11] Trong nghiên cứu vi sinh vật, nghiên cứu thực Zarei cộng (2016) đưa kết đầy hứa hẹn cao nấm men sản xuất từ men bánh mì phương pháp học Trong quy trình này, cao chiết nấm men sản xuất phương pháp học nhiệt độ áp suất cao Chiết xuất nấm men sau thử nghiệm để đánh giá khả tăng trưởng tế bào vi khuan (Escherichia colỉ Staphylococcus aureusỴ Ket cho thấy tăng trưởng tế bào vi khuân môi trường chứa cao nấm men thí nghiệm tương đương với tăng trưởng vi khuân nuôi môi trường chứa ba cao nấm men thương mại [8] Nghiên cứu áp dụng phương pháp phá vỡ tế bào nấm men phương pháp học theo nghiên cứu Zarei (2016) với số sửa đối cho phù hợp với nấm men thu nhận từ trình lên men rượu thực khảo sát khả tăng trưởng số chủng vi sinh vật môi trường chứa dịch chiết nấm men Sự tăng trưởng vi khuấn nuôi môi trường chứa dịch chiết nấm men so sánh với số cao nấm men thương mại Mục tiêu thí nghiệm đánh giá tiềm việc sử dụng nguồn nấm men - xác men q trình lên men rượu cơng nghiệp để sản xuất dịch chiết nấm men phương pháp phá vỡ học, nhằm phát triến phương pháp đơn giản hiệu chi phí cho trình sản xuất cao nấm men Phương pháp nghiên cứu 3.1 Vật liệu nghiên cứu Nguyên liệu Dịch sau lên men rượu cung cấp công ty Trách nhiệm hữu hạn Huy Việt - Tây Đô, 1904 QL91, Phường Thuận An, Thốt Nốt, cần Thơ kiểm tra hàm lượng dinh dưỡng bao gồm lượng hàm lượng amino acid lượng đường tổng Trang tầm kỹ thuật đo lường chất lượng (QUATEST 3) Chủng vi khuẩn Các chủng vi khuẩn sử dụng thử nghiệm tăng trưởng hai chủng vi khuẩn Gram ầm (Escherichia coỉi ATCC 25922, Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027) hai chủng vi khuan Gram dương (Bacillus cereus ATCC 10876, Staphylococcus aureus ATCC 25923) 3.2 Phương pháp nghiên cứu 3.2.1 Khảo sát quy trình thu nhận dịch chiết nấm men Xác men sau lên men rượu thu nhận rửa lần với nước cất tỉ lệ 1:2 (khối lượng/thể tích) Huyền phù sau ly tâm 6000 vòng/phút 10 phút thu nhận phần cặn - bã men Thí nghiệm khảo sát điều kiện tách chiết thực sử dụng máy hấp khử tràng (Hirayama) Quá trình hấp kết thúc máy hấp đạt nhiệt độ thiết lập sau áp suất giảm xuống 0, đồng thời nhiệt độ giảm 95°c Hồn hợp sau làm lạnh nhanh đá 10 phút Khảo sát tỉ lệ bã men : nước cất Bã men trước tiên xử lý nhiệt độ 121 °C 30 phút với tỉ lệ bã men rượumước cất 1:1, 1:2, 1:3, 1:4 1:5 Huyền phù sau ly tâm 6000 vòng/phút 10 phút thu nhận phần tan - dịch chiết nấm men Phần dịch chiết nấm men mồi tỉ lệ sau đưa thể tích định lượng protein tan phưong pháp Bradford Lượng nucleic acid định tính phương pháp mật độ quang bước sóng AỉóOnm dịch chiết nấm men pha lỗng 100 lần Ngồi ra, tế bào sau cịn nhuộm thuốc nhuộm Loefflers (thuốc nhuộm nhuộm xanh tế bào không phân biệt tế bào sống/chết) số tế bào chưa bị phá vỡ đếm sử dụng buồng đếm hồng cầu Dựa tỉ lệ tế bào nấm men bị phá vỡ, lượng protein nucleic acid, quy trình có tỉ lệ bã men : nước thích hợp lựa chọn Khảo sát nhiệt độ phá tế bào Xác men xử lý nhiệt độ khảo sát 100°C, 110°C 121 °C 30 phút, sau làm lạnh nhanh đe phá màng tế bào Huyền phù sau ly tâm 6000 vòng/phút 10 phút thu nhận phần tan - dịch chiết nấm men Các dịch chiết nấm men mồi điều kiện nhiệt độ sau định lượng protein tan, nucleic acid xác định số tế bào bị phá vỡ tương tự khảo sát ảnh hưởng tỉ lệ xác men:nước Khảo sát thịi gian phá tế bào Xác men sau xử lý nhiệt độ 121 °C thời gian khảo sát 10 phút, 20 phút 30 phút, sau làm lạnh nhanh để phá màng tế bào Huyền phù sau ly tâm 6000 vòng/phủt 10 phút thu nhận phần tan - dịch chiết nấm men Các dịch chiết nấm men điều kiện thời gian tách chiết sau định lượng protein tan, nucleic acid xác định số tế bào bị phá vỡ tương tự khảo sát ảnh hưởng tỉ lệ xác memnước Biếu đồ lượng protein nucleic acid tách chiết sử dụng phần mềm GraphPad Prism Các giá trị thể trang bình cộng ba lần lặp lại độ lệch chuẩn (Standard Deviation - SD) Thống kê T-test (kiểu paired test) phần mem GraphPad Prism sử dụng để so sánh hàm lượng nucleic acid protein tách mẫu khảo sát Khác biệt coi có ý nghĩa với (*, p